通常被称为 "第五个RNA碱基"，N6-甲基腺苷，或m6A，是最常见和最丰富的真核生物RNA修饰，占所有RNA甲基化的80%以上。 它主要存在于mRNA中，但也可以在非编码物种如tRNA、rRNA和miRNA中观察到。 通过与被称为 "阅读者 "的各种结合蛋白的相互作用，m6A几乎影响到核糖核酸生物学的每个方面：结构、剪接、定位、翻译、稳定性和周转[1]。 除了在RNA代谢中的核心作用外，m6A还是其他生理过程的一个因素，如细胞分化、免疫、炎症和昼夜节律钟[2]。 异常的m6A甲基化已经牵涉到不同的病症：糖尿病、肥胖、神经变性和癌症，仅举几例。 m6A RNA的形成似乎是一个共同转录事件，发生在RNA生命周期的早期，由一个多蛋白甲基转移酶复合物介导。

目前，有几种方法用于表观转录体范围的m6A绘图。

MeRIP-seq。 RNA甲基化免疫沉淀测序（MeRIP-seq）的发展是表观转录组学领域的一个里程碑，因为它是第一个在整个转录组水平上检测m6A的方法[3]。 MeRIP-seq将m6A RNA免疫沉淀与NGS结合起来，允许从富集的含m6A的RNA片段中高通量定位修饰位点，这些片段已被特异性抗体沉淀，并被逆转录和测序。 在免疫沉淀前的随机破碎步骤中产生的片段大小限制了对m6A位点的精确测绘，使其在约200 nt的范围内。 抗体的选择允许MeRIP-seq适应于研究其他修饰的RNA类型（如5hmC RNA，[4]。

参考文献3中所示的MeRIP-seq流程示意图

miCLIP. m6A单个核苷酸分辨率交联和免疫沉淀（miCLIP）是为了解决MeRIP-seq方法在单个核苷酸分辨率下绘制m6A RNA位点的缺点[5]。 该方法的主要特点是将免疫沉淀的RNA片段与捕获抗体进行紫外交联。 蛋白酶K处理后，RNA上交联位点的抗体残留物在cDNA合成过程中诱发标志性突变（截断和C→T转换），这些突变可以通过测序识别，并用于更精确地绘制特定的m6A位置。 这些抗体诱导的突变特征也被成功地应用于m6Am RNA修饰的绘图。

参考文献5中所示的miCLIP流程示意图

PA-m6A-seq。 光交联辅助m6A测序（PA-m6A-seq）是一种基于紫外线的替代策略，用于高分辨率（~23 nt）的全转录组m6A绘图[6]。 这种方法采用光敏核苷交联剂来诱导m6A定位的标志性突变，类似于miCLIP。 尿苷类似物4-硫尿苷（4SU）被纳入样本RNA中。 然后用抗m6A抗体免疫沉淀全长的、未破碎的、4SU标记的RNA分子，并应用紫外线照射以在m6A结合的抗体和邻近的4SU之间建立共价交联。 交联的RNA用RNase T1消化，得到约30 nt长的片段，进一步处理后进行文库制备和测序，由此可以鉴定与m6A位点相邻的交联产生的T→C转换。

参考文献6中所示的PA-m6A-seq协议示意图。

已有的用于表观转录体范围内的m6A图谱的方法，如MeRIP-seq、PA-m6A-seq和miCLIP，要么被广泛使用，但无法实现m6A图谱的高分辨率，即使提高了图谱的分辨率，但仍存在可重复性差和过程复杂的问题。 特别是，它们很耗时（>2天），而且成本很高。 为了解决这些问题，IVDSHOW联合开发了一种新的方法：使用核酸酶进行m6A富集的靶下裂解和释放（CUT&RUN m6A MeRIP）[7-16]。 这种创新的方法结合了MeRIP-seq和miCLIP的优点和专有的技术，实现了更高程度的富集、较少的样本投入、更低的背景，以及更快、更简化的程序。 m6A RNA甲基化片段富集试剂盒（qPCR版），即MeRIP试剂盒使用先进的RNA裂解酶组合，同时对免疫捕获的RNA进行破碎，并裂解/去除目标含m6A序列两端的任何RNA序列，而不影响被抗体吸附的RNA区域。 因此产生的短RNA片段只与m6A抗体结合。 因此，真正的目标m6A富集区可以被可靠地识别，并可实现高分辨率绘图。

用m6A RNA甲基化片段富集试剂盒（qPCR版）处理的样品的m6A峰分布与已发表的数据中显示的预期区域有很好的相关性（插图；见文献3）。

参考文献:

1. Zaccara S, Ries RJ, Jaffrey SR. Reading, writing and erasing mRNA methylation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(10):608-624. doi:10.1038/s41580-019-0168-5
2. Hastings MH. m(6)A mRNA methylation: a new circadian pacesetter. Cell. 2013;155(4):740-741. doi:10.1016/j.cell.2013.10.028
3. Meyer KD, Saletore Y, Zumbo P, Elemento O, Mason CE, Jaffrey SR. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 2012;149(7):1635-1646. doi:10.1016/j.cell.2012.05.003
4. Delatte B, Wang F, Ngoc LV, et al. RNA biochemistry. Transcriptome-wide distribution and function of RNA hydroxymethylcytosine. Science. 2016;351(6270):282-285. doi:10.1126/science.aac5253
5. Linder B, Grozhik AV, Olarerin-George AO, Meydan C, Mason CE, Jaffrey SR. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 2015;12(8):767-772. doi:10.1038/nmeth.3453
6. Chen K, Lu Z, Wang X, et al. High-resolution N(6) -methyladenosine (m(6) A) map using photo-crosslinking-assisted m(6) A sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 2015;54(5):1587-1590. doi:10.1002/anie.201410647
7. Pan XY, Bi YH, Cheng M, et al. METTL3 facilitates hepatic fibrosis progression via m6A-YTHDF2 dependent silencing of GPR161. Preprint. bioRxiv. 2021; 2021.12.15.472749. Published 2021 Dec 15. doi:10.1101/2021.12.15.472749
8. Huang J, Sun W, Wang Z, et al. FTO suppresses glycolysis and growth of papillary thyroid cancer via decreasing stability of APOE mRNA in an N6-methyladenosine-dependent manner. J Exp Clin Cancer Res. 2022;41(1):42. Published 2022 Jan 28. doi:10.1186/s13046-022-02254-z
9. Zhou T, Chen G, Chen M, et al. Direct Full-Length RNA Sequencing Reveals an Important Role of Epigenetics During Sexual Reversal in Chinese Soft-Shelled Turtle. Front Cell Dev Biol. 2022;10:876045. Published 2022 Mar 25. doi:10.3389/fcell.2022.876045
10. Ji X, Sun W, Lv C, et al. ALKBH5-induced circRNA NRIP1 promotes glycolysis in thyroid cancer cells by targeting the miR-541-5p/PKM2 and miR-3064-5p/PKM2 axes. Preprint. Res Sq. 2022;rs.3.rs-1493404. Published 2022 Apr 4. doi:10.21203/rs.3.rs-1493404/v1
11. Chen YH, Jiang T, Fan BY, et al. Transcriptome-wide N6-methyladenosine methylome profiling of Bombyx mori reveals a potential mechanism of epigenetic regulation on diapause. Preprint. Res Sq. 2022;rs.3.rs-1561012. Published 2022 Apr 18. doi:10.21203/rs.3.rs-1561012/v1
12. Xu C, Huang H, Zhang M, et al. Methyltransferase-Like 3 Rescues the Amyloid-beta protein-Induced Reduction of Activity-Regulated Cytoskeleton Associated Protein Expression via YTHDF1-Dependent N6-Methyladenosine Modification. Front Aging Neurosci. 2022;14:890134. Published 2022 Apr 25. doi:10.3389/fnagi.2022.890134
13. Wang X, Lu X, Wang P, et al. SRSF9 promotes colorectal cancer progression via stabilizing DSN1 mRNA in an m6A-related manner. J Transl Med. 2022;20(1):198. Published 2022 May 4. doi:10.1186/s12967-022-03399-3
14. Zhao TV, Hu Z, Ohtsuki S, et al. Hyperactivity of the CD155 immune checkpoint suppresses anti-viral immunity in patients with coronary artery disease. Nat Cardiovasc Res. 2022;1:634–648. Published 2022 Jul 13. doi:10.1038/s44161-022-00096-8
15. Li W, Xing C, Bao L, et al. Comprehensive analysis of RNA m6A methylation in pressure overload-induced cardiac hypertrophy. BMC Genomics. 2022;23(1):576. Published 2022 Aug 11. doi:10.1186/s12864-022-08833-w
16. Chen D, Fu L, Su T, et al. N6-methyladenosine methylation analysis reveals transcriptome-wide expression response to salt stress in rice roots. Environ Exp Bot. 2022;201:104945. Published 2022 Sept. doi:10.1016/j.envexpbot.2022.104945