EZH2抑制使多药耐药B细胞淋巴瘤对依托泊苷介导的细胞凋亡重新敏感
发布时间：
2026-01-18 15:25
EZH2抑制使多药耐药B细胞淋巴瘤对依托泊苷介导的细胞凋亡重新敏感
Matthew Smonskey1, Elena Lasorsa1, Spencer Rosario , Jason S. Kirk1, Francisco J. Hernandez-Ilizaliturri2, Leigh Ellis
美国纽约州布法罗市罗斯威尔帕克癌症研究所药理学与治疗学系
美国纽约州布法罗市罗斯威尔帕克癌症研究所医学系
美国纽约州布法罗市纽约州立大学分子药理学与癌症治疗学系
通信作者:Leigh Ellis，邮箱:Leigh.Ellis@roswellpark.org
关键词:淋巴瘤；EZH2；依托泊苷；治疗；表观遗传学
收稿日期:2015年12月10日；录用日期:2016年1月22日；发表日期:2016年1月29日
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摘要
重新激活凋亡途径是治疗耐药性B细胞淋巴瘤患者的一种有吸引力的策略。肿瘤抑制因子p53对于对用于治疗侵袭性B细胞淋巴瘤的多种DNA损伤剂的凋亡反应至关重要，包括依托泊苷。已经证明，依托泊苷诱导的DNA损伤和治疗效果通过与组蛋白甲基转移酶zeste同源物2(EZH2)抑制剂联合使用而增强。此外，已确定EZH2可调节细胞对DNA损伤的命运决定。使用对依托泊苷诱导的细胞死亡具有抗性的B细胞淋巴瘤细胞系；我们表明p53显著下调，而p53的负调节因子MDMX显著上调。然而，这些细胞系仍然对依托泊苷介导的DNA损伤有反应，并表现出细胞周期抑制和衰老诱导。此外，EZH2的化学抑制将DNA损伤导向与MDMX和BCL-X_缺失相关的主要p53依赖性凋亡反应。这些数据证实了EZH2在决定DNA损伤后的细胞命运中的作用，并为侵袭性治疗耐药性B细胞淋巴瘤患者提出了一种新的治疗策略。
引言
肿瘤抑制因子TP53(p53)在包括B细胞淋巴瘤在内的多种癌症中失活或突变[1]。p53对DNA损伤的反应通常通过激活参与细胞周期停滞、衰老和凋亡相关的基因来发生[2]。像依托泊苷这样的基因毒性化疗药物通过p53-DNA损伤信号传导介导治疗效果。依托泊苷是与利妥昔单抗联合用于治疗侵袭性B细胞淋巴瘤的多种基因毒性化疗选择之一。不幸的是，治疗失败后，进一步的治疗选择有限；因此需要新的治疗方向。
在患者中使用基因毒性化疗未能实现临床反应，部分原因可能是p53诱导衰老而非凋亡。多项研究表明，p53介导的衰老损害了各种癌症对化疗的凋亡反应[3-6]，导致化疗耐药和患者对这类疗法的反应有限。最近，多梳蛋白zeste同源物2(EZH2)被证明可调节癌细胞对DNA损伤的命运[7]。EZH2是一种组蛋白甲基转移酶，在各种人类癌症中经常过度表达。从机制上讲，EZH2催化组蛋白H3赖氨酸27(H3K27me3)的三甲基化，导致基因抑制，其作用与细胞增殖、凋亡和衰老有关[8]。
此前，我们的研究表明依托泊苷与EZH2抑制具有显著的联合效应，在致命性前列腺癌模型中导致细胞凋亡增加，并伴有持续的DNA损伤[9]。此外，独立研究证实了这种联合在具有BRG1或EGFR突变的非小细胞肺癌模型中的优势[10]。
本研究调查了两种独立的多药耐药B细胞淋巴瘤模型对依托泊苷的p53反应。我们证明，对多药耐药B细胞淋巴瘤进行依托泊苷治疗会导致p53激活和DNA损伤，这与细胞周期停滞和衰老的诱导有关。在多药耐药B细胞淋巴瘤中抑制EZH2会使依托泊苷介导的DNA损伤反应转向与MDMX和BCL-X表达缺失相关的p53依赖性凋亡反应。这些数据拓宽了依托泊苷和EZH2抑制剂联合作为侵袭性B细胞淋巴瘤新型治疗策略的相关性和实用性。
结果
多药耐药B细胞淋巴瘤对依托泊苷介导的细胞死亡反应降低，伴有p53和MDMX表达异常
先前已证明，B细胞淋巴瘤细胞系RL和Raji反复暴露于利妥昔单抗会诱导产生利妥昔单抗耐药表型(RL-4RH和Raji-4RH)[11]。令人惊讶的是，RL-4RH和Raji-4RH细胞系对多种具有不同作用机制的化疗药物表现出显著耐药性。有趣的是，它们对p53依赖性DNA损伤剂依托泊苷产生了获得性耐药。Olejniczak等人[11]证明，RL-4RH和Raji-4RH细胞系在 时仍对依托泊苷介导的凋亡具有耐药性。用递增浓度的依托泊苷处理亲本及耐药的RL和Raji细胞系，证实耐药性与剂量无关(图1A和1C)。由于观察到对依托泊苷介导的细胞死亡具有耐药性，我们研究了依托泊苷是否仍能诱导DNA损伤。用低剂量依托泊苷(10μM)处理Raji 4RH细胞系会导致显著水平的DNA损伤，当与EZH2抑制剂GSK126联合使用时，这种损伤也能维持(图1B)。依托泊苷的作用机制是p53依赖性的；因此，p53及其调节因子的状态值得关注。与各自的亲代细胞系相比，RL-4RH和Raji-4RH细胞系中p53 mRNA和蛋白的基础表达显著降低。此外，与每个亲代相比，在Raji-4RH中观察到p53表达的负调节因子MDMX mRNA增加，但在RL-4RH中未观察到，不过在每个耐药细胞系中MDMX蛋白水平均显著增加(图1D - 1F)。这些数据表明，对依托泊苷介导的凋亡的耐药性部分是通过MDMX - p53信号轴的调节获得的。
图1:A. 用所示浓度的依托泊苷处理Raji和Raji-4RH细胞系72小时。通过碘化丙啶摄取测定细胞死亡，并通过流式细胞术进行定量。B. 通过蛋白质印迹法评估Raji-4RH细胞的组蛋白提取物中p - 的水平。总组蛋白H3用作上样对照。C. 用所示浓度的依托泊苷处理RL和RL-4RH细胞系7小时。通过碘化丙啶摄取测定细胞死亡，并通过流式细胞术进行定量。D - E. 通过实时PCR评估Raji、Raji 4RH、RL和RL 4RH细胞系中基线MDMX和Tp53 mRNA表达。GAPDH用作参考管家基因。F. 使用Raji、Raji 4RH、RL和RL 4RH全细胞裂解物通过蛋白质印迹法评估MDMX和Tp53的基线蛋白表达。GAPDH用作上样对照。G - H. 用 依托泊苷处理Raji、Raji 4RH、RL和RL 4RH细胞系24小时，并通过实时PCR评估Tp53和p21 mRNA表达。GAPDH用作参考管家基因。细胞死亡和PCR实验代表3个独立实验的平均值 SEM。
多药耐药B细胞淋巴瘤对依托泊苷表现出p53 - p21反应，与 停滞和细胞衰老增加相关
虽然RL-4RH和Raji-4RH细胞系对依托泊苷介导的细胞凋亡具有抗性，但尚不清楚p53是否仍具有功能，以及对包括细胞周期停滞和衰老在内的所有p53介导机制的抗性是否被消除。用 依托泊苷处理72小时后，Raji-4RH细胞中p53 mRNA和p53靶基因p21显著增加(图1G)。RL-4RH细胞中p53 mRNA没有显著增加，尽管p21表达仍增加，表明可能存在p53活性(图1H)。进一步分析表明，处理后RL-4RH和Raji-4RH细胞系在 期细胞周期停滞显著增加(图2A)，细胞增殖减少(图2B)，衰老增加(图2C)。总体而言，这些数据表明，RL-4RH和Raji-4RH细胞系中p53对依托泊苷信号的反应仍然活跃。
靶向EZH2导致细胞死亡和H3K27me3缺失
最近，EZH2已成为多种癌症(包括侵袭性B细胞淋巴瘤)的高度优先治疗靶点。此外，已证明EZH2在响应DNA损伤时决定细胞命运，并且依托泊苷与EZH2抑制剂联合使用可引发强大的抗肿瘤活性[9,10]。用浓度递增的EZH2抑制剂GSK126 [12]处理RL-4RH和Raji-4RH细胞14天，结果显示两种细胞系之间细胞膜完整性的丧失相似(图3A - 3B)。有趣的是，在GSK126的非细胞毒性和细胞毒性浓度(2μM对 )之间，H3K27me3的抑制作用相同，且两种细胞系中EZH2蛋白均未丢失(图3C - 3D)。这些数据表明，多药耐药B细胞淋巴瘤对EZH2抑制剂保持敏感性，并且GSK126诱导的细胞毒性与EZH2组蛋白甲基转移酶活性无关。
图2:用10μM依托泊苷处理Raji 4RH和RL 4RH细胞系72小时，并通过以下方法进行评估:A. 通过流式细胞术检测细胞周期，B. 通过MTS测定法检测细胞增殖，C. 通过检测β - 半乳糖苷酶活性检测衰老。所有实验均为3次独立实验的平均值±SEM。 *p<0.05。
EZH2抑制与依托泊苷联合治疗导致p53持续表达以及与MDMX和BCL - X 表达抑制相关的DNA损伤
先前，我们的研究及其他研究已证明依托泊苷与EZH2抑制剂联合使用具有更强的抗肿瘤活性[9, 10]。因此，研究这种联合用药在这些多药耐药B细胞淋巴瘤模型中的潜力具有很高的研究价值。我们的数据图2表明，p53仍可通过细胞周期阻滞和衰老增加对依托泊苷治疗产生反应。据此，我们进一步分析了长期(11天)药物暴露后p53、EZH2和MDMX的反应。蛋白质免疫印迹分析表明，依托泊苷单药治疗以及与GSK126联合使用均能同等程度地诱导p53蛋白表达(图4A)。通过短期和长期药物处理(第3天与第11天)后p-γH2AX表达分析Raji-4RH细胞中的DNA损伤，结果表明依托泊苷单药治疗和联合治疗均能诱导相似水平的DNA损伤，且两种治疗方法随时间推移均能同等程度地维持这种损伤(图4B)。与p53蛋白表达持续存在一致的是，p21 mRNA表达增加。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21是已知的p53检查点激活和衰老的主要基因靶点及介质[13, 14]。在两种细胞系中，GSK126处理均显著增加p21 mRNA，但未激活细胞衰老(图4C - 4D)。依托泊苷治疗显著增加p21 mRNA，这是由于p53对依托泊苷产生反应所致。联合治疗时p21 mRNA也会显著增加(图4C)。与p21表达增加一致，依托泊苷和联合治疗也能使衰老显著增加(图4D)，与对照和GSK126处理的细胞相比，这与EZH2蛋白表达缺失有关(图4E)。如图1所示，RL - 4RH和Raji - 4RH中MDMX蛋白表达显著上调。治疗11天后，GSK126处理似乎对MDMX蛋白表达影响不大。单独使用依托泊苷确实降低了MDMX水平，但联合治疗对MDMX蛋白表达的降低作用最大(图4F)。此外，观察到与其他治疗组相比，联合治疗可降低抗凋亡蛋白BCL - X_的表达(图4F)。这些数据表明，虽然长期治疗保留了p53 - p21衰老信号，但联合治疗可增强对调节表观遗传基因调控、p53信号传导和细胞凋亡的关键蛋白的抑制作用。
图3:用指定浓度的GSK126处理Raji 4RH和RL 4RH细胞系14天。A. 通过碘化丙啶摄取测定细胞死亡，并通过流式细胞术进行定量。B. 用指定浓度的GSK126处理Raji 4RH和RL 4RH细胞系48小时。分别通过蛋白质免疫印迹法使用组蛋白提取物和全细胞裂解物评估H3K27me3和EZH2的蛋白表达。总组蛋白H3和GAPDH分别用作上样对照。细胞死亡实验代表3个独立实验的平均值 SEM。
依托泊苷与EZH2抑制联合使用可增强多药耐药B细胞淋巴瘤的凋亡反应
如图1和图2所示，依托泊苷处理RL - 4RH和Raji - 4RH细胞诱导凋亡无效，不过能够介导细胞周期阻滞并增加细胞衰老。此外，图4表明联合治疗有潜力有效促进p53表达和信号活性，同时使EZH2和MDMX表达缺失。虽然联合治疗仍能显著促进p21和衰老，但有必要确定联合治疗与单药治疗相比的总体凋亡反应。我们评估了RL - 4RH和Raji - 4RH细胞在接受单药和联合治疗14天后的凋亡反应(图5)。在所研究的治疗组中， 浓度的依托泊苷单药暴露足以在两种细胞系中适度增加凋亡标志物，包括线粒体膜电位丧失、磷脂酰丝氨酸细胞表面暴露增加和DNA片段化(图5A - 5F)。令人兴奋的是，涉及非细胞毒性浓度的GSK126(2μM)与 依托泊苷的联合治疗导致两种细胞系中所有凋亡指标均显著总体增加(图5A - 5F)。这些结果证实EZH2是细胞对治疗诱导的p53 - DNA损伤反应的主要决定性效应因子。
图4:将Raji 4RH和RL 4RH细胞系按所示处理11天。A. 使用全细胞裂解物进行蛋白质免疫印迹分析以评估p53蛋白表达。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作上样对照。B. 使用组蛋白提取物进行蛋白质免疫印迹分析以评估磷酸化γH2AX(p-γH2AX)蛋白表达。总组蛋白H3用作上样对照。C. 使用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)评估p21信使核糖核酸(mRNA)表达。GAPDH用作看家参考基因。D. 通过检测β-半乳糖苷酶( -galactosidase)活性评估细胞衰老。E - F. 使用蛋白质免疫印迹分析评估EZH2、MDMX和BCL-X 蛋白表达。GAPDH用作上样对照。PCR实验代表3个独立实验的平均值 标准误(SEM)。*p<0.05。
联合治疗诱导的细胞凋亡依赖于p53
先前有报道称，EZH2抑制使DNA损伤反应导向一种独立于p53的细胞凋亡 [7]。为了对此进行研究，我们使用了Eμ-myc B细胞淋巴瘤细胞系 [15]。如预期的那样，图6A显示，暴露3天的Eμ-myc淋巴瘤对依托泊苷诱导的细胞凋亡高度敏感，无论是作为单一药物还是与GSK126联合使用。GSK126单一药物活性对诱导Eμ-myc淋巴瘤细胞凋亡的作用极小(图6A)。缺乏 的Eμ-myc淋巴瘤保留野生型p53，尽管由于泛素连接酶活性导致p53蛋白酶体降解增加，其表达受到抑制 [16]。因此，在3天药物暴露后，依托泊苷及其联合用药在诱导Eμ-myc/p194r-1/淋巴瘤细胞凋亡方面具有显著效果(图6B)。在Eμ-myc/p53^-淋巴瘤中删除p53导致依托泊苷及其联合用药诱导的细胞凋亡完全消除。这些数据表明，GSK126和依托泊苷联合诱导的细胞凋亡依赖于p53活性。
讨论
依托泊苷是与利妥昔单抗联合用于治疗侵袭性B细胞淋巴瘤的多种基因毒性化疗药物之一。不幸的是，一旦对这些治疗产生耐药性，目前没有可用的治疗策略，这突出表明迫切需要确定新的治疗选择。对治疗的耐药性通常涉及肿瘤细胞对细胞凋亡反应的减弱或抑制。机制包括抗凋亡蛋白如 的过度表达以及肿瘤抑制蛋白p53的表达/功能丧失。恢复p53活性的治疗方法是一种引人关注的方法，最近临床试验的成功重新激发了基于p53的癌症治疗的热情，即通过靶向MDM2 - p53和MDMX - p53界面。恢复p53活性的复杂性在于，要使p53实现所需的细胞反应，以介导对DNA损伤的细胞凋亡。p53对DNA损伤的反应通常通过激活参与细胞周期停滞、衰老和细胞凋亡的基因来发生。有趣的是，多项研究表明，p53介导的衰老会损害各种癌症中对化疗的细胞凋亡反应 [3 - 6]，导致化疗耐药以及患者对这类治疗的反应有限。
图5:将Raji 4RH和RL 4RH细胞系按所示处理14天。A - F. 通过四甲基罗丹明乙酯(TMRE)的流式细胞术分析、磷脂酰丝氨酸表面暴露(膜联蛋白V染色)与碘化丙啶摄取以及细胞周期分析(亚G 分析)评估细胞凋亡。所有实验代表3个独立实验的平均值 标准误(SEM)。*p<0.05。
先前的研究表明，组蛋白甲基转移酶EZH2是细胞对DNA损伤作出反应时细胞命运的关键调节因子。抑制EZH2会导致细胞凋亡，而不是在对包括依托泊苷在内的基因毒性药物诱导的DNA损伤作出反应时导致细胞周期停滞[7]。我们的数据与这些结果一致，因为我们表明，对耐药B细胞淋巴瘤细胞系进行单次依托泊苷处理会诱导与细胞周期停滞和衰老相关的DNA损伤。此外，GSK126抑制EZH2并联合依托泊苷处理改变了细胞对凋亡的反应，支持了EZH2在决定细胞对DNA损伤反应中的细胞命运方面的机制作用。
一个重要的p53靶基因是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21，它控制着处于衰老或凋亡状态的细胞的初始细胞周期停滞[13]。此外，p21被认为对p53介导的凋亡起负调节作用[13]。我们的结果表明，正如预期的那样，短期依托泊苷处理后p21有明显反应。然而，长期分析依托泊苷或GSK126处理后的结果显示，单次依托泊苷处理和联合处理均导致p53-p21持续表达。如前所述，p53-p21轴的持续表达与通过激活Rb-E2F1途径诱导的DNA损伤相关的细胞周期停滞和衰老密切相关[13]。这与p53无法启动其凋亡信号通路同时发生。我们的数据表明，依托泊苷单次处理和联合处理均导致p53-p21持续表达并伴有衰老。然而，联合处理显著增加了RL-和Raji-4RH细胞系中的凋亡反应。这些数据表明，EZH2确实显著控制细胞对DNA损伤的反应。p53的促凋亡靶标包括仅含BH3结构域的蛋白PUMA和NOXA。这两个靶基因的表达分析显示，任何处理后均无显著变化(数据未显示)，表明抑制EZH2改变细胞对依托泊苷介导的DNA损伤反应的能力是通过其他机制实现的。Wu等人描述，要么是FBXO32介导的p21蛋白酶体降解，要么是CHK1抑制，解释了EZH2在细胞对DNA损伤反应中决定细胞命运的潜在调节作用[7]。我们的结果未研究FBXO32的相对表达，尽管如上所述，我们长期暴露于依托泊苷及联合处理后的实验确实表明p21表达得以维持。本研究与Wu等人观察到的p21反应差异可能取决于背景，因为研究的是不同的癌症模型。
先前的研究表明，RL-和Raji-4RH多药耐药细胞系显示出涉及内在凋亡途径的异常[17]。与亲代细胞系相比，耐药细胞系显示促凋亡蛋白BAK和BAX缺失，以及抗凋亡蛋白BCL-X 增加[17]。已知这三种蛋白在凋亡过程中作用于线粒体完整性。此外，我们的数据表明，依托泊苷和GSK126联合处理显著增加了线粒体损伤。由于EZH2通过H3K27me3使基因表达沉默，我们评估了所有处理后BAK和BAX的反应，尽管两个靶标均未升高(数据未显示)，表明这些基因表达的缺失与EZH2无关。先前已证明，BCL-2和BCL-X 对线粒体损伤的保护作用可诱导生长停滞或衰老，同时抑制化疗后的凋亡。Hayward等人[18]先前的一项研究还表明，BCL-X 在拓扑异构酶I抑制剂伊立替康处理后抑制p53依赖性凋亡。最近，BCL-X 表达增加介导了B细胞淋巴瘤的治疗耐药性。BCL- 表达通过一种微小RNA(miR)表观遗传机制调节。在miR-377去抑制并同时BCL-X表达缺失后，凋亡反应得以恢复[19]。我们的数据还表明，BCL-X_蛋白表达的缺失与联合处理后凋亡反应增加相关，这表明EZH2可能通过表观遗传机制调节BCL-X 。
图6:Eμ-myc、E-myc/p194/>和Eµ-myc/p53 小鼠B细胞淋巴瘤按所示处理72小时。A - C。通过磷脂酰丝氨酸表面暴露(膜联蛋白V染色)与碘化丙啶摄取的流式细胞术分析评估细胞凋亡。结果代表3个独立实验的平均值 标准误。
最显著的是，我们观察到与各自的亲本细胞系相比，RL和Raji - 4RH细胞系中MDMX蛋白表达显著增加。MDMX是MDM家族的一部分，作为p53表达和功能的关键抑制剂发挥作用[20]。DNA损伤时，MDMX蛋白稳定性由MDM2调节，MDM2诱导MDMX蛋白酶体降解[20]。在我们的实验中，依托泊苷单药处理导致MDMX蛋白表达丧失，联合处理进一步增强了这种作用。该数据还表明MDMX蛋白的调节涉及DNA损伤下游的表观遗传调节。
由于化疗伴随的毒副作用，一种将DNA损伤反应导向细胞凋亡并允许降低化疗剂量的联合治疗方法对患者将有很大益处。总体而言，我们证明在B细胞淋巴瘤多药耐药模型中，组蛋白甲基转移酶EZH2的抑制调节了对基因毒性化疗的细胞命运决定。此外，该数据表明了新的信息，即分别作为凋亡和p53信号重要调节因子的BCL - X和MDMX部分受EZH2的表观遗传调节。最终，这些结果为将基因毒性疗法与EZH2抑制剂联合作为侵袭性治疗耐药B细胞淋巴瘤患者的新型治疗策略提供了令人兴奋的潜力。
材料与方法
Eμ-myc、Eμ-myc/p53 和Eμ-myc/p19/rf - B细胞淋巴瘤由Ricky Johnstone博士惠赠。Eμ-myc淋巴瘤在补充有10%胎牛血清、青霉素/链霉素、 L - 天冬酰胺和 2 - 巯基乙醇的高糖DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基)中于6孔板中培养，置于 湿度培养箱中。人B细胞淋巴瘤细胞系(RAJI - 4RH和RL - 4RH)由Francisco Hernandez - Ilizaliturri博士惠赠，并在标准条件下( 5%二氧化碳)于补充有10% FBS和青霉素/链霉素的RPMI(罗斯韦尔公园纪念研究所)1640培养基中培养。依托泊苷(西格玛 - 奥德里奇公司)和GSK126(Xcess生物科学公司)分别以 和 的储备浓度保存在DMSO中。
体外细胞死亡和增殖测定
将细胞接种到24孔板中，终浓度为 个细胞/孔。次日，以所示浓度加入选定的化合物。根据制造商的说明，通过碘化丙啶(PI)摄取(西格玛奥德里奇公司)、膜联蛋白V染色(BD Pharmigen)、细胞周期分析或四甲基罗丹明乙酯(TMRE)染色(西格玛奥德里奇公司)进行活力测试。使用根据制造商说明制备的MTS试剂(普洛麦格公司)进行增殖测定。根据制造商的说明使用衰老检测试剂盒(Biovisions Incorporated)测定衰老。
定量实时PCR
通过TRIzol提取法从细胞系中分离RNA。根据iScript cDNA合成试剂盒(美国伯乐公司， Hercules)进行cDNA合成。将1μg RNA加入到含有无核酸酶的 以及试剂盒中的试剂(5X iScript反应混合物 + iScript逆转录酶)的主混合物中，总体积为 。在进行qRT-PCR之前，将cDNA按1:4稀释。使用NCBI的引物设计工具(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计PCR引物，熔解温度为 ，所得产物大小为75 - 200bp。引物购自Integrated DNA technologies(美国科拉尔维尔)。引物序列如下:MDMX(正向:TGGAAGGACGGGCCATCT，反向:TGCTATAAAAACCTT AATAACCAGCTGAA)，TP53(正向:CACATGACGGAGGTTGTG，反向:ACACGCAAATTTCCTTCCAC)，P21(正向:GACCTGTCACTGTCTTGTA，反向:CCTCTTGGAGAAGATCAGCCG)和GAPDH(正向:GTCTTCACCACCATGGAGAAG，反向:CAAAGTTGTCATGGATGACCTTGG)。每个PCR反应在 体积中使用SYBR Green主混合物(美国伯乐公司， Hercules)进行技术重复。使用GAPDH作为对照基因。将每个基因的所得Ct值标准化为GAPDH的表达值。
蛋白质免疫印迹法及抗体
全细胞裂解物制备(WCL):收集细胞，并用RIPA缓冲液(美国西格玛奥德里奇公司)+ 1X P - STOP + 1X PIC(罗氏公司)在冰上裂解30分钟。每隔十分钟将艾本德管涡旋10秒。细胞裂解后，在 下以13,000 rpm离心15分钟。收集每个管的上清液并转移到新管中。
组蛋白提取:使用Epigentek(EpiQuik总组蛋白提取试剂盒OP - 0006)组蛋白提取试剂盒进行组蛋白提取。
通过考马斯亮蓝蛋白测定法(美国伯乐公司)测量全细胞裂解物(WCL)和组蛋白提取物的蛋白质浓度。使用4 - 15%的SDS - PAGE凝胶(美国伯乐公司)分离蛋白质裂解物(50μg WCL，5μg组蛋白提取物)。通过半干转印法(美国伯乐公司， Hercules)在15V下将蛋白质从SDS - PAGE凝胶转移到硝酸纤维素膜(0.2μm)(美国伯乐公司， Hercules，加利福尼亚州)上35分钟。在室温下，将膜在5%脱脂牛奶或0.1%吐温 - PBS(tPBS)中的BSA中封闭1小时。在 下用tPBS短暂洗涤膜 后，与一抗孵育过夜。然后在加入用tPBS稀释的辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗(美国伯乐公司， Hercules，加利福尼亚州)之前，将膜洗涤 分钟。在室温下振荡孵育1小时后，将膜在tPBS中洗涤 分钟。通过使用ECL检测试剂(英国通用电气医疗集团生命科学部)的增强化学发光法观察免疫反应条带。将印迹膜曝光于生物膜1秒 - 10分钟。然后在柯达胶片显影剂中显影胶片。为了估计条带的分子量，使用预染蛋白梯度(美国伯乐公司， Hercules，加利福尼亚州)。以下一抗用于蛋白质免疫印迹法:Tp53(细胞信号转导公司)，MDMX(ProteinTech)，EZH2(细胞信号转导公司)，H3K27me3(细胞信号转导公司)，总组蛋白H3(细胞信号转导公司)，GAPDH(细胞信号转导公司)。每个蛋白质免疫印迹数据已在至少两个生物学独立实验中得到证实。
致谢
本研究得到了罗斯韦尔公园癌症研究所(RPCI)的启动资金(授予LE)以及RPCI癌症中心支持基金(P30CA06156)的支持。我们要感谢RPCI的Cory Mavis和Jenny Gu博士提供有关RL和Raji B细胞淋巴瘤细胞系的知识。我们还要感谢Ricky Johnstone博士(澳大利亚墨尔本彼得·麦卡勒姆癌症中心)提供Eμ-myc B细胞淋巴瘤细胞系。
利益冲突
作者声明无利益冲突。
作者贡献
MS进行研究、分析数据并设计实验，EL、SR和JSK进行研究，FJHI提供重要试剂，LE分析数据、设计实验并撰写稿件。
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B细胞淋巴瘤,依托泊苷,EZH2,GSK126
表观信息
2026-10-14
2026-10-12
2026-10-11
2026-10-11
2026-10-09
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