FEN1对G1期单链断裂的快速修复至关重要
发布时间：
2026-04-29 21:10
FEN1对G1期单链断裂的快速修复至关重要
卡米拉·布尔多娃 ，理查德·海尔斯通 ，哈娜·汉兹利科娃 ，基思·W·卡尔德科特
捷克科学院分子遗传学研究所基因组动力学实验室，捷克共和国布拉格4区142 20 英国萨塞克斯大学基因组损伤与稳定性中心，法尔默，布莱顿BN1 9RQ 瑞士伯尔尼大学兽医学院动物病理学研究所，3012伯尔尼
*通信应寄往此处。电子邮件:k.w.caldecott@sussex.ac.uk
通信也可寄往哈娜·汉兹利科娃。电子邮件:hana.hanzlikova@img.cas.cz
摘要
依赖于瓣状核酸内切酶1(FEN1)的长片段修复一直被认为是DNA单链断裂修复(SSBR)的一个次要子途径，仅在短片段修复不可行时才被激活。然而，长片段修复在活细胞中的重要性仍不清楚。在这里，我们使用缺失FEN1的人RPE - 1细胞来比较快速修复各种类型DNA单链断裂(SSB)的短片段和长片段途径的需求。我们发现，由异常的拓扑异构酶1活性产生的SSB在没有FEN1的情况下也能有效修复。相反，在用甲磺酸甲酯(MMS)处理后或用过氧化氢 处理后在碱基切除修复过程中产生的SSB的快速修复对FEN1表现出出乎意料的高度依赖性。事实上，在G1期，FEN1缺失使SSBR速率减慢的程度与短片段修复蛋白XRCC1或POLβ的缺失相似甚至更大。正如预期的那样，FEN1与XRCC1或POLβ的联合缺失具有累加或协同作用，在MMS或H 暴露后严重减弱SSBR速率。这些数据突出了FEN1在人类细胞中SSB快速修复中出人意料的需求，挑战了长片段修复是SSBR的一个次要子途径的主流观点。
图形摘要
引言
单链断裂(SSB)是细胞中最常见的DNA损伤之一，可直接由脱氧核糖的氧化损伤引起，也可在受损DNA碱基的碱基切除修复(BER)过程中间接产生[1]。此外，SSB可作为对DNA复制和基因转录至关重要的酶促过程的中间体出现，如冈崎片段的成熟、拓扑异构酶的异常活性以及表观遗传重编程过程中5 - 甲基胞嘧啶的去甲基化[1 - 3]。因此，SSB的快速修复对于在与细胞和机体健康相容的水平上维持基因组完整性至关重要。这一点在至少六种遗传性遗传疾病的存在中得到了最好的说明，其中四个单链断裂修复(SSBR)基因之一发生了突变[4]。
收到:2025年2月25日。修订:2025年6月2日。编辑决定:6月2日 这是一篇开放获取文章，根据创作共用协议发布，允许在任何媒介中无限制地重用、分发和复制，只要符合健康要求。
当前模型提出，单链断裂修复(SSBR)通过两种不同的途径进行，即短片段修复和长片段修复[4-6]。短片段修复涉及在损伤位点替换单个核苷酸，通常由DNA聚合酶 进行，而长片段修复涉及通过POL 和/或DNA聚合酶 (POL )的作用替换 个核苷酸[7-14]。短片段修复由与支架蛋白XRCC1相互作用的蛋白质介导，包括脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、多核苷酸激酶磷酸酶(PNKP)、POL 和DNA连接酶III[7,15-19]。相比之下，长片段修复由与增殖细胞核抗原(PCNA)相关的蛋白质促进，如POLδ、翼状核酸内切酶1(FEN1)和DNA连接酶I[11-13,20-23]。长片段修复的一个决定性特征是FEN1的参与，它负责去除长片段缺口填充过程中产生的 单链翼片[13,20]。
早期的生化研究发现，短补丁修复是碱基切除修复的主要子途径，占碱基切除修复反应的70%以上[24 - 26]。然而，后来的研究报告称，长补丁碱基切除修复发生的频率与短补丁修复相似或更高[27, 28]。影响这些途径之间平衡的一个因素是细胞类型。例如，从人诱导多能干细胞分化而来的肌肉细胞在活跃的胞嘧啶去甲基化过程中主要采用短补丁碱基切除修复，而在分化的神经元中，短补丁和长补丁碱基切除修复都很常用[29, 30]。影响子途径选择的另一个因素是单链断裂处 -末端的化学性质[31]。例如，在碱基切除修复过程中，双功能DNA糖基化酶会产生具有典型 -磷酸的 -末端，这使得在单核苷酸缺口填充后能够快速连接，从而有利于短补丁修复。相比之下，单功能DNA糖基化酶会产生 -无碱基位点，这些位点需要通过POLβ的脱氧核糖磷酸二酯酶(dRpase)活性进行切除[32]，这可能会增加单链断裂的半衰期以及更长修复补丁的机会。事实上，还原或氧化的 -无碱基位点对dRpase活性具有抗性，只能通过长补丁修复来修复[24, 32, 33]。最后，由氧化脱氧核糖的氢提取和分解产生的“直接”单链断裂的修复可以通过短补丁或长补丁修复来实现[14, 18]。
在这里，我们使用了缺失FEN1和/或XRCC1或POL 的人类细胞，分别研究长补丁修复和短补丁修复对活细胞中不同类型单链断裂快速修复的相对贡献。我们的研究结果表明，FEN1对单链断裂修复率的影响比之前预期的要大得多，这挑战了长补丁修复是一个次要子途径的观点。
材料与方法
细胞系、细胞培养、化学试剂和抗体
人野生型hTERT RPE-1细胞(记为RPE-1)、U2OS细胞和FEN1缺失衍生物(FEN1-/- RPE-1克隆#21/6；FEN1- U2OS克隆#6；记为koFEN1)先前已有描述[34]。HEK293 Flp-In™ T-REx™购自赛默飞世尔科技公司。细胞在补充有10%血清和青霉素/链霉素的DMEM/F-12或DMEM培养基(Gibco)中，于 、 和 氧气条件下培养生长。定期检测细胞是否受支原体污染。为使RPE-1细胞同步进入G0/G1期，将其培养至汇合状态，并在完全培养基中保持汇合3天，随后在低血清培养基中孵育3天。为诱导DNA单链断裂，细胞在完全培养基中于 用 喜树碱(CPT)或0.1 mg/ml甲磺酸甲酯(MMS)处理指定时间，或在无血清培养基中于冰上用 过氧化氢 处理 。CPT、MMS和 购自西格玛奥德里奇公司(分别为C9911、129925和H1009)。PARP抑制剂奥拉帕尼(S1060；Selleck Chemicals)的终浓度为 。一抗和二抗见补充表S1。
如先前所述[34 - 36]，使用CRISPR/Cas9质粒对hTERT RPE-1细胞进行基因编辑。对于POL 敲除细胞(POL RPE-1克隆#9；记为koPOL )，gRNA序列为GGC-CGCCATGAGCAAACGGA和GCAGCGGGTCGTCTTC-CGTG，通过细胞分选选择克隆分离株，并通过蛋白质印迹法验证敲除情况。FEN1/POLβ双敲除细胞(FEN1 RPE-1克隆#2；记为koFEN1/POLβ)在上述FEN1 RPE-1细胞系中构建。
为构建XRCC1敲除的RPE-1细胞(XRCC1 RPE-1克隆#23；记为koXRCC1)，使用合成gRNA(GGUAGAGUAUGGGGUCCGAG和CAGACACUUACC-GAAAAUGG)和重组Cas9蛋白。通过稀释获得克隆分离株，并通过蛋白质印迹法验证敲除情况。FEN1/XRCC1双敲除细胞(FEN1 RPE-1克隆#23；记为koFEN1/XRCC1)在上述FEN1-/- RPE-1细胞系中构建。通过稀释获得的克隆用PCR进行插入基因分型，并通过蛋白质印迹法验证。为在HEK293 FlipIN-TRex细胞中产生FEN1敲除(FEN1-/- HEK293 #克隆23；记为koFEN1)，使用合成gRNA(UGUGGCCCCCAGUGCCAUCC)与Cas9蛋白[34]。通过稀释分离克隆，并通过蛋白质印迹法验证敲除情况。
FEN1的纯化及蛋白质转染
His标签的野生型和催化失活的FEN1(R100A)在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中通过用 异丙基 -D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)在 过夜诱导表达，如先前所述[37,38]。细菌细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(20 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 M NaCl，10 mM咪唑)中，超声处理，并在 以 在 离心。上清液过滤后加载到 HiTrap柱上。柱子用裂解缓冲液和含有 咪唑的裂解缓冲液大量洗涤。蛋白质用洗脱缓冲液 咪唑， Tris-HCl，pH 7.5洗脱，用含有 二硫苏糖醇(DTT)的 稀释，并加载到5 ml HiTrap Q Sepharose上。收集含有FEN1蛋白的流穿液，分装并在使用前保存在 。
为了通过蛋白质转染(蛋白转染)对细胞进行互补，将细胞用胰蛋白酶消化，计数，用PBS洗涤，并重悬于缓冲液R(Neon试剂盒)中。 中100000个细胞的等分试样与 纯化的FEN1蛋白混合，并用Neon 10 μl电穿孔尖端(1350 V/20 ms/2脉冲)进行电穿孔。在彗星试验前，细胞在完全培养基中恢复15分钟。
间接免疫荧光显微镜和sSTRIDE
处理前1天将细胞接种到盖玻片上。处理后，用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，并在冰上用预提取缓冲液(25 mM HEPES，pH 7.4，50 mM NaCl，1 mM EDTA，3 mM MgCl2，0.3 M蔗糖，0.5% Triton X-100)预提取 。然后将细胞在冰上用4%甲醛固定，用冷甲醇/丙酮通透 ，并用PBS中的5% BSA封闭。
对于sSTRIDE [39]，盖玻片在含有5 μM核苷酸(生物素-7-dATP、生物素-16-dCTP、生物素-16-dUTP和dGTP；耶拿生物科学公司)的缓冲液2(NEB)中与DNA聚合酶I(NEB)在湿润箱中于 孵育 。反应通过0.1 M EDTA终止，盖玻片用PBS洗涤。
将一抗用含 的牛血清白蛋白(BSA)在室温下孵育。盖玻片用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，再用含二抗的牛血清白蛋白(BSA)在室温下孵育30 - 60分钟，然后用PBS洗涤三次。用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的PBS孵育5分钟进行细胞核染色。然后盖玻片用 洗涤，空气干燥，并用封片剂封片。使用配备ScanR高内涵模块和UPLXAPO 或UPLXAPO DRY物镜的奥林巴斯IX81显微镜采集图像。DAPI信号用于基于强度的细胞核分割，并对各个通道的总荧光强度进行定量分析。使用FlowJo软件(TreeStar)分析不同细胞群体的信号强度。
碱性彗星试验
细胞用胰蛋白酶消化，并按所述用指定的基因毒素处理。处理后，细胞用冰冷的PBS洗涤，重悬于冰冷的PBS中，并与低熔点琼脂糖 混合后铺在涂有琼脂糖的载玻片上。细胞在裂解缓冲液(2.5M氯化钠、100mM乙二胺四乙酸(EDTA)、10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH10，补充1%二甲基亚砜(DMSO)和1% Triton X - 100)中于 裂解 。然后在碱性电泳缓冲液 (1mM EDTA、1% DMSO，pH>13)中解旋DNA 45分钟。载玻片置于彗星电泳槽(赛默飞世尔科技公司)中，在冷室中于 电泳25分钟。电泳后，载玻片用0.4M Tris(pH7.4)中和15分钟(方案II)或过夜(方案I)，然后用PBS稀释的SYBR Green(西格玛奥德里奇公司)染色。对于方案I，染色后立即使用 物镜和彗星试验IV软件(Perceptive Instruments)对图像进行评分。对于方案II，载玻片用 洗涤三次，空气干燥，使用配备ScanR高内涵模块和UPLSAPO 物镜的奥林巴斯IX81显微镜采集图像。使用CometScore 2.0软件对每个样品至少50个细胞的彗星进行评分。
细胞分级分离
细胞用胰蛋白酶消化，并按所述用指定的基因毒素处理。处理后，细胞用冰冷的PBS洗涤，重悬于补充有蛋白酶抑制剂(罗氏公司)的提取缓冲液( 羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH7.4，150mM氯化钠，1mM EDTA，3mM氯化镁(MgCl2)，0.3M蔗糖，0.5% Triton X - 100)中，在冰上孵育15分钟。孵育后，样品在 以 离心15分钟。染色质沉淀用提取缓冲液洗涤三次，重悬于Laemmli样品缓冲液(2%十二烷基硫酸钠(SDS)，10%甘油，50mM Tris - HCl，pH6.8)中，煮沸并超声处理以进行后续分析。
克隆形成细胞存活试验
将指定的野生型和单/双敲除视网膜色素上皮细胞(RPE - 1)同步到G0/G1期，并以300个细胞/10厘米培养皿的密度接种在完全培养基中。 后，细胞在室温下用指定剂量的甲基磺酸甲酯(MMS)处理30分钟。培养皿用PBS洗涤两次，然后在无药物培养基中培养11天。细胞用乙醇固定，用结晶紫染色，并计数菌落。确定并绘制菌落的相对存活分数。
十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE)和蛋白质印迹法
为制备全细胞提取物，按所述用指定的基因毒素处理细胞，用冰冷的PBS洗涤两次，在Laemmli样品缓冲液(2% SDS、10%甘油、50 mM Tris-HCl，pH 6.8)中裂解，煮沸并超声处理。蛋白质样品通过双-Tris SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶进行分离，并转移到硝酸纤维素膜上。膜在含牛奶的PBS-T中封闭，并在 与一抗孵育过夜。用PBS-T洗涤后，膜与相应的HRP偶联二抗孵育，再次洗涤，并使用ECL底物(GE)和感光胶片(AGFA)显影(Opti-max，Protec)。
统计分析
所有实验至少包含三个独立的生物学重复，并使用GraphPad Prism(GraphPad软件)进行ANOVA统计分析及Sidak或Holm/Sidak事后分析。星号用于表示统计学显著性(*P <.0332，**P <.0021，***P <.0002，****P <.0001)。所有数据以平均值 标准差绘制，仅显示相关的统计学显著性比较。
结果
FEN1促进人类细胞中高效的DNA单链断裂修复
为研究人类细胞中DNA单链断裂修复(SSBR)对FEN1的需求，我们使用通过CRISPR/Cas9编辑产生的FEN1缺失细胞(’koFEN1’)进行碱性彗星试验，在用各种诱导不同类型生理相关DNA单链断裂的基因毒素处理后。首先，我们使用了甲基磺酸甲酯(MMS)，它诱导烷基化的DNA碱基，在碱基切除修复(BER)过程中被脱嘌呤嘧啶内切酶(APE1)转化为单链断裂。在MMS处理期间，FEN1缺失显著增加了异步RPE-1细胞群体中单链断裂的积累，尽管程度小于XRCC1缺失(’koXRCC1’)(图1A)。重要的是，这种表型通过野生型FEN1的蛋白转染得以挽救，但携带核酸酶活性位点突变R100A的催化失活FEN1(CD)则不能(补充图S1A)。在其他人类FEN1缺失细胞系中，包括U2OS [34]和HEK293(补充图S1B和C)，也观察到MMS处理后单链断裂修复的类似缺陷。在用过氧化氢 处理后也得到了类似结果，过氧化氢通过脱氧核糖氧化和断裂直接诱导单链断裂，并作为碱基切除修复的中间体间接诱导单链断裂。事实上，令人惊讶的是，在 后，FEN1缺失细胞中的单链断裂修复速率至少与XRCC1缺失细胞中观察到的一样慢(图1B和补充图S1D)。与MMS和 相反，在用喜树碱(CPT)处理后，FEN1缺失细胞没有积累更高水平的单链断裂，CPT由于拓扑异构酶1(TOP1)活性失败而诱导单链断裂(图1C)。
通过测量ADP核糖基化的稳态水平获得了进一步的证据，支持了在单链断裂修复(SSBR)中对FEN1的需求大于预期，ADP核糖基化是单链断裂(SSB)的间接指标。与碱性彗星试验一致，这些实验表明，在用甲基磺酸甲酯(MMS)处理后，FEN1缺失和XRCC1缺失的RPE - 1细胞中ADP核糖基化蛋白的积累和/或持续时间增加(图1D)。值得注意的是，在MMS处理期间，XRCC1缺失的细胞中ADP核糖的积累比FEN1缺失的细胞快得多(图1D)，这与长片段碱基切除修复(long - patch BER)在MMS处理后比短片段碱基切除修复(short - patch BER)发生的时间更晚一致。之前已经报道过，在MMS处理后期，XRCC1缺失的细胞中ADP核糖基化迅速下降，这反映了由于聚(ADP - 核糖)聚合酶1(PARP1)活性大幅升高导致的 耗尽[40]。在 处理后，FEN1的缺失对ADP核糖基化下降的速率产生了可测量的影响(图1E)。然而，在XRCC1缺失的细胞中没有观察到这种情况，尽管FEN1和XRCC1缺陷的细胞在碱性彗星试验中显示出类似的延迟修复(见上文)。这可能反映了在 处理后，使用全细胞提取物进行蛋白质印迹法测量ADP核糖基化的局限性，因为我们确实通过间接免疫荧光检测到，在XRCC1缺陷的细胞中， 诱导的染色质中ADP核糖基化的下降速率降低(见补充图S3D)。与碱性彗星试验(图1C)一致，在喜树碱(CPT)处理期间，FEN1缺失并没有提高ADP核糖基化的水平(补充图S1E)。
图1. FEN1促进人类细胞中高效的DNA单链断裂修复(SSBR)。(A) 通过碱性彗星试验测量未处理细胞(NT)或在37°C下用0.1 mg/m L MMS处理15分钟后的异步野生型(RPE-1)、FEN1缺失(koFEN1)和XRCC1缺失(koFEN1)的RPE-1细胞中的DNA链断裂情况。(B) 通过碱性彗星试验测量未处理细胞(NT)或在冰上用 过氧化氢(H )处理 ，然后在 释放到无药物培养基中培养指定时间后的异步野生型(RPE-1)、FEN1缺失(koFEN1)和XRCC1缺失(koXRCC1)的RPE-1细胞中的DNA链断裂情况。相对于 处理后立即的值显示尾部矩(绝对尾部矩在补充图S1D中提供)。(C) 通过碱性彗星试验测量未处理细胞(NT)或在37°C下用10或30 μM CPT处理45分钟后的异步野生型(RPE-1)、FEN1缺失(koFEN1)和XRCC1缺失(koXRCC1)的RPE-1细胞中的DNA链断裂情况。(D) 在未处理条件(NT)或在 用 MMS处理指定时间后的野生型(RPE-1)、FEN1缺失(koFEN1)和XRCC1缺失(koXRCC1)的RPE-1细胞中的单和多聚ADP核糖基化蛋白(MAR/PAR)水平。显示FEN1、XRCC1和组蛋白H3的水平作为对照。(E) 在未处理条件(NT)或如面板(B)所述用 处理后的野生型(RPE-1)、FEN1缺失(koFEN1)和XRCC1缺失(koXRCC1)的RPE-1细胞中的单和多聚ADP核糖基化蛋白(MAR/PAR)水平。
为了独立验证FEN1缺失的细胞在用MMS和 处理后表现出单链断裂修复减少，我们进行了sSTRIDE [39]，这是一种基于荧光显微镜的高灵敏度技术，通过 -末端标记直接标记单链断裂。与我们的碱性彗星试验一致，sSTRIDE显示在用MMS处理期间FEN1缺失的细胞中单链断裂的积累明显更多，并且在 处理后单链断裂的下降速率降低(补充图S1F和G)。在用MMS处理后的XRCC1缺失的细胞中观察到类似的结果。有趣的是，sSTRIDE无法检测到XRCC1缺失的细胞中 诱导的单链断裂增加，推测是因为这些细胞具有降低的PNKP 3’-磷酸酶活性[18]，这是将 诱导的 -磷酸末端转化为可以支持末端标记的3’-羟基末端所必需的[39]。
FEN1是细胞周期G1期快速单链断裂修复(SSBR)所必需的
接下来，我们研究了DNA甲基化或DNA氧化后FEN1对快速单链断裂修复(SSBR)的强烈需求是否反映了其在S期的活性，在S期，FEN1和其他长片段修复蛋白在DNA复制中起着至关重要的作用。为了验证这一点，我们首先使用免疫荧光检测了野生型和FEN1缺失的RPE - 1细胞在整个细胞周期中的ADP核糖基化水平。在未处理细胞的异步群体中，与野生型细胞相比，FEN1缺失的细胞在S期表现出更高水平的ADP核糖基化，这与这些细胞中未连接的冈崎片段增加一致(图2A，标记为“NT”的面板)[34, 41]。在 处理后，野生型和FEN1缺失的细胞在所有细胞周期阶段的ADP核糖基化都增加了(图2A和B)。然而，令人惊讶的是， 在 处理后，G1期FEN1缺失的细胞中的ADP核糖基化明显高于野生型细胞(图2A - C和补充图S2A，左面板)。在用甲基磺酸甲酯(MMS)处理后的G1期FEN1缺失的细胞中也观察到了类似的结果(图2D和补充图S2B，左面板)。虽然在MMS和 处理后，FEN1缺失的S期细胞中的平均ADP核糖基化水平也高于野生型S期细胞，但这种差异没有统计学意义，可能受到未连接的冈崎片段的影响(补充图S2A和B，右面板)。为了更好地区分G1期细胞，除了DAPI染色外，我们还进行了MCM2免疫染色。这些实验证实， 在 处理后，FEN1缺失对ADP核糖基化的影响在MCM2阴性(早期G1期)细胞中比在MCM2阳性(晚期G1 /早期S期)细胞中更明显(补充图S2C)。
为了进一步验证FEN1在G1期的重要性，我们通过汇合和血清饥饿诱导生长停滞，使RPE - 1细胞同步于G0 / G1期(图2E和补充图S2D)。与上述实验一致，在用 或MMS处理后，与野生型细胞相比，G0 / G1期停滞的FEN1缺失的细胞表现出明显更高水平和/或更长时间的ADP核糖基化持续存在(图2F和 )。此外，在用 或MMS处理后，当使用碱性彗星试验直接测量SSBR时，在G0 / G1期停滞的FEN1缺失的细胞中观察到明显的缺陷(图2G和I，补充图S2E和F)。这些发现表明，FEN1对于快速的SSBR速率至关重要，特别是在细胞周期的G1期。
FEN1依赖的修复是G1期快速单链断裂修复的主要途径
为了研究短片段和长片段修复在G1期的相对重要性，我们使用了缺乏FEN1和/或短片段修复蛋白POL 或XRCC1的细胞(图3A)。在G1期用MMS处理期间，ADP核糖基化水平在POLβ缺失细胞(’koPOLβ’)中比在FEN1缺失细胞中积累得更快，这与短片段修复比长片段修复更早启动的观点一致(图3B)。通过碱性彗星试验测量，FEN1或POLβ的缺失也导致在G1期15分钟MMS处理期间诱导的DNA断裂积累，POLβ缺失的影响比FEN1缺失更大(图3C，’0’时间点)。然而，令人惊讶的是，在随后无药物培养基孵育期间，MMS诱导的断裂在POL 缺失细胞中在 内降至背景水平，但在FEN1缺失细胞中没有显著下降(图3C和补充图S3A)。在同时缺乏POLβ和FEN1的G1细胞中，MMS诱导的单链断裂(SSB)持续水平甚至高于仅缺乏FEN1的细胞，突出了抑制短片段和长片段碱基切除修复(BER)的累加或协同影响(图3C和补充图S3A)。这些结果表明，虽然在15分钟MMS暴露期间需要POLβ依赖的短片段BER，但在更长的修复期内它与长片段修复变得冗余。与此一致，单独删除POL 在RPE - 1细胞中对MMS没有显著敏感性，而删除FEN1则有(补充图S3B)。FEN1缺失在G1期对MMS诱导的SSB修复的影响也比XRCC1缺失更大，并且两种蛋白的缺失再次具有累加或协同影响(图3C和补充图S3A)。
FEN1缺失对G1期 诱导的SSB修复的影响也比XRCC1或POL 缺失大得多，并且FEN1与POLβ或XRCC1的缺失再次具有累加或协同影响(图3D和补充图S3C)。当通过测量 诱导的ADP核糖基化水平间接检测SSB时观察到类似结果(补充图S3D，标记为’G1’的面板)。相反，与我们早期实验一致，FEN1缺失对 诱导的ADP核糖基化在 期或G2期细胞中的持续存在影响较小(补充图S3D，标记为’S’和’G2’的面板)。
最后，为了确认短片段和长片段修复在我们的实验中表现如预期，我们比较了PARP抑制和XRCC1缺失对短片段和长片段修复蛋白募集到染色质中的影响。如预期的那样，PARP抑制阻碍了MMS或 处理后XRCC1和POL 募集到染色质中，这与其在短片段修复中的作用一致(图4A、C和D)。同样，XRCC1缺失阻止了POL 的募集(图4A和B)。相反，在长片段BER期间与FEN1一起发挥作用的PCNA和POLD1的募集不受PARP抑制或XRCC1缺失的影响(图4A - D)。这些数据证实了XRCC1 - POLβ和FEN1 - PCNA - POLD1分别在人类细胞的短片段和长片段修复中的不同作用。
图2. G1期快速单链断裂修复(SSBR)需要FEN1。(A) 通过间接免疫荧光检测异步野生型(RPE-1)和FEN1缺失(koFEN1)的RPE-1细胞中与染色质相关的ADP-核糖基化(MAR/PAR)。细胞不做处理(NT)或在冰上用100 μM 处理 ，然后在 的无药物培养基中孵育指定时间。等高线图显示ADP-核糖基化水平(MAR/PAR)与DNA含量(DAPI)的关系。(B) 图(A)中异步细胞的代表性图像。经去污剂提取后可视化的与染色质结合的核单链和多聚ADP-核糖基化蛋白(MAR/PAR)显示为绿色；细胞核用DAPI染色(蓝色)。(C) 如图(A)所示，对在冰上用100 μM 处理10分钟，然后在37°C的无药物培养基中孵育60分钟的样品中MAR/PAR阳性的2n(G₁期)细胞进行定量分析。(D) 通过间接免疫荧光检测异步细胞中与染色质相关的ADP-核糖基化(MAR/PAR)，细胞不做处理(NT)或用含0.1 mg/ml甲磺酸甲酯(MMS)处理60分钟。显示ADP-核糖基化与DNA含量(DAPI)的等高线图。(E) G₀/G₁同步化方案的示意图。(F) 通过间接免疫荧光对G₀/G₁同步化细胞中与染色质相关的ADP-核糖基化(MAR/PAR)进行定量分析，细胞不做处理(NT)或在冰上用 处理10分钟，然后在37°C的无药物培养基中孵育指定时间。(G) G₁期野生型(RPE-1)、FEN1缺失(koFEN1)和XRCC1缺失(koXRCC1)的RPE-1细胞中的DNA链断裂情况，在冰上用 处理或不处理(NT)10分钟，然后在 释放到无药物培养基中孵育指定时间后，通过碱性彗星试验测量。相对于 处理后立即的值给出尾部矩(绝对尾部矩见补充图S2E)。(H) 通过间接免疫荧光对G₀/G₁同步化细胞中与染色质相关的ADP-核糖基化(MAR/PAR)进行定量分析，细胞不做处理(NT)或用含0.1 mg/ml甲磺酸甲酯(MMS)处理指定时间。(I) G₁期野生型(RPE-1)和FEN1缺失(koFEN1)的RPE-1细胞中的DNA链断裂情况，在未处理的细胞(NT)中或在 用0.1 mg/ml甲磺酸甲酯(MMS)处理15分钟后，通过碱性彗星试验测量。
图3. FEN1依赖性修复是G1期快速单链断裂修复(SSBR)的主要途径。(A) 通过蛋白质印迹法检测所示野生型(RPE-1)和单/双敲除RPE-1细胞全细胞提取物中FEN1、XRCC1和POLβ的水平。组蛋白H2B和输入蛋白 的水平用作上样对照。(B) 通过间接免疫荧光对G0/G1期同步化的野生型(RPE-1)、FEN1缺失(koFEN1)、POLβ缺失(koPOLβ)和FEN1/POLβ缺失(koFEN1/POLβ)的PRE-1细胞进行染色质相关ADP-核糖基化(MAR/PAR)定量分析，这些细胞用0.1 mg/ml甲磺酸甲酯(MMS)处理指定时间。(C) 通过碱性彗星试验测量G1期野生型(RPE-1)和所示单/双敲除RPE-1细胞系中的DNA链断裂，未处理细胞(NT)或在37°C用0.1mg/ml MMS处理15分钟后，在无药物培养基中孵育指定时间。显示绝对尾部矩(相对尾部矩见补充图S3A)。(D) 通过碱性彗星试验测量G1期野生型(RPE-1)和所示单/双敲除RPE-1细胞系中的DNA链断裂，未处理细胞(NT)或在冰上用 处理10分钟后，在 的无药物培养基中孵育指定时间。尾部矩相对于 处理后的即时值呈现(绝对尾部矩见补充图S3C)。
图4. 单链断裂修复过程中短补丁和长补丁修复蛋白的募集。(A) 对G0/G1期同步化的野生型(RPE-1)和XRCC1缺失(koXRCC1)的RPE-1细胞在37°C用0.1 mg/ml MMS处理1小时后，对全细胞裂解物或全细胞提取物的去污剂提取部分(染色质部分；CH)中的蛋白质进行蛋白质印迹分析。在所示情况下，细胞在MMS处理前用10 μM聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂(PARPi；奥拉帕利)预处理15分钟。(B) 对上述所示RPE-1细胞在冰上用100 μM 在无血清培养基中处理10分钟后，然后在 释放到新鲜的完全培养基中20分钟后的蛋白质提取物进行蛋白质印迹分析。(C) 对上述所示RPE-1细胞用 处理后的蛋白质提取物进行蛋白质印迹分析。在所示情况下，细胞在 处理前用10 μM聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂(PARPi；奥拉帕利)预处理15分钟。(D) 对用 MMS在 处理 的表达HA标签的POLD1的RPE-1细胞的蛋白质提取物进行蛋白质印迹分析。在所示情况下，细胞在MMS处理前用 聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂(PARPi；奥拉帕利)预处理 。
讨论
长片段修复被认为是单链断裂修复(SSBR)中相对次要的子途径，例如，只有在短片段修复无法进行时才会发生[24 - 26]。然而，后来的研究表明，在碱基切除修复(BER)过程中，长片段修复发生的频率可能至少与短片段修复一样高[27, 28]。与后一项研究一致，我们发现长片段修复蛋白FEN1的缺失在用甲基磺酸甲酯(MMS)或 处理后对SSBR速率产生了惊人的巨大影响。事实上，在G1期停滞的细胞中，FEN1缺失的影响与缺失XRCC1或POL 相似或更大。例如，虽然XRCC1、POL 或FEN1的缺失在短时间(15分钟)的MMS处理过程中都会导致单链断裂(SSB)积累增加，但在随后的 无药物培养基恢复过程中，FEN1缺陷细胞中SSB的持续存在时间最长。事实上，在POLβ缺陷细胞中，MMS诱导的SSB在 内恢复到背景水平。这种残留修复依赖于FEN1，因为FEN1缺失会消除这种修复。MMS诱导的SSB在XRCC1缺陷细胞中也会下降，尽管比在POLβ缺失细胞中下降得更慢。在BER过程中XRCC1缺失产生更大影响可能反映了其在抑制PARP1过度结合以及内源性“捕获”BER中间体方面的作用，这会减缓短片段BER[36, 40]。
虽然FEN1依赖的BER能够补偿POL 的缺失并不奇怪，但我们发现FEN1对于野生型细胞中快速的BER速率至关重要，这一发现出乎意料。当前模型提出，只有当POL 无法促进短片段BER时，例如如果单链断裂(SSB) 末端的脱氧核糖部分被氧化且无法被POLβ裂解酶活性去除时，才需要FEN1依赖的长片段BER[24, 32, 33]。然而，MMS主要产生由APE1处理的无碱基位点，从而产生POL 依赖的短片段BER的典型底物。尽管如此，基于在POLβ缺失、FEN1缺失和FEN1/POLβ双缺失细胞中积累和持续存在的MMS诱导的SSB的比较水平(见图3C)，我们的数据表明，在DNA烷基化后的BER事件中，超过一半需要长片段BER。一种可能的解释是，POL 在BER过程中“意外”插入额外核苷酸的频率比以前认为的要高得多，从而引发了长片段BER的必要性。
虽然MMS和 都间接诱导单链断裂(SSB)，作为碱基切除修复(BER)的中间体，但 还通过脱氧核糖的氧化和分解直接诱导SSB [42]。与我们在用MMS处理的细胞中的发现类似，在G1期，FEN1缺失对 诱导的SSB修复率的影响比XRCC1或POL 缺失的影响显著更大。事实上，虽然POL 在用MMS处理后对SSB的快速修复有部分冗余作用，但在 处理后则完全不需要。然而，XRCC1仍然比POLβ更关键，这可能是由于其在招募和刺激PNKP中的作用，PNKP的活性可修复 -磷酸末端，这些末端存在于 诱导的大部分(>50%)“直接”DNA断裂处[18,43 - 45])。 处理后POL 和XRCC1的部分冗余性再次主要是FEN1依赖性修复的结果，因为FEN1与POL 或XRCC1同时缺失对单链断裂修复(SSBR)率有累加或协同影响。有趣的是，我们观察到在同时缺乏FEN1和XRCC1或POL 的细胞中， 诱导的SSB有一些残留下降，这可能反映了另一种修复途径的活性。
最后，值得注意的是，FEN1并非单链断裂快速修复普遍必需的。与MMS和 不同，FEN1缺失不影响喜树碱(CPT)处理期间因TOP1活性失败而诱导的SSB的修复率。这可能反映出在TOP1诱导的SSB处不需要填补缺口，TOP1诱导的SSB由一个切口组成，其中TOP1多肽通过 -磷酸酪氨酸键与 -末端共价连接。
总之,我们的结果强化了XRCC1 - POLβ和FEN1 - PCNA - POLD1在人类细胞短补丁和长补丁修复中的不同作用。然而，这些结果表明，FEN1依赖性长补丁修复并非备用途径，而是DNA烷基化和DNA氧化后单链断裂快速修复所必需的，特别是在细胞周期的G1期。
致谢
作者贡献:K.B.进行了实验，R.H.提供了一些帮助。H.H.和K.W.C.设计并管理了该项目，K.W.C.构思了该项目。H.H.和K.W.C.撰写了手稿，K.B.提供了编辑方面的帮助。
补充数据
补充数据可在NAR在线获取。
利益冲突
无申报。
资金
Caldecott实验室的资金来自英国医学研究理事会[给K.W.C.的项目资助MR/W024128/1]。Hanzlikova实验室的资金来自捷克科学基金会[给H.H.的25 - 15199S]，以及机构资金[RVO - 68378050]。对位于捷克共和国布拉格IMG的光学显微镜核心设施的Olympus ScanR的访问得到了MEYS - [LM2023050, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045, 和CZ.02.01.01/00/23_015/0008205]的支持。支付本文开放获取出版费用的资金由研究理事会的整笔资金提供。
数据可用性
本研究的基础数据可在文章及其在线补充材料中获取。
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