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CTCF介导的染色质组织的结构基础

发布时间：

2026-06-02 20:58

条目# CTCF介导的染色质组织的结构基础

曼努埃尔·奥索里奥·瓦莱里亚诺，亚历山大·C·斯通，永野正博，邦妮·苏，劳拉·卡恰尼尼，安德斯·S·汉森，卢卡斯·法尔农，塞歇尔·M·沃斯

哈佛医学院细胞生物学系，马萨诸塞州波士顿

美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院生物工程系，邮编02139

麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所基因调控观测站；美国马萨诸塞州剑桥市02142

4美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所诺和诺德基金会疾病基因组机制中心，邮编02142

美国马萨诸塞州剑桥市02139科赫综合癌症研究所

美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院生物学系，68号楼，埃姆斯街31号，邮编02139

美国马里兰州 Chevy Chase 霍华德·休斯医学研究所

这些作者贡献相同

+通讯作者应联系:lucas_farnung@hms.harvard.edu，seyvos@mit.edu

真核生物的DNA在多个尺度上进行组织，以支持基因组压缩、适当的基因表达和DNA重组。在这些过程中起核心作用的是CCCTC结合因子(CTCF)，它定义了特定的染色质环结构，并将增强子元件与启动子隔离开来。染色质围绕CTCF结合位点以独特的模式组织，然而，这种模式的作用仍不清楚。在这里，我们报告了重组的CTCF-核小体复合物的冷冻电子显微镜结构，揭示CTCF二聚化促进核小体寡聚化形成特定的高阶组装体，涉及特定的组蛋白-组蛋白和CTCF-CTCF相互作用。值得注意的是，CTCF在非染色质化的DNA底物上不能有效地寡聚化。细胞中CTCF-CTCF相互作用界面的破坏导致染色质环化显著减少，并损害细胞分化。这些结果表明，CTCF位点的染色质结构在支持基因组远端区域的高阶相互作用中起重要作用，并且这些相互作用对于支持细胞类型特异性基因表达很重要。

引言

CCCTC结合因子(CTCF)是一种重要的DNA结合蛋白，在基因表达调控、DNA修复和重组以及发育过程中起核心作用。CTCF负责形成划定调控域的染色质环、增强子绝缘以及对正确转录控制至关重要的长程染色质相互作用。染色质环被认为主要通过黏连蛋白的作用形成，黏连蛋白可以主动挤出DNA环。CTCF通过其11个锌指(ZnF)识别不对称DNA结合基序以定向方式结合DNA，锌指两侧是灵活的N端和C端(图1a) 。这种定向结合决定了黏连蛋白挤出DNA环的距离。最后，据报道CTCF可与自身结合；然而，这种结合的功能作用尚未确定。因此，CTCF与DNA的定向结合对局部染色质结构和3D基因组组织都有深远影响，但CTCF-CTCF相互作用在这些功能中的作用尚不清楚。

在CTCF与其同源序列基序初始结合时，CTCF被认为会招募染色质重塑因子，包括ISWI、SWI/SNF和CHD家族成员。这导致在CTCF结合位点两侧建立不对称的无核小体区域，在CTCF的N端一侧有80 - 110个碱基对(bp)，在C端一侧有40 - 80个bp，并形成阶段性核小体阵列，在CTCF两侧各有多达10个定位良好的核小体。与CTCF相邻的定位核小体的破坏会改变三维基因组相互作用，并表现为环化减少，可能会影响基因组隔离。CTCF通过其N端与黏连蛋白相互作用，CTCF N端一侧较大的无核小体区域可能提供足够的空间来容纳和滞留黏连蛋白。这表明CTCF通过其与黏连蛋白的直接关联以及对核小体组织的直接影响来影响三维基因组组织。

最近的研究开始阐明黏连蛋白如何与结合；然而，尚不清楚CTCF位点的核小体相位和CTCF自身相互作用如何影响三维基因组组织。在这里，我们使用细胞中的生化、结构和三维基因组方法系统地解决了这些问题。总之，我们的结果表明CTCF和核小体协同作用以诱导不同的染色质构象，从而增强全基因组的环化相互作用。

CTCF介导的染色质组织的结构基础

结果

CTCF与核小体形成高阶组装体

为了研究CTCF在染色质环境中的功能，我们首先纯化了人CTCF，并评估其与携带完整CTCF结合序列基序或随机序列的线性DNA片段的结合。如先前观察到的，CTCF很容易与包含其结合基序的线性DNA结合。相比之下，在相同浓度范围内，与随机DNA序列的结合可以忽略不计(图1b、c和扩展数据图1a、b)。总之，这些结果证实我们纯化的全长CTCF特异性地与包含其序列基序的DNA结合。

图1:CTCF以序列和方向依赖的方式促进核小体二聚化。

a，全长人CTCF的结构域架构。氨基酸边界在下方标明，本研究中突变的残基在示意图上方显示。实线表示在此处报道的冷冻电镜重建中建模的蛋白质区域。先前描述的CTCF与蛋白质SA1/SA2、PDS5A和RNA结合区域(RBR)相互作用的区域已标明。

b、c，通过生物层干涉术(BLI)检测全长CTCF与线性DNA的结合。显示了CTCF浓度增加时的传感图。(b)42个碱基对(bp)的共有CTCF结合序列或(c)42个bp的随机序列。

d，重构的单核小体示意图，其中包含CTCF结合序列，有两种方向，使CTCF的N端(N - 核小体)或C端(C - 核小体)朝向Widom 601核小体定位序列(W601)。显示了CTCF结合基序的核苷酸序列以及各个锌指接触(ZnF1 - 11)的相对位置。橙色圆圈代表连接到核小体上用于检测的FAM荧光团。

e、f，对从FAM标记的N-核小体的梯度固定(GraFix)中收集的级分进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)分析，(e)未加入CTCF时，或(f)与CTCF孵育后。虚线灰色框突出显示的泳道对应于用于质量光度分析的级分。梯度级分在含0.2x TBE缓冲液的3.5%丙烯酰胺Tris-硼酸-EDTA(TBE)非变性凝胶上进行分析；第一个泳道中包含对照核小体(Ncl)。图中指出了对应于游离核小体(Ncl)、CTCF结合核小体(Ncl+CTCF)以及与含有2个核小体和2个CTCF分子的二聚体复合物相对应的高阶物种(2xNcl+2xCTCF)的位置。

g，在存在CTCF的情况下对N-核小体进行质量光度分析。左图显示图f中的级分1。右图显示图f中的级分2。图中指出了预期质量和计算质量。

h、i、j，对FAM标记的(h)C-核小体、(i)含有42 bp随机序列的核小体以及(j)包含与CTCF孵育的CTCF结合基序的42 bp线性DNA片段的GraFix级分进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)分析。梯度级分在(h、i)3.5%或(j)5%丙烯酰胺TBE非变性凝胶上进行分析。虚线灰色框突出显示的泳道对应于用于质量光度分析的级分(见扩展数据图1i)。

k，对不同核小体底物上CTCF-核小体二聚化的定量分析。柱形图表示来自3次重复实验的平均值标准差。图中显示了各个数据点。

CTCF介导的染色质组织的结构基础

接下来，我们研究了CTCF与单核小体底物的结合情况。使用含有80 bp DNA突出端、随后是Widom 601核小体定位序列以及42 bp CTCF共有基序或42 bp随机序列的DNA序列来重构核小体(图1d，方法)。CTCF基序以两种方向提供，以使CTCF的N端(N-核小体)或C端(C-核小体)朝向重构的核小体(图1d)。我们使用蔗糖密度梯度超速离心，随后进行质量光度分析，以评估CTCF-核小体复合物的化学计量比(扩展数据图1c)。戊二醛要么包含在蔗糖梯度中(梯度固定(GraFix))，要么在梯度离心后添加，以防止复合物解离。两种交联方案均获得了相似的结果(扩展数据图1d、e，方法)。在没有CTCF的情况下，核小体主要以单体形式存在。值得注意的是，加入CTCF后，观察到了与核小体-CTCF复合物一致的新群体以及与CTCF结合的核小体二聚体(2个核小体和2个CTCF分子)相对应的更高分子量物种(图1e-g、k和扩展数据图1f)。对于缺乏80 bp核外DNA的核小体(0-W601-N-核小体)也检测到了这种行为(扩展数据图1g、h)。当结合基序翻转，使CTCF的C端更靠近核小体(C-核小体)时，二聚体复合物的比例显著降低(图1h、k)。与我们在线性DNA上的实验一致，CTCF不与含有随机DNA序列的核小体结合(图1i、k)。最后，对未染色质化的、含有基序的42 bp DNA进行的GraFix实验仅显示单体CTCF-DNA复合物，未检测到可检测的高阶群体(图1j和扩展数据图1i)。总之，这些结果表明CTCF诱导核小体自缔合，并且这种行为受CTCF相对于核小体的方向影响。

CTCF-核小体复合物的冷冻电镜结构

接下来，我们使用低温电子显微镜(cryo-EM)在N-核小体模板上可视化CTCF。我们形成了CTCF-单核小体复合物，并使用GraFix分离寡聚状态。收集含有二聚体物种的级分，进行缓冲液交换、浓缩，并用于制备单颗粒低温电子显微镜样品(扩展数据图2a)。对预处理后的显微照片和二维重建的初步检查显示，堆积的核小体二聚体与延伸的核小体外DNA显示出CTCF的密度(图2a和扩展数据图2b、c)。广泛的三维分类产生了一个最终图谱，分辨率为3.7 Å(傅里叶壳层相关金标准0.143)，核小体密度对应于3.2 - 6.3 Å，CTCF密度对应于6.5 - 8.4 Å，分别(图2b，扩展数据图2d - k，扩展数据图3，图谱B)。观察到CTCF锌指(ZnFs)1 - 8。该结构使用非洲爪蟾核小体的高分辨率结构和CTCF的先前X射线晶体结构进行建模。最终模型经过手动调整、优化，并在观察到的分辨率下显示出良好的立体化学性质(扩展数据表1)。在分辨率下解析了一个聚焦于核小体二聚体堆叠且具有更大颗粒子集的图谱(扩展数据图2d - f，扩展数据图3，图谱A)。

该结构显示两个由CTCF-CTCF和H2A-H2B相互作用结合在一起的CTCF结合单核小体，形成了一个伪对称二聚体堆叠(图2c、d)。这种I型组蛋白堆叠相互作用分别在含有核小体阵列或带有连接组蛋白H1的核小体的X射线晶体结构和低温电子显微镜重建中观察到。有趣的是，我们观察到一个小的额外密度，似乎由同一核小体上的H2A Glu64和H2B His46残基以及相对核小体上的H2B Glu102和His106残基协调(图2d)。我们暂时将额外密度归为一个离子，因为锌存在于我们的反应中，并且已被认为介导酵母核小体之间的类似相互作用。目前的低温电子显微镜方法不允许对离子进行实验鉴定。最后，H4 N端尾巴之一插入到堆叠核小体的DNA双链之间，但未与H2A-H2B酸性斑块相互作用(图2e) 。

CTCF分子结合其同源DNA序列并以平行方向二聚化，两个CTCF分子使用ZnF6 - 7 - 8之间的结合界面彼此不对称相互作用。来自一个CTCF分子的ZnF6残基His413、Arg415似乎与相对CTCF分子上的ZnF7残基Tyr462、Glu464以及ZnF8残基His477、Glu478缔合(图2f)。CTCF通过与DNA大沟中的碱基之间的相互作用识别其序列基序。这种结合模式的唯一例外是ZnF8，它仅与磷酸骨架相互作用，跨越DNA小沟。未观察到CTCF与组蛋白之间明显的直接相互作用。CTCF二聚化已在先前的X射线晶体结构中观察到；然而，这些相互作用与这里观察到的涉及的锌指不同(扩展数据图4a、b)，并且它们的生物学意义尚未经过实验测试。我们的结果表明，CTCF使用包含ZnF6 - 7 - 8的相互作用界面二聚化，并促进I型核小体堆叠。

相互作用界面的破坏减少二聚化

为了评估观察到的相互作用对二聚化的重要性，我们构建了一系列组蛋白和CTCF突变体。H2B相互作用残基的突变(His46Val、Glu102Lys、His106Leu)或N端H4尾巴的缺失(Δ1-19)显著降低了二聚化(图2g、h、k)。CTCF突变体通过引入点突变或用甘氨酸-丝氨酸接头完全取代ZnF8产生(ZnF8 残基466-494被18个氨基酸的甘氨酸-丝氨酸接头取代)。ZnF6-7-8相互作用残基的点突变设计用于破坏结合

图2:CTCF-核小体二聚体的冷冻电镜结构。

a，CTCF-核小体二聚体的代表性二维(2D)类别。

b，分辨率为3.7 Å的CTCF-核小体二聚体的冷冻电镜密度图(图B，扩展数据图2d)。CTCF 1用粉色渐变表示，CTCF 2用紫色渐变表示。核小体DNA对于核小体1为海蓝色，对于核小体2为天蓝色。组蛋白颜色如下:H2A黄色，H2B红色，H3道奇蓝，H4黄绿色。

c，CTCF-核小体二聚体的结构模型。介导二聚化的区域如下所示:(1)来自核小体1和2的H2A和H2B之间的界面，(2)来自核小体2的H4尾巴，(3)来自CTCF 1的ZnF7-8和来自CTCF 2的ZnF6’之间的界面。颜色同b图。

d，H2A-H2B相互作用界面。来自图A(扩展数据图2d)的密度显示为透明表面。介导这种相互作用的残基显示为棍状。

e，来自核小体2的H4 N端尾巴插入堆叠的核小体之间。带正电荷残基的Ca骨架显示为球体。来自图A(扩展数据图2d)的密度显示为透明表面。

f，CTCF 2的ZnF6’和CTCF 1的ZnF7-8之间的CTCF-CTCF相互作用界面。介导这种相互作用的推定残基显示为球体。由于我们在该区域的结构分辨率有限，这些残基是根据它们相对于Ca骨架的相对位置选择的。

g，h，对用FAM标记的N-核小体(g)含有组蛋白H2B突变体(His46Val、Glu102Lys、His106Leu)或(h)H4无尾突变体(Δ1-19)与野生型CTCF孵育后的GraFix级分进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。凝胶制备方法如图1e、f所述。

i，j，对用FAM标记的N-核小体与(i)CTCF ZnF7-8(Tyr461Gly、Glu464Val、His477Val、Glu478Arg)或(j)CTCF ZnF6-7-8(His413Gly、Arg415Ala、Tyr461Gly、Glu464Val、His477Val、Glu478Arg)孵育后的GraFix级分进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。凝胶制备方法如图1e、f所述。

k，图g-j中核小体-CTCF二聚化的定量分析。柱表示来自3次重复的平均值标准差。显示了各个数据点。

界面，但保留适当的ZnF折叠(图2f，方法)。使用了两种构建体，ZnF7-8

含有Tyr462Gly、Glu464Val、His477Val和Glu478Arg取代，以及ZnF6-7-8含有

图3:CTCF与双核小体底物的结合。

a，包含两个维登姆核小体定位序列(W601和W603)的二核小体构建体(二核小体34)的示意图，这两个序列由连接DNA连接，该连接DNA包含CTCF结合序列的前34 bp，可容纳锌指ZnF1 - 8。显示了CTCF结合基序相对于两个核小体的方向以及锌指接触点(ZnF1 - 8)的位置。橙色圆圈表示用于检测的FAM荧光团。

b，c，对从Dinucleosome 34的GraFix中收集的级分进行的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，(b)未添加CTCF或(c)与CTCF孵育后。梯度级分(15 - 45%蔗糖)在3.5%丙烯酰胺TBE非变性凝胶上进行分离。显示了与CTCF结合的二核小体34(DiNcI + CTCF)、CTCF - 二核小体34二聚体(2xDiNcI + 2xCTCF)和三聚体(3xDiNcI + 3xCTCF)对应的位置。游离的二核小体34(DiNcl)作为对照加载在第一泳道中。用虚线灰色框突出显示的泳道对应于用于质量光度分析的级分。

d，对图c中第1和第2级分的质量光度分析。显示了预期质量和计算质量。

e，CTCF - 二核小体34二聚体的代表性显微照片。虚线框表示在右图中放大的区域，突出显示了CTCF - 二核小体34二聚体。勾勒出二核小体二聚体的轮廓，并用黑色箭头表示单个核小体。显示了比例尺。

f，CTCF - 二核小体34二聚体的代表性二维分类图。白色箭头表示核小体堆叠；显示了连接一个CTCF - 二核小体34二聚体的连接DNA分子。显示了比例尺。

g，分辨率为7.8 Å的CTCF - 二核小体34二聚体的冷冻电镜图(图C，扩展数据图6d和e)。

h，使用图g中的图谱拟合的CTCF - 二核小体34二聚体的结构模型。该模型的着色与图2b相同。

i，CTCF - 二核小体34三聚体的代表性二维分类图。白色箭头表示3个核小体的堆叠。显示了比例尺。

j，k，冷冻电镜图展示了二核小体34 - CTCF三聚体的两种不同构型，其中来自第三个核小体的CTCF结合的核外DNA相对于前两个核小体呈(j)平行构型或(k)交叉构型。显示了核小体堆叠以及来自第三个核小体的CTCF结合的核外DNA的方向。这些图谱的着色与图2b相同。

CTCF介导的染色质组织的结构基础:锌指7 - 8替换以及额外的锌指6点突变His413Gly和Arg415Ala(扩展数据图1a)。锌指7 - 8和锌指6 - 7 - 8构建体与线性DNA的结合亲和力与野生型CTCF相似，而锌指8 导致DNA结合亲和力略有下降(扩展数据图4c，e - g)。在GraFix实验中，所有构建体均表现出严重的二聚化缺陷(图2i - k和扩展数据图4h，j)。这些数据表明CTCF - 核小体二聚化依赖于组蛋白 - 组蛋白和CTCF - CTCF相互作用。

在我们的冷冻电镜图中未观察到CTCF的N端和C端，它们被认为具有重要的功能作用。具体而言，CTCF的N端对于黏连蛋白的定向停滞至关重要，介导与包括PDS5A和SA1/SA2在内的黏连蛋白相关蛋白的相互作用，并且据报道其自身会在上二聚化(图1a)。除了锌指结构1和10外，CTCF的C端可以与RNA结合，并且RNA结合可能促进CTCF的自缔合。因此，我们接下来测试了CTCF的N端或C端是否在CTCF - 核小体二聚化中发挥作用。我们纯化了仅包含锌指结构1 - 11(CTCF残基263 - 581)的CTCF构建体，以研究仅锌指结构是否能介导二聚化(扩展数据图1a)。事实上，锌指结构1 - 11足以介导二聚化以及与单核小体的高阶相互作用(扩展数据图4i，j)。此外，在我们的检测条件下，两端均未与DNA结合(扩展数据图4d)。这些结果表明，CTCF的锌指结构对于CTCF - 单核小体二聚化是必要且充分的。

CTCF - 双核小体复合物的结构

在细胞中，核小体围绕CTCF结合位点呈阶段性排列。在CTCF的每一侧最多可观察到10个规则间隔的核小体。因此，我们评估了在CTCF两侧各有一个核小体的DNA底物上，CTCF - 核小体二聚化是否得以保留。我们首先在Widom 601和Widom 603核小体定位序列之间放置了一个34或42 bp的CTCF结合基序(双核小体34和双核小体42)(图3a和扩展数据图5a)。我们观察到，在没有CTCF的情况下，两种双核小体构建体都会在一定程度上自缔合(图3b和扩展数据图5b，d)。然而，添加CTCF显著增强了双核小体底物的多聚化(图3c，d和扩展数据图5c)。

然后，我们生成了模拟CTCF位点处核小体天然间距的序列。具体而言，我们使用了包含Widom 601序列和一个42 bp CTCF结合基序的底物，它们被80 bp或110 bp的连接DNA隔开(扩展数据图5e)。我们再次观察到CTCF增强了这些构建体的二聚化，表明连接子长度不影响CTCF诱导核小体二聚化的能力(扩展数据图5f - i)。

接下来，我们通过冷冻电镜观察CTCF - 双核小体样本，以确定是否使用相似的相互作用界面来介导双核小体底物的二聚化。使用了34 bp和42 bp连接子的底物。冷冻电镜样本的制备与用于CTCF - 单核小体结构的样本相同(扩展数据图6a，方法)。对预处理后的显微照片进行检查发现了双核小体二聚体(图3e和扩展数据图6b)。此外，在我们最初的二维分类中，我们观察到了I型核小体堆积，并且从排列良好的核小体堆栈延伸出额外的模糊密度，对应于第二对核小体(图3f，以及扩展数据图6c)。42 bp连接子构建体对第二对核小体显示出更大的灵活性，因此未用于进一步分析(数据未显示)。经过广泛的三维分类后，解析出了CTCF - 双核小体34二聚体复合物(图3g，h和扩展数据图6d - f)。最终图谱的分辨率为7.8 Å(傅里叶壳层相关金标准为0.143)，由核小体2和4形成的核小体堆栈的局部分辨率对应于6.9 - 10.3 Å。较低的分辨率是由于连接两个核小体堆栈的DNA具有灵活性。重要的是，单核小体二聚体之间的接触在双核小体结构中是保守的。

CTCF协调高阶染色质相互作用

多个CTCF结合位点通常位于黏连蛋白介导的环的基部和绝缘子位点。同样，之前的超分辨率显微镜研究在细胞中观察到了几个CTCF分子的小簇。有人提出多个CTCF结合位点的存在可增强环和绝缘子的强度。对我们的CTCF-单核小体二聚体结构的分析表明，多个CTCF-核小体分子可以使用重复的结合界面相互作用(扩展数据图5j)。支持这一观点的是，我们在对GraFix纯化复合物的天然凝胶和质量光度分析中观察到了高阶CTCF-二核小体多聚体的形成(图3c、d和扩展数据图5c)。为了了解在多个(>2)CTCF-核小体复合物可能接触的环境中CTCF和核小体是如何组织的，我们从GraFix中选择了一种三聚体CTCF-二核小体物种进行冷冻电镜分析(图3c、d、i和扩展数据图6a)。我们获得了三聚体堆叠的两种不同结构(图3j、k和扩展数据图7)。两种三聚体结构都保留了I型核小体堆叠相互作用。在这些结构中，被CTCF结合的两个核小体在结构上与我们在二聚体结构中观察到的相似(均方根偏差为1.1 Å)。有趣的是，相对于包含CTCF结合基序的核外DNA的位置，观察到第三个核小体处于两种不同的方向。第一种方向导致三个CTCF分子以平行方式相互作用(图3j，扩展数据图7c(图E，分辨率为4.4 Å))。在第二种结构中，第三个核小体旋转了，使得结合的CTCF分子位于相反的一侧，并与两个平行取向的CTCF分子交叉(图3k，扩展数据图7c(图D，分辨率为3.6 Å)。尽管我们无法解析侧链密度，但我们的3D分类表明

图4:mESCs中CTCF二聚化界面的破坏损害增殖、生殖系分化和CTCF-黏连蛋白环化。

a，CRISPR/Cas9介导的对Blimp1-mVenus；Stella-ECFP(BVSC)小鼠胚胎干细胞(mESCs)进行工程改造以在CTCF二聚化界面引入点突变的示意图。锌指6突变体:H413G和R415A；锌指7-8突变体:Y461G、E463V、H477V和E478R；锌指6-7-8突变体:锌指6和锌指7-8替换的组合。

b，野生型和突变型mESCs在连续传代15天期间的生长曲线(左)和估计的倍增时间(右)。生长曲线显示归一化到第0天的累积细胞数。倍增时间箱线图总结了每个基因型的估计值。中心线表示中位数，下铰链和上铰链分别表示第一和第三四分位数，上下须分别延伸到1.5倍四分位距范围内的最大值和最小值。点的形状代表独立的同基因克隆。P值使用双侧 Welch t检验计算。

c，通过RT-qPCR测量的Citcf mRNA水平，相对于野生型绘制(虚线)。点代表独立克隆。条代表平均值，误差条表示标准偏差。P值使用双侧 Welch t检验计算。

e，通过流式细胞术测量的PGCLC诱导效率，作为诱导4天后Blimp1-mVenus(BV)报告基因阳性细胞的比例。点的形状代表独立克隆。条代表平均值，误差条表示标准偏差。P值使用双侧 Welch t检验计算。

图f，代表性的微观C接触图谱，显示了与野生型相比，锌指6 - 7 - 8突变体在8号染色体(上)和19号染色体(下)的两个位点上CTCF - 黏连蛋白环的缺失。上三角表示锌指6 - 7 - 8；下三角表示野生型。黑色箭头指示环的位置。野生型的CTCF和RAD21 ChIP - seq轨迹显示在下方。

图g，跨基因型的指定环类别的聚集环堆积(观察值/预期值)。行显示所有环(全部)、CTCF - 黏连蛋白环(黏连蛋白CTCF)、增强子 - 启动子环(E - P)和启动子 - 启动子环(P - P)。列包括野生型和指定的突变体。UNT和ΔCTCF分别代表来自Narducci 202561的未处理和急性CTCF缺失条件。每个图左上角的数字表示聚集峰富集分数(中心像素值)。

图h，TAD边界周围的聚集绝缘谱。绝缘分数被汇总到已识别的边界。线条表示每种条件下边界中心千碱基(kb)内的平均绝缘分数谱。

利用不同的交叉几何结构来保留CTCF分子之间的相互作用。这些结果表明，可以很容易地形成高阶CTCF - 核小体结构。

CTCF二聚化界面的破坏损害了小鼠胚胎干细胞的生长和分化

接下来，我们评估了CTCF二聚化的生理相关性。为此，我们构建了携带Blimp1 - mVenus和Stella - CFP(BVSC)种系报告转基因的小鼠胚胎干细胞(mESCs)，以产生三个携带点突变的细胞系，这些突变在单核小体的背景下破坏了CTCF的自我相互作用(图4a)。与我们的体外CTCF二聚化突变体类似，我们在锌指6(His413Gly和Arg415Ala；以下简称“锌指6”)、锌指7 - 8(Tyr461Gly、Glu464Val、His477Val和Glu478Arg；“锌指7 - 8”)或两者组合(“锌指6 - 7 - 8”)中引入了替换(图4a，扩展数据图8a)。由于锌指6和锌指7 - 8分别由外显子7和8编码，锌指6 - 7 - 8细胞系是通过对锌指7 - 8背景进行顺序编辑产生的。我们为每个基因型建立了至少两个独立的同基因克隆用于下游分析。

图5:收敛的CTCF - 黏连蛋白环周围的微观C读取水平特征支持对称的“二聚体堆叠”几何结构。

图a，读取水平的微观C分析示意图。根据以核小体为中心的连接，使用链感知偏移将读取末端转换为近似的核小体位置或连接点坐标，可以推断CTCF基序周围的连接几何结构。

图b，每种条件下围绕定向CTCF基序中心(正向和负向基序分别显示)的平均核小体读取密度(每百万计数(CPM))。

图c，收敛的CTCF - 黏连蛋白环的以基序为中心的二维相互作用图谱。热图显示了在野生型和指定突变体中，跨越环的读取对相对于两个锚点处的CTCF基序的位置(15个碱基对的区间；距离按基序方向定向)。

图d，基于模型的对核小体密度轨迹的以基序为中心的信号分布的解释。顶部，CTCF基序中心周围的平均核小体密度，注释位置对应于推断的CTCF占据足迹。底部，示意图说明了用于将映射的读取位置与连接点相关联的坐标转换。

图e，用于按连接方向对读取对进行分层并假设核小体二聚体堆叠几何结构的可能连接事件的连接方向类别(3′到3′、3′到5′、5′到3′和5′到5′)示意图。

图f，图c中野生型连接点相互作用图谱按连接方向类别分开。彩色框表示用于量化与对称核小体二聚体堆叠几何结构一致的富集的位置窗口。

图g，分配到图f中定义的预期位置窗口的读取对的比例，绘制了野生型和突变体的情况。点表示独立的微观C重复，深红色点表示平均值。

涉及锌指结构域7-8(ZnF7-8)的突变导致明显的生长缺陷。ZnF7-8和ZnF6-7-8细胞的增殖速度比野生型或ZnF6 CTCF细胞慢，其中ZnF6-7-8表现出最强的生长受损(图4b，

CTCF介导的染色质组织的结构基础

补充表1)。在ZnF7-8和ZnF6-7-8 CTCF细胞中，Ctcf mRNA水平适度但显著升高，而不同基因型的核CTCF蛋白水平基本保持不变(图4c，扩展数据图8b、c)。相比之下，所有突变体中CTCF与染色质结合的部分均减少(扩展数据图8b、c)。有几种机制可以解释这种表型，包括停留时间的变化、与环相关蛋白的结合改变，或依赖于染色质可及性的间接影响。然而，鉴于这些锌指替换在体外并未显著改变内在DNA结合(扩展数据图4c)，一个合理的解释是细胞中的CTCF二聚化稳定了CTCF与染色质的结合。

为了进一步阐明这些突变的功能后果，接下来我们使用一种成熟的体外诱导系统量化生殖系分化效率，该系统能够从mESCs 中诱导产生功能性生殖细胞(图4d)。在这个系统中，mESCs首先分化为类上胚层细胞(EpiLCs)，相当于体内植入后的上胚层，然后通过细胞因子驱动诱导产生原始生殖细胞样细胞(PGCLCs)，包括BMP4刺激(图4d)。虽然不同基因型之间EpiLC诱导情况大致可比，但ZnF7-8和ZnF6-7-8 CTCF细胞在PGCLC诱导方面表现出明显缺陷(图4e和扩展数据图8d、e)。总体而言，这些数据表明CTCF二聚化界面在生理上很重要，支持细胞增殖，并且是强大的生殖细胞分化所必需的。

CTCF二聚化界面的破坏削弱了CTCF-黏连蛋白环

为了研究破坏CTCF二聚化界面如何影响三维基因组组织，我们在野生型和突变型CTCF小鼠胚胎干细胞(mESCs)中进行了高分辨率的Micro-C 实验，每个重复样本获得了16亿到24亿个独特的连接片段，所有条件下总共获得了173亿个独特的连接片段。各重复样本在不同基因型间具有高度一致性(扩展数据图9a，补充表2)。全基因组相互作用概率作为基因组距离的函数基本保持不变，这与之前的观察结果一致，即即使是急性CTCF缺失对全局接触尺度的影响也很小(扩展数据图9b) 。同样，A/B区室图谱没有显示出明显的全局变化，尽管每个突变体都表现出轻微的、基因型特异性的差异(扩展数据图9c - e)。相比之下，在ZnF7 - 8和ZnF6 - 7 - 8 CTCF细胞中，CTCF - 黏连蛋白环明显减弱，在ZnF6 CTCF细胞中减少程度较为适中(图4f，g和扩展数据图10a)。值得注意的是，这些二聚化界面突变体中的环减弱现象虽然明显，但不如急性CTCF降解时那么严重。这种效应是挤出介导的CTCF - 黏连蛋白环所特有的。基于亲和力的相互作用，如启动子 - 启动子和增强子 - 启动子环，只受到微弱影响(图4g，扩展数据图10b) 。环减弱在常染色质区域比在异染色质区域更明显(扩展数据图10c)。尽管CTCF - 黏连蛋白环大幅减弱，但染色质绝缘在很大程度上得以保留，与急性CTCF降解相比，域内相互作用仅适度减少(图4h，扩展数据图10d)。对环的影响强于对绝缘的影响，这与之前观察到的干扰CTCF - 黏连蛋白相互作用所需的两个关键氨基酸的结果相符。这些结果表明，黏连蛋白在CTCF位点的暂停或停滞可能足以维持大多数边界绝缘，而稳定的环状构象更依赖于完整的CTCF二聚化界面。

Micro-C读取水平分析支持“对称二聚体堆叠”构型

由于Micro-C是一种以核小体为中心的三维基因组学方法，主要分析核小体对之间的连接，读取对可用于推断核小体定位和连接接头几何形状(图5a) 。我们首先检查了CTCF基序周围的核小体相位。我们观察到CTCF基序周围的核小体相位良好，这与之前的研究结果一致。然而，与野生型相比，所有突变体的振幅都减弱了，而核小体位置没有明显偏移(图5b)。这种效应在ZnF7 - 8和ZnF6 - 7 - 8 CTCF细胞中最强，这与它们更强的环丢失表型和更低的染色质结合CTCF分数一致。尽管如此，核小体相位的振幅仍然比急性CTCF缺失后的数据集更有序(扩展数据图11a) 。这些数据与一个模型一致，即CTCF二聚化有助于在CTCF基序两侧±1千碱基范围内的核小体组织。

鉴于稳定的CTCF - 黏连蛋白环优先在反向排列的CTCF基序之间形成，我们接下来研究Micro-C连接事件在这些环处是如何排列的。我们聚焦于一组精心挑选的反向CTCF - 黏连蛋白环，其中每个锚定包含一个单一的、反向排列的CTCF基序。然后，我们使用链感知坐标变换推断基序中心周围相互作用的核小体位置(扩展数据图11b - d)。野生型细胞在两个锚定之间显示出有序的相互作用模式，反映了两个CTCF基序两侧定位良好的核小体之间的连接，而在ZnF7 - 8和ZnF6 - 7 - 8 CTCF细胞中这种模式不太明确(图5c和扩展数据图11c，d)。

为了进一步解释这些模式，我们研究了基序中心周围的CTCF结合谱。一个模型表明，CTCF和辅助因子在基序中心周围大约从-22 bp到+23 bp占据DNA，这解释了特征性的双峰(图5d)。然后，我们根据连接方向(即哪些末端连接)和与基序的距离对连接事件进行分类(图5e、f和扩展数据图11b - d)。在野生型细胞中，预期从我们在体外观察到的对称“二聚体堆叠”几何结构产生的读段类别也有所富集，但在ZnF7 - 8和ZnF6 - 7 - 8 CTCF突变体中减少(图5g)。总之，

CTCF介导的染色质组织的结构基础

这些读段水平的Micro - C特征支持这样一种观点，即我们在冷冻电镜重建中观察到的对称二聚体堆叠构象在野生型细胞中更稳定或更频繁地出现，并且破坏二聚化界面会使细胞内以及体外的这种构型不稳定。

讨论

在细胞中，核小体在CTCF结合位点周围高度有序排列。这种组织参与基因绝缘和染色质环化。CTCF在体内和体外也有自我结合的倾向。然而，CTCF位点周围核小体的有序排列以及CTCF自我结合在基因组组织中的具体作用仍不清楚。在这里，我们观察到CTCF与核小体协同作用形成高阶寡聚体组装。这里鉴定出的CTCF - CTCF相互作用对于介导哺乳动物细胞中的染色质环化很重要，并且是细胞增殖和分化所必需的。

我们的工作得出了与CTCF与染色质化DNA的定向结合相关的三个重要观察结果。第一，我们观察到当CTCF与核小体外DNA结合时，它优先以平行方式与自身结合。第二，CTCF自我结合涉及平行CTCF分子上ZnF6和ZnF7 - 8之间的不对称结合界面。第三，我们观察到当CTCF的N末端面向核小体时，CTCF分子的二聚化非常有利。这些观察结果值得注意，因为两个CTCF位点的平行取向是形成黏连蛋白驱动的环锚的适当形成所必需的，其中CTCF的N末端必须面向挤出的黏连蛋白分子以诱导黏连蛋白马达的稳定暂停。在细胞中，这些观察结果可能解释了为什么CTCF二聚化界面突变体显示出环挤出介导的CTCF - 黏连蛋白环的强烈减弱，而染色质绝缘在很大程度上得以保留(图4f - h，扩展数据图10)，这与之前对直接CTCF - 黏连蛋白相互作用中涉及的残基进行突变的工作一致。先前已表明绝缘不需要CTCF分子的平行取向。总之，这些观察结果支持一个模型，即黏连蛋白在CTCF位点的暂停/停滞在很大程度上足以产生绝缘，而稳定的环构象更强烈地依赖于完整的CTCF二聚化界面。

我们的CTCF二聚化界面突变体在体外没有显示出DNA结合缺陷，但在细胞中显示出明显的增殖和生殖系分化缺陷(图4b、e；扩展数据图4c、8e)。重要的是，稳定的CTCF - 黏连蛋白环仅在一小部分时间内存在(在小鼠胚胎干细胞中平均约为3 - 4% )，并且相对寿命较短(中位数 )。因此，我们的数据表明，即使是短暂或不频繁的环化构型在生理上也可能具有重要意义，可能是通过在发育时间尺度上加强调控相互作用。

最后，我们的读取水平的Micro-C分析结果与从我们的结构研究中推断出的对称“二聚体堆叠”构型一致(图5e - g，扩展数据图11b - d)。尽管效应大小适中，且Micro-C无法直接解析埃级别的界面，但与我们的CTCF二聚化界面突变体相比，野生型细胞中特定基序近端连接模式的富集表明，完整的二聚化界面会使局部核小体尺度的组装产生偏差。最近的一项研究估计Micro-C的有效连接捕获半径为，这意味着这些信号应反映核小体空间范围内的染色质构象。结合最近的研究表明Micro-C和相关的核小体分辨率染色体构象分析可以提供局部染色质几何结构的读数，我们的结果支持这样一种概念，即以核小体为中心的连接模式可用于推断精细尺度染色质结构的各个方面。未来，将超高分辨率3D基因组学与正交结构方法相结合，可能能够更精确和定量地推断局部染色质结构，而这些结构目前主要通过结构和生化分析来获取。

这项工作为CTCF和局部染色质结构在促进高阶基因组相互作用方面提供了一个模型。首先，染色质重塑和CTCF的结合主要导致CTCF N端的核小体从CTCF位点移开。进一步的核小体重塑在CTCF两侧形成一系列相位核小体。重塑将在核小体和CTCF之间创造足够的空间来容纳挤出的黏连蛋白。黏连蛋白介导的环挤出使基因组中远端的、与CTCF结合的区域靠近。一旦两个CTCF位点靠近，两个CTCF位点侧翼定位良好的核小体之间的CTCF自相互作用和堆叠相互作用可以通过一种自我强化机制协同作用，以稳定染色质环锚(扩展数据图11e)。核小体 - 核小体、CTCF - CTCF相互作用可以以不依赖黏连蛋白的方式促进。总之，我们的工作表明CTCF功能在多个基因组尺度上整合，从DNA序列到染色质组织，以影响基因组的长程折叠，最终调节基因表达。

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冷冻电镜,CTCF,ZnF6-7-8,H2A-H2B,核小体,DNA,三维基因组

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