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特异性信号通路的抑制而非效应基因的表观遗传沉默是先天性耐受的主要机制

发布时间：

2026-07-17 21:38

特异性信号通路的抑制而非效应基因的表观遗传沉默是先天性耐受的主要机制

安娜·M·马休蒂娜，波琳娜·V·马克西姆奇克，格奥尔基·Z·奇卡杜阿和米哈伊尔·V·帕申科夫

俄罗斯联邦医学与生物局国家研究中心“免疫学研究所”临床免疫学实验室，俄罗斯莫斯科；2莫斯科国立罗蒙诺索夫大学生物系，俄罗斯莫斯科；3莫斯科国立罗蒙诺索夫大学基础医学院，俄罗斯莫斯科；4俄罗斯联邦卫生部N.N.布罗欣国家肿瘤医学研究中心肿瘤实验诊断与生物治疗实验室，俄罗斯莫斯科

引言:通过模式识别受体(PRR)激活的巨噬细胞进入一种短暂的耐受状态，其特征是对同一受体的再次刺激反应性降低。基于信号传导和表观遗传机制被用来解释这种先天性耐受。然而，这两组机制应该会导致不同的结果。表观遗传情况(效应基因沉默)预测PRR的激活应该广泛地交叉耐受不相关PRR的激动剂，而在基于信号传导的情况下(特定PRR下游信号通路的抑制)，交叉耐受应该只发生在使用相同PRR和/或信号通路的激动剂之间。此外，还描述了所谓的不可耐受基因，它们获得了不同的表观遗传标记并对用相同激动剂再次刺激的反应性增加。这种基因的存在可以通过表观遗传机制很好地解释，但仅通过信号传导机制很难解释。

方法:为了评估信号传导和表观遗传机制对先天性耐受的贡献，我们用通过不同途径发出信号的TLR4或NOD1受体激动剂使人类巨噬细胞产生耐受，并使用不同的信号传导、代谢和转录组学读数评估耐受细胞对同源再次刺激和交叉刺激的反应。我们开发了一种基于转录组学的方法来区分对二次刺激的反应和对一次刺激的持续反应。

结果:我们发现用NOD1激动剂产生耐受的巨噬细胞对同源再次刺激没有反应，而用LPS产生耐受的巨噬细胞在LPS再次刺激时部分保留了激活NF - κB途径的能力，这使得一小部分促炎基因能够维持低水平表达。导致LPS耐受的原因是IFN - 产生所需信号通路的阻断，导致IFN调节基因的“假耐受”。NOD1或TLR4耐受的巨噬细胞中的许多基因由于一次刺激(由于持续转录和/或高mRNA稳定性)而上调，但对……没有反应

检查更新

开放获取

编辑

豪尔赫·塞尔万特斯，

得克萨斯理工大学健康科学

中心，美国

审阅

李武，

美国弗吉尼亚理工大学

克里斯托·韦尔，

美国杜兰大学

通信

米哈伊尔·V·帕申科夫

Impashenkov@yandex.ru

专业板块

本文已提交至《免疫学前沿》杂志的分子固有免疫版块

于2022年7月28日收到

于2023年1月9日接受

于2023年1月26日发表

引用

马休蒂娜·A·M、马克西姆奇克·P·V、奇卡杜阿·G·Z和帕申科夫·M·V(2023年)抑制特定信号通路而非效应基因的表观遗传沉默是固有耐受的主要机制。《免疫学前沿》14:1006002。doi: 10.3389/fimmu.2023.1006002

版权

同源再刺激。基因对同源再激发的高反应性是一种罕见且不一致的现象。然而，大多数对同源刺激无反应的基因对通过不同途径的PRR信号激动剂表现出不变或升高的反应。

讨论:因此，抑制特定信号通路而非表观遗传沉默是固有耐受的主要机制。

关键词

固有免疫反应、耐受、脂多糖、TLR4、胞壁酰肽、NOD1、巨噬细胞、转录组分析

引言

病原体衍生分子与天然免疫细胞的模式识别受体(PRR)相互作用，会触发许多编码炎症和杀菌效应分子的基因表达。通过PRR激活后数小时内，天然免疫细胞进入短暂的耐受状态，即再次通过相同PRR刺激时无法产生促炎细胞因子(1-6)。尽管细胞因子反应受到抑制，但接受过PRR激动剂耐受剂量的小鼠对病原体的抵抗力增强(7-9)，这表明耐受并非无反应性，而是对宿主有益的反应性改变。因此，诱导对特定PRR激动剂的耐受可能有预防败血症和其他由对病原体过度炎症反应引起的危及生命状况的潜力。同时，对广泛的PRR激动剂的耐受可能会损害宿主防御，并导致在细菌性败血症晚期观察到的免疫麻痹。

关于天然耐受的机制尚无共识。最常见的是，耐受被认为是PRR信号传导的激活后暂时阻断，这可由多种机制介导，如受体的内化或降解、从信号蛋白上去除激活的翻译后修饰，或升高诱饵分子的表达以中断信号级联(｛2, 3, 5, 11｝)。或者，耐受可能由表观遗传调控(12-14)。特别是，有人指出，脂多糖(LPS)(一种Toll样受体4(TLR4)激动剂)在小鼠巨噬细胞中诱导的基因可根据其对LPS再刺激的反应分为两组(12)。可耐受(T)基因，包括那些编码促炎介质的基因，对再刺激的反应比初次刺激弱得多或根本无反应。不可耐受(NT)基因，包括那些编码抗菌肽的基因，与初次刺激相比，对再刺激的反应相同或增强。LPS耐受细胞中T和NT基因的不同行为被认为取决于其启动子中染色质的不同修饰，导致诱导性的丧失或增加(12)。表观遗传机制也被认为是天然免疫记忆的基础，即PRR激动剂引起的长期效应，这是一个正在深入研究的课题(15)。

基于信号传导和表观遗传的耐受情况都有优缺点。表观遗传情况可以解释NT基因的现象，尽管决定T和NT行为选择的因素尚未明确确定(4, 12, 14)。此外，T/促炎基因和NT/抗菌基因之间的二分法与对PRR激动剂耐受的动物增强的抗菌保护一致，支持了耐受是一种基于最小化炎症组织损伤以及增强直接杀菌机制的防御策略的观点。然而，如果耐受仅由表观遗传调控，那么刺激任何PRR都会抑制(交叉耐受)对随后刺激任何其他PRR的转录反应，这与实验数据相矛盾(4, 5)。相反，关于交叉耐受的实验观察结果可以很好地由基于信号传导的机制解释。例如，当两个受体使用相同的近端衔接子(如MyD88)时，TLR对之间会发生交叉耐受，而使用不同的衔接子(MyD88和TRIF)会导致交叉启动而不是交叉耐受(5)。然而，基于信号传导的机制无法解释T和NT基因子集的不同行为，因为两者显然都由相同的信号通路调控(12)。

除了TLR外，核苷酸结合寡聚化结构域1(NOD1)和NOD2在细菌的天然识别中也起着重要作用，它们可感知细菌肽聚糖(胞壁肽)片段(16, 17)。NOD1和NOD2下游的信号通路高度相似，并依赖RIP2激酶作为近端衔接子(18, 19)。相比之下，TLR4通过MyD88和TRIF衔接子发出信号(20, 21)。因此，NOD1/NOD2和TLR4依赖性信号通路的近端部分不同，这应该导致交叉启动(5)。实际上，体内给予或体外添加到培养物中的LPS和NOD1/NOD2激动剂以任何顺序分开通常会相互启动(4, 22-25)。尽管如此，一些研究描述了NOD2激动剂对随后LPS诱导反应的抑制作用(26-28)。

为解决这些争议，我们通过用Toll样受体4激动剂(脂多糖)或核苷酸结合寡聚化结构域1激动剂(N-乙酰-D-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-内消旋-二氨基庚二酸[M-三DAP])将人巨噬细胞在体外培养时间来诱导其产生耐受性，然后评估它们对相同或另一种激动剂二次刺激的信号传导、转录和代谢反应。在解释耐受性细胞的反应时，有两个重要问题:(i)区分对二次刺激的反应和对初次刺激的持续反应；(ii)对初次和二次刺激反应动力学的可能差异。我们开发了一种基于转录组学的方法，能够对基因对二次刺激的反应进行分类，并将它们与对初次刺激的持续反应区分开来。我们发现，在未致敏的巨噬细胞中由Toll样受体4或核苷酸结合寡聚化结构域1激动剂诱导的绝大多数基因对用相同激动剂的再次刺激没有反应，并且基因对同源再次刺激的反应性增加是一种罕见且不一致的现象。然而，对同源再次刺激无反应的基因对通过不同信号通路起作用的异源刺激显示出不变或增强的反应性，这表明表观遗传沉默不是先天耐受性的主要机制。

材料和方法

试剂

合成的M-三DAP、来自大肠杆菌O111:B4的超纯脂多糖和合成的聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)购自In vivogen(加利福尼亚州圣地亚哥)。使用先前描述的测试系统(29)确认脂多糖不含核苷酸结合寡聚化结构域1/核苷酸结合寡聚化结构域2激动剂。所有激动剂均溶解于无内毒素水中(In vivogen)。按照Lipofectamine(赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆)制造商的建议制备聚I:C与Lipofectamine 3000的复合物(脂质体-聚I:C)。重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)购自美天旎生物技术公司(德国贝吉施格拉德巴赫)，重组人干扰素-β1b(rhIFN-β1b)购自Generium(俄罗斯莫斯科)。完全培养基(CCM)是补充有2 mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPMI-1640(均购自赛默飞世尔科技)。IκB激酶抑制剂(PF-184)购自Tocris(英国布里斯托尔)，放线菌素D(ActD)购自西格玛(密苏里州圣路易斯)。

巨噬细胞的培养和刺激

从20至60岁的健康供体采集静脉血。采血得到了免疫学研究所当地伦理委员会的批准(方案编号10/2017)。如前所述(30)，通过用rhGM-CSF(40 ng/ml)培养血液单核细胞6天来获得巨噬细胞。在实验前，将巨噬细胞以个细胞/孔的密度重新接种于不含rhGM-CSF的CCM中的24孔板中，并使其静置24小时。为诱导耐受性，将巨噬细胞用M-三DAP(10μg/ml)、脂多糖(100 ng/ml)培养时间或不添加激动剂作为对照。时间后，去除培养基，用温热的RPMI-1640轻轻洗涤细胞，向孔中加入新鲜温热的CCM，使细胞静置30分钟。然后，加入与上述相同浓度的培养基、M-三DAP或脂多糖，以产生和刺激的所有组合(实验设计见图1A)。在一些实验中，将未致敏和脂多糖耐受性巨噬细胞用rhIFN-β1b(10 U/ml)或脂质体-聚I:C(相当于聚I:C)培养。在刺激前加入酶抑制剂。在指定时间点收集用于RNA分离和蛋白质免疫印迹的细胞裂解物以及细胞培养上清液，并保存在。

新一代RNA测序

我们使用来自同一供体在两个不同时间点产生的巨噬细胞(两个生物学重复)进行了两个独立的、设计相同的实验(图1A)。为了评估基因表达的动力学，在刺激后和获取样本，每个实验产生了18个样本集。使用来自耶拿生物科学公司(德国耶拿，产品编号PP - 210)的试剂盒提取总RNA，并用DNA酶I(新英格兰生物实验室，马萨诸塞州伊普斯威奇，产品编号M0303)处理。使用寡聚dT包被的超顺磁性珠子(新英格兰生物实验室，产品编号E7490)纯化mRNA。使用NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒和样品纯化珠子(新英格兰生物实验室，产品编号E7765)以及NEBNext 用于Illumina的多重寡核苷酸(新英格兰生物实验室，产品编号E7335和E7500)按照制造商说明制备带条形码的cDNA文库。使用2100生物分析仪系统(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉)评估文库质量。18个cDNA文库的混合样本在两个独立的运行中使用Illumina NovaSeq 6000平台(俄罗斯莫斯科Evrogen公司)进行测序，在和实验中每个文库分别产生和23.4 条读数。使用bcl2fastq v2.20转换软件(Illumina)生成FASTQ文件。使用Salmon软件包将读数与参考人类转录组(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release - 98/fasta/homo_sapiens/cdna/Homo_sapiens.GRCh38.cdna.abinitio.fa.gz)进行比对。在实验中成功比对读数的百分比为，在实验中为 0.57%。对来自同一基因的不同mRNA变体的计数进行求和。

根据基因转录本的丰度(在两个实验中的至少一个文库中至少有50个原始计数)和功能(仅蛋白质编码基因)选择基因进行进一步分析，这产生了一组11,964个基因。两个实验中同义文库的全局表达谱显示出很强的相关性(补充图S1A)。来自两个RNA - seq实验的单个基因表达测量也高度相关，特别是对于表达变化最大的基因(补充图S1B、C)。

使用每百万读数(RPM)值来分析差异基因表达。RPM值超过两倍的差异被认为具有生物学意义。为避免除以零，在计算RPM之前将等于零的计数替换为1。RNA - seq数据已存入GEO，登录号为GSE207510。

根据基因在第一次和第二次刺激后的行为进行分类

在每个RNA - seq实验中，针对每个刺激序列(LPS→LPS、M - triDAP→M - triDAP、LPS→M - triDAP、M - triDAP→LPS)分别进行分类，比较两个实验中同义分类的结果(见下文)。

激动剂2 激动剂1	中等	M - 三磷酸腺苷(10微克/毫升)	脂多糖(100纳克/毫升)
中等		0 M - 三磷酸腺苷	脂多糖
M - 三磷酸腺苷(10微克/毫升)	M - 三磷酸腺苷	M - 三磷酸腺苷 M - 三磷酸腺苷	M - 三磷酸腺苷脂多糖
脂多糖(100纳克/毫升)	脂多糖	脂多糖 M - 三磷酸腺苷	脂多糖脂多糖

图1

研究的实验设计和基因分类标准。(A)细胞培养实验设计。(B)基于RPM比值的基因分类标准。激动剂1(A1)用于刺激(24小时)，激动剂2(A2)用于刺激(1或4小时)。激动剂1和2可以相同。0，表示无激动剂培养。

在每个分类中，最初基于图1B(上部)所示的5个指标构建了两个子分类(分别针对刺激后的和时间点)。与之前的工作不同，我们不仅比较了二次刺激(激动剂激动剂2)后基因的表达与一次刺激后基因的表达，还比较了在相同时间无激动剂再培养的耐受巨噬细胞中的表达(激动剂 )，这使得能够区分对二次刺激的反应与对一次刺激的持续反应。我们首先鉴定了在一次刺激 1或后表达比未刺激的巨噬细胞中增加两倍以上的诱导基因。根据它们在二次刺激(激动剂激动剂2)后的诱导性，这些基因进一步分为不可诱导、低诱导、正常诱导和高诱导。不可诱导基因对二次刺激无反应，即在激动剂培养中未诱导到高于所达到的水平。低诱导、正常诱导和高诱导基因对二次刺激的反应分别比对一次刺激弱、相等或强。许多我们称为“晚期”的基因在一次刺激1或后未被诱导，但在或后上调，即在激动剂培养中。这些晚期基因中的大多数对二次刺激无反应(类似于不可诱导基因，尽管应该注意的是，这些基因的反应可以在另外的或后正确评估，这里没有进行)。然而，一些晚期基因即使在二次刺激1或后仍进一步上调(超过两倍)，并被称为“高诱导-2”。在一次刺激和无激动剂再培养后未被诱导，但在二次刺激后(在激动剂激动剂2培养中)被诱导的基因被分类为从头诱导。最后，表达但对一次或二次刺激均无反应的基因被称为无反应(图1B)。这种方法允许对所有分析基因的进行分类。

基于在1和构建的亚分类，对基因进行了全面评估，以表征它们在整个刺激序列中的行为(图1B，下半部分)。如果一个基因在两个时间点都被分类为不可诱导，或者在一个时间点不可诱导而在另一个时间点无反应或反应延迟，则该基因被认为是可耐受的(T)。如果一个基因至少在一个时间点被分类为低诱导、正常诱导、高诱导、高诱导-2或从头诱导，而不管另一个时间点的反应如何，则该基因被认为是不可耐受的(NT)。NT基因的这个定义包括所有对二次刺激有任何反应的基因，不一定比一次刺激更强。在NT类别中，一些基因分为两个子类别之一:持续表达(SE)基因和正常或高诱导(NH)基因(图1B)。SE基因符合以下标准:(i)在用激动剂1培养24小时并在有或无激动剂2的情况下再培养1小时后，该基因的表达比未刺激细胞高倍；(ii)在无激动剂( 时的激动剂 )再培养4小时后，表达与无激动剂再培养1小时相比下降倍；(iii)在有激动剂( 时的激动剂激动剂2)再培养4小时后，与时的激动剂相比，表达变化倍(持续)。如果一个基因至少在一个时间点是正常诱导或高诱导且不符合SE标准，则该基因被分类为。

为了评估在两个RNA-seq实验中观察到的基因行为模式的可重复性，我们按如下方式使用检验。假设实验1和实验2产生了基因集和，分别包含给定类别的和个基因。和之间的交集是一个包含个基因的集。分析的基因总数为11,964(见上文)。和的成员随机重合的概率是，随机重合情况下的基因数量将是，四舍五入到最接近的整数。在的情况下，通过检验比较预期和实际重合的比例。如果获得，则基因的行为被认为是非随机的(可重复的)。为了确认RNA-seq结果，还在更多实验中通过半定量RT-PCR分析了选定基因的表达，应用与RNA-seq数据相同的分类标准。

RNA-seq数据的进一步分析

使用加州大学圣地亚哥分校和布罗德研究所开发的软件进行基因集富集分析(GSEA)(32)。使用Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus )进行聚类分析和热图绘制。

使用CiiiDER软件进行转录因子结合位点(TFBS)预测，该软件使用MATCH算法和JASPAR位置频率矩阵(33)。潜在TFBS与“理想”TFBS序列之间允许的最小相似性分数为0.85(分数0表示完全不匹配，分数1表示完全匹配)。TFBS富集分数(ES)的计算方法如下:ES ，其中和是基因集1和2中包含TFBS的基因数量，和是集合1和2中的基因总数(33)。通过检验评估富集的显著性。该软件自动选择一个截止值(在0.85 - 1范围内)，此时基因集1和2之间的差异最为显著。

实时定量PCR

总RNA使用RevertAid 第一链cDNA合成试剂盒，以oligo - dT引物(赛默飞世尔科技)进行逆转录。我们评估了以下几类23个基因的表达:细胞因子(IFNB1、IL1B、IL6、IL10、IL12B、IL23A、TNF)、干扰素反应标志物(MX1)、NOD1受体(NOD1)及其衔接蛋白(RIPK2 [RIP2])、NF - κB家族转录因子(TFs)(NFKB1 [NFKB - p50]、RELA [p65])、NF - KB信号传导的负调节因子(NFKBIA [IKBA]、TNFAIP3 [A20])、来自(13)的NT基因(FPR1、PTGES)、E2F家族TFs(E2F1、E2F2)，以及在我们的RNA - seq实验中被分类为LPS LPS序列超诱导的几个基因(WNT5A、PIM2、PKIG、RIPOR2)。使用7300实时定量PCR系统(应用生物系统公司)在先前描述的条件下进行扩增(30, 34)。引物序列列于补充表S1中。相对表达(RE)通过方法计算，以每个供体的未刺激巨噬细胞作为参考样本，GAPDH作为看家基因。RE的两倍或更高差异被认为具有生物学意义。

mRNA稳定性评估

巨噬细胞如上述进行和刺激。在刺激的时加入放线菌素D(ActD) 。在加入ActD时以及加入ActD后获取RNA样本。如上述进行RT - PCR。mRNA衰变率计算为加入ActD后的mRNA水平与加入ActD前的水平之比。

新生转录本的分离与分析

该实验步骤改编自(35)和(36)。用冰冷的PBS冲洗巨噬细胞单层(约个细胞/样本)，并在冰冷的低渗缓冲液(10 mM HEPES、10 mM KCl、1.5 mM MgCl ，pH 7.9)中孵育，该缓冲液补充有蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete Mini，赛默飞世尔科技)。通过加入终浓度为的Nonidet P-40并剧烈吹打使细胞质膜裂解。裂解物在下离心。去除上清液(胞质部分)并储存在，而核沉淀重悬于核洗涤缓冲液( HEPES、蔗糖、 DTT、蛋白酶抑制剂混合物、 RiboLock [赛默飞世尔科技]，pH 7.9)中并如上离心。核沉淀用尿素缓冲液(1 M尿素、20 mM HEPES、7.5 mM EDTA、 Nonindet P-40、 RiboLock)在处理并在离心。去除含有核质和与染色质弱结合的RNA种类的上清液，沉淀再次用尿素缓冲液( 在 )洗涤。洗涤后的染色质沉淀在溶解于TriReagent(西格玛)中。按照TriReagent制造商的建议分离染色质相关RNA(caRNA)并溶解于无RNase水中。RNA样本用DNase(NEB，货号M303)处理并使用Monarch RNA Cleanup Kit Protocol(NEB，货号T2030)进行纯化。使用随机六聚体引物(赛默飞世尔科技)通过RevertAid RT Kit对纯化的caRNA进行逆转录。为了捕获未剪接和部分剪接的全长前体mRNA以及成熟mRNA，将PCR引物置于分析基因的最后外显子中(补充表S2)。如上所述进行RT-PCR。使用U6小核RNA水平进行标准化。

酶联免疫吸附测定

细胞培养上清液中TNF和IL-6的水平通过夹心酶联免疫吸附测定(eBioscience/赛默飞世尔科技)测定。

蛋白质免疫印迹法

该实验步骤先前已有描述(30, 34)。印迹用抗IKBo(货号9242)、RIP2(货号4142)、磷酸化p38(pT180/pY182，货号9211)、磷酸化JNK(pT183/pY185，货号4668)或总p38(货号9212)的兔抗体，或抗磷酸化ERK1/2(pT202/pY204，货号9106)或总ERK1/2(货号4696)的小鼠单克隆抗体进行检测，所有抗体均来自Cell Signaling Technologies(马萨诸塞州丹弗斯)。用抗 -微管蛋白(克隆DM1A，Novus Biologicals，科罗拉多州森特尼尔)染色作为上样对照。

细胞代谢的实时分析

如前所述(34)，使用Seahorse XFe96分析仪(安捷伦科技公司)测量细胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)，并做了修改。简要地说，巨噬细胞用胰蛋白酶消化、计数，然后以每孔 CCM 16,000个细胞接种到Seahorse XF96板(安捷伦科技公司)中。让细胞贴壁，之后加入激动剂或培养基。第二天，用补充了 -谷氨酰胺、11 mM D-葡萄糖(西格玛)和10%胎牛血清的基础培养基(安捷伦科技公司)洗涤细胞两次。洗涤后，向孔中加入上述培养基，并在大气空气培养箱中平衡，然后将板转移到分析仪中。每9分钟测量一次ECAR和OCR。进行三次基础测量，然后注入激动剂或培养基，并再进行22次测量。

统计学

通过检验比较比例。通过Pearson检验分析相关性。通过重复测量方差分析和Tukey校正进行多重比较。

结果

未致敏巨噬细胞对M-triDAP和LPS的转录反应

用M-triDAP或LPS处理未致敏巨噬细胞可诱导数百种编码炎症介质、干扰素反应蛋白、杀菌蛋白的基因表达(补充图S2A、S2B)。在初次刺激时上调的许多基因的表达在时保持稳定或进一步增加(在用激动剂处理并在无激动剂的情况下再培养的培养物中)(补充图S2C)。另一大组基因在初次刺激的1或时未被诱导，但在时上调(晚期基因)(补充图S2C)。因此，在初次刺激后24小时，即通常评估耐受性的时间点，对初次M-triDAP或LPS刺激存在持续的转录反应。

LPS耐受巨噬细胞对LPS再刺激的反应

最初使用两个参数评估耐受性:TNF产生(取决于从头基因表达)和激活诱导的糖酵解增强(不需要从头基因表达(37))。在用LPS处理并再用LPS刺激的巨噬细胞中，与未致敏巨噬细胞的LPS反应相比，这两种类型的反应均受到强烈抑制(图2A、B)，证实了LPS耐受状态。RNA测序显示，LPS耐受巨噬细胞中的大多数基因对LPS再刺激无反应(LPS LPS)，这使它们属于T类别(图2C、D)。然而，相当一部分基因对再刺激有一些反应(NT模式)(图2C、E)。许多NT基因符合持续表达(SE)标准:在 LPS刺激期间它们的mRNA水平维持在刺激后达到的水平，但在无LPS再培养4小时后下降超过两倍(图2F)。然而，只有少数NT基因是NH，即对二次刺激的反应与对初次刺激的反应相同或更强，且不符合SE标准(图2G)。

来自两个RNA测序实验的T、NT、SE和NH基因集之间的重叠显著大于随机预期(图3A)。

在早期对LPS耐受的小鼠巨噬细胞进行的转录组分析中，NT基因被定义为那些在二次LPS刺激后的表达等于或大于初次刺激后的基因(表达，在的单个时间点评估)(12)。尽管这个定义旨在捕捉与我们的NH基因具有相同特征的基因，但它没有考虑初次刺激(LPS )后的残余基因表达或基因表达动力学。当我们按照(12)中的定义来定义NT基因时，在实验1和实验2中分别获得了271个和360个NT基因，这比我们研究中鉴定出的NH基因数量多4 - 8倍。因此，(12)中使用的标准高估了对二次LPS刺激反应不变或增强的基因数量。

图2

LPS耐受巨噬细胞对LPS再刺激的反应。巨噬细胞用LPS(L)或单独培养基(0)培养，洗涤后再用LPS或单独培养基培养指定时间。(A) 未致敏和LPS耐受巨噬细胞上清液中TNF的水平(ELISA，G实验，M士d)。(B) 添加LPS后未致敏和LPS耐受巨噬细胞的ECAR动力学(6个代表性实验中的1个，详细的M士，一式四份孔)。(C) RNA测序实验1中相对基因表达(RPM )的热图。(D-G) RNA测序实验1和2中T基因(D)、所有NT基因(E)、SE基因(F)、NH基因(G)的相对基因表达(lo 转换)的统计。框代表第25和第75百分位数，框内的线是中位数，须线是和百分位数。通过重复测量方差分析和Tukey校正的P值(*p < 0.05，***p < 0.001，***p < 0.0001，n.s. = 无显著性)。

在功能上，根据我们的标准定义的许多NT基因编码促炎蛋白(图3B，补充图S3)，尽管LPS耐受细胞中促炎基因的表达比初次刺激期间的峰值水平低几个数量级(补充图S4A)。只有少数NT基因编码抗菌肽/蛋白(图3B，补充图S3)。

在使用来自独立供体的巨噬细胞的额外实验中，通过实时PCR(RT-PCR)检测了20个选定基因的反应模式(补充图S4A，B)。尽管单个基因的反应并不一致，但基于RNA测序和RT-PCR的分类通常相互对应:(i) RNA测序实验中鉴定的SE基因(IL1B、IL6、IL12A、IL23A、TNF、RIPK2、NFKB1)在RT-PCR实验中主要表现为SE或更少见的T行为；(ii) RNA测序鉴定的T基因(IL10、IFNB1、MX1、NOD1、RELA、NFKBIA、FPR1、PTGES)在RT-PCR中大多表现为T或更少见的组成型行为。FPR1和PTGES基因在早期研究(12)中被归类为NT，在 LPS刺激后显示出高残余表达，并且在大多数供体中对刺激无反应，这使它们属于T类别。最后，RNA测序实验中鉴定为NH的基因在RT-PCR实验中表现出非常多变的行为；重要的是，对于PIM2、PKIG、RIPOR2、WNT5A基因，分别仅在3/10、1/10、0/10和4/10的供体中观察到NH模式，表明它们的NH行为可能是供体特异性的。

图3

对LPS耐受巨噬细胞对LPS再刺激的反应分析。(A) 在RNA-seq实验1和2中鉴定出的T、NT、SE和NH基因集的大小，以及它们的交集(基因数量)。括号中显示的是如果它们纯粹是随机的情况下预期的巧合数量。使用检验评估预期和实际巧合数量之间的差异。(B) 在118个NT基因中显著过度富集的基因集(在检验中均有 )。

从RNA-seq和RT-PCR数据(图2C、D，补充图S4)可以看出，许多T基因，如PTGES、FPR1和MX1，在 LPS刺激后残留mRNA表达稳定升高，但对刺激无反应。为了验证它们对 LPS刺激无反应，我们平行评估了它们新生的染色质相关转录本水平和成熟的细胞质mRNA水平。我们证实了PTGES、FPR1和MX1的T行为(LPS 和LPS 刺激之间新生或成熟转录本水平无差异)(图4A、B)。同时，PTGES、FPR1和MX1的mRNA在LPS 或LPS 条件下均显示出高稳定性(图4C)，这解释了从培养基中去除LPS后它们的水平稳定升高的原因。相比之下，IL1B、IL6和TNF基因对 LPS刺激有反应(与LPS 条件相比，LPS LPS中新生和成熟转录本水平高>1 log )(图4A、B)，这导致它们的mRNA在LPS LPS条件下持续表达。然而，IL1B、IL6和TNF的mRNA在LPS 条件下相对不稳定(图4C)，这解释了从培养基中去除LPS(LPS )后它们的快速下降。

此外，我们专门分析了在LPS处理1或时在幼稚巨噬细胞中诱导但在后恢复到基线表达的基因(LPS )。在RNA-seq实验1和2中分别发现了429个和461个这样的基因。其中，分别鉴定出23个和33个NT基因；然而，这些NT基因中只有两个在实验之间是共同的，这并不比偶然预期的显著更多。

M-triDAP耐受巨噬细胞对M-triDAP再刺激的反应

用M-triDAP预处理巨噬细胞可抑制TNF产生以及对M-triDAP再次刺激的反应中激活诱导的ECAR糖酵解增加(图5A、B)，这与LPS LPS序列中观察到的情况类似。然而，在M-triDAP耐受的巨噬细胞中，被归类为NT的基因要少得多(图5C - E)。在两个RNA-seq实验中只有四个基因被归类为NT，这并不比偶然预期的显著更多(图5F)。在两个实验中只有一个基因满足NH标准，没有一个显示出SE行为(图5F)。RT-PCR证实了对二次M-triDAP刺激缺乏转录反应，绝大多数分析的基因被归类为T或组成型(补充图S5A、B)。

TNF和IL6基因在LPS LPS设置中的SE行为以及在M-triDAP M-triDAP设置中缺乏这种行为在蛋白质水平上得到了证实:与LPS 条件相比，LPS LPS序列诱导分泌的TNF和IL - 6水平显著增加，而与M-triDAP 相比，M-triDAP M-triDAP序列没有增加细胞因子的产生(图6A)。

因此，在转录水平上，经M-三-DAP耐受的巨噬细胞对相同激动剂失去反应性，而经LPS耐受的巨噬细胞对LPS仍保持部分反应性。LPS耐受细胞的这种行为并非由于耐受条件不理想，因为使用了足够高浓度的LPS ，并且将初次LPS刺激的持续时间改为18或并未改变TNF和IL6 mRNA表达模式(数据未显示)。LPS再刺激后，LPS耐受巨噬细胞中基因诱导性保留或增加的现象并不一致。然而，LPS再刺激可以维持某些基因的残余表达升高，而在没有LPS的情况下，这种升高会迅速消失。

图4

未致敏和LPS耐受巨噬细胞中mRNA表达模式、mRNA转录和mRNA稳定性之间的关系(RT-PCR)。细胞在无或有LPS的情况下培养24小时，洗涤后在无或有LPS的情况下再培养指定时间。(A、B)分别为未致敏和LPS耐受巨噬细胞中细胞质成熟mRNA表达和染色质相关RNA(caRNA)表达的动力学。两个实验中的一个，结果相似。>1，LPS→0和LPS→LPS巨噬细胞之间差异超过1个对数。未处理巨噬细胞中对数 mRNA或caRNA表达等于零。(C)LPS刺激的未致敏巨噬细胞和再培养时有或无LPS的LPS耐受巨噬细胞中成熟细胞质mRNA的稳定性(3个实验，条表示平均值)。在(再)刺激1小时时加入放线菌素D(ActD)，细胞进一步培养1小时。结果以加入ActD前后mRNA水平的比值表示。

基因的非耐受行为与耐受细胞中信号通路的激活相关

LPS LPS刺激后观察到相对大量的非耐受基因，这表明TLR4依赖性信号通路在LPS耐受巨噬细胞中仍部分活跃。我们评估了未致敏和耐受细胞中TLR4和NOD1下游的NF-κB和MAP激酶通路(图6B)。在未致敏巨噬细胞中，正如预期的那样，M-三-DAP和LPS诱导IκBα快速降解以及p38、ERK和JNK磷酸化。在用培养基再培养的M-三-DAP或LPS耐受巨噬细胞中，IKBO水平相对于基线有所增加。M-三-DAP再刺激时，M-三-DAP耐受细胞中未观察到IKBO降解，而LPS再刺激LPS耐受巨噬细胞时，IκBα发生显著降解，尽管与未致敏LPS刺激的巨噬细胞相比有延迟(图6B)。这表明同源再刺激时，LPS耐受而非M-三-DAP耐受巨噬细胞中NF-KB通路被激活。IKKB的药理学抑制导致LPS(再)刺激的未致敏或LPS耐受巨噬细胞中IL1B、IL6和TNF mRNA水平显著降低，证实了该通路的功能活性(图6C)。M-三-DAP或LPS耐受细胞中磷酸化p38水平升高，但同源再刺激时未观察到进一步增加(图6B)。在同源再刺激条件下，JNK磷酸化完全被阻断，而LPS再刺激LPS耐受细胞时，磷酸化ERK有轻微短暂增加。在任何测试条件下，总p38和ERK1/2水平均未受到显著影响(图6B)。因此，LPS耐受巨噬细胞对同源再刺激的部分转录反应性以及M-三-DAP耐受巨噬细胞中缺乏这种反应性与NF-κB通路的激活相关。

M-三-DAP和LPS耐受巨噬细胞对交叉刺激的反应

如果耐受的巨噬细胞中的T基因在转录水平上被沉默，它们不仅会失去对相同激动剂的反应性，还会失去对其他模式识别受体(PRR)激动剂的反应性。为了验证这一点，我们用脂多糖(LPS)使巨噬细胞耐受，然后用M-三肽二氨基嘧啶(M-triDAP)重新刺激，反之亦然。为了在不同刺激序列之间进行正确比较，我们在两个RNA测序实验中选择了446个基因，这些基因在未致敏的巨噬细胞中通过短期(1或 )用M-三肽二氨基嘧啶和脂多糖处理均可诱导。

图5

M-三肽二氨基嘧啶耐受的巨噬细胞对M-三肽二氨基嘧啶重新刺激的反应。巨噬细胞用M-三肽二氨基嘧啶(M)或单独培养基(0)培养，洗涤后在无或有M-三肽二氨基嘧啶的情况下再培养指定时间。(A)用M-三肽二氨基嘧啶重新刺激后，未致敏和M-三肽二氨基嘧啶耐受的巨噬细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF)水平(酶联免疫吸附测定，6次实验，M+σ)。(B)加入M-三肽二氨基嘧啶后，未致敏和M-三肽二氨基嘧啶耐受的巨噬细胞细胞外酸化率(ECAR)的动力学(一式四份孔的次实验中的1次代表性实验)。(C)RNA测序实验1中相对基因表达(每百万读段中来自某基因的读段数每百万读段中来自某基因的读段数 )的热图(D，E)RNA测序实验1和2中T基因(D)和所有非T基因(E)相对基因表达(对数转换)的统计。(F)RNA测序实验1和2中鉴定的T、非T、SE和NH基因集的大小及其交集(基因数量)。括号中显示的是如果它们完全随机时预期的巧合数量。统计分析同图2和图3。*p<0.05，***p<0.001，***p<0.0001，ns.=无显著性差异

当用脂多糖重新刺激M-三肽二氨基嘧啶耐受的巨噬细胞时，大多数分析的基因表现为非T(NT)(图7A, B)，两个RNA测序实验(图8A)和验证性逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)实验(补充图S6A, B)之间有良好的一致性。在M-三肽二氨基嘧啶 M-三肽二氨基嘧啶条件下观察到的约三分之二的T基因在M-三肽二氨基嘧啶脂多糖条件下转变为非T(图8B)。在M-三肽二氨基嘧啶脂多糖条件下鉴定的大多数非T基因在未致敏或M-三肽二氨基嘧啶耐受的巨噬细胞中均可被脂多糖同等诱导，这使它们属于NH类别(图7，补充图S6A, B)。M-三肽二氨基嘧啶耐受细胞中的核因子κB(NF-KB)途径、p38和c-Jun氨基末端激酶(JNK)途径对脂多糖刺激有反应(图6B)。

同样，在脂多糖 M-三肽二氨基嘧啶序列后，大多数分析的基因表现出非T(NH)行为(图9A, B)。在脂多糖脂多糖设置中归类为T的基因中约一半以及几乎所有归类为非T的基因在脂多糖 M-三肽二氨基嘧啶设置中属于非T类别(图8C)。很大一部分非T基因是超诱导性的，即M-三肽二氨基嘧啶在脂多糖耐受细胞中比在未致敏细胞中更大程度地诱导它们的表达，在M-三肽二氨基嘧啶处理4小时时很明显(图8，补充图S7A, B)。脂多糖耐受的巨噬细胞对M-三肽二氨基嘧啶反应增强可能是由于RIPK2信使核糖核酸(mRNA)和相应的RIP2衔接蛋白表达增加(补充图S7A, C)。与此一致，在用M-三肽二氨基嘧啶重新刺激60分钟的脂多糖耐受细胞中，p38和JNK的磷酸化强烈增强(图6B)。脂多糖耐受的巨噬细胞中的NF-KB途径也对M-三肽二氨基嘧啶刺激有反应(图6B)。

图6

用培养基(0)、M-triDAP(M)或LPS(L)对未致敏、M-triDAP耐受和LPS耐受的巨噬细胞进行再培养后，NF-κB和p38信号通路的激活情况。(A)在所示刺激序列后巨噬细胞上清液中TNF和IL-6的水平(3至9个实验)。采用重复测量方差分析并进行Tukey校正的统计分析。*p < 0.05，n.s. = 无显著性差异。(B)在第二次刺激后指定时间点对IkBa、磷酸化p38、磷酸化ERK1/2、磷酸化JNK、总p38、总ERK1/2和α-微管蛋白进行免疫印迹(三个代表性蛋白质印迹中的一个)，并将相应的光密度数据标准化为15分钟时未处理的巨噬细胞。(C)IκB激酶抑制剂对未致敏和LPS耐受的巨噬细胞中TNF、IL6和IL1B mRNA表达的影响(RT-PCR)。细胞在有或无LPS的情况下培养24小时，洗涤后，在有或无PF 184(5 μM)的情况下孵育15分钟，然后在有或无LPS的情况下再培养1或4小时。3个实验，柱状图表示平均值。*p < 0.05，**p < 0.01，用于相同刺激条件下用PF 184处理或未处理的细胞之间的比较(配对t检验)。

当整体呈现NT基因表达时(图7A、9A)，对刺激的反应，尤其是在时，可能会被刺激后具有高残留表达的基因部分掩盖。然而，当专门检查在具有高诱导性且在刺激后具有低残留表达的基因时，例如在LPS M-triDAP或M-triDAP LPS条件下的TNF，或在M-triDAP LPS条件下的IL6(补充图S6A、S7A)，很明显它们在1或4小时对刺激的反应不会因刺激而显著改变。

图7

用M-triDAP(M)耐受的巨噬细胞对LPS(L)刺激的反应。仅包括在两个实验中，在1和/或4小时刺激后，未致敏巨噬细胞中可被M-triDAP和LPS诱导的基因(n = 446)。(A)RNA测序实验1和2中，M-triDAP LPS刺激后T和NT基因表达的一般统计。未致敏巨噬细胞对LPS(0 LPS)、M-triDAP耐受的巨噬细胞对M-triDAP(M-triDAP→M-triDAP)以及M-triDAP诱导的残留表达(M-triDAP→0)的反应平行显示。(B)RNA测序实验1中相对基因表达的热图。统计分析同图2。**p < 0.01，***p < 0.0001，n.s. = 无显著性差异

总之，在同源刺激序列中表现为T的大多数基因，在交叉刺激时会转变为NH。这些数据与稳定转录沉默作为耐受主要机制的观点相矛盾。

NT和T基因特征的比较

由于在交叉刺激下，大量基因表现为T(图8)，我们比较了在不同刺激序列中鉴定出的T基因和非T(NT)基因的调控需求。TFBS预测分析表明，在LPS M - triDAP和LPS LPS条件下，T基因的启动子富含参与I型干扰素诱导或应答的转录因子(TFs)的位点(IRF家族、STAT1:STAT2、STAT4)(图10A)。因此，在LPS→LPS和LPS→M - triDAP条件下，HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_RESPONSE基因集的成员以及在较小程度上HALLMARK_INTERFERON_GAMMA_RESPONSE基因集的成员被优先归类为T，但在M - triDAP→LPS条件下被归类为NT(图10B)。应当指出，为该分析选择的446个基因必须能够被M - triDAP诱导，这排除了许多IFN调节的基因，因为它们仅由LPS诱导。在分析LPS LPS条件下所有LPS诱导的基因时，HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_RESPONSE基因集的35个成员存在于T基因中，而在NT基因中只有1个(通过检验，p < 0.001)。

已知IFN - β通过自分泌或旁分泌作用介导LPS诱导的大部分转录程序(38)。一些IFN调节的基因也可由M - triDAP诱导，可能通过不依赖IFN的机制。RNA测序和RT - PCR均显示，IFNB1基因在未致敏或M - triDAP耐受的巨噬细胞中可被LPS诱导，但在LPS耐受的巨噬细胞中不能被LPS诱导，在未致敏或LPS耐受的巨噬细胞中也不能被M - triDAP诱导(图10C)。因此，一个关键的IFN应答基因MX1在与LPS孵育后被诱导，但与M - triDAP孵育后未被诱导(图10D)。在LPS→LPS条件下，MX1表现为T(图10D，补充图S4)。然而，外源性IFN - β在未致敏或LPS耐受的巨噬细胞中同样能很好地增强MX1 mRNA表达(图10E)，这表明MX1的“耐受化”是由于缺乏内源性IFN - β，而非基因沉默。由于在LPS耐受的巨噬细胞中，IFNB1基因既不被LPS也不被M - triDAP诱导，这些条件下IFN - β的缺乏导致LPS诱导的、IFN调节的基因出现明显的“耐受化”。

图8

RNA测序实验中鉴定出的T基因集和NT基因集的交集。仅包括在两个RNA测序实验中，在1小时和/或4小时刺激后，在未致敏巨噬细胞中既能被LPS又能被M - triDAP诱导的446个基因。(A)在RNA测序实验1和2中，不同刺激序列下鉴定出的T基因集和NT基因集的大小及其交集。(B)维恩图显示M - triDAP M - triDAP和M - triDAP→LPS刺激下T基因集和NT基因集的交集。(C)维恩图显示LPS→LPS和LP→M - triDAP刺激下T基因集和NT基因集的交集。

为了检查IFNB1基因本身在LPS耐受的巨噬细胞中是否沉默，我们用脂多糖 - 聚肌苷酸:胞苷酸(lipo - poly - I:C)重新刺激它们，脂多糖 - 聚肌苷酸:胞苷酸是一种脂质体包裹的双链RNA，它通过视黄酸诱导基因样受体(RLR)激活IFNB1表达，即通过一条不同于TLR或NOD使用的途径(39)。如图10F所示，在LPS耐受的细胞中，IFNB1基因对脂多糖 - 聚肌苷酸:胞苷酸仍有完全反应，并且在LPS耐受或未致敏的巨噬细胞中，在脂多糖 - 聚肌苷酸:胞苷酸刺激时观察到类似的MX1诱导(图10G)。因此，LPS耐受的巨噬细胞中缺乏IFNB1表达可能是由于TLR4下游TRIF依赖的信号通路受到抑制。总之，这些数据表明内源性IFN - 的缺乏是导致LPS耐受的一个重要因素。

此外，在LPS LPS条件下，T基因启动子富含E2F1和E2F2结合位点(E2F1靶基因是E2F2靶基因的一个子集)(图10A)。不同研究报道了E2F1和E2F2转录因子在促炎刺激反应中的正负作用(40 - 43)。有趣的是，与未处理的巨噬细胞相比，LPS耐受细胞中E2F1和E2F2 mRNA水平显著下调(图10H、I)。这些数据支持一个假说，即E2F1和E2F2的缺乏可能是LPS耐受的另一种机制。总体而言，在LPS LPS条件下，259个T基因中有160个(62%)含有IRF3/8、STAT1:STAT2、STAT4或E2F2结合靶点，而在NT类别的88个基因中只有20个(23%)含有此类基因(通过检验，p < 0.0001)。

图9

用LPS(L)耐受的巨噬细胞对M - triDAP(M)刺激的反应。仅包括在两个实验中，经1小时和/或4小时刺激后，在未处理的巨噬细胞中可被M - triDAP和LPS诱导的基因(n = 446)。(A)RNA测序实验1和2中，LPS→M - triDAP刺激后T和NT基因表达的总体统计。同时展示了未处理的巨噬细胞对M - triDAP(0→M - triDAP)、LPS耐受的巨噬细胞对LPS(LPS→LPS)以及残留的LPS诱导基因表达(LPS→0)的反应。(B)RNA测序实验1中相对基因表达的热图。统计分析同图2。*p < 0.05，****p < 0.0001，n.s. = 无显著性差异。

我们无法得出关于LPS LPS和LPS M - triDAP条件下其余T基因的结论。这些基因可能受到其他调控机制的影响，如微小RNA介导的转录后沉默。这同样可能适用于M - triDAP→LPS序列，在该序列中未发现与T基因显著相关的TFBS(图10A)。

讨论

耐受是固有免疫的一种基本机制，其作用是限制炎症反应，但也可能是脓毒症患者免疫麻痹的基础。固有耐受的具体机制尚未完全明确。已经提出了基于表观遗传和信号传导的机制(5, 12)，但它们都不能充分解释耐受的所有方面。表观遗传假说预测，用一种PRR激动剂处理的细胞对其他PRR激动剂也会无反应(交叉耐受)。基于信号传导的假说意味着通过不同途径的PRR信号诱导的反应不应交叉耐受。在这里，我们用TLR4或NOD1受体激动剂使人类巨噬细胞耐受，这两种受体利用不同的信号传导途径，并分析了耐受细胞对同源再刺激和交叉刺激的反应。必要时，我们还使用了通过其他受体和途径发出信号的刺激物，如I型干扰素受体和RLRs。

图10

幼稚和脂多糖耐受巨噬细胞中T和NT基因表达的调控。(A) 在其启动子中含有所示转录因子结合位点(TFBS)的T和NT基因数量。仅分析在两个RNA测序实验中表现出相同行为的基因(见图8A)。所示转录因子满足以下标准:(i) TFBS存在于至少10%的T或NT基因中；(ii) 富集分数(ES)>1；(iii) T和NT基因集中TFBS频率之间存在显著差异(通过检验，p<0.01)。图右侧的数字表示ES。(B) 在不同刺激序列下，所示基因集的基因在T和NT基因中的表示。(C, D) 在第二次刺激1小时和4小时后，不同刺激序列后IFNB1和MX1 mRNA的相对表达。水平条表示平均值。(E) 外源性IFN-B (I) 对幼稚和脂多糖耐受巨噬细胞中MX1 mRNA表达的影响。细胞用培养基(0)或脂多糖(L，100 ng/ml)培养24小时，然后用培养基、脂多糖(100 ng/ml)或rhIFN-β1b(10 U/ml)再培养1小时或4小时。(F, G) 脂质体聚肌苷酸:聚胞苷酸(P)分别对幼稚和脂多糖耐受巨噬细胞中IFNB1和MX1 mRNA表达的影响。幼稚或脂多糖耐受巨噬细胞用培养基(0)或脂质体聚肌苷酸:聚胞苷酸(1 μg/ml)再培养1小时或4小时。(H, I) 用培养基(0)或脂多糖(L)再培养1小时或4小时后，幼稚和脂多糖耐受巨噬细胞中E2F1和E2F2 mRNA的表达。在(C, D, H, I)中，红色和黑色符号分别表示RNA测序和逆转录-聚合酶链反应数据。*p<0.05，***p<0.001，无显著性差异(n.s.)。

巨噬细胞对模式识别受体(PRR)刺激的典型反应是糖酵解速率迅速增加，这在刺激后的内通过细胞外酸化速率(ECAR)的升高得以体现。这种反应已通过PI3K-Akt依赖的己糖激酶-II和GLUT1葡萄糖转运蛋白的细胞内重新分布得到解释(44 - 46)，并且不需要从头进行基因表达(37)。在用相同激动剂再次刺激的脂多糖或M-三肽DAP耐受的巨噬细胞中，ECAR升高同样受到抑制(图2A、5A)，表明相应受体下游的PI3K-Akt依赖信号通路受到抑制。同样，在用同源激动剂再次刺激时，脂多糖或M-三肽DAP耐受的巨噬细胞中p38和JNK通路未被激活(图6B)。有趣的是，NF-κB通路在脂多糖耐受的巨噬细胞中对同源激动剂再次刺激有反应，但在M-三肽DAP耐受的巨噬细胞中没有反应。这表明M-三肽DAP耐受的巨噬细胞中NOD1依赖的信号传导比脂多糖耐受细胞中TLR4依赖的信号传导受到更深刻的抑制。同时，在交叉刺激条件下，与幼稚巨噬细胞相比，NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAP)的激活没有受到抑制，这表明如前所述，脂多糖和M-三肽DAP耐受的巨噬细胞中的信号转导在受体近端阶段被阻断。

为了分析耐受巨噬细胞中基因的行为，我们比较了再次刺激(激动剂激动剂2)后耐受巨噬细胞中每个基因的表达，不仅与未激活巨噬细胞中的表达进行比较，还与在无激动剂条件下重新培养的耐受细胞(激动剂 )中的表达进行比较，这使得我们能够区分对二次刺激的反应和对初次刺激的持续反应。这与一些早期的研究不同，在那些研究中，基因是根据用激动剂进行和刺激后的简单表达比率分为T和NT，而没有考虑耐受刺激后的残留表达；因此，那些研究中对二次刺激反应增强的基因数量可能被高估了。其次，研究两个时间点(初次/二次刺激后1小时和4小时)使我们能够大致评估和比较未激活和耐受巨噬细胞中基因表达的动力学。

M-triDAP和LPS耐受的巨噬细胞对同源再次刺激的转录反应有所不同。M-triDAP耐受的巨噬细胞几乎没有反应(图5，补充图S5)，而在LPS耐受的巨噬细胞中，一部分LPS诱导基因对LPS仍保留一定的反应性，这与LPS耐受细胞中TLR-4依赖性信号传导的不完全阻断一致。通过分析基因表达的动力学，我们发现LPS耐受细胞中的许多这些NT基因遵循持续表达(SE)模式，即一个基因在24小时的LPS耐受处理后具有升高的残留表达，当从培养基中去除LPS后该表达下降，但当再次添加LPS进行刺激时保持在升高水平。然而，我们没有发现对LPS再次刺激的反应始终与对初次刺激相同或更强的基因(考虑到初次LPS刺激后的残留基因表达)。对同源再次刺激反应增强的基因的存在很难用基于信号传导的机制来解释。M-triDAP或LPS耐受的巨噬细胞中几乎不存在此类基因消除了基于信号传导的耐受模型的一个重要缺点。同时，应该注意的是，耐受巨噬细胞的转录组由于初次刺激而发生了显著改变(补充图S2)，并且耐受巨噬细胞中许多基因的表达高于初次刺激的1小时或 (例如，在LPS→LPS条件下的PTGES和FPR1)，这可以通过高mRNA稳定性和/或持续转录来解释(图4)。然而，这些基因中的大多数在同源再次刺激时不会改变其mRNA表达，因此被归类为T。

因此，我们没有观察到LPS耐受的小鼠巨噬细胞(12)中报道的T/促炎基因和NT/抗菌基因之间的二分法。如上所述，我们对NH基因的定义旨在捕获与Foster等人(第12条)研究中的NT基因具有相同特征的基因，但考虑到残留基因表达。当我们分析Foster等人(12)定义为NT的196个基因时，我们的数据集中只有126个基因显著表达，在任何时间点只有56个基因被LPS诱导，根据我们的标准只有4个基因是NT，没有一个是NH。此外，我们的标准定义的许多NT基因(即对LPS再次刺激有任何反应)编码促炎蛋白(图3B，补充图S3)。这些差异可能是由于种间差异((12)中的小鼠巨噬细胞与我们研究中的人类巨噬细胞)。

脂多糖耐受巨噬细胞中T基因的启动子携带组蛋白的抑制性共价修饰，再次受到脂多糖刺激时缺乏激活组蛋白修饰(12, 13, 48, 49)。这些表观遗传标记被认为是T基因沉默的基础；然而，它们也可能是由于TLR4下游信号通路受阻导致缺乏激活输入来解释。我们利用通过不同途径发出信号的TLR4和NOD1受体激动剂交叉刺激巨噬细胞。如前所述，M - triDAP和脂多糖耐受的巨噬细胞保留激活两个受体共有的信号通路远端部分的能力(NF - KB、丝裂原活化蛋白激酶)。因此，与未致敏巨噬细胞中的反应相比，大多数对同源再刺激无反应的基因对交叉刺激显示出正常或增强的反应(图7 - 9)。显然，在耐受特定PRR激动剂的细胞中观察到的抑制性表观遗传标记可以通过刺激另一个通过保持活跃的不同途径发出信号的PRR轻易克服。由此可见，特定PRR下游信号通路的抑制而非表观遗传沉默在先天耐受中起关键作用。我们的数据与早期研究一致，早期研究表明通过不同近端衔接蛋白发出信号的PRR对不会交叉耐受(5, 49)。同时，我们应该指出，我们使用了相对短期的耐受，这与脓毒症早期或暴发性脓毒症最为相关。长期PRR激动剂治疗诱导的表型改变，如先天免疫记忆、训练免疫或耗竭，可能比短期耐受更依赖表观遗传机制(15, 五十)。

为了寻找导致耐受的其他因素，我们发现脂多糖→脂多糖和脂多糖→M - triDAP条件下的许多T基因受IFN调节。IFNB1基因本身在脂多糖耐受细胞经脂多糖再刺激时表现为T基因，且不能被M - triDAP诱导。然而，IFNB1基因在脂多糖耐受的巨噬细胞中并未沉默，因为它对RLR激动剂仍有完全反应(图10F)。此外，受IFN调节的基因如MX1，在脂多糖耐受细胞中表现为T基因，对外源IFN - β仍有完全反应(图10E)。这意味着脂多糖耐受细胞中IFN调节基因的“假耐受”是由于内源性IFN - 缺乏，这本身是由TLR4下游TRIF依赖信号通路受阻(或M - triDAP无法诱导IFNB1表达)引起的，而不是由IFNB1基因沉默导致的。鉴于我们的数据，重组IFN - β或RLR激动剂可用于细菌性脓毒症的免疫麻痹阶段以恢复保护性基因表达。

另一种可能导致LPS耐受性的机制可能是E2F1和/或E2F2转录因子的缺乏。在LPS耐受的巨噬细胞中，E2F1和E2F2 mRNA表达强烈下调，而含有E2F1和/或E2F2结合位点的启动子在T基因中富集(图10A、H、I)。E2F1和E2F2表达的下调可能由促炎细胞因子如TNF的自分泌/旁分泌作用介导(51)。E2F家族转录因子是细胞周期的关键调节因子(52)，而它们在先天免疫反应中的作用尚未完全明确，有报道称其具有促炎和抗炎作用(40 - 43)。作为促炎作用的例子，E2F1和RelA之间的物理和功能相互作用已得到证实(43, 53)，敲低或敲除内源性E2F1会导致体外和体内LPS诱导的促炎细胞因子产生减少(39, 51)。E2F2可能作为TLR4依赖性信号传导的正调节因子(54)。因此，E2F1和E2F2的缺乏可能会损害LPS耐受巨噬细胞中一部分LPS诱导的、E2F依赖性基因的表达，尽管这一假设需要进一步的实验验证。有趣的是，在M - triDAP耐受的巨噬细胞中也检测到E2F1和E2F2 mRNA的减少(数据未显示)，但这没有明显的后果，因为M - triDAP耐受细胞中NOD1依赖性信号转导在更上游的受体近端阶段被阻断(见上文)。

总之，我们表明耐受巨噬细胞中基因的行为不是预先确定的，而是取决于第一次(耐受诱导)和第二次(消退)刺激的特定序列。我们的数据与基于信号传导机制可以充分解释先天耐受性的观点一致。未被抑制的信号通路可用于恢复耐受细胞的反应性。

数据可用性声明

本研究中呈现的数据存于GEO数据库，登录号为GSE207510，网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE207510。

伦理声明

涉及人类参与者的研究已由免疫研究所伦理委员会审查并批准。患者/参与者已提供书面知情同意书以参与本研究。

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