线粒体损伤引发神经元自噬负调控因子的协同降解

比沙尔·巴萨克 © 1,2 埃丽卡·L.F. 霍尔兹鲍尔 © 1,2

通过线粒体自噬破坏受损线粒体清除的突变是包括帕金森病在内的神经系统疾病的病因。在这里，我们确定了一种由神经元线粒体损伤激活并与经典的Pink1/帕金依赖性线粒体自噬并行运作的线粒体自噬应激反应(MitoSR)。线粒体应激水平的增加引发了一种分级反应，该反应通过泛素-蛋白酶体途径和选择性蛋白水解诱导自噬负调控因子的协同降解，包括肌管蛋白相关磷酸酶(MTMR)5、MTMR2和Rubicon。MTMR5/MTMR2抑制自噬体的生物发生；与此一致的是，MTMR2缺失后自噬体对线粒体的吞噬作用增强。Rubicon抑制溶酶体功能，阻断神经元自噬的后期步骤；Rubicon缺失可缓解这种抑制作用。MTMR2和Rubicon的靶向缺失足以增强线粒体自噬，促进自噬体的生物发生并促进线粒体自噬体-溶酶体融合。总之，这些发现表明，治疗性激活MitoSR以诱导自噬负调控因子的选择性降解可能会增强应激神经元中线粒体的质量控制。

收到日期:2025年4月22日

接收日期:2025年7月15日

在线发表日期:2025年8月9日

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线粒体是通过产生三磷酸腺苷(ATP) 为细胞代谢需求提供能量燃料的主要细胞器。神经元由于其极化性质和高代谢活性，特别依赖线粒体来提供能量以调节神经传递、钙稳态和神经可塑性 。这种升高的代谢活性使神经元线粒体更容易受到损伤；由于神经元是有丝分裂后细胞，这种损伤会在生物体的整个生命周期中持续积累。功能失调的线粒体片段的积累对神经元有毒性，因为它会导致活性氧(ROS)、促炎信号分子的产生，并可能触发细胞死亡，所有这些都会导致神经退行性变 。

神经元采用多种质量控制机制来防止受损线粒体的积累，从而维持线粒体生理功能 。真核细胞中调节细胞器更新和稳态的关键过程之一是 自噬。在基础条件下，神经元自噬主要在突触部位和轴突末端启动，在那里一个不断生长的吞噬泡吞噬附近的细胞质成分 。自噬体在逆行运输到胞体的过程中成熟，在胞体中它与酸性溶酶体融合以介导其内容物的降解 。

在基础条件下，线粒体约占大脑中通过非选择性自噬降解的货物的10%-20% 。然而，当线粒体发生去极化或氧化应激时，其靶向清除主要由受体介导的选择性自噬驱动，即线粒体自噬 。在神经元中，Pink1/帕金介导的线粒体自噬仍然是自噬进行线粒体质量控制的最充分表征的途径 。在该途径中，线粒体损伤诱导PINK1激酶在线粒体外膜上积累 ，这导致E3连接酶帕金的募集和激活 。激活的帕金随后使大量线粒体蛋白泛素化 。这些泛素化蛋白作为募集自噬受体的结合平台 ，以促进吞噬性自噬体的形成，从而将受损的线粒体与细胞质隔离。参与该途径的基因突变会导致帕金森病(PD) 、肌萎缩侧索硬化症(ALS) 和额颞叶痴呆(FTD) 。这些观察结果表明线粒体自噬是维持神经元健康的关键重要途径；然而，对于该途径在神经元中如何被调节的了解有限。

美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生理学系。 帕金森病科学联盟(ASAP)

合作研究网络，美国马里兰州雪佛龙蔡斯。电子邮件:holzbaur@pennmedicine.upenn.edu

越来越多的数据表明，控制神经元自噬的调节途径具有细胞类型特异性，因为它们对自噬诱导剂(如mTOR抑制或氨基酸饥饿 )相对具有抗性。这种抗性部分由肌管素相关磷酸酶5(MTMR5)的表达介导，MTMR5是一种在神经元中负调节自噬的蛋白质 。MTMR5属于肌管素蛋白家族，该家族蛋白作为磷脂酰肌醇3 - 磷酸(PI3P)和磷脂酰肌醇3,5 - 磷酸 磷酸酶发挥作用。据报道，该家族中的蛋白质，如MTMR6、MTMR8、MTMR9、MTMR14在不同细胞类型中抑制自噬 。MTMR5是该家族中无催化活性的成员，在神经元中特别富集 ，并且已被证明可调节活性MTMR2磷酸酶的定位和酶活性 。MTMR5 - MTMR2复合物通过使VPS348作用产生的PI3P去磷酸化，共同抑制自噬体生物发生的早期步骤。与此模型一致，在诱导多能干细胞衍生的神经元中敲低MTMR5或MTMR2会导致mTOR抑制期间自噬体数量增加 。

另一种已知在非神经元细胞中下调自噬的负调节因子是Rubicon 。Rubicon最初被鉴定为III类磷脂酰肌醇3激酶复合物II(PI3KC3 - C2)的一个亚基。PI3KC3 - C2包括亚基UVRAG、VPS34、VPS15和BECN1，并在吞噬泡扩张和内体成熟中起到关键作用 。Rubicon与PI3KC3 - C2的一个亚群结合，以阻止该复合物募集到正在生长的膜上 。与此一致，在非神经元细胞中过表达Rubicon会减少PI3P形成 和自噬体数量 。Rubicon还与含RAB7的晚期内体和溶酶体结合，并参与调节膜运输和减少自噬通量 。最近在HeLa细胞中的一项研究表明，线粒体损伤时RAB7的磷酸化诱导Rubicon与另一种RAB7结合蛋白Pacer交换，Pacer是自噬的正调节因子。这种交换允许线粒体去极化后通过自噬适度增加线粒体周转，支持Rubicon在抑制细胞器稳态中的作用 。

在神经系统中，最近的研究结果表明，在小鼠中全身敲除Rubicon可减少在脑纹状体中注射天然未磷酸化形式的 - 突触核蛋白后磷酸化 - 突触核蛋白的积累 ，这是帕金森病的一个主要病理标志。据报道，肌萎缩侧索硬化症患者腰脊髓区域的Rubicon水平也较高 。因此，这些观察结果需要对Rubicon在通过自噬调节神经元稳态中的作用进行详细的分子理解。

在这里，我们证明，在神经元线粒体损伤的情况下，MTMR5、MTMR2和Rubicon会以分级的方式协同降解，且与Pink1/Parkin活性无关。在线粒体应激时，我们发现Rubicon被泛素化并靶向蛋白酶体进行降解；MTMR2和MTMR5在线粒体应激反应中也被泛素化，但其降解涉及蛋白酶体和钙依赖性蛋白水解。我们将这些蛋白质在线粒体损伤时的选择性降解称为线粒体自噬应激反应(MitoSR)，并假设这种反应通过降解自噬的负调节因子来加速线粒体自噬通量。这与最近发现MTMR5/MTMR2负调节的结果一致 自噬体生物发生 ，我们发现这种肌管蛋白复合物的缺失会增强神经元对氧化损伤的线粒体吞噬作用。相比之下，在基础条件下，Rubicon通过RAB7被招募到神经元溶酶体，阻断溶酶体功能，从而抑制自噬体成熟。我们发现，靶向去除这些负调节因子会显著增加基础条件下以及轻度氧化应激诱导后的神经元线粒体周转率。因此，我们提出，直接针对自噬负调节因子的治疗干预可能会促进患有神经退行性疾病(如帕金森病和肌萎缩侧索硬化症)的患者清除受损线粒体，这些疾病中的线粒体自噬受到损害。

结果

线粒体应激引发自噬负调控因子的降解

自噬过程对神经元存活至关重要，然而神经元对基础自噬通量的重大变化具有很大抗性。最近的研究进展发现了几种自噬负调控因子，包括MTMR5、MTMR2 和Rubicon ，它们可在不同细胞系统中降低自噬通量。这使我们思考，在细胞应激期间需要上调自噬时，神经元能否绕过这些自噬抑制因子？为验证这一想法，我们用递增剂量的抗霉素A(Ant A)处理小鼠胚胎皮质神经元，抗霉素A是一种特征明确的线粒体去极化剂，可抑制电子传递链的复合物III，产生局部活性氧 。在载体(乙醇 - EtOH)处理条件下或低剂量 的Ant A处理下，MTMR5、MTMR2和Rubicon的水平保持不变(图1A - D)。然而，随着Ant A浓度增加(15 nM，30 nM)，我们观察到MTMR5、MTMR2和Rubicon的表达水平显著下降。对于MTMR2，我们还在蛋白质印迹中检测到一种降解产物的出现平行增加，该降解产物迁移到完整蛋白质下方。对于Rubicon，我们在蛋白质印迹中观察到第二条迁移更快的条带，可能代表第二种异构体(补充材料S1)；由于这两条带的表达在响应线粒体损伤时平行下降，我们在分析中关注更突出的条带。总之，这些观察结果表明，随着Ant A浓度增加，自噬的三种负调控因子MTMR5、MTMR2和Rubicon的水平协同下降。这些发现表明线粒体活性氧的产生触发了这些蛋白质的剂量依赖性降解。

Pink1 / Parkin介导的线粒体自噬是从神经元中清除功能失调线粒体的主要降解机制 。因此，我们测试了这些负调控因子的降解是否依赖于Pink1 / Parkin介导的线粒体自噬。为此，我们用递增浓度的Ant A处理来自Parkin 小鼠的胚胎皮质神经元。如在野生型小鼠胚胎的神经元中观察到的那样，在用载体(EtOH)或低剂量(3 nM)的Ant A处理的Parkin 神经元中，我们没有看到这三种负调控因子的降解(图1E - H)。同样，如在野生型神经元中所见，在较高的Ant A浓度(15 nM，30 nM)下，我们在Parkin 神经元中看到了MTMR5/2和Rubicon的协同降解。总体而言，这些结果表明这些自噬抑制因子的损伤诱导降解与Parkin活性无关。

真核细胞中的两种主要降解途径是自噬和蛋白酶体系统。鉴于这些蛋白质与自噬的负调控有关联，我们首先询问阻断自噬是否可以挽救经历线粒体应激的神经元中MTMR5、MTMR2和Rubicon的水平。在添加溶剂或Ant A并在巴弗洛霉素A1(Baf A1)存在下再处理2小时之前，我们用Baf A1处理神经元1小时。我们发现，Baf A1诱导的自噬体-溶酶体融合阻断并不能挽救线粒体损伤诱导的MTMR5/2或Rubicon的损失(图1I-L)。相反，与溶剂相比，当单独用Baf A1处理神经元时，我们观察到Rubicon水平增加了约2倍，但MTMR2/5水平没有增加(图1I，L)。这些数据表明，Rubicon在神经元的基础条件下可能通过溶酶体降解或基础自噬进行周转。然而，这些机制均不介导线粒体应激诱导的Rubicon的降解。

针对线粒体应激反应中自噬负调控因子的降解机制

接下来，我们测试了MTMR5、MTMR2和Rubicon的降解是否由蛋白酶体介导。我们用药物MG132处理神经元 阻断蛋白酶体活性1小时，然后加入溶剂或Ant A以及MG132再处理2小时。我们发现，抑制蛋白酶体活性完全挽救了线粒体应激时对照细胞中观察到的MTMR5、MTMR2和Rubicon的降解(图2A - D)。与溶剂处理的神经元相比，当仅用MG132处理神经元而不使用Ant A时，我们还观察到Rubicon水平增加了约2倍(图2A，D)，这表明Rubicon的周转在神经元中受到自噬(图1I，L)和蛋白酶体途径(图2A，D)的严格调控。相比之下，当我们用Baf A1或MG132处理HeLa细胞时，我们分别观察到Rubicon水平没有增加(补充图S2A，B)或只有非常微小的变化(补充图S2C，D)。这些

图1 | 线粒体应激引发MTMR5、MTMR2和Rubicon的协同降解，与帕金活性或自噬通量无关。

A - D MTMR5、MTMR2和Rubicon随着抗霉素A浓度的增加而降解。A野生型(WT)小鼠胚胎皮质神经元裂解物的代表性蛋白质印迹，用溶剂(乙醇)或浓度递增的抗霉素A(3 nM、15 nM或30 nM)处理2小时。B MTMR5条带强度相对于用乙醇或浓度递增的抗霉素A处理的WT神经元的总蛋白进行归一化。C完整的MTMR2条带强度与用乙醇或浓度递增的抗霉素A处理的WT神经元的总(完整 + 降解)条带强度的比值。D Rubicon条带强度相对于用乙醇或浓度递增的抗霉素A处理的WT神经元的总蛋白进行归一化(A - D:N = 4次实验，采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验)。E - H在帕金蛋白 小鼠胚胎的皮质神经元中也观察到MTMR5、MTMR2和Rubicon的协同降解。E帕金蛋白 小鼠胚胎皮质神经元裂解物的代表性蛋白质印迹，用溶剂(乙醇)或浓度递增的抗霉素A(3 nM、15 nM或 )处理2小时。F MTMR5条带强度相对于用乙醇或浓度递增的抗霉素A处理的帕金蛋白 神经元的总蛋白进行归一化。G完整的 MTMR2条带强度与用乙醇或浓度递增的抗霉素A处理的帕金蛋白 神经元的总(完整 + 降解)条带强度的比值。H Rubicon条带强度相对于用乙醇或浓度递增的抗霉素A处理的帕金蛋白 神经元的总蛋白进行归一化(E - H: 次实验，采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验)。I - L自噬抑制不会阻止MTMR5、MTMR2或Rubicon因线粒体损伤而发生的降解。I野生型皮质神经元裂解物的代表性蛋白质印迹，先用溶剂(二甲基亚砜)或500 nM巴弗洛霉素A1(巴弗A1)处理 ，然后再用溶剂(乙醇)或 抗霉素A处理2小时。J MTMR5条带强度相对于用二甲基亚砜/巴弗A1和乙醇/抗霉素A处理的野生型神经元的总蛋白进行归一化。K完整的MTMR2与用二甲基亚砜/巴弗A1和乙醇/抗霉素A处理的野生型神经元的总(完整 + 降解)条带强度的比值。L Rubicon条带强度相对于用二甲基亚砜/巴弗A1和乙醇/抗霉素A处理的野生型神经元的总蛋白进行归一化(I - L:N = 4次实验，J、L:采用单因素方差分析和Sidak多重比较检验，K:Kruskal - Wallis检验)。误差条表示标准误。源数据作为源数据文件提供。 结果表明，Rubicon水平在神经元中以细胞类型特异性方式受到严格调控。

被靶向蛋白酶体机制进行降解的蛋白质首先会与泛素(Ub)或类泛素蛋白结合。由于我们观察到在神经元中用MG132处理后Rubicon会积累，我们测试了Rubicon在神经元中是否被泛素化，以及这种泛素化是否会因线粒体损伤而增加。为此，我们用溶剂(乙醇)或抗霉素A处理神经元2小时，然后免疫沉淀Rubicon以富集该蛋白质的泛素化形式。事实上，我们在western印迹上能够看到出现分子量更高的条带，这些条带对Rubicon和Ub均呈阳性(图2E)。更重要的是，我们能够看到在响应线粒体损伤时出现一条明显的泛素化Rubicon条带(图2E)。我们的结果表明，线粒体损伤后泛素化Rubicon与总Rubicon的比例显著增加，表明这种损伤加速了Rubicon的泛素化及其被蛋白酶体机制的降解(图2E、F)。在平行实验中，我们免疫沉淀了MTMR2；这种富集导致出现分子量更高、对MTMR2呈阳性的泛素化条带，尽管我们没有观察到响应线粒体应激时泛素化有显著增加(补充图S3A、B)。这一观察结果，与氧化应激诱导的MTMR2明显的蛋白水解切割(图1A)一起，表明可能有其他机制导致MTMR2的降解。由于可用抗体被证明对免疫沉淀无效，我们无法对MTMR5进行平行实验。

为了进一步证实我们的发现，我们进行了补充实验:富集泛素化蛋白，然后在免疫沉淀部分中检测MTMR5/2和Rubicon的存在。对于这个实验，我们用 MG132处理神经元 以阻断泛素化蛋白的蛋白酶体降解，然后在存在MG132的情况下再加入抗霉素A 2小时以触发线粒体损伤。处理后，我们使用泛素富集试剂盒从处理过的神经元裂解物中下拉与泛素结合的蛋白(见方法)。与用对照珠子进行的下拉实验相比，我们在下拉部分中看到泛素化蛋白有显著富集(图2G、H)。作为这种方法的阳性对照，我们检测了线粒体融合蛋白2(MFN - 2)，因为这种线粒体外膜GTP酶作为诱导PINK1/ Parkin依赖性线粒体自噬 后的初始步骤之一会被Parkin泛素化。与此一致，我们在泛素下拉部分中检测到MFN - 2的富集，证实了线粒体自噬的开始(图2G)。western印迹分析表明，自噬的所有三个负调节因子MTMR5/2和Rubicon(图2G、I - K)都在泛素下拉部分中富集。

蛋白质泛素化涉及三个连续的酶促反应级联，包括泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3) 。我们询问阻断泛素与MTMR5、MTMR2和Rubicon的酶促结合是否会阻止它们的降解。为此，我们用PYR41处理神经元 ，PYR41是一种不可逆地阻断所有泛素 - E1酶活性的药物，然后再加入溶剂或抗霉素A以及PYR41额外处理2小时。我们观察到在阻断线粒体应激期间的E1活性后，Rubicon水平完全恢复(补充图S3C、D)。对于MTMR2，我们观察到在对线粒体损伤用PYR41处理时，其完整形式有显著但部分的恢复(补充图S3C、E)，并且在MTMR5中也观察到类似趋势(补充图S3C、F)。

这些观察结果共同表明，在应对线粒体应激时，Rubicon主要通过蛋白酶体途径降解，但其他降解机制可能也参与了MTMR5和MTMR2的缺失。先前的研究已聚焦于钙 在调节线粒体自噬 中的作用。为了研究MTMR5/2的降解是否 依赖，我们用两种 螯合剂EGTA和BAPTA处理神经元。我们观察到，在神经元受到线粒体应激时用EGTA处理后，MTMR5和MTMR2的降解完全得到挽救(补充图S3G-I)。基于这一发现，我们推测线粒体损伤诱导的胞质 水平变化可能激活 激活的蛋白酶，从而降解MTMR2和MTMR5。还需要进一步的研究来确定这些导致MTMR5/2降解的其他机制。

相比之下，Rubicon主要通过泛素-蛋白酶体系统清除。由于这种降解不依赖于E3连接酶Parkin(图1E、H)，我们想知道在基础条件下以及对氧化损伤作出反应时，还有哪些其他E3连接酶可能诱导Rubicon的泛素化。最近在软骨细胞中的研究表明，E3连接酶HECTD1通过泛素化 调节Rubicon水平。我们通过用编码针对HECTD1的短发夹RNA(shRNA)或非靶向对照的慢病毒转导体外培养第1天(DIV1)的原代皮质神经元，来询问HECTD1是否在神经元中调节Rubicon水平。到DIV6-8时，我们能够使HECTD1的表达降低60%以上，并注意到Rubicon增加了47%，这表明在基础条件下HECTD1在神经元中调节Rubicon水平(补充图S4A-C)。为了研究HECTD1在应对线粒体损伤时调节Rubicon水平是否必不可少，我们用慢病毒shRNA使HECTD缺1，并随后用抗霉素A(Ant A)处理神经元2小时。在这些条件下，相对于同样用Ant A处理的对照神经元，我们观察到Rubicon的缺失水平有小幅但不显著的增加(补充图S4D-F)。因此，虽然HECTD1在基础条件下调节细胞内Rubicon水平，但其他E3连接酶可能也……

有助于这种调节或补偿线粒体损伤时HECTD1功能的丧失。HECTD1是28个成员的HECT E3连接酶家族的成员，因此另一个家族成员可能表现出冗余的底物特异性。实际上，之前已经研究过多种E3连接酶在线粒体应激期间调节蛋白质水平的概念。在没有Parkin的情况下，E3 据报道，连接酶MUL1可调节线粒体外膜蛋白MFN-2的水平以促进线粒体自噬 。同样，作为HECT家族蛋白成员的HUWE1，已知在线粒体损伤时会使MFN-2泛素化以促进线粒体自噬 。需要进一步开展组合测试候选E3连接酶的工作，以全面解决这个问题。

图2 | 急性线粒体损伤诱导MTMR5、MTMR2和Rubicon经蛋白酶体泛素化降解。A-D:蛋白酶体抑制阻断三者协同降解。A:WT小鼠胚胎皮质神经元裂解物经溶剂(乙醇)或10 μM MG132处理1 h，继以溶剂或15 nM抗霉素A处理2 h后的代表性Western blot。B:WT神经元中MTMR5条带强度相对于总蛋白归一化(乙醇/MG132 vs 乙醇/抗霉素A)。C:完整MTMR2占总(完整+降解)条带的比例归一化。D:Rubicon条带强度相对于总蛋白归一化(A-D:N=3，单向ANOVA及Sidak检验)。E、F:线粒体损伤加速神经元Rubicon泛素化。E:WT皮质神经元裂解物经溶剂或30 nM抗霉素A处理2 h后，经Rubicon抗体或对照兔IgG免疫沉淀的代表性Western blot。F:定量 在用乙醇或抗霉素A处理的神经元中对Rubicon进行免疫沉淀后，泛素化Rubicon与总Rubicon的比例( 实验，双尾不成对 检验)。G-K自噬的负调节因子在应对线粒体应激时会被泛素化。G野生型小鼠胚胎皮质神经元裂解物中泛素富集测定的代表性蛋白质印迹。用 MG132处理神经元 ，然后再用 抗霉素A处理2小时(Ub珠=泛素化亲和珠)。H用Ub珠或对照珠进行下拉后Ub富集，以输入泳道中的强度进行归一化。I用Ub珠或对照珠进行下拉后MTMR5富集，以输入泳道中的强度进行归一化。J用Ub珠或对照珠进行下拉后MTMR2富集，以其在输入泳道中的强度进行归一化。K用Ub珠或对照珠进行下拉后Rubicon富集，以其在输入泳道中的强度进行归一化(G-K: 实验，双尾不成对 检验)。误差条表示SEM。源数据作为源数据文件提供。

MTMR5/2和Rubicon的降解代表了神经元对线粒体损伤的一种特异性反应

接下来，我们询问线粒体自噬负调控因子的靶向降解是一种特异性反应，还是其他线粒体自噬相关蛋白更普遍损失的一部分(图3A - H和补充图S4G)。为此，我们首先检测了MFN - 2蛋白的水平，已知其在Pink1/Parkin激活后会被降解。我们观察到MFN - 2的降解，证实了线粒体损伤的诱导(图3A，B)。接下来，我们检测了30 nM抗霉素A(Ant A)处理对Parkin(图3C)、TBK1(图3D)、RAB7(图3E)、BNIP3(图3F)以及线粒体蛋白(包括COX2(图3G)和Mitofilin(图3H))的影响，发现它们的水平总体上未受影响。

然后，我们研究了在自噬体生物发生和成熟过程中起关键作用的蛋白质(图3I - M和补充图S4H)。我们首先检测了VPS34的水平，它是PI3K复合物的一个组分，可促进自噬体生长膜上PI3P的合成，从而在自噬体生物发生中对抗MTMR5/2的功能 。我们观察到线粒体损伤后细胞中VPS34的水平没有显著变化(图3I)。我们还检测了自噬机制其他关键组分的水平，包括ATG5(图3J)、ATG7(图3K)、GABARAPs(图3L)和LC3(图3M)，以确定它们是否会因线粒体损伤而改变，但在用抗霉素A处理皮层神经元后，发现它们的总水平未受影响。我们确实注意到ATG5出现了一个明显的裂解产物，但发现其总水平相似(图3J和补充图S4H - ATG5)。

接下来，我们研究了溶酶体蛋白(图3N - R和补充图S4I)，因为这个细胞器在自噬体成熟中起关键作用。我们确实观察到溶酶体腔内蛋白酶组织蛋白酶B的水平显著降低(图3N，O)，这可能表明溶酶体活性增强以应对线粒体损伤，下面将更详细地研究。然而，我们没有观察到其他溶酶体蛋白水平的显著变化，如V - ATPase质子泵ATP6V1E1的亚基(图3N，P)或LAMP1(图3Q)和SCARB2(图3R)。

MTMR5和MTMR2属于14个成员的肌管素相关磷酸酶家族，所以我们检测了线粒体损伤对另外两个先前与自噬和/或线粒体损伤反应有关的MTMR家族成员表达水平的影响(图3S，T和补充图S4J)；在一项无偏向性蛋白质组学筛选中发现MTM1对PINK1活性变化有反应 ，并且MTMR14(也称为JUMPY)是先前已鉴定的自噬负调控因子 。然而，在用 抗霉素A处理的原代皮层神经元中，我们没有观察到MTM1或MTMR14表达水平的显著变化(图3S，T)，进一步证实了观察到的MTMR5和MTMR2在应对线粒体应激时降解的特异性。

最后，我们将这些观察结果与管家蛋白(图3U - W和补充图S4K)α/β - 微管蛋白、甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶(GAPDH)和肌动蛋白的水平进行了比较，在用抗霉素A处理皮层神经元后，它们的水平没有变化(图3U - W)。总体而言，这些结果表明线粒体损伤后MTMR5/2和Rubicon的降解代表了对特定靶点的清除，以解除对线粒体自噬的抑制。

接下来，我们测试了这些负调控因子的降解是否是作为对蚁酸A处理的特异性反应而被诱导的，或者是否可以由其他诱导线粒体损伤的范式引发。我们用靶向线粒体电子传递链不同组分的药物处理原代皮质神经元:寡霉素A(Oligo A)是线粒体ATP合酶(复合体V)的抑制剂，可阻断氧化磷酸化，而羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)是一种解偶联剂，可干扰线粒体内膜上的质子梯度，从而破坏线粒体膜电位。免疫印迹分析表明，用寡霉素A(500 nM， )或CCCP 处理皮质神经元足以诱导MTMR5、MTMRr2和Rubicon的协同降解(图4A-D)。这些发现证实，用蚁酸A升高线粒体ROS产生、用寡霉素A抑制ATP合成或用CCCP破坏线粒体膜电位均可触发该应激反应途径的激活。

接下来，我们询问其他形式的细胞器损伤是否会在神经元中诱导类似的反应。我们通过用 L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯(LLOMe)处理神经元 来靶向溶酶体，LLOMe是一种特征明确的药物，可破坏溶酶体膜的完整性，引发溶酶体自噬 ，这可通过SQSTM1/p62募集到受损溶酶体来监测 。与先前的发现一致，我们发现LLOMe处理诱导了围绕LAMP1阳性溶酶体形成大的p62聚集体，从而证实了溶酶体应激的诱导(补充图S5A)。然而，在这些条件下，我们未观察到MTMR5/2或Rubicon表达水平的变化(图4E-H)。在平行实验中，我们通过用 衣霉素处理神经元3小时来诱导内质网(ER)应激。转录因子ATF4 水平升高证实了ER应激的诱导(图4I，J)，但在这些条件下我们未观察到MTMR5、MTMR2或Rubicon水平的变化(图4I，K-M)。最后，我们研究了蛋白毒性应激的影响，蛋白毒性应激可通过用 MG132处理神经元3小时以诱导聚集体自噬 来诱导。我们观察到泛素化蛋白的积累(补充图S5B，C)，从而证实了蛋白毒性，但在用MG132处理的神经元中我们未观察到MTMR5、MTMR2和Rubicon水平降低(补充图S5D-G)。总之，这些结果表明，MTMR5、MTMR2和Rubicon的降解是对线粒体应激的反应，而不是对其他细胞应激源的反应，包括那些足以诱导溶酶体自噬、ER应激或

聚集性自噬，支持了我们的假设，即这是一种线粒体自噬特异性应激反应。 在神经元中 。与此一致的是，当我们用 寡聚A/5 Ant A处理原代小鼠星形胶质细胞时，与用载体(二甲基亚砜/乙醇)处理的细胞相比，我们检测到MFN-2显著减少(图4N、O)，从而证实了线粒体自噬的开始。在两种条件下，星形胶质细胞中的MTMR5水平都非常低，这与MTMR5被鉴定为一种神经元富集蛋白 一致。然而，

与神经元类似，星形胶质细胞对线粒体损伤剂有强烈反应，以触发Pink1/Parkin介导的线粒体自噬 ，尽管诱导这种反应通常需要比诱导线粒体自噬有效的浓度更高的药物浓度

图3 | 线粒体损伤不影响神经元中与线粒体自噬相关的大多数蛋白质的水平。A、B线粒体损伤引发MFN-2的降解，这是Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的结果。A用载体(乙醇)或30 nM Ant A处理野生型皮质神经元2小时，并用MFN-2进行检测的代表性蛋白质印迹。B用载体(乙醇)或Ant A处理的神经元中MFN-2水平的定量。C - H线粒体损伤不影响其他线粒体自噬相关蛋白和线粒体蛋白的水平。用载体(乙醇)或30 nM Ant A处理神经元2小时后，对其他线粒体自噬蛋白(C Parkin、D TBK1、E RAB7、F BNIP3)和线粒体蛋白(G COX2、H Mitofilin)水平的定量。I - M促进自噬的蛋白质水平在线粒体损伤期间未改变。用载体(乙醇)或30 nM Ant A处理神经元2小时后，对自噬相关蛋白(I VPS34、J ATG5、K ATG7、L GABARAP、M LC3)水平的定量。N、O线粒体损伤引发组织蛋白酶B的降解，可能是因为溶酶体功能增强。N用载体(乙醇)或 Ant A处理 野生型皮质神经元的代表性蛋白质印迹， 并用组织蛋白酶B和ATP6V1E1检测。O:载体(乙醇)或Ant A处理神经元后，组织蛋白酶B水平定量。P-R:线粒体应激期间溶酶体膜蛋白不受影响。用载体或30 nM Ant A处理神经元2小时后，定量溶酶体膜蛋白(P ATP6V1E1、Q LAMP1、R SCARB2)。S、T:线粒体损伤不靶向MTMR家族其他蛋白。处理后定量MTMR家族成员(S MTM1、T MTMR14)。U-W:管家蛋白在线粒体损伤后未变。处理后定量管家蛋白(U α/β-微管蛋白、V GAPDH、W肌动蛋白)。(统计:除COX2、BNIP-3和TBK-1外，其余蛋白均进行双尾非配对t检验；上述三种因数据非正态分布采用曼-惠特尼检验。误差条表示标准误。源数据见附件。) MTMR2(图4N，P)和Rubicon(图4N，Q)的水平更为稳定，且在不同条件下保持相当，没有证据表明线粒体损伤会导致其靶向降解。总体而言，这些发现表明星形胶质细胞中的线粒体损伤会触发Pink/Parkin介导的线粒体自噬，而不会降解MTMR5/2和Rubicon。同样，在一个广泛用于研究线粒体自噬的特征明确的细胞模型中，用Ant A/Oligo A或溶剂(DMSO/乙醇)处理转染了外源性Parkin 的HeLa细胞后，我们没有检测到这三种负调节因子的降解，尽管MFN-2水平降低，从而证实了线粒体损伤的诱导以及Pink1/Parkin线粒体自噬的启动(补充图S5H-L)。

综上所述，这些结果表明，虽然在所检测的所有三种细胞类型中，线粒体损伤均成功触发了Pink1/Parkin线粒体自噬，但MTMR5/2和Rubicon的选择性降解仅在神经元中出现。因此，我们得出结论，这种反应的激活对神经元中的线粒体应激具有特异性，并且主要靶向自噬的负调节因子。因此，我们将此称为线粒体应激反应(MitoSR)，并提出MitoSR是神经元对急性线粒体损伤的一种特异性细胞保护反应。

Rubicon定位于胞体溶酶体并抑制神经元中的溶酶体活性

线粒体损伤的诱导导致MTMR5、MTMR2和Rubicon的靶向降解，因此我们研究了这三种负调控因子的缺失如何增强线粒体降解。已知MTMR5和MTMR2共同作用，通过抑制自噬体上PI3P的形成 来抑制神经元自噬的早期步骤，因此这些蛋白质的降解预计会增强自噬体的生物发生。然而，Rubicon在调节神经元自噬中的作用尚未得到研究。

首先，我们检测内源性Rubicon，发现相对于HeLa细胞，神经元中的富集倍数约为3.5倍(图5A、B)。为了研究Rubicon的亚细胞定位，我们用人类Rubicon的EGFP标记构建体转染神经元并进行活细胞成像。我们发现Rubicon形成环状点状结构，主要分布在神经元胞体中(图5C)；在树突(图5D)和轴突(图5E)中也观察到点状结构，但频率较低。我们将自噬体标记物(mCherry-LC3)和溶酶体标记物(LAMP1-Halo)与EGFP-Rubicon一起共转染神经元。胞体内近60%的EGFP-Rubicon点状结构与LAMP1-Halo共定位，而只有10%的EGFP-Rubicon点状结构与mCherry-LC3共定位(图5F、G)。因此，在神经元以及非神经元细胞系A549和HeLa细胞 中，Rubicon定位于溶酶体和晚期内体。

Rubicon通过其C末端RH结构域与Rab7结合(图5H)，这种相互作用对胞吞运输产生负面影响，并且 在非神经元细胞如HEK293或 中对自噬体成熟产生负面影响。在这个RH结构域内，三个保守的半胱氨酸残基突变为甘氨酸(C912G、C915G、C923G)以及组氨酸残基突变为亮氨酸(H920L)(Rubicon )导致Rubicon与Rab7的相互作用完全丧失 。为了测试这个结构域是否决定Rubicon在神经元中的定位，我们将这些突变引入全长Rubicon并在神经元中表达这个构建体(图5H)，同时共表达mCherry-Rubicon 或mCherry-Rubicon 以及GFP-RAB7和LAMP1-Halo。虽然Rubicon 显示出强烈的膜结合并与RAB7和LAMP1都共定位，但Rubicon 仍位于胞质中，不再与RAB7或LAMP1共定位(图5I-K)。这一观察结果表明，Rubicon的RH结构域对于Rubicon在神经元中与溶酶体的结合至关重要，如结构研究 所示，它介导了与RAB7的相互作用。

据报道，Rubicon 通过抑制 PI3KC3-C2 复合物募集到正在生长的自噬体膜上，从而阻止自噬体成熟 。然而，在神经元中，我们发现 Rubicon 与溶酶体而非自噬体有显著关联(图 5G)。因此，我们探究 Rubicon 是否影响溶酶体生理功能。我们通过用靶向 shRNA 质粒进行核转染来敲低内源性 Rubicon，使内源性蛋白消耗约 60%(补充图 S6A、B)。我们用溶酶体示踪剂 Lyso-tracker Green 标记溶酶体，其在溶酶体的酸性环境中发出荧光，并用自噬染料 DAPRed 标记自噬体它掺入自噬体膜并在疏水环境中发出荧光 。与对照神经元相比，敲低 Rubicon 导致 Lyso-tracker Green 标记的溶酶体数量增加约 2.5 倍(图 6A、B)。我们还发现，在神经元中敲低 Rubicon 后，自噬体数量也显著增加(图 6A、C)。需要注意的是，DAPRed 染料掺入自噬体膜，并且在自噬体 - 溶酶体融合后仍会保持荧光；因此，该染料不能特异性区分自噬体和自溶酶体，所以敲低 Rubicon 后 DAPRed 斑点的增加可能反映自噬体生物合成增强或更多自溶酶体的形成。实际上，当我们测量 DAPRed 和 Lyso-tracker 斑点的共定位作为自噬体 - 溶酶体融合的指标时，我们发现从神经元中去除 Rubicon 后，每个神经元胞体中的自溶酶体数量增加了约 2.7 倍(图 6A、D)。

我们的数据表明，去除 Rubicon 会导致 Lyso-tracker 标记的溶酶体数量增加。这可能表明去除 Rubicon 后溶酶体生物合成增加，和/或可能表明 Rubicon 抑制溶酶体酸化，因此敲低 Rubicon 会导致酸化溶酶体比例增加。为了确定 Rubicon 是否影响溶酶体生物合成，我们敲低 Rubicon 并检测

溶酶体蛋白LAMP1和SCARB2的水平。实际上，我们观察到在Rubicon缺失后这两种蛋白的水平显著增加(补充图S6C - E)，从而表明Rubicon对溶酶体生物合成起负调控作用。接下来，我们测试了Rubicon对溶酶体功能的影响。对于这个实验，我们用两种溶酶体标记染料LysoPrime Green 和pHLys Red(见方法)处理神经元。虽然LysoPrime Green对pH有抗性，因此标记溶酶体的总量，而pHLys Red在去酸化时从细胞器中扩散出来，因此优先标记酸性更强的溶酶体池。我们用这两种染料依次标记神经元，然后使用 巴弗洛霉素A1使溶酶体部分去酸化 小时以增加检测的动态范围

图4 | MitoSR激活特异性清除神经元线粒体损伤并靶向自噬负调控因子。A-D:多种线粒体自噬诱导剂协同降解MTMR5、MTMR2和Rubicon。A:野生型皮质神经元裂解物经载体(乙醇/DMSO)、抗霉素A、寡霉素A或CCCP处理2h后的代表性Western blot(浓度见图)。B:处理后MTMR5水平占总蛋白比值。C:完整MTMR2占总量(完整+降解)比值。D:Rubicon条带强度占总蛋白比值(A-D:N=4，单因素方差分析+Dunnett检验)。E-H:溶酶体损伤不触发上述因子降解。E:野生型小鼠胚胎皮质神经元裂解物经载体(乙醇)或1 mM亮抑酶肽处理2h后的Western blot。F-H:与载体相比，亮抑酶肽处理后MTMR5、MTMR2及Rubicon水平的倍数变化(E-H:N=3，Mann-Whitney检验)。I-M:内质网损伤 不会触发自噬负调控因子的降解。I 用载体(二甲基亚砜)或 衣霉素(TM)处理野生型小鼠胚胎皮层神经元裂解物的代表性蛋白质免疫印迹。与载体处理相比，野生型神经元用 TM 处理后 ATF4 水平的变化倍数 。与载体处理相比，野生型神经元用 TM 处理后 MTMR5 水平的变化倍数。与载体处理相比，野生型神经元用 TM 处理后 MTMR2 水平的变化倍数。与载体处理相比，野生型神经元用 TM 处理后 Rubicon 水平的变化倍数(I - M: 实验，曼 - 惠特尼检验)。N - Q 星形胶质细胞中的线粒体损伤不会触发 MitoSR。N 用载体(乙醇、二甲基亚砜)或 抗霉素 A、 寡霉素 A 处理野生型小鼠星形胶质细胞 6 小时后的代表性蛋白质免疫印迹。与载体处理相比，野生型星形胶质细胞用 抗霉素 A、 寡霉素 A 处理后 MFN - 2 水平的变化倍数。与载体处理相比，野生型星形胶质细胞用 抗霉素 A、 寡霉素 A 处理后 MTMR2 水平的变化倍数。与载体处理相比，野生型星形胶质细胞用 抗霉素 A、 寡霉素 A 处理后 Rubicon 水平的变化倍数 实验，曼 - 惠特尼检验)。误差线表示标准误。源数据作为源数据文件提供。 (图 6E)。在 孵育后，使用共聚焦显微镜对神经元进行实时成像。我们观察到，在 Rubicon 敲低的神经元中，由 LysoPrime Green 标记的总溶酶体数量有少量增加，但无统计学意义(图 6F、G)。更显著的是，我们发现 Rubicon 敲低后，由 pHLys Red 标记的酸性溶酶体数量显著增加(图 6F、H)。我们对 Rubicon 敲低后酸性溶酶体与总溶酶体的比例进行了量化，发现在 Rubicon 缺失的神经元中该比例显著增加(图 6F、I)。为了扩展这一观察结果，我们询问 Rubicon 敲低后观察到的酸性溶酶体数量增加是否代表功能性溶酶体数量的相应增加。为了测试这一点，我们敲低 Rubicon，并使用 Magic Red(一种在溶酶体蛋白酶组织蛋白酶 B 水解时发出荧光的染料)测量功能性活性溶酶体的数量。我们发现 Rubicon 敲低后 Magic Red 斑点数量增加了约 1.8 倍(图 6J、K)，证明 Rubicon 在调节神经元溶酶体活性中起作用。因此，总体而言，这些结果表明 Rubicon 影响溶酶体生物发生并调节神经元中的溶酶体 和降解功能。

接着，我们探究了Rubicon对溶酶体功能的影响如何作用于神经元中自噬体的成熟。在神经元胞体中，大多数由LC3标记的自噬体通常是对LAMP1 也呈阳性的自噬溶酶体。然而，有趣的是，我们发现与EGFP-Rubicon相关的大多数溶酶体(由LAMP1-Halo标记)并不与自噬体(由mCherry-LC3标记)共定位(图6L，M)。因此，我们质疑Rubicon是否会阻断神经元中自噬体与溶酶体的融合。为此，我们将EGFP或EGFP-Rubicon与mCherry-LC3和LAMP1-Halo一起转染到神经元中。我们发现过表达Rubicon后，每个神经元胞体中mCherry-LC3斑点的数量没有变化(图6N，O)。然而，当我们将mCherry-LC3和LAMP1-Halo之间的共定位作为自噬溶酶体形成的指标进行测量时，我们发现EGFP-Rubicon的过表达导致mCherry-LC3和LAMP1-Halo均呈阳性的斑点减少了约50%(图6N，P)。

为了确定自噬溶酶体数量的减少是由于自噬体与溶酶体融合减少还是由于自噬体生物发生受到抑制，我们对过表达EGFP或EGFP-Rubicon的神经元中LAMP1 LC3 自噬溶酶体与总LC3 自噬体的比例进行了量化。在过表达EGFP的神经元中，我们发现几乎约70%的LC3*自噬体与溶酶体共定位；在过表达GFP-Rubicon的神经元中，这个数字降至约34%，表明自噬体与溶酶体的融合下降了约50%(图6N，Q)。这一发现与我们的敲低实验结果相关， 在敲低Rubicon后我们观察到自噬溶酶体数量增加(图6A，D)，共同表明去除Rubicon会触发神经元中的自噬流。与此一致的是，当我们从神经元中耗尽Rubicon时，我们看到神经元中最丰富的自噬货物之一突触素-1的水平降低 ，这表明自噬导致的周转率增加(补充图S6F，G)。因此，我们的数据表明Rubicon通过影响溶酶体的生物发生和功能来严格调节神经元中的自噬流。

负调控因子的缺失促进神经元中的线粒体自噬通量

先前的研究表明，与肌管蛋白相关的蛋白质MTMR5和MTMR2相互作用以抑制神经元中的自噬体形成 ，而我们在此发现，Rubicon负向调节溶酶体功能以调节自噬体 - 溶酶体融合。因此，在急性线粒体应激期间，当MitoSR被激活时，预计MTMR5、MTMR2和Rubicon的协同降解会上调自噬通量，以促进受损线粒体的有效周转。因此，我们询问这些负调控因子的缺失是否足以促进在低于触发MitoSR阈值的轻度氧化损伤水平下的神经元中更有效的线粒体自噬通量(图1A - 3 nM Ant A)。从疾病的角度来看，这可能代表一种强大的治疗方法，因为据认为，大多数自噬受损的神经疾病本质上是慢性的，随着时间的推移，神经元经历低水平但持续的线粒体应激。这些水平可能不足以激活MitoSR，导致受损线粒体的清除效率低下。为了验证这一假设，我们在DIV = 0时用针对Rubicon和PI3P磷酸酶Mtmr2的shRNA质粒对神经元进行核转染。在敲低6 - 7天后(补充图S7A - C)，我们进行了线粒体自噬通量测定(图7A)。在该测定中，我们用线粒体自噬染料DMP Red标记神经元，该染料主要标记酸化的线粒体，表明它们被吞噬在酸化的自溶酶体内(见方法) 。作为额外的测试，我们使用溶酶体追踪染料标记酸性溶酶体，并检查线粒体自噬染料与溶酶体追踪染料之间的共定位，以量化线粒体自噬溶酶体的数量。在基础条件下，与线粒体是神经元自噬体的主要货物一致 ，MTMR2和Rubicon的协同去除能够通过自噬促进线粒体周转增加，如DMP Red和溶酶体追踪染料的共定位增加所示(补充图S7D，E)。接下来，我们诱导轻度线粒体损伤，通过用 Ant 处理神经元 来模拟神经退行性疾病的慢性病例，然后进行 追赶以探测线粒体自噬通量的变化。与处理的神经元相比

与对照短发夹RNA相比，MTMR2和鲁比肯蛋白的组合敲低导致线粒体自噬溶酶体数量显著增加(图7B、C)。MTMR2和鲁比肯蛋白的联合缺失导致低水平线粒体应激的神经元中线粒体自噬通量增加约三倍。这一观察结果表明，自噬负调节因子的靶向缺失可导致低水平氧化应激下线粒体更新增强。 自噬负调节因子可导致低水平氧化应激下线粒体更新增强。

由于MTMR2影响自噬体生物发生的早期步骤，而Rubicon主要影响自噬体成熟的后期步骤，我们想知道这些蛋白质是独立发挥作用还是协同作用来抑制线粒体自噬。为了验证这一点，我们分别敲低了

图5 | Rubicon在神经元中定位于溶酶体是依赖RAB7的。

A、B Rubicon在神经元中表达增强。A为HeLa细胞或野生型小鼠胚胎皮质神经元裂解物的代表性Western blot，检测Rubicon。B Rubicon条带强度相对于HeLa细胞或野生型神经元总蛋白归一化(N=3，双尾非配对t检验)。C-E显示Rubicon定位于初级皮质神经元的胞体、树突和轴突中的细胞器。C、D、E分别为转染EGFP-Rubicon的野生型皮质神经元胞体、树突和轴突的代表性最大投影。F、G显示Rubicon与晚期内体/溶酶体标记物LAMP1-Halo共定位，但不与自噬体标记物mCherry-LC3共定位。F为转染mCherry-LC3、LAMP1-Halo和EGFP-Rubicon的野生型皮质神经元胞体的单Z平面共聚焦图像。黄色框标示EGFP-Rubicon与LAMP1-Halo或mCherry-LC3共定位区域。 G 每个神经元胞体中与LAMP1 - Halo或mCherry - LC3共定位的EGFP - Rubicon斑点数量的比例( 实验，双尾不成对 检验)。H - K Rubicon定位于溶酶体是RAB7依赖性的。H Rubicon 和Rubicon 的结构域组织示意图，标注了RUN、PI3K结合结构域(PIKBD)和Rubicon同源性(RH)结构域(结构域未按比例绘制)。I 用GFP - RAB7、LAMP1 - Halo和mCherry - Rubicon 或mCherry - Rubicon 转染的神经元胞体的单z平面共聚焦图像。黄色框表示插入区域。J 每个神经元胞体中与mCherry - Rubicon 或mCherry - Rubicon 共定位的总GFP - RAB7面积的比例。K 每个神经元胞体中与mCherry - Rubicon 或mCherry - Rubicon 共定位的总Halo - LAMP1面积的比例(I - K: 实验，双尾不成对 检验)。所有面板:误差条表示SEM，比例尺 。源数据作为源数据文件提供。 神经元中的MTMR2(补充图S7F、G)和Rubicon(补充图S6A、B)，并测试了轻度线粒体损伤(3 nM抗霉素A)对线粒体自噬通量的影响。我们发现，与对照相比，MTMR2的缺失导致线粒体自噬溶酶体数量适度增加(图7D、E)。然而，在敲低Rubicon的神经元中，我们观察到线粒体自噬溶酶体数量显著增加(图7D-E)。当我们对变化进行量化时，我们发现敲低Rubicon导致线粒体自噬通量增加约2倍(图7F)。同样有趣的是，在野生型Rubicon水平的对照神经元中，用载体处理和抗霉素A处理的线粒体自噬体数量之间没有显著变化(图7D、E)。这一观察结果强化了我们的发现，即在轻度氧化应激下(比较图1A中载体与3 nM抗霉素A处理)，负调节因子，尤其是Rubicon的水平没有变化，并且这些水平足以抑制线粒体更新。此外，我们的结果表明，敲低Rubicon对线粒体自噬通量的影响比敲低MTMR2更大(图7F)，这可能是因为MTMR2在自噬途径的早期起作用，而Rubicon主要通过阻断自噬体 - 溶酶体融合影响倒数第二步。

讨论

线粒体功能障碍会对神经元健康产生毁灭性影响，并与包括帕金森病(PD)或肌萎缩侧索硬化症(ALS) 在内的几种神经系统疾病的发病机制有关。神经元的终末分化特性使得这些细胞必须修复或降解受损的线粒体，以防止活性氧(ROS) 和/或线粒体DNA 的释放。在这里，我们报告了在神经元中高水平线粒体损伤时触发的线粒体自噬应激反应(Mitophagic Stress Response，或MitoSR)。MitoSR与经典的Pink1/Parkin介导的线粒体自噬途径并行运作(图8)，通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)触发Rubicon的降解，以及通过蛋白水解和UPS触发MTMR5和MTMR2的降解。这些负调节因子通过不同但互补的机制积极抑制自噬流，而靶向敲低MTMR2和Rubicon足以显著刺激神经元线粒体自噬。

已表明受损的线粒体可引发多种应激反应途径。例如，作为特征明确的综合应激反应机制的一部分，受损的细胞器可通过启动翻译延伸因子eIF 的磷酸化从而使其失活，来减弱线粒体蛋白的翻译。或者，线粒体内错误折叠的蛋白质可诱导线粒体蛋白酶、伴侣蛋白和ROS解毒酶的转录激活，以通过一种称为线粒体未折叠蛋白反应 的途径启动修复过程。线粒体功能障碍还可抑制蛋白质导入细胞器，通过一种称为错误靶向蛋白激活的未折叠蛋白反应(UPRam) 的途径，触发细胞质中积累的线粒体蛋白的蛋白酶体降解。 (UPRam) 。虽然启动这些机制是为了修复受损的线粒体以恢复其功能，但线粒体自噬是一种降解机制，用于消除不可逆受损的有毒线粒体片段。MitoSR是在急性线粒体应激条件下被诱导的，它能使神经元更有效地降解受损的细胞器。由于这种细胞类型具有高代谢活性和有丝分裂后特性，这种反应在神经元中可能尤为关键。

我们的结果表明，MitoSR对自噬负调节因子的降解主要是由蛋白酶体机制介导的，而不是由自噬体介导的。先前有报道称蛋白酶体机制在基础条件下调节几种自噬蛋白(WIPI2 、ULK1 、ATG16L9 )的水平。与此一致，我们现在发现Rubicon的水平在基础水平上由E3连接酶HECDT1调节。与此无关的是，线粒体损伤还会触发几种线粒体外膜蛋白 的蛋白酶体降解。然而，MitoSR的激活代表了一种协调反应，即在高氧化应激条件下，降解多种自噬抑制剂以加速线粒体更新。确实引人注目的是，MitoSR对线粒体应激具有特异性，因为当我们分别使用硫代乙酰胺(LLOMe) 或衣霉素(Tunicamycin) 诱导神经元中的溶酶体或内质网损伤时，我们没有检测到这些负调节因子的降解。此外，在原代星形胶质细胞或HeLa细胞中，线粒体损伤不会激活MitoSR，这表明这种激活可能是神经元对高水平线粒体应激的特异性反应。

与先前报道的抑制自噬体生物发生的MTMR5-MTMR2复合物 一起，我们在此确定Rubicon是基础神经元自噬的关键负调节因子(图6和8)。Rubicon在神经元中大量表达，并定位于胞体LAMP1阳性内涵体或溶酶体。与先前关于Rubicon在非神经元 中的研究一致，我们发现在神经元中，Rubicon通过其C末端RH结构域以RAB7依赖性方式募集到溶酶体膜上。与最近在HeLa细胞中的发现 相反，我们发现在神经元中，Rubicon通过调节溶酶体生理对线粒体自噬具有强大的抑制作用。当Rubicon被耗尽时，酸性溶酶体的数量显著增加，自噬溶酶体的数量增加得更多。据此，当在神经元中敲低Rubicon时，我们观察到溶酶体功能增加(通过组织蛋白酶B活性测量)。因此，在神经元中，Rubicon与溶酶体结合(图5F，G)并调节溶酶体酸化(图6F，I)，从而调节其水解活性(图6J，K)。这种抑制直接影响自噬的后期步骤，主要影响自噬体-溶酶体融合(图6N，Q)。因此，MTMR5/2抑制自噬的早期步骤 ，而Rubicon主要调节后期步骤，在自噬受损的神经疾病背景下，这两者都是关键的调节节点 。

我们实验室之前的研究表明，线粒体自噬体与溶酶体的融合很慢，实际上是神经元线粒体自噬的限速步骤 。在此，我们为这种融合延迟提供了一个机制基础。在低损伤水平(3 nM)时，鲁比肯蛋白未被降解(图1A、D)，鉴于其在阻断自噬体-溶酶体融合中的作用(图6N、Q)，它会阻碍溶酶体对线粒体自噬体的酸化。然而，当线粒体应激反应在更高损伤水平被激活时，鲁比肯蛋白的降解促进了携带受损线粒体的自噬体与溶酶体的融合。 与这一假设一致，当我们降低神经元中鲁比肯蛋白的水平并诱导轻度线粒体损伤时，我们观察到线粒体自噬通量增加了两倍。此外，在敲低MTMR2后，我们也看到线粒体自噬通量有适度增加。作为线粒体应激反应的一部分，敲低MTMR2会上调自噬体的形成，但由于鲁比肯蛋白在下游控制这些自噬体与溶酶体的融合，它成为调节通量的限制因素。

我们的研究为未来的研究开辟了有趣的途径。为什么神经元需要对自噬进行如此严格的负调控？什么

图6 | Rubicon抑制溶酶体功能和自噬体成熟。

A - D Rubicon基因敲低增加了皮质神经元中溶酶体和自噬溶酶体的数量。A用对照或Rubicon shRNA进行核转染并用DAPRed和溶酶体追踪染料处理的神经元的单z平面共聚焦图像。用青色虚线表示用于定量的神经元胞体轮廓。黄色框表示插入区域。B对照与Rubicon基因敲低神经元中每个神经元胞体的溶酶体数量(由溶酶体追踪染料斑点标记)的变化倍数。C对照与Rubicon基因敲低神经元中每个神经元胞体的自噬体数量(由DAPRed斑点标记)的变化倍数。D对照与Rubicon基因敲低神经元中每个神经元胞体的自噬溶酶体数量(由DAPRed和溶酶体追踪染料斑点共定位标记)的变化倍数(A - D: 实验，曼 - 惠特尼检验)。E示意图描绘了在神经元中使用LysoPrime Green、pHLys Red分别标记总溶酶体和酸性溶酶体，然后用75 nM巴弗洛霉素A1处理进行溶酶体pH检测分析的步骤。F - I Rubicon对神经元中的溶酶体酸化有负面影响。F用Ctrl或Rubicon shRNA进行核转染并按照(E)中方案检测溶酶体pH的神经元的代表性最大投影。用青色虚线表示用于定量的神经元胞体轮廓。G对照或Rubicon基因敲低神经元中由LysoPrime Green标记的溶酶体总数。H对照或Rubicon基因敲低神经元中由pHLys Red标记的酸性溶酶体数量。I对照或Rubicon基因敲低神经元中酸性溶酶体与总溶酶体的比例(F - I: 实验，双尾不成对 检验)。 J、K Rubicon基因敲低增加了具有蛋白水解活性的溶酶体数量。J用对照或Rubicon shRNA进行核转染并用Magic Red染料处理的神经元的单z平面共聚焦图像。用青色虚线表示用于定量的神经元胞体轮廓。K对照与Rubicon基因敲低神经元中每个神经元胞体的Magic Red斑点数量的变化倍数( 实验，曼 - 惠特尼检验)。(L、M)Rubicon与溶酶体相关但与自噬溶酶体无关。L用EGFP - Rubicon、LAMP1 - Halo和mCherry - LC3转染的神经元的单z平面共聚焦图像。用青色虚线表示用于定量的神经元胞体轮廓。黄色框表示插入区域。M在胞体中与EGFP - Rubicon共定位的溶酶体(LAMP1 - Halo)与mCherry - LC3共定位或不共定位的比例( 实验，双尾不成对 检验)。N - Q Rubicon的过表达抑制自噬体成熟。N用mCherry - LC3、LAMP1 - Halo和EGFP或EGFP - Rubicon转染的神经元的单z平面共聚焦图像。黄色框表示插入区域。O每个表达EGFP或EGFP - Rubicon神经元胞体的自噬体数量(由mCherry - LC3斑点标记)。P每个表达EGFP或EGFP - Rubicon神经元胞体的自噬溶酶体数量(由mCherry - LC3和LAMP1 - Halo斑点共定位标记)。Q每个表达EGFP或EGFP - Rubicon神经元胞体的自噬溶酶体(LAMP LC3 )与自噬体(LC3 )的比例( 实验，双尾不成对 检验)。所有面板:误差条表示SEM，比例尺 。源数据作为源数据文件提供。 如果自噬在神经元中急性或慢性上调会发生什么？一项在近端肾小管上皮细胞中进行的有趣研究表明，在没有Rubicon的情况下，溶酶体功能不堪重负 。通过自噬，不同细胞器膜的磷脂会过度转移到溶酶体，导致形成膨胀的高活性溶酶体。我们的研究表明，在神经元中，Rubicon同样作为调节溶酶体功能的关键检查点。通过调节溶酶体生理功能，Rubicon可能控制基础自噬通量，以防止自噬溶酶体对细胞成分的分解失调。据报道，抑制自噬体成熟或溶酶体功能会触发细胞外囊泡分泌自噬货物 ，这一过程被称为“溶酶体抑制期间的分泌自噬(SALI)”。鉴于Rubicon在调节溶酶体功能和自噬后期步骤中的作用，探索该蛋白在分泌自噬中的作用将很有趣。

总之，我们在此确定了多种应激反应机制，统称为线粒体应激反应(MitoSR)，这些机制在急性线粒体损伤时被激活，通过降解自噬的负调节因子来增加线粒体自噬。我们揭示了Rubicon通过调节溶酶体功能在抑制神经元自噬中的机制性作用。此外，我们表明，在轻度线粒体应激下，靶向消耗这些负调节因子可以促进受损线粒体的自噬周转。这一发现可能在慢性神经退行性疾病中尤为重要，在这些疾病中，线粒体应激可能较轻，但会随着时间的推移持续加剧。因此，我们提出，在帕金森病或肌萎缩侧索硬化症患者的退化神经元中，线粒体自噬受损，靶向自噬的负调节因子可能会增强线粒体周转，并防止这些疾病特有的功能失调线粒体的病理积累。

方法

伦理声明

本研究是根据美国国立卫生研究院(NIH)的《实验动物饲养与使用指南》进行的。所有涉及动物的实验均遵循宾夕法尼亚大学机构动物护理与使用委员会批准的方案。

化学物质和试剂

使用以下化学品:乙醇(Decan Labs，#2716)、二甲基亚砜(DMSO，Sigma Aldrich，#D2650)、抗霉素A (Sigma Aldrich，#A8674)、巴弗洛霉素A1(Sigma，Aldrich，#SML1661)、MG132(Selleckchem，#S2619)、寡霉素A(Sigma Aldrich，#75351)、CCCP(Sigma Aldrich #C2759)、LLoMe(Cayman Chemicals #16008)、PYR 41(Tocris Bioscience #2978)、EGTA(RPI #E14100)、BAPTA(Invitrogen™ #B6769)、衣霉素(Sigma Aldrich #T7765)。用于体外培养的以下试剂:聚-L-赖氨酸(Sigma Aldrich #P1274)、聚-D-赖氨酸(Gibco #A3890401)、马血清(Gibco #16050122)、胎牛血清(Sigma Aldrich #F2442)、丙酮酸钠(Gibco #11360070)、D-(+)-葡萄糖溶液(Sigma Aldrich #G8769)、氯化钠(NaCl，Fisher BioReagents #BP358-1)、最低必需培养基(MEM，Gibco #11095072)、谷氨酰胺(Gibco #35050061)、青霉素-链霉素(10,000 U/mL，Gibco #15140122)、神经基础培养基(Gibco # 21103049)、无血清B27补充剂(Gibco #17504044)、Hibernate® E低荧光(TransnetyxYX Tissue #HELF-500 ml)、阿糖胞苷(Sigma Aldrich，#C6645)、杜氏改良 Eagle 培养基(DMEM，Corning，#10-017-CM)、高糖和丙酮酸钠DMEM(Gibco #11995073)。

实验模型和研究对象详情

本研究中使用的小鼠品系包括野生型[C57BL/6J (RRID: IMSR_JAX:000664)]和帕金 [B6.129S4-Prkntm1Shn/J (RRID: IMSR_JAX:006582)]。按照宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准的方案，在第15.5天从小鼠胚胎中取出皮质。用0.25%胰蛋白酶消化后研磨分离神经元。然后将神经元悬液接种在聚-L-赖氨酸包被的培养板上的贴壁培养基(MEM和补充剂，包括10%马血清、1mM丙酮酸钠、 D-葡萄糖和 )中。贴壁后(5-6小时)，将培养基换成维持培养基(MM)[Neurobasal和补充剂，包括33 mM D-葡萄糖、2 mM GlutaMax、37.5 mM NaCl、青霉素(100单位/毫升)/链霉素(100毫克/毫升)和2% B27]。在接下来的一天，加入5μM阿糖胞苷以限制非神经元细胞如神经胶质细胞的生长。对于涉及用shRNA质粒敲低的实验，使用体外培养6-7天(DIV)的神经元。其他实验使用DIV 8-10的神经元进行。

该方案改编自:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.81wgby723vpk/v1

根据先前发表的方案 分离原代小鼠星形胶质细胞。

该方案改编自:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.e6nvwdp9wlmk/v1

HeLa-M细胞(在正文中称为HeLa，由英国剑桥医学研究所的Andrew Peden馈赠)分别通过STR分析和MycoAlert检测试剂盒(Lonza，LT07)进行了鉴定和支原体污染检测。细胞在杜氏改良 Eagle 培养基中培养，并添加1%谷氨酰胺和10%胎牛血清。

神经元、星形胶质细胞和HeLa细胞在 条件下于单独的培养箱中，添加 进行培养。

转染

使用Lipofectamine 2000(赛默飞世尔科技产品编号11668019)转染小鼠胚胎皮质神经元。总共1.5μg DNA

图7 | MTMR2和Rubicon的缺失促进受损线粒体的自噬清除。A示意图描绘了分别使用DMP Red和溶酶体追踪染料标记酸化线粒体和溶酶体的线粒体自噬检测步骤。B、C MTMR2和Rubicon的缺失增加了自噬体中吞噬的线粒体数量。B用对照或Mtmr2和Rubicon短发夹RNA转染神经元并按照(A)中方案进行线粒体自噬检测的代表性最大投影图。用青色虚线表示用于定量的神经元胞体轮廓。黄色框表示插入区域。C用对照或Mtmr2和Rubicon短发夹RNA转染神经元并按照(A)中方案进行线粒体自噬检测的每个胞体的线粒体自噬溶酶体数量(由DMP Red和溶酶体追踪染料共定位斑点标记) 实验，双尾非配对t检验)。D - F Rubicon的缺失是 足以显著增强线粒体自噬通量。D用对照、Mtmr2或Rubicon短发夹RNA转染神经元并按照(A)中方案进行线粒体自噬检测的代表性最大投影图。用青色虚线表示用于定量的神经元胞体轮廓。黄色框表示插入区域。E用对照、Mtmr2或Rubicon短发夹RNA转染神经元并按照(A)中方案进行线粒体自噬检测的每个胞体的线粒体自噬溶酶体数量(由DMP Red和溶酶体追踪染料共定位斑点标记)。F用对照、Mtmr2或Rubicon短发夹RNA转染神经元并按照(A)中方案进行线粒体自噬检测的每个胞体的线粒体自噬通量的变化倍数(D - F: 实验，Kruskal - Wallis检验)。所有图:误差条表示标准误，比例尺 。源数据作为源数据文件提供。

图8 | 模型:MTMR5/2和Rubicon在基础条件下抑制神经元自噬，而急性线粒体应激通过线粒体自噬受体(MitoSR)诱导这些负调节因子的选择性降解。上图描绘了MTMR5/2和Rubicon在基础条件下抑制神经元自噬的作用。MTMR5/2的活性将PI3P水解为PI，抑制自噬体生物发生的早期步骤 。Rubicon阻断溶酶体酸化和自噬体 - 溶酶体融合，从而影响自噬的后期步骤。下图描绘了线粒体自噬受体(MitoSR)的诱导，其与Pink1 / Parkin途径并行作用，以响应神经元中的线粒体损伤引发线粒体自噬。线粒体自噬受体(MitoSR)的激活诱导MTMR5、MTMR2和Rubicon的泛素化，并将这些负调节因子靶向蛋白酶体进行降解。MTMR5和MTMR2也会发生蛋白水解降解。这种协同降解促进了自噬通量的增加，促进了线粒体更新。与 Lipofectamine混合并在室温(RT)下孵育 以形成DNA - 脂质复合物。然后将混合物加入新鲜的MM中的神经元中并孵育 ，之后将培养基替换为1:1条件培养基:新鲜MM。在成像前，神经元转染18 - 24小时。以下质粒用于转染:EGFP - Rubicon(RRID:Addgene_221659)、LAMP1 - Halo(RRID:Addgene_221655)、mCherry - LC3(RRID:Addgene_221656)、mCherry - Rubicon (RRID:Addgene_221657)、mCherry - Rubicon (RRID:Addgene_221658)和EGFP - Rab7A(RRID:Addgene_28047)、EGFP - N1(RRID:Addgene_6085 - 1)。在处理前，使用Lipofectamine 2000将 无标签的人Parkin(RRID:Addgene_187897)转染HeLa细胞18 - 24小时。

该方案改编自:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.81wgby723vpk/v1

核转染

在解剖当天，胰蛋白酶消化后，将悬浮的胚胎神经元用shRNA质粒进行核转染。根据制造商的方案，在来自Lonza的Amaxa核转染仪II设备中进行核转染。对于每个 神经元，使用 的shRNA质粒进行核转染。使用的质粒如下:非靶向shRNA对照质粒DNA(Sigma Aldrich；SHC016)、TRC小鼠Rubicon shRNA(Sigma Aldrich；TRCN0000283271)、TRC小鼠Mtmr2 shRNA(Sigma Aldrich；TRCN0000030094)

该方案改编自:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.kqdg3wo9zv25/v1

蛋白质免疫印迹法

样品在RIPA缓冲液(50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠和0.1% SDS，pH = 7.4)中裂解，该缓冲液添加了Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂(ThermoFisher Scientific，货号#78442)，于 下处理 。随后将样品于 离心，收集上清。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(ThermoFisher Scientific，货号#23225)测定上清中的蛋白浓度。然后将样品于 变性，并在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离。凝胶上分离的蛋白随后于 转印至Immobilon-FL PVDF膜(Millipore)，转印时间为 。转印后，将膜在室温下干燥 ，然后用甲醇复水。随后将膜用Revert™ 700总蛋白染色液(Licor，货号#926-11021)染色5分钟，用含6.7%乙酸和30%甲醇的水洗涤两次，然后在Odyssey CLx红外成像系统(Li-COR)中成像。此后，将膜用含30%甲醇的0.1 M NaOH脱色。将膜在EveryBlot封闭缓冲液(Bio-Rad，货号#12010020)中封闭5分钟，然后于 与相应的一抗孵育过夜。次日，将膜用含0.1% Tween-20的 TBS(50 mM Tris-HCl、274 mM NaCl、9 mM KCl)(TBST)洗涤三次。将膜与相应的二抗在室温下孵育 ，用TBST洗涤三次，然后在Odyssey CLx红外成像系统中成像。如需剥离膜，则在 NewBlot™ IR剥离缓冲液(Licor，货号#928-40028)中于室温下处理20分钟，并从封闭步骤开始重新检测。条带强度使用Image Studio 软件(Li-COR)进行定量。本研究中使用了以下一抗:Rubicon 1:1000(CST D9F7；RRID: AB_10891617)、MTMR2 1:2000(sc-365184；RRID: AB_10708283)、MTMR5 1:500(sc-393488；RRID: AB_3097714)、Parkin 1:1000(CST 2132；RRID: AB_10693040)、VPS34 1:2000(NB110-87320SS；RRID: AB_1199455)、Mitofusin-2 1:1000(sc-100560；RRID: AB_2235195)、ATG7 1:1000(ab133528；RRID: AB_2532126)、ATG5 1:1000(ab108327；RRID: AB_2650499)、GAPDH 1:1000(ab9484；RRID: AB_307274)、Actin 1:1000(Sigma Aldrich MAB1501R；RRID: AB_2223041)、Tubulin 1:2000(CST 2148；RRID: AB_2288042)、LC3B 1:1000(ab48394；RRID: AB_881433)、Ubiquitin 1:1000(sc-8017；RRID: AB_628423)、LAMP1 1:1000(DSHB 1D4B，RRID: AB_2134500)、Mitofilin 1:1000(ab110329，RRID: AB_10859613)、HECTD1 1:2000(ab101992，RRID: AB_10711075)、ATF4 1:1000(CST 11815，RRID:AB_2616025)、SCARB2 1:1000(LSBio LS-B305，RRID:AB_2182974)、Synapsin-1 1:2000(Sigma AB1543P，RRID:AB_90757)、RAB7 1:1000(ab50533，RRID:AB_882241)、BNIP3 1:500(sc56167，RRID:AB_2066767)、TBK-1 1:1000(CST 3013，RRID:AB_2199749)、COX2 1:2000(ab198286，AB_2861364)、GABARAP 1:1000(ab109364； RRID:AB_10861928)，组织蛋白酶B，稀释比例1:1000(CST 31718，RRID:AB_2687580)；ATP6V1E1，稀释比例1:1000(Sigma GW22284F，RRID: AB_1845192)；MTM1，稀释比例1:500(Proteintech 13924-1-AP，RRID:AB_2147700)；MTMR14，稀释比例1:500(Proteintech 14973-1-AP，RRID:AB_2147828)。以下二抗使用的稀释比例为1:20,000:IRDye® 800CW驴抗小鼠IgG(Li-cor #926-32212，RRID: AB_621847)；IRDye® 680RD驴抗小鼠IgG(Li-cor # 926-68072，RRID: AB_1095362)；IRDye® 800CW驴抗兔IgG(Li-cor # 926-32213，RRID: AB_621848)；IRDye® 680RD驴抗兔IgG(Li-cor # 926-68073，RRID: AB_10954442)；IRDye® 680RD驴抗鸡二抗(Li-cor #926- 68075, RRID:AB_10974977)；IRDye® 800CW山羊抗大鼠IgG二抗(Li-cor # 926-32219，RRID: AB_1850025)

该方案改编自:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.5jyl8j5zrg2w/v1

自噬、溶酶体功能和线粒体自噬的检测

为了检测自噬，将神经元在新鲜的MM中与50 nM DAP Red(同仁化学研究所，D677 - 10)在 下孵育 。吸出培养基，并用新鲜的MM洗涤神经元。然后将神经元与含有 溶酶体示踪剂绿色(赛默飞世尔科技#L7526)的新鲜MM在 下再孵育 ，并在含有 溶酶体示踪剂绿色的成像培养基中进行实时成像。

详细方案可在:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.36wgqqkz3gk5/v1获取

为了测试溶酶体功能，将神经元在新鲜的MM中与魔红底物(MR - RR2)(伯乐，ICT937)以终浓度1:4000孵育15分钟，温度为 。孵育后，在含有1:4000稀释的魔红底物的成像培养基中对神经元进行实时成像。

详细方案可在:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.5jyl8q43712w/v1获取

为了检测线粒体自噬，将神经元在新鲜的MM中与 线粒体自噬染料(同仁化学研究所，MD01 - 10；此处标记为DMP Red)在 下孵育 。吸出培养基，并用新鲜的MM洗涤神经元两次。然后将神经元在MM中与乙醇或3 nM抗霉素A孵育1小时，然后在不含乙醇或抗霉素A的新鲜MM中再孵育1.5小时。加入终浓度为 的溶酶体示踪剂绿色(赛默飞世尔科技#L7526)，然后将神经元再孵育25 - 30分钟。然后吸出培养基，并在含有50 nM溶酶体示踪剂绿色的成像培养基中进行实时成像。

详细方案可在:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.j8nlkrpj6v5r/v1获取

溶酶体pH检测

使用同仁化学研究所(Dojindo)的溶酶体酸性pH检测试剂盒(L266)检测溶酶体pH。首先，将神经元在新鲜的MM中与LysoPrime Green以1:20,000的终浓度在 于 孵育。吸出培养基，并用新鲜的MM洗涤神经元两次。然后，将神经元与pHLys Red以1:10,000的终浓度在 孵育30分钟。再次吸出培养基，并用新鲜的MM洗涤神经元两次。对神经元进行成像以检查两种染料的标记是否正确。确认后，吸出成像培养基，然后将神经元在含有 巴弗洛霉素A1(Baf A1)的新鲜MM中孵育 以进行部分溶酶体去酸化。孵育后，吸出含有Baf A1的培养基，并在成像培养基中对神经元进行实时成像。

详细方案可在以下网址获取:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.kqdg3wr47v25/v1

对Rubicon和MTMR2进行免疫沉淀

将神经元用乙醇或 抗A处理 。孵育后，用1×PBS洗涤神经元，然后在含有 HEPES(pH = 7.4)、 EDTA、 、 、 Triton X - 100、 亮抑酶肽、 、 TAME、 胃蛋白酶抑制剂A、 PMSF以及 去泛素化酶抑制剂N - 乙基马来酰亚胺的裂解缓冲液中裂解。神经元裂解后，将裂解物在 下离心 ，弃去沉淀。取5%的上清液作为输入样本，稍后用于蛋白质印迹分析。将剩余的上清液分成两等份，一份加入 的Rubicon抗体(CST E5J5V，RRID:AB_3697738)或6 μg的MTMR2(sc - 365184)抗体；另一份加入 的相应IgG对照[针对Rubicon的兔IgG(CST 2729S，RRID:AB_1031062)和针对MTMR2的小鼠IgG(Vector labs I - 2000 - 1，RRID:AB_3668950)]。将上清液与抗体或其相应的IgG在 下于轨道摇床上孵育过夜。第二天，每份样品加入 的蛋白A磁珠(用于Rubicon抗体和兔IgG)(Invitrogen 10002D)或蛋白G磁珠(用于MTMR2抗体和小鼠IgG)(Invitrogen 10004D)，用含有0.02%吐温 - 20的1×PBS洗涤三次，最后在裂解缓冲液中洗涤一次。洗涤后，将磁珠与含有抗体或IgG的上清液在 下于轨道摇床上孵育4小时。孵育后，将含有免疫沉淀复合物的磁珠进行磁性分离，并用 PBS洗涤四次。最后将免疫沉淀的蛋白质在 含SDS的样品缓冲液中于 下洗脱 ，随后用于蛋白质印迹分析。

详细方案可在:https://doi.org/10.17504/protocols.io.4r3l21m7pg1y/v1获取

泛素富集分析

在添加 抗霉素A并孵育2小时之前，神经元用 MG132再处理 。孵育后，用 PBS洗涤神经元，并在含有50 mM HEPES(pH = 7.4)、1 mM EDTA、1 mM MgCl2、25 mM NaCl、0.5% Triton X - 100、20 μg/mL亮抑酶肽、2 mM DTT、20 μg/mL TAME、2 μg/mL胃蛋白酶抑制剂A和1 mM PMSF的裂解缓冲液中裂解。泛素检测试剂盒(Cytoskeleton，BK161)提供的去泛素化抑制剂也以 浓度添加到裂解缓冲液中。神经元裂解后，裂解物在17,000 x 下离心10分钟，弃去沉淀。将5%的上清液作为输入保存，稍后用于蛋白质印迹分析。该分析使用泛素检测试剂盒(Cytoskeleton，BK16)进行，按照制造商方案中所述步骤进行，有一些修改。简要地说，泛素化亲和珠和泛素化IP对照珠用 PBST洗涤两次，用1×PBS洗涤一次，然后与等体积的裂解物在 孵育4小时。孵育后，珠子在 以 离心 。珠子用BlastR - 2 洗涤缓冲液洗涤三次并离心。最后洗涤和离心后，珠子在室温下与珠子洗脱缓冲液孵育5分钟，然后在旋转柱中以 离心 以收集免疫沉淀物。向每个样品中加入2 - 巯基乙醇，然后在 煮沸 用于蛋白质印迹分析。

详细方案可在:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.eq2ly4z7rlx9/v1

实时成像与图像分析

需要时，在成像前，用100 nM的Janelia Fluor 646 Halo配体(Promega，产品编号:#GA112A)标记神经元20分钟，然后再冲洗20 - 30分钟。在含有HibernateE Brain Bits并补充有 D - 葡萄糖、 和 B27的成像培养基中对神经元进行成像。在 的环境箱内对神经元进行45 - 60分钟的实时成像。成像在配备Apochromat 100x 1.49 N.A.油浸物镜的尼康Eclipse Ti显微镜上的PerkinElmer UltraView Vox旋转盘共聚焦显微镜上进行，使用带有VisiView(Visitron)的滨松CMOS ORCA Fusion(C11440 - 20UP)相机。

为了量化胞体中EGFP - Rubicon、LAMP1 - Halo和mCherry - LC3之间的共定位，从单个z平面跨通道手动识别斑点并进行二值化处理。然后使用Fiji/ImageJ中的AND函数计算共定位斑点的数量。对于GFP - Rab7、LAMP - Halo和mCherry - Rubicon 或mCherry - Rubicon 的共定位实验，在Fiji/ImageJ中使用Yen阈值对单个z平面的细胞区域进行阈值处理并二值化。然后使用Fiji/ImageJ中的AND函数计算共定位区域。

为了量化单个z平面中DAPRed、Lysotracker的数量，确定感兴趣区域，即胞体。然后使用llastik分割工具(一种机器学习分割软件)对DAPRed和Lysotracker阳性斑点进行分割。对图像进行二值化处理，并使用Fiji/ImageJ中的“分析粒子”选项计算数量。使用AND函数计算共定位的DAPRed和Lysotracker斑点的数量。

为了量化单个z平面中Magic Red阳性斑点的数量，确定感兴趣区域，即胞体。然后使用Ilastik分割对Magic Red阳性斑点进行分割。对图像进行二值化处理，并使用Fiji/ImageJ中的“分析粒子”选项计算数量。为了使用LysoPrime Green和pHLys Red测量溶酶体酸化，生成每个图像每个通道的最大投影。然后使用Ilastik对胞体中的LysoPrime Green和pHLys Red阳性斑点进行分割。对图像进行二值化处理，并使用Fiji/ImageJ中的AND和“分析粒子”函数计算数量。

为了测量线粒体自噬溶酶体数量(即共定位的DMP Red和Lysotracker斑点)，生成每个图像每个通道的最大投影。然后使用Ilastik对胞体中的DMP Red和Lysotracker阳性斑点进行分割。对图像进行二值化处理，并使用AND函数计算共定位的DMP Red和Lysotracker斑点的数量。

详细方案可在:https://doi.org/10.17504/protocols.io.261gek6eog47/v1获取

免疫染色

吸出MM，并用 PBS洗涤神经元一次。然后将神经元用补充有4%蔗糖的4%多聚甲醛(4% PFA/4%蔗糖)在室温下固定10分钟。固定后，样品用PBS洗涤三次，然后在-20°C下用冰冷的甲醇通透8分钟。通透后，洗涤神经元并用封闭液(5%山羊血清和1% BSA溶于PBS)在室温下封闭90分钟。然后将神经元与一抗在封闭液中于 过夜孵育。第二天，在孵育14 - 16小时后，用1×PBS洗涤神经元三次，并与二抗(也在封闭液中)在室温下孵育60分钟。孵育后，洗涤样品，用ProLong Gold封片并成像。使用了以下一抗:p62，浓度为1:250(ab56416，RRID: AB_945626)；LAMP1，浓度为1:100(DSHB 1D4B，RRID: AB_2134500)；MAP2，浓度为1:500(Sigma Aldrich AB5622，RRID: AB_91939)。使用了以下稀释度为1:1000的二抗 - Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG(H + L)(A11006，RRID: AB_2534074)，Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG(H + L)(A21429，RRID: AB_2535850)，Alexa Fluor 633山羊抗小鼠IgG(H + L)(A21052，RRID:AB_2535719)。

该方案改编自:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.rm7vzqpb8vx1/v1

慢病毒转导

将DIV = 1的神经元用从Horizon Dharmacon 试剂获得的慢病毒颗粒(MOI = 9)进行转导。感染后3 - 4天通过观察GFP信号确认转导。在DIV 6 - 8时，去除含病毒的培养基，将神经元用乙醇或30 nM抗A处理2小时。处理后的样品进行裂解并准备用于蛋白质印迹分析。Dharmacon使用pSMARTEF1a/TurboGFP质粒制备带有针对Hectd (Cat#V3SM7593 - 236146236)的shRNA序列或非靶向对照(Cat #S03 - 005000 - 01)的慢病毒。

详细方案可在以下网址获取:https://doi.org/10.17504/ protocols.io.rm7vz9mb4gx1/v1

统计与可重复性

所有统计分析均使用Graphpad Prism 10.4.1版本进行。所有柱状图和超级图均使用Graphpad Prism 10.4.1版本生成。使用Shapiro-Wilk正态性检验对所有生物学重复的数据点进行正态分布测试。柱状图上的每个数据点代表一个生物学重复。对于超级图，每个生物学重复由带黑色轮廓的彩色形状表示，其相应的技术重复由相同的半透明颜色和形状表示。所有定量分析均在每个条件下至少三个生物学重复上进行。数据以平均值表示，误差条表示平均值的标准误差。 和 被认为具有显著性。在神经元分离过程中未确定小鼠胚胎的性别。未使用统计方法预先确定样本量。将来自一只小鼠的多个胚胎的神经元汇集在一起，并随机分配到任何实验条件。看起来不健康并显示出起泡迹象的神经元被排除在图像采集之外。在分析过程中去除了质量差的图像。在实验和结果评估过程中，研究人员未对分配情况进行盲法处理。

报告总结

有关研究设计的更多信息，请参阅与本文相关的《自然》系列报告总结。

数据可用性

与本研究相关的所有原始文件均已上传至Zenodo。本研究中使用的所有实验室材料的信息已在上传至Zenodo的关键资源表(KRT)文件中提供。所有新协议均已上传至protocols.io。本文提供了源数据。

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