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一种用于蛋白质靶向和结合测定的定量、无标记视觉干涉比色测定平台

发布时间：

2026-09-14 15:27

一种用于蛋白质靶向和结合测定的定量、无标记视觉干涉比色测定平台

安娜·洛佩斯 - 坎皮斯特罗斯’，希拉里·斯威特，西亚兰·特里，克雷格·加伦，于婉，罗伯特·E·伯勒尔，凯尔·莫克姆，马修·尼克尔，迈克尔·瑟普，迈克尔·乔伊斯，洛恩·泰里尔和托德·P·W·麦克马伦。

用于评估蛋白质相互作用的大量免疫测定技术成本高昂或具有平台特异性。我们提出了一种无标记视觉干涉比色测定法(VICA)，通过创建一个彩虹色表面来量化肽和蛋白质的相互作用，无需分光光度光学器件或微流控技术即可直接可视化。对纳米多孔氧化铝表面进行调整，使其与上层蛋白质层的折射率相匹配，以产生视觉干涉颜色。为了使表面功能化，我们使用蛋白A - 羧基谷氨酸(GLA)构建体创建了一个亲和捕获系统，该系统可定向抗体以增强信号。使用现成的抗体，该平台可以在缓冲液、全血或血清中分离分析物。该表面在低至50飞摩尔的浓度下会产生明显的颜色变化，并且可以在同一张载玻片上连续监测寡聚物的形成。VICA提供了与生物层干涉测量法和传统免疫测定法相当的动力学参数，同时还能够对大型大分子复合物中的蛋白质进行表征。

数千种使用各种报告机制(例如比色、荧光或化学发光)的不同商业免疫测定法对分光光度读数器基础设施有共同要求。存在小型化的示例，但这些通常是为单一分析物设计或需要专用试剂盒，因此对于少量测试需要大量投资。抗体特异性是这些测定法准确性的核心，而报告基团和分光光度特征决定了测定法的保真度和范围，这与基础设施的投资直接相关。蛋白质和试剂通常针对不同平台进行固定。因此，其应用往往受到成本、试剂供应以及获得稳定基础设施等障碍的限制。

无需复杂的报告化学或分光光度技术即可检测蛋白质 - 蛋白质或蛋白质 - 抗体相互作用的能力在实验设计和成本方面具有显著的理论优势。一些最早的视觉比色工具最早由朗缪尔和谢弗报道，通过蛋白质在部分反射层上结合时光程长度的变化产生干涉颜色。不幸的是，由于颜色对比度差、器件合成复杂以及灵敏度适中，随后创建测量设备的尝试受到限制。灵敏度。用于将蛋白质和抗体固定在表面的基于硅和硅烷的化学方法很复杂，效率各不相同，并且在不同蛋白质或抗体部分的应用有限。设备灵敏度的变化是其被采用的障碍，二氧化硅的固定折射率也限制了其实验效用。灵敏度问题的一个解决方案是在钽上创建一个多孔铝层，以尽量减少光散射和折射率差异。然而，催化铝表面上的蛋白质变形和降解、蛋白质固定不佳及其生物活性丧失限制了这些产品的商业化。

为消除对分光光度光学处理的需求，我们创建了一种能够通过纳米级光程长度变化产生可见颜色的虹彩表面。这种用于检测和定量蛋白质 - 蛋白质或蛋白质 - 肽相互作用的无标记视觉干涉颜色测定(VICA)平台使用钽上的多孔阳极氧化铝层，通过匹配氧化铝和吸附蛋白层的折射率来最小化光散射。可以针对单个蛋白质调整膜厚度、孔隙率和折射率，以进一步提高精度和准确性。我们通过创建一个界面层来解决生物活性氧化铝表面的挑战，该界面层使用由高密度羧酸域定义的新型固定方法来防止潜在的氧化。该富含羧酸的域由凝血酶原的羧基谷氨酸(GLA)域建模，使我们能够将蛋白质定向在氧化铝表面，在那里它作为蛋白质固定的稳定基础层。我们的方法提供了一个整体表面，避免了典型的被动免疫测定中随机取向、吸附不良或表面密度低的问题，在被动免疫测定中通常不超过10%的抗体表位可用于结合。VICA输出是一个可预测且精确的颜色序列，可以通过肉眼或相机观察，使用简单的偏振滤光片可提高对比度。化学交联以及GLA - 蛋白A和GLA - Fc抗体构建体证明了设计的GLA域在薄膜表面结合和定向捕获蛋白的效用。该平台可用于定量测定或在缓冲液、血清或全血中快速评估多达四种蛋白质的蛋白质 - 蛋白质复合物。无需ELISA、生物层干涉术(BLI)或表面等离子体共振(SPR)的复杂分光光度基础设施即可评估潜在分子缔合的动力学。我们预计VICA可以提供一个新的平台来揭示和定量一系列生物分子及其生物分子相互作用物，包括发现或临床研究中的代谢物。

加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学外科和肿瘤学系。加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学生物医学工程系。加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市SN生物医学公司。加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学物理系。加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市帕沃尼斯诊断公司。加拿大艾伯塔省阿尔伯塔大学化学系。加拿大艾伯塔省阿尔伯塔大学医学微生物学和免疫学系。电子邮件:tpm1@ualberta.ca

图1 | 使用阳极氧化铝进行蛋白质检测的视觉干涉显色。a 具有干涉色和反射的薄膜装置示意图。由于反射波长的干涉，蛋白质单层吸附导致的膜厚度变化将表现为颜色变化。凝血酶原的三维结构使用I-TASSER生成。10个γ-羧基谷氨酸残基(红色)位于全长蛋白质的第49、50、57、59、62、63、68、69、72和75位。用于观察薄膜上产生的颜色变化的设置。最佳视角是从表面通过偏振滤光片。最佳观察是在白光背景下完成的。b 在恒电位条件(8 V)下，在磷酸中对铝钽薄膜进行阳极氧化时的电流密度-时间图。关键阶段已标记。孔隙和形成在开始后立即开始从的电流开始，在搅拌的磷酸中(阶段A)。阶段B始于氧化钽层的形成，阶段表示在一段低电流密度和孔结构变化之后的完整蚀刻过程。c在波长为370和时，对于在氧化铝(阶段B)和氧化钽(阶段C)孔形成后具有不同初始铝厚度的器件，xy平面中的光学常数。消光系数为零。对于每个初始铝薄膜厚度，在完全阳极氧化后的原始孔径直方图，误差条表示标准偏差(SD)。e通过椭偏仪测定的不同阶段的氧化铝和氧化钽层的厚度，误差条表示SD ，与相应观察到的干涉色进行比较。

结果

使用阳极氧化铝产生视觉干涉色用于蛋白质检测

我们假设可以利用干涉色在无需分光光度计的情况下，精确地在阳极氧化铝表面可视化纳摩尔浓度的分析物(图1a)。为了将蛋白质固定并定向在阳极氧化铝表面，我们使用了一种基于凝血酶GLA结构域建模的带负电荷的蛋白质构建体。凝血酶是一种维生素K依赖的蛋白质，具有高度紧凑的带负电荷结构域，其中十个GLA残基集中在，如图1a所示，使用I-TASSER软件呈现其三维结构。通过阳极氧化在氧化铝中形成孔隙，使我们能够产生适合一阶或二阶干涉色的适当相移，并具有合适的对比度，无需分光光度计即可观察到(补充图1)。使氧化铝表面和蛋白质的折射率相匹配，能够检测在空气/蛋白质和铝/钽界面反射的光程长度变化，同时将其他反射产生的噪声降至最低。通过调节阳极氧化条件，如电势、电解质组成、时间和温度，调整阳极氧化铝的孔隙率和孔径，可以实现折射率的匹配。通过偏振滤光片在角度观察到的最终颜色，是光程长度变化的结果，该变化与固定在表面的蛋白质的数量和大小成正比。

为了定义氧化铝层的特性，使其能产生适当的相移和颜色变化，且无其他反射产生的噪声，我们建立了一个实验矩阵，其中对光程长度进行调制，起始的溅射铝厚度有四种不同值: 和。我们通过阳极氧化，利用引入孔隙来调制这些薄铝膜的折射率。铝和钽氧化物层的形成由电流密度随时间的变化关系确定(图1b)。阳极氧化三个阶段的代表性扫描电子显微镜(SEM)图像见补充图2，通过SEM测量的平均孔径随阳极氧化的变化关系见补充图3。通过构建椭偏模型确定了不同厚度下孔隙形成对氧化铝层折射率的影响。如在图1c中所示，在370至波长下的椭偏测量用于计算样品阳极氧化到阶段B和C时的折射率。在阶段B，折射率随初始膜厚度变化。到阶段C时，所有氧化铝层的折射率趋于一致，为蛋白质固定创造了一个一致的界面。折射率匹配过程将由于折射光以及蛋白质与氧化铝层之间的反射而导致的信号损失降至最低。对于这些薄膜，超过90%的孔隙直径在15至之间(图1d)，使孔隙内蛋白质复合物的形成降至最低。孔隙中蛋白质的存在会增加氧化铝层的有效折射率，最终由于蛋白质与氧化铝层折射率不匹配导致的光散射而降低可视化效果。椭偏测量还用于确定阳极氧化的铝氧化物和钽膜厚度在整个阳极氧化过程中如何变化(图1e)。钽氧化物层在阳极氧化的阶段B形成，对于所有不同的起始铝厚度，在时厚度均匀，因为它阻碍电流流动并停止进一步的电化学氧化。随着阳极氧化的进行，不同初始厚度薄膜产生的干涉色也通过偏振膜进行可视化，图1e顶部展示了每个阶段和厚度的情况。随着光程长度的变化，我们证明随着氧化铝厚度的变化有一系列颜色可供可视化。同样明显的是，钽氧化物层的形成以及厚度的变化会改变观察到的干涉色。我们观察到厚度的纳米级变化会产生显著的颜色变化，这有可能用于微调氧化铝表面，以根据蛋白质大小或浓度优化分析物检测。

图2 | GLA介导的氧化铝-蛋白质相互作用稳定性及RGB坐标测量精度。a 椭偏仪测得氧化铝厚度分布，表面经放射性标记和天然凝血酶原处理15分钟，随凝血酶原浓度变化，误差条为标准差。b 不同凝血酶原浓度对表面密度的影响，误差条为标准差；人血清白蛋白实验相同。c 放射性标记交换实验:先吸附标记凝血酶原，再与未标记凝血酶原及白蛋白在不同浓度下孵育，误差条为标准差。d 暴露后氧化铝表面的干涉颜色。左为初始铝厚，底为氧化阶段及蛋白溶液暴露情况。溶液含凝血酶原(P)及凝血酶原+抗体(+Ab)。e C阶段颜色图，展示CIE 1976色度图上添加抗体后的颜色变化，轴坐标表示人眼可感知颜色。f 连续蛋白堆积实验:依次添加凝血酶原、绵羊抗凝血酶原IgG 、兔抗绵羊IgG 和山羊抗兔IgG ，显示代表性干涉颜色图像。蛋白质暴露后氧化铝表面的干涉颜色。图像左侧显示初始铝厚度，图像底部显示氧化阶段和蛋白质溶液暴露情况。溶液由凝血酶原(P)和凝血酶原 + 凝血酶原抗体(+Ab)组成。e C阶段颜色的相应图，展示了在CIE 1976色度图上向凝血酶原中添加抗体时的颜色变化。x轴和y轴的CIE坐标表示人眼可感知的特定颜色。f 连续蛋白质堆积实验。将凝血酶原添加到表面，然后与凝血酶原绵羊IgG抗体、兔抗绵羊IgG 和山羊抗兔IgG 孵育。显示了观察到的干涉颜色的代表性图像。

用于量化蛋白质-蛋白质相互作用的简单RGB坐标分析

由于具有彩虹色的氧化铝表面通过颜色变化对光程长度的纳米级变化做出响应，我们接着研究了GLA标签介导的固定在薄膜表面的强度和耐久性。以凝血酶原作为与GLA连接的蛋白质的示例，椭偏测量量化了放射性标记的和天然凝血酶原结合到薄膜上时光程长度的变化，以研究表面上的交换情况，以及与高水平白蛋白竞争时的变化。我们使用放射性标记的 -凝血酶原、人白蛋白和凝血酶原混合物来监测表面密度变化。作为对照，未标记的和 -标记的凝血酶原对氧化铝表面表现出相同的亲和力(图2a)。我们观察到表面对凝血酶原的偏好强于白蛋白(图2b)，并且用未标记的凝血酶原孵育会诱导与表面蛋白质的浓度依赖性交换。然而，即使将载玻片洗涤，人血清白蛋白也不会取代大量的凝血酶原(图2c)。GLA介导的氧化铝相互作用的稳定性允许进行长时间测量，对蛋白质/氧化铝界面的完整性影响最小。

图3 | 调整氧化铝厚度以考察凝血酶原抗体颜色变化的动态范围。a 将凝血酶原抗体加入不同厚度的氧化铝表面上的凝血酶原中，生成绘制于CIE图的颜色，标准偏差位于符号范围内。b 逐步增加表面凝血酶原量以确定信号饱和度。凝血酶原水平在0.1至间增加时信号增强；超过此浓度后接近信号最大值，表明抗体的薄膜结合能力，与放射性标记研究结果一致。c 氧化铝表面的可调性与范围曝光时间的变化定义，以图形方式表示。结果使用扩展图5中概述的欧几里得几何(ΔC)进行量化。对于固定浓度的凝血酶原和凝血酶原抗体，增加曝光时间允许通过增加颜色变化，超过此时间，在这些浓度下进一步的颜色变化最小。一式三份测量，误差条表示标准差。d 在表面上以固定浓度的凝血酶原抗体应用增加浓度的凝血酶原时观察到的颜色变化，持续。一式三份测量，误差条表示标准差。e 使用缓冲液的FORMOscreen系统测量抗体-抗原结合的欧几里得几何( )变化(以中心处-20开始每20递增)的径向表示。

如在图2d中概述的那样，我们在不同的氧化铝厚度和阳极氧化阶段下，探索了使用我们的VICA系统时蛋白质结合所观察到的颜色变化。正如所预测的那样，当按顺序添加到氧化铝表面时，不同的初始厚度在抗体与凝血酶原结合时提供了一系列可观察到的颜色。阳极氧化不同阶段的孔结构变化以及氧化钽层的存在与否都表现为颜色变化。在初始铝厚度的较低和较高极端情况下，与凝血酶原或凝血酶原加抗体结合时可观察到的颜色变化比在95至之间观察到的变化更难辨别。通过椭偏仪测量，在该厚度范围内光的衰减跨越绿色波长，产生从红色到蓝色的互补色。作为一种简单而精确的变化量化工具，我们使用红色、绿色和蓝色(RGB)坐标以及CIE 1976颜色图表进行可视化。使用RGB坐标可以快速量化颜色差异，这些差异可以使用欧几里得几何进行存储和比较，欧几里得几何通常用于比色分析。两点之间的距离定义为，基于RGB坐标，并且颜色可以转换为CIE LUV颜色空间以在二维中直观地表示颜色变化，如在CIE图表上绘制的那样(图2e和补充图4a) 。在我们的模型系统中使用载玻片，我们将RGB几何量化系统用于一个多步骤实验途径示例。我们使用凝血酶原底物和具有不同物种反应性的顺序分层抗体来量化同一张载玻片上干涉颜色的变化(图2f)。顺序添加的蛋白质逐渐改变光程长度(见图1)并导致观察到的颜色变化。添加不适当的竞争物种的 IgG抗体并没有显著消除结合，如通过量化的观察到的颜色的微小变化所证明的那样(补充图4b)。在我们对结合了凝血酶原的该表面的研究中，我们在简单和复杂的生物溶液(包括人血清)中观察到非靶向蛋白质的结合极少，这与先前的研究一致，先前的研究表明抗体和大多数其他蛋白质对多孔氧化铝的亲和力较低 (补充图4b)。此外，该设备以及测量的与凝血酶原或抗凝血酶原结合的RGB坐标具有很高的精度，基于在人血清中的21次单独测量，在给定载玻片内变异系数小于3%，在不同载玻片之间变异系数小于6%。(补充图5)。

蛋白质-蛋白质结合的定量测量及抗体配方筛选

为了使用简单的相机展示该平台的简易性和功能范围，我们以凝血酶原作为模型系统，研究了这种视觉干涉彩色免疫分析的定量性能特征。首先，我们使用凝血酶原 - 凝血酶原抗体结合模型演示了调谐的概念。观察到的RGB坐标变化与初始氧化铝表面厚度成正比，由此，图3a中绘制的三种不同厚度的颜色范围被记录下来。这一特性可用于改变信噪比。例如，我们使用添加了凝血酶原抗体的人混合血清加标样品，确定了每种初始氧化铝厚度的信号强度和检测限(补充图6)。基于在处计算出的凝血酶原表面印记，一个直径为、表面积为的圆在大约时应接近饱和。这与向结合的凝血酶原水平增加的情况下添加凝血酶原抗体所产生的信号一致，颜色信号在以上饱和(图3b)。此外，在250至4200勒克斯的不同光照强度下，量化这些颜色变化的能力得以保留(补充图7)。我们还确定，观察到的干涉颜色变化可以被预测为所施加分析物的时间依赖性(图3c)和浓度依赖性(图3d)效应。这使得用户能够对复杂溶液中的蛋白质 - 蛋白质(如抗原 - 抗体)相互作用进行成像和定量，以定义分子缔合的成分和动力学。为了证明快速分析用于测量抗体 - 抗原相互作用的实用性，我们使用了专为优化抗体制剂设计的FORMOscreen系统，来评估我们模型系统中的抗体结合情况。我们观察到，如通过图3e雷达图中的所量化的，抗体结合亲和力随、去污剂和离子强度的变化而发生显著变化。

图4 | 氧化铝表面在蛋白质相互作用测量中的实际应用。a氧化铝表面在评估抗体特异性以识别交叉反应性以及抗原-抗体对的结合效率方面的效用，使用欧几里得几何进行评估，误差棒表示标准差。与凝血酶交联的血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)和血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)随后分别与各自的抗体接触。直接应用于凝血酶表面的抗体不会引起明显的颜色变化。新型GLA-蛋白A构建体与不同人和小鼠IgG抗体的结合。我们使用包含凝血酶GLA序列和蛋白A的重组杂合蛋白创建了一个抗体下拉系统。单独的蛋白A不与薄膜表面结合，但GLA-蛋白A构建体应用于表面时会产生强烈且可重复的颜色变化。在溶液中使用该构建体与不同IgG种类(小鼠和人)进行下拉实验，结果显示蛋白A与人IgG抗体的特异性结合，而不与小鼠IgG克隆结合，误差棒表示标准差。我们使用天然凝胶确认了该构建体与人IgG结合的特异性。(数据未显示)。c使用新型GLA-Fc抗体针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2，100μg/mL)进行夹心测定，以捕获在未接触过病毒的人血清中以不同水平加标的SARS核衣壳或S1抗原，并将其应用于表面，洗涤，然后与市售未修饰的相应抗体孵育，误差棒表示标准差。d在三个月的样本采集期内，通过聚合酶链反应(PCR)和血清学检测对SARS-CoV-2核衣壳抗体进行血清分离株检测(阴性；阳性，非配对检验)。e新鲜毛细血管血中SARS-CoV-2核衣壳抗体的定量与酶联免疫吸附测定检测到的抗体水平相关。

为了评估长期储存后这种方法的实用性，我们制备了含有凝血酶原的薄膜载玻片，并将它们在室温下黑暗环境中储存。我们测量了在结合抗凝血酶原一抗后再结合二抗IgG时颜色的变化。结果表明，在载玻片首次制备后长达180天内都能够对结合进行定量，并且该平台在低温下也能很好地工作(补充图8)。

缓冲液和生物溶液中蛋白质的直接检测和夹心检测

为了在不使用分光光度计的情况下，在人体或细胞培养样本上通过直接免疫测定和夹心免疫测定全面探索VICA的潜在应用，我们展示了三种不同的方法将蛋白质固定在表面。首先，使用常见的戊二醛方法将血小板衍生生长因子配体(PDGF-AA和PDGF-BB)与凝血酶原交联，以将蛋白质固定在VICA表面。在交叉结合评估中，仅当适当的抗体-抗原对相互作用时，将抗PDGF-AA或抗PDGF-BB抗体添加到斑点中，才会出现清晰而精确的颜色变化(图4a)。当结合的PDGF-AA与抗PDGF-BB抗体孵育时，或者当抗体在没有配体的情况下与凝血酶原包被的表面孵育时，未观察到颜色变化。我们还通过评估三种不同的PDGFRA抗体与其抗原的相互作用，评估了在各向异性环境(溶液中的蛋白质混合物)中的结合。使用两步法在动态环境中结合PDGFRA的机会证明了多克隆抗体(Ab#2-Thermo Scientific Cat. PA5-32545，和Ab#1-Millipore Cat. 07-276)和单克隆抗体(Ab#3-Cell Signaling，Cat. 5241)之间的亲和力差异(补充图9)。这也证明了我们的平台如何也可用于表面上的蛋白质结合以及溶液中的各向异性结合。其次，我们基于GLA和一个中间kringle结构域设计了一种新型的亲和捕获蛋白A-GLA构建体，该构建体允许将蛋白A定向固定在阳极氧化铝表面(补充图10)。证明了蛋白A的同种型特异性，仅当蛋白A-GLA构建体特异性结合人IgG抗体而不结合小鼠IgG时，才观察到干涉色变化(图4b)。这些结果表明，使用VICA和市售抗体可能捕获多种抗原。第三，我们设计了两种新型抗SARS-CoV-2抗体，其Fc区域与凝血酶原的GLA结构域融合。针对SARS-CoV-2刺突蛋白的核衣壳和S1部分设计并生产了GLA-Fc抗体构建体。这些构建体使抗体能够直接在薄膜表面进行整体定向。这些抗体用作SARS-CoV-2刺突或核衣壳蛋白的捕获剂，然后允许检测抗体进行夹心免疫测定。随着SARS-CoV-2刺突或核衣壳蛋白剂量的增加，观察到干涉色差异增加(图4c)。当测定中省略捕获抗体或抗原时，未观察到这种反应(数据未显示)。最后，使用通过GLA结构域固定SARS-CoV-2抗原的直接测定设计，我们检测了人血清(图4d)和新鲜全血(图4e)中抗SARS-CoV-2核衣壳抗体的水平。当检测血清样本时，42份PCR阴性样本中有2份具有较高的干涉色变化，62份PCR阳性样本中有5份具有较低的干涉色变化(敏感性92%，特异性95%)(图4d)。当进行抗SARS-CoV-2核衣壳特异性ELISA(EDI™，美国圣地亚哥)时，ELISA测定的抗体水平与通过毛细管采样在新鲜血液中使用VICA测定的抗体水平相关 (图4e)。与定量ELISA(Pro-Lab，加拿大多伦多)相比，使用VICA检测SARS-CoV-2刺突蛋白也获得了类似的结果(补充图11)。总体而言，该平台在复杂生物混合物中的稳定性以及堆叠潜在报告基团的能力允许在无需专门光学读取器或电子设备的情况下进行信号放大。在定量评估中，亲和捕获整体定向提供了最佳光学特性，同时避免了对具有可变反应效率的聚合物或其他官能团化学的需求。

图5 | VICA、BLI及WB验证PDGFRA与PDGF-AA结合。a用碳酸氢盐缓冲液洗脱阳极氧化铝表面结合的蛋白，WB检测。泳道1-3为PDGFRA、PDGF-AA及抗PDGF-AA抗体对照；泳道3-6为表面洗脱的蛋白复合物。b将蛋白层加至载玻片，用椭偏仪测厚度以证明蛋白- 蛋白质相互作用。c使用局部拟合和1:1结合模型，通过BLI测定PDGF - AA与PDGFRA结合的。d使用VICA并结合动力学，在多个配体浓度下计算饱和结合曲线，以测定PDGF - AA与PDGFRA结合的 (非线性最小二乘拟合模型，95%置信度)。e使用VICA测定PDGF - AA与PDGFRA结合的 (非线性最小二乘拟合模型，95%置信度)。

使用VICA、BLI和蛋白质印迹法比较血小板衍生生长因子受体A(PDGFRA)与配体的结合参数

为了评估VICA平台的保真度，我们检查了从制备好的载玻片上分离得到的蛋白质印迹，并对可比的BLI实验进行了动力学分析，以确认我们平台的精度，该精度由光程长度和观察到的颜色变化来定义。首先，我们从阳极氧化铝表面洗脱蛋白质，并通过蛋白质印迹法分析其组成(图5a)，以记录与载玻片上观察到的颜色变化相对应的蛋白质沉积的顺序变化。其次，我们使用椭圆偏振仪在同一载玻片上直接测量蛋白质固定时厚度的变化。我们观察到光程长度有精确且可重复的变化(图5b)，这与单独或作为复合物依次添加不同蛋白质一致(标准误小于1.5%)。在另一组实验中，我们使用VICA和生物层干涉术(BLI)完成动力学测量以进行比较。使用多种配体浓度的结合动力学来确定使用BLI和VICA时血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA)与血小板衍生生长因子受体A(PDGFRA)结合的解离常数 (分别为图5c、d)。我们还在酶动力学模型上使用VICA来推断相互作用的最大速度(图5e)并计算米氏常数。从VICA和BLI技术获得的可比数值表明，在动力学测量方面，VICA具有与BLI相似的能力。鉴于能够在载玻片上完成顺序实验以进行或的测定，时间长达数小时、数天或根据需要更长时间，VICA还可以进行额外的时间进程以及时间和平衡实验设计。最后，我们证明了通过使用二级生物素化抗体实现了高达两个数量级的信号放大，该抗体允许与链霉亲和素偶联的纳米颗粒结合(补充图12a)。蛋白质印迹也与载玻片上捕获的蛋白质在可视化至低于时进行了定量关联(补充图12b)。

讨论

我们创建了一个具有彩虹色表面的平台，能够测量低至50飞摩尔蛋白质的单个蛋白质或复合物，适用于研究天然构象下的肽 - 蛋白质或蛋白质 - 蛋白质相互作用。我们利用氧化铝表面的静电特性及其作为路易斯酸和碱的能力，通过带负电荷的氨基酸构建体(凝血酶原的GLA结构域 )将结构固定在表面。与被动表面免疫测定相比，亲和捕获固定模式的好处在于，整体取向可避免蛋白质的随机取向，否则可能导致空间位阻和目标部分的低效捕获。它还避免了对反应效率可变的聚合物或其他官能团化学物质的需求。GLA介导的氧化铝相互作用的稳定性允许进行长时间测量，对蛋白质/氧化铝界面的完整性影响最小。这不仅允许在复杂的生物溶液中进行实验，还允许进行顺序实验和多个步骤，解决了其他受单一反应和单一测量限制的技术中的挑战。我们认为，这是当前标准结合测定的出色辅助手段，在当前标准结合测定中，需要可变的温度和时间来确定结合亲和力。

灵敏度可根据表面饱和度显著变化。检测限由表面上足以增加光程长度以便能明显观察到相移所需的分子数量决定。这意味着体积和动力学是主要的速率限制决定因素。在本研究中，我们使用了小体积(<20μl)，但增加给定浓度溶液的体积可将灵敏度提高多达1000倍。通过改变薄膜厚度来最小化噪声，还可通过匹配氧化铝表面和蛋白质的折射率来提高灵敏度，消除蛋白质/氧化铝界面处不需要的光散射。薄膜基板的制造具有高度可重复性，因为氧化钽层用作阳极氧化完成的高保真标记，阻止电流流动以停止进一步的电化学氧化。出于本研究的目的，我们创建了一个定制的封闭系统，可阻挡外部光线，在其中可调整颜色图案。我们当前的分析以简单性为目标进行设计和呈现，使用简单的相机和偏振滤光片，并不排除对光谱输出进行更详细分析的可行性，我们认为光谱输出确实包含有关蛋白质浓度、结合和构型的信息。我们还注意到人类视觉感知由更高密度的绿色受体组成；因此，眼睛在这个范围内对辨别对比颜色最敏感。未来的工作将研究如何通过亮度、色调和色度之间的复杂相互作用来优化氧化铝结构，以实现人类视觉感知。

将坚固的氧化铝与亲和捕获系统相结合，允许进行长时间进程实验和平衡实验，因为如果需要，能够在数小时或数天内重复使用载玻片来完成或测定。此外，通过单一构建体或交联反应，可使用现成的抗体或蛋白质来创建定性或定量测定，这些测定可在缓冲液以及复杂溶液中起作用包括细胞培养物、血清或全血。我们的实验表面允许在溶液的各向异性环境中结合，或通过将特定抗体下拉到表面在二维上有序排列。总体而言，该平台具有广泛的应用，从用于相互作用组发现研究的多重筛选，到亲和力测量，再到在复杂溶液中的不同洗涤剂中验证抗体以进行临床前验证或临床诊断测试。该平台的成本仅为分光光度法的一小部分，并且该平台可用于偏远或资源匮乏的环境。

方法

薄膜沉积

直径为的未加工硅片衬底(马萨诸塞州南波士顿大学晶圆公司)在由体积比为1:3的过氧化氢 (宾夕法尼亚州中心谷J.T.贝克公司)和硫酸 (宾夕法尼亚州中心谷J.T.贝克公司)组成的王水溶液中进行清洗。使用旋转冲洗干燥器中的氮气将晶圆完全干燥，并使用平面磁控溅射(宾夕法尼亚州杰斐逊山库尔特·J·莱斯科公司)进行镀膜。钽的纯度目标为99.95%，铝的纯度目标为99.9995%(库尔特·J·莱斯科公司)。在铝沉积过程中，功率密度保持在，氩气压力在7至10毫托之间，衬底旋转速度为。在沉积光学厚度的钽之后，在70 - 140纳米的不同深度溅射铝。

薄膜氧化

将晶圆切割成不同尺寸的碎片，最大尺寸不超过，并在恒电位条件下于进行一步阳极氧化，持续不同时间以达到薄膜形成的所需阶段。需要进行初步测试以确定能够在蛋白质吸附单层的一阶干涉范围内产生可见颜色变化的厚度范围；如Nickel等人所述，使用电流密度来确定样品选择的氧化阶段。阳极(待氧化的溅射层)和阴极(铝箔)彼此平行，间距为。用于阳极氧化的电解质由室温下的磷酸组成。在初始孔形成期间和阳极氧化铝生成开始时，阳极氧化电流密度变化遵循精确模式，并且随着形成开始，电流密度降低。所有阳极氧化运行均在的时间段内结束。所有实验均在磁力搅拌棒以搅拌电解质溶液的条件下进行。

场发射扫描电子显微镜

使用穿透式透镜探测器拍摄阳极氧化铝载玻片的场发射扫描电子显微镜(FE SEM，蔡司Sigma)图像。使用3或的加速电压以及的孔径。所有FE SEM图像均在超高真空条件下采集，制备好的样品的像素驻留时间为，探针电流为。用于分析的器件样品在阳极氧化后进行切割，并安装在显微镜短柱上。在引入蛋白质复合物之前拍摄的表面层图像用于评估平均孔径和面积分数。通过首先设置比例并调整阈值，使用ImageJ NIH开源软件(https://imagej.nih.gov/ij/)进行此测试。从载玻片代表性区域沿三条水平线和三条垂直线测量的孔中提取平均孔径。获得了平均值、标准差、最小值和最大值。

椭偏测量法

使用可变角度光谱椭偏仪(VASE)分析薄膜器件层的光学常数和厚度。在WVase32®软件(J. A. Woollam Co., Inc., Lincoln, NE)上采用自下而上的方法建立模型。模型中使用的基础层是硅，随后是钽层，接着是一层薄的五氧化二钽层和在阳极氧化过程中形成的多孔氧化铝薄膜。对于所有样品，在300至的可见波长范围内，以的增量记录和值，通常在与法线成至的角度下，以的间隔进行记录。使用了各种拟合模式来准确表示每层的特性。使用洛伦兹振子层对钽金属进行建模，使用柯西层对钽氧化物和氧化铝进行建模。在使用有效介质近似(EMA)对表面粗糙度进行建模时未显示出改进，并且进行了扫描以确认在检查多孔氧化铝层期间去极化可忽略不计。

试剂、蛋白质和抗体

戊二醛(50% w/v)和L-赖氨酸购自德国达姆施塔特西格玛奥德里奇公司。人凝血酶原(APP006B)和抗凝血酶原抗体(CL20110A)购自美国俄亥俄州韦斯特切斯特阿尼亚拉诊断公司。兔抗羊IgG二抗(172-1017)购自美国加利福尼亚州赫尔克里士伯乐公司。吉比科PDGF-AA(PHG0035)、PDGF-BB(PHG0046)、磷酸及山羊抗兔IgG二抗(31210)购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司。抗PDGF-AA(sc-128)和抗PDGF-BB(sc-127)抗体购自美国得克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术公司。抗PDGF受体A抗体分别购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司(货号PA5-32545)、美国加利福尼亚州特梅库拉密理博公司(货号07-276)及美国马萨诸塞州丹弗斯细胞信号技术公司(货号#524)[1]。SARS-CoV-2刺突蛋白1嵌合抗体(HC2001)、核衣壳嵌合抗体(HC2003)及重组刺突蛋白1和核衣壳蛋白购自美国新泽西州皮斯卡塔韦金斯瑞生物科技公司。生物素化兔抗羊IgG(ab6746)购自英国剑桥艾博抗有限公司，链霉亲和素偶联金纳米球(AUIR40)购自美国加利福尼亚州圣地亚哥纳米复合公司。GLA修饰蛋白A购自英国剑桥剑桥蛋白制品公司。FORMOScreen制剂购自德国耶拿耶拿生物科学公司。EDI™ COVID-19核衣壳IgG定量ELISA试剂盒购自美国加利福尼亚州圣地亚哥表位诊断公司，Prolisa™定量抗SARS-CoV-2 IgG免疫测定试剂盒购自加拿大安大略省里士满山Pro-Lab诊断公司。

患者样本

伦理批准通过阿尔伯塔大学健康研究伦理委员会ID Pro00018758获得。总共从阿尔伯塔精准实验室获得了104份人类血清样本；62份样本是在PCR确诊的COVID-19感染后3至10周收集的，42份样本是从血清学确诊的阴性个体中收集的。

生物制品的吸附以及蛋白质与阳极氧化铝表面的连接

冻干纯化的重组人凝血酶原在 Tris-HCl、缓冲液( )中复溶，并将不同浓度的蛋白质溶液点样于直径的斑点中，在100%相对湿度和室温下孵育规定时间。随后用移液器除去溶液，并用去离子水彻底冲洗玻片。通过将含有吸附蛋白的特定器件表面暴露于为了使蛋白质与凝血酶原交联，将新鲜的5%(v/ )戊二醛溶液在磷酸盐缓冲液、中于室温下沉积在涂有凝血酶原的圆圈上1小时，然后用PBS(磷酸盐缓冲盐水)冲洗。然后，将感兴趣的蛋白质在室温下加入到凝血酶原斑点中2小时。用于蛋白质层堆叠的二抗在室温下依次孵育。为了停止蛋白质与表面的结合事件，一旦孵育时间结束，通过移液器除去蛋白质样品，并用去离子水彻底冲洗载玻片，进行可视化和拍照。

凝血酶原放射性标记

2- S-(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(p-SCN-Bn-NOTA)(Macrocyclics公司，得克萨斯州普莱诺)螯合剂通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC) 三氟乙酸(TFA)/乙腈进行纯化，得到p-SCN-Bn-NOTA-3TFA。凝血酶原浓度通过使用贝克曼库尔特DU 730(贝克曼库尔特公司，加利福尼亚州布雷亚)测定，以获得A₂₈₀测量值，凝血酶原的百分溶液消光系数ε₁% = 13.8 。碳酸氢钠、TBS(Tris缓冲盐水)和醋酸钠(NaOAc)缓冲液用Chelex 100树脂预处理，并使用痕量金属级盐新鲜制备。凝血酶原通过与蛋白质的赖氨酸残基进行异硫氰酸酯生物共轭与大环螯合剂NOTA共轭。凝血酶原溶液(在TBS中，，10 mg/mL)(ACOA，Aniara，俄亥俄州韦斯特切斯特)进行离心过滤，以实现缓冲液交换为。所得溶液与p-SCN-Bn-NOTA-3TFA(0.112 mg，141 nmol，12当量)在缓冲溶液中于和反应过夜。使用尺寸排阻柱从反应物中纯化NOTA-凝血酶原共轭溶液，同时实现缓冲液交换为TBS(pH 7.4)。其余部分使用Amicon Ultra 离心过滤器(密理博公司，安大略省伊顿比克)在NaOAc 中进行离心过滤用于标记。溶液在中分成等份，置于的缓冲液中，并储存在。凝血酶原标记使用 (马林克罗德特放射学研究所，密苏里州圣路易斯)进行。为此，将126 - 163.8 MBq 在的NaOAc缓冲液中加入到NOTA-凝血酶原溶液(100μg，在61.4μl的中)。反应混合物在以550 rpm振荡。接下来，加入的 EDTA。在之后，使用TLC EDTA评估掺入情况，。使用尺寸排阻色谱法纯化溶液，同时实现缓冲液交换为pH 7.4的TBS。使用放射性最高的馏分。

颜色检测与统计分析

通过带有偏光膜的肉眼观察阳极氧化铝表面上的蛋白质固定情况，该偏光膜可消除从器件表面反射的p偏振光。为了通过匹配氧化铝表面和下层表面的s偏振光反射强度来产生最强的颜色对比度，以的入射角观察光反射。实验装置仅需要在相机中使用偏光膜，载玻片的评估角度与法线成 (见图1)。使用红、绿、蓝(RGB)坐标系来定量定义可见颜色。为了获得坐标，在相同条件下拍摄图像并上传到颜色坐标输出系统(imagecolourpicker.com)，并对每个样品点或空白载玻片的五个一致位置上的三个坐标求平均值。通过欧几里得几何定义定量和比较测量，独立减去R、G和B分量以确定差异ΔC。使用OriginLab(OriginLab Corporation)将RGB坐标转换为CIE 1976颜色空间。使用GraphPad(GraphPad Software, Inc.)分析动力学结果；图中提供了平均值，并标注了标准偏差。显著性度量通过学生检验确定。值小于0.01被认为具有显著性。

数据可用性

支持本研究结果的数据可在论文及其补充信息文件中获取。材料或信息的获取没有限制。原始数据文件可在合理请求下从相应作者处获得。

收到:2024年7月22日；接受:2024年11月22日；在线发表:2024年12月5日

参考文献

1. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clin. Chem. 51, 2415-2418 (2005).

2. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides 72, 4-15 (2015).

3. Avrameas, S. Historical background of the invention of EIA and ELISA. Clin. Chem. 52, 1430a-1431 (2006).

4. Matson, R. S. in ELISA: Methods and Protocols (ed. Matson, R. S.) (Springer, 2023).

5. Shi, Y. et al. Application of microfluidics in immunoassay: recent advancements. J. Healthc. Eng. 2021, 2959843 (2021).

6. Aydin, M., Aydin, E. B. & Sezgintürk, M. K. Advances in immunosensor technology. Adv. Clin. Chem. 102, 1-62 (2021).

7. Kinnamon, D. S., Heggestad, J. T., Liu, J. & Chilkoti, A. Technologies for frugal and sensitive point-of-care immunoassays. Annu. Rev. Anal. Chem. 15, 123-149 (2022).

8. Hasan, M. S. et al. Rapid ultrasensitive and high-throughput bioburden detection: microfluidics and instrumentation. Anal. Chem. 94, 8683-8692 (2022).

9. Park, H. W., Choi, J. W., Joo, K. K., Kim, N. R. & Shin, C. D. Estimating fluor emission spectra using digital image analysis compared to spectrophotometer measurements. Sensors 23, 4291 (2023).

10. Langmuir, I. & Schaefer, V. J. Monolayers and multilayers of chlorophyll. J. Am. Chem. Soc. 59, 2075-2076 (1937).

11. Alvarez, S. D., Li, C. P., Chiang, C. E., Schuller, I. K. & Sailor, M. J. A label-free porous alumina interferometric immunosensor. ACS Nano 3, 3301-3307 (2009).

12. Van Dong, L., Hoon Eng, K., Quyen, L. K. & Gopalakrishnakone, P. Optical immunoassay for snake venom detection. Biosens. Bioelectron. 19, 1285-1294 (2004).

13. Maul, D. M., Bilodeau, R. J. & Bogart, G. R. Methods for optimizing an optical assay device. EP0546222B1 (1997).

14. Hyndman, D., Flynn, T. G., Lever, G. & Burrell, R. Protein immobilization to alumina supports: I. Characterization of alumina-organophosphate ligand interactions and use in the attachment of papain. Biotechnol. Bioeng. 40, 1319-1327 (1992).

15. Hyndman, D., Burrell, R., Lever, G. & Flynn, T. G. Protein immobilization to alumina supports: II. Papain immobilization to alumina via organophosphate linkers. Biotechnol. Bioeng. 40, 1328-1336 (1992).

16. Harbeck, R. J., Teague, J., Crossen, G. R., Maul, D. M. & Childers, P. L. Novel, rapid optical immunoassay technique for detection of group A streptococci from pharyngeal specimens: comparison with standard culture methods. J. Clin. Microbiol. 31, 839-844 (1993).

17. Burrell, R. E., Naylor, A. G. & Rosenfeld, A. M. Thin film diagnostic device. US5124172A (1992).

18. Djokić, S. S. & Burrell, R. E. Visual detection of protein adsorption onto electrochemically oxidized aluminium surfaces. Biosens. Bioelectron. 13, 271-278 (1998).

19. Murray, J. P. & Laband, S. J. Degradation of poliovirus by adsorption on inorganic surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 37, 480-486 (1979).

20. Wittayanukulluk, A., Jiang, D., Regnier, F. E. & Hem, S. L. Effect of microenvironment pH of aluminium hydroxide adjuvant on the chemical stability of adsorbed antigen. Vaccine 22, 1172-1176 (2004).

21. Kasprzyk-Hordern, B. Chemistry of alumina, reactions in aqueous solution and its application in water treatment. Adv. Colloid Interface Sci. 110, 19-48 (2004).

22. Beketov, G., Shynkarenko, O. & Apatska, M. Towards improving ELISA surfaces: SPR assessment of polystyrene modification efficiency for promoting immobilization of biomolecules. Anal. Biochem. 618, 114101 (2021).

23. Welch, N. G., Scoble, J. A., Muir, B. W. & Pigram, P. J. Orientation and characterization of immobilized antibodies for improved immunoassays (Review). Biointerphases 12, 02D301 (2017).

24. Flockhart, B. D., Leith, I. R. & Pink, R. C. Electron-transfer at alumina surfaces. Part 2. Electron-donor properties of aluminas. Trans. Faraday Soc. 65, 542-551 (1969).

25. Cuypers, P. A. et al. The adsorption of prothrombin to phosphatidylserine multilayers quantitated by ellipsometry. J. Biol. Chem. 258, 2426-2431 (1983).

26. Yang, J. et al. The I-TASSER Suite: protein structure and function prediction. Nature Methods 12, 7-8 (2015).

27. Roy, A., Kucukural, A. & Zhang, Y. I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction. Nat. Protocols 5, 725-738 (2010).

28. Zhang, Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics 9, 40 (2008).

29. Mohankumar, V. K. et al. Red, green, and blue gray-value shift-based approach to whole-field imaging for tissue diagnostics. J. Biomed. Opt. 17, 076010 (2012).

30. Akiyama, K., Watanabe, K., Fukui, M., Higuchi, H. & Noda, T. Quantitative evaluation of digital-image enhancement during heads-up surgery. Sci. Rep. 9, 15931 (2019).

31. Justiawan et al. Comparative analysis of colour matching system for teeth recognition using colour moment. Med. Devices: Evid. Res. 12, 497-504 (2019).

32. Burrell, R. E. Aluminum oxide surfaces and interface molecules. WO2019161491A1 (2019).

33. Nagasaki, Y., Kobayashi, H., Katsuyama, Y., Jomura, T. & Sakura, T. Enhanced immunoresponse of antibody/mixed-PEG co-immobilized surface construction of high-performance immunomagnetic ELISA system. J. Colloid Interface Sci. 309, 524-530 (2007).

34. Lai, X., Gao, G., Watanabe, J., Liu, H. & Shen, H. Hydrophilic polyelectrolyte multilayers improve the ELISA system: antibody enrichment and blocking free. Polymers 9, 51 (2017).

35. Ito, H., Ogawa, M. & Sunaga, S. Evaluation of an organic light-emitting diode display for precise visual stimulation. J. Vis. 13, 6-6 (2013).

36. Lee, W. & Park, S. J. Porous anodic aluminium oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chem. Rev. 114, 7487-7556 (2014).

37. Nickel, M. R., Melligan, G., McMullen, T. P. W. & Burrell, R. E. The effect of chemical additives in phosphoric acid anodization of aluminium-tantalum thin films. Thin Solid Films 685, 245-253 (2019).

38. Ono, S. & Masuko, N. Evaluation of pore diameter of anodic porous films formed on aluminium. Surf. Coat. Technol. 169-170, 139-142 (2003).