黑色素瘤中持久性细胞状态导向的转变与脆弱性
发布时间：
2026-09-16 21:13
黑色素瘤中持久性细胞状态导向的转变与脆弱性
海克·肖维斯特雷0,2，巴图尔·尚南 ，希娜·M·戴格诺特 - 米尔 ，罗伯特·J·朱 ，丹尼尔·皮卡德 ，斯特凡妮·埃格特迈尔 ，雷娜塔·瓦拉尔贾伊@ ，克里斯汀·S·吉布哈特@ ，安东尼奥·塞奇@ ，法努施·卡沙尼© ，奥利弗·凯米纳® ，萨曼莎·J·斯特本斯® ，秦柳 ，尹祥凡 ，基鲁詹·杰亚库马尔 ，费利克斯·C·E·沃格尔® ，克莱门斯·克雷普勒 ，维托·W·丽贝卡® ，琳达·库巴特® ，史密斯·S·卢昂 ，扬·福斯特 ，苏珊娜·霍恩 ，马克·雷姆克 ，迈克尔·埃尔曼 ，安妮特·帕申© ，于尔根·C·贝克尔 ，艾丽斯·赫尔弗里希 ，丹尼尔·劳赫(p ，马库斯·凯泽(p) ，谢拉兹·古尔@ ，梅恩哈德·赫林[3]，伊万·博格斯基7，何塞·内普图诺·罗德里格斯 - 洛佩斯19，尼古拉斯·K·哈斯@ ，德克·沙登多夫 & 亚历山大·罗斯©
黑色素瘤是一种高度可塑性的肿瘤，其特征在于不同细胞身份根据生物学背景进行动态相互转换。高表达H3K4去甲基化酶KDM5B(JARID1B)的黑色素瘤细胞处于缓慢循环但可逆的持久性细胞状态。随着时间的推移，KDM5B高表达细胞可促进具有平衡KDM5B表达异质性的肿瘤快速重新增殖。到目前为止，尚未研究KDM5B高表达持久性细胞的细胞身份，这在黑色素瘤中错失了一个重要的细胞状态导向治疗机会。在此，我们建立了一种强力霉素可滴定系统，用于基因诱导KDM5B在肿瘤内的永久表达，并筛选模拟此效应的化学试剂。转录谱分析和细胞功能测定证实，二氢吡啶2 - 苯氧基乙基4 - (2 - 氟苯基)-2,7,7 - 三甲基 - 5 - 氧代 - 1,4,5,6,7,8 - 六氢喹啉 - 3 - 羧酸酯(称为化合物1)支持高KDM5B表达，并引导黑色素瘤细胞沿黑素细胞谱系分化并使细胞周期停滞。高KDM5B状态还通过对细胞分裂离断的负调节来阻止细胞增殖。此外，用化合物1处理可促进黑色素细胞特异性酪氨酸酶基因的表达，使黑色素瘤细胞对酪氨酸酶处理的抗叶酸前药3 - O - (3,4,5 - 三甲氧基苯甲酰)-(-)-表儿茶素(TMECG)特别敏感。总之，我们的研究为黑色素瘤的双重打击策略提供了概念验证，其中持久性细胞状态导向的转变限制了肿瘤可塑性，并使黑色素瘤细胞易于进行谱系特异性消除。
*论文末尾列出了作者单位。
细胞可塑性指细胞从一种表型转变为另一种表型的能力，被视为主要 因素和 非基因肿瘤进化的驱动因素。最近的时间分辨转录组分析表明，尤其要将黑色素瘤理解为一个异质生态系统，它通过可变分化的持久性状态动态转变，以逃避诸如减瘤治疗等外源性压力 。
不同癌症中持久性细胞的一个标志是，它们短暂地处于染色质介导的慢周期状态，其特征是组蛋白H3赖氨酸去甲基化酶(KDMs)的核表达水平高但可逆 。持久性细胞的其他特征包括维持胚胎存活或代谢程序，平衡它们对氧化线粒体呼吸以及氧和脂质自由基解毒的依赖性 。迄今为止，大多数研究都集中在通过利用脂肪酸氧化、自噬或铁死亡等单一弱点，将持久性细胞作为总肿瘤群体中的小亚群进行选择性清除 。以前用于选择性清除表达H3K4去甲基化酶的黑色素瘤细胞(KDM5B高表达)的方法，例如基于它们对氧化ATP产生的生物学依赖性，显示出了一些效果，但由于这种肿瘤实体具有高度的代谢灵活性而受到影响 。令人惊讶的是，到目前为止，KDM5B高表达黑色素瘤持久性细胞的细胞身份尚未被揭示，错失了一个重要的治疗机会。此外，该领域缺乏操纵持久性细胞表型转换动力学并将其与细胞身份特异性清除相结合的策略。
黑色素瘤通常以KDM5B高表达、KDM5B中等表达和KDM5B低表达细胞的连续表达谱为特征。相比之下，良性黑素细胞痣在大多数细胞中高水平表达KDM5B 。单分选的黑色素瘤细胞可以迅速重新建立KDM5B的异质性，而不管它们最初的KDM5B表达水平如何 。即使在体外和体内细胞毒性应激下通常会出现的KDM5B高表达状态的明显富集 ，在存活的黑色素瘤细胞中也会迅速恢复到正常分布。这表明慢周期KDM5B高表达持久性细胞是肿瘤再增殖的一个短暂来源，但黑色素瘤的长期存在需要动态的KDM5B肿瘤组成。
总之，这表明慢周期KDM5B高表达持久性状态可能根据生物学背景对肿瘤命运产生不同甚至相反的影响，并且可能被用作黑色素瘤肿瘤消除策略的治疗靶点。在本研究中，我们系统地研究了(i)KDM5B高表达黑色素瘤持久性状态的实际分化表型，(ii)迫使黑色素瘤细胞异位高水平表达KDM5B而没有机会自发恢复到正常表达异质性的后果，以及(iii)KDM5B导向的细胞状态转换是否可以用作治疗弱点。
结果
KDM5B高表达状态在肿瘤内强制和持续表达的模型。黑色素瘤中KDM5B的表达通常呈异质性分布，而良性黑素细胞痣在大多数细胞中高水平表达KDM5B(图 )。黑色素瘤中KDM5B的高表达与患者的不良生存显著相关(图1b)，而其他KDM5家族成员则缺乏这种相关性(补充图1a)。在其他癌症实体中，KDM5B与生存的相关性不一致(补充图1b)。为了创建一个能够外源诱导KDM5B蛋白表达的实验模型，我们克隆了一个Tet-On 3G系统，其中 KDM5B的表达由强力霉素诱导的 启动子驱动，并建立了稳定的黑色素瘤细胞克隆(WM3734Tet3G-KDM5B和WM373WTE4G-EGFP对照，补充图2a - c)。在克隆扩增和强力霉素诱导后，我们观察到KDM5B mRNA和蛋白水平呈剂量依赖性上调(图1c和补充图2c)，同时H3K4me3蛋白水平呈反向下降，证实了功能性KDM5B的表达(补充图2d)。在持续的强力霉素处理下，KDM5B蛋白水平至少稳定上调3周(补充图2d)。KDM5B免疫染色显示，在大多数WM3734 细胞中信号增强(图1d)。从这里开始，我们将这种情况称为强制KDM5B 细胞状态。
为了获得另一种独立的调节KDM5B表达的方法，该方法还允许简单地应用于几种黑色素瘤细胞系或体内，我们开发了一种基于细胞的化合物筛选试验，应用我们之前发表的在WM3734黑色素瘤细胞中稳定表达的KDM5B启动子 - EGFP报告构建体(WM3734KDM5Bprom - EGFP细胞 ，补充图3a)。这种基于荧光的模型有助于监测KDM5B转录状态的动态变化。在筛选了一个7500种化合物的文库后，在CMV启动子 - EGFP报告试验中对主要命中物进行了反筛选，并且在剂量反应曲线和独立试验中对确认的命中物进行了进一步验证(补充图3b - d)。选择命中化合物的主要标准是在 处理时不存在立即的整体细胞毒性以及对KDM5B启动子驱动的EGFP表达(缩写为K/EGFP，更多细节见“方法”)的调节。由于可能存在对KDM5B高表达细胞的被动富集的掩盖效应，如之前在各种细胞毒性药物 中所见，直接增加K/EGFP信号的化合物未被考虑。相反，K/EGFP信号降低特别令人感兴趣，因为它可能间接表明由于化合物处理导致内源性KDM5B蛋白水平持续增加(例如，通过高KDM5B蛋白水平对mRNA转录的负反馈)。
经流式细胞术分析和免疫细胞化学证实，排名第一的化合物2-苯氧基乙基-4-(2-氟苯基)-2,7,7-三甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氢喹啉-3-羧酸酯(PubChem名称BAS00915510，此处缩写为Cpd1)可重复性地提高KDM5B蛋白水平，无论所测试的黑色素瘤细胞系的基因型如何(图1e、f和补充表1)。选择一种未能改变K/EGFP转录和内源性KDM5B蛋白水平的结构同源化合物作为后续实验的阴性对照(缩写为Neg4，补充表1和补充图3c、d)。KDM是组蛋白去甲基化酶和转录调节因子，因此主要在细胞核中发挥作用 。相应地，对细胞核与细胞质区室中KDM5B表达定位的定量分析证实，Cpd1可使细胞核KDM5B呈时间依赖性增加(补充图3e)，模拟了Tet-On 3G诱导的KDM5B表达的效果。同样，这与所测试的黑色素瘤细胞类型无关(补充图3f)。
由于在Cpd1处理后的大多数黑色素瘤细胞中观察到KDM5B明显的核富集(图1f)，我们推测Cpd1可能作为一种潜在的作用模式影响KDM5B蛋白的自然稳态。用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺对黑色素瘤细胞进行纵向处理，结果显示KDM5B蛋白稳定下降，在24小时和 后分别下降了79%和98%。与Cpd1共同处理导致KDM5B水平升高(在24小时和72小时时分别升高382%和147%)，这表明Cpd1可能减弱KDM5B蛋白的降解，从而维持其核表达水平(图1g)。为了研究KDM5B的细胞降解途径，我们建立了一个蛋白酶靶向嵌合体(PROTAC)模型 (补充图4a)。该模型基于SLF -沙利度胺与FKBP12标记的KDM5B的结合。SLF’是FKBP12的合成结合配体，而沙利度胺招募E3泛素连接酶cereblon进行泛素化，随后对靶向的KDM5B进行蛋白酶体降解。在WM3734黑色素瘤细胞中，将SLF’-沙利度胺应用于FKBP2标记的KDM5B，我们可以证明KDM5B蛋白以E3泛素连接酶依赖性方式迅速被蛋白酶体降解(补充图4b)。由于蛋白酶体降解是一个钙依赖性过程 ，且Cpd1的二氢吡啶结构表明其具有钙通道阻滞剂的功能，我们测试了Cpd1是否影响黑色素瘤细胞内的钙含量和泛素化蛋白的降解水平。事实上，急性和长期的Cpd1处理均导致储存性钙内流显著减少(补充图4c)，同时伴随着泛素化KDM5B的积累(图1h)。
图1组蛋白H3K4去甲基化酶KDM5B/JARID1B的表达调控。a黑色素瘤患者样本(左)与良性人类痣(右)的抗KDM5B免疫染色。高阳性细胞核为深红色，中等阳性细胞核为浅红色，低表达细胞核为蓝色。同型对照显示在右上角。所示为不同黑色素瘤或痣样本的代表性图像(各n = 5)。b根据TCGA数据集，基于KDM5B表达的切点优化计算皮肤黑色素瘤患者的Kaplan-Meier生存曲线(高表达，红色，与低表达，绿色，TCGA浏览器工具UCSC Xena和GraphPad Prism)。风险表中的患者样本量(风险数)已注明。通过长秩(Mantel-Cox)检验进行显著性测试。c通过qPCR评估强力霉素(Dox)处理24小时后KDM5B mRNA的诱导情况。所示为一个代表性示例(平均值，n = 2)。d在所示浓度下用Dox滴定24小时后，WM3734Fet3G-KDM5B细胞的抗KDM5B细胞核免疫染色(左为代表性图像；右为以细胞核染色强度的归一化频率分布表示的定量结果)。所示为三个克隆中的一个代表性克隆。e用Cpd1处理72小时后，内源性KDM5B蛋白水平的流式细胞术检测。平均值±标准差(n = 4)；双侧t检验。f用10 μM Cpd1处理72小时后，三种不同黑色素瘤细胞系(WM3734、WM88、MelJuso)的抗KDM5B细胞核免疫染色(左为代表性图片；右为以细胞核染色强度的归一化频率分布表示的定量结果)。 用Cpd1(10 μM)加环己酰亚胺(CHX，50 μg/ml， )处理WM3734细胞后KDM5B蛋白水平的时间进程。II用Cpd1处理WM3734细胞72小时后免疫沉淀泛素蛋白缀合物。用泛素-HRP抗体检测细胞总泛素化蛋白含量(上排)。用KDM5B特异性抗体检测泛素化KDM5B蛋白的比例(中间排)。Neg4用作结构同源化合物对照(n = 2)。为了更好地显示免疫沉淀产生的KDM5B条带，对两种处理的对比度进行了同等增强。源数据作为源数据文件提供。
KDM5B的强制表达将黑色素瘤细胞导向生长缓慢的持久状态。标准增殖(MTT)和凋亡(半胱天冬酶3加膜联蛋白V测量或7-AAD流式细胞术)分析表明，在短期化合物1处理的黑色素瘤细胞系或WM3734 Tet3G-KDM5B细胞中，其作用更像是细胞生长抑制而非凋亡或毒性作用(图2a，左图和补充图5a、b)。对于化合物1，基于MTT分析中的跨细胞系比较(补充图5c)假设了最大可行剂量 ，并将其用于所有后续实验。与关于KDM5B相关治疗持久性 的报道一致我们观察到，无论测试的黑色素瘤细胞系如何，KDM5B上调后对MAPK信号通路抑制剂(MAPKi)治疗的药物敏感性均降低(图2a，右图)。
接下来，我们测试了在KDM5B表达谱持续定向到更高水平且没有机会动态恢复到正常异质性的情况下，黑色素瘤细胞群体的行为。在WM3734 模型中强制表达KDM5B，在长期二维(2D)生长分析中减少了细胞数量，并以剂量依赖性方式降低了非锚定依赖性3D集落形成(图2b、c和补充图5d)。未处理的WM3734和WM3734 Tet3G-EGFP对照细胞的生长不受强力霉素影响(补充图5e)。然后在体内研究了KDM5B对肿瘤增殖的影响。我们让异种移植到体内的WM3734Tet3G-KDM5B细胞在向饮用水中添加强力霉素之前形成肿瘤，直至达到约 。这导致肿瘤生长显著延迟近2周(图2d； ，线性混合效应模型)。
化合物1的长期处理显著降低了不同黑色素瘤细胞系的生长，无论其基因型如何(图2e，补充图6a - c显示了长达16天的处理示例)。此外，先前对MAPK抑制产生抗性的黑色素瘤细胞对KDM5B表型的化学强化有反应，这支持了以下观察结果:在最初的KDM5B富集后，长期耐药的黑色素瘤细胞群体重新建立了正常的KDM5B异质性(图2f和补充图6d - g)。7-AAD染色表明，这种效应更多是上调的KDM5B的抗增殖作用的结果，而非化合物毒性的结果(补充图6h)。
此外，有限稀释分析和三维集落形成实验表明，在持续暴露于化合物1(Cpd1)的情况下，黑色素瘤细胞的肿瘤再增殖能力丧失(图2g、h)。相比之下，在接种到软琼脂之前仅用Cpd1预处理黑色素瘤细胞3天不足以减少形成的集落数量，这再次表明在正常条件下KDM5B表型具有自发可逆性(图2i和补充图6i)。在三维胶原球状体模型中，持续用Cpd1处理也降低了黑色素瘤细胞的侵袭能力(图2j)。有趣的是，Cpd1强烈损害了黑色素瘤细胞形成合适球状体的能力；特别是在胶原包埋之前开始处理时(图2k)。
最后，我们在异种移植和免疫健全的同基因小鼠黑色素瘤模型 中测试了Cpd1。与鼠CM细胞一样，Cpd1处理的表型效应事先在针对WM3734细胞的正交体外实验中得到了证实(分别参见补充图6j、k、图1e、f以及补充图3d、5c、6b、c)。在这两种小鼠模型中，与载体对照相比，Cpd1处理均产生了显著的抗肿瘤生长效应(图2l、m)。离体免疫染色证实了Cpd1诱导的向高KDM5B表达状态的转变(补充图6l)。
总之，我们的结果表明，KDM5B的表达动态可以通过外源性基因或化学调控受到限制，这为操纵依赖KDM5B的肿瘤维持提供了一种可能性。
KDM5B介导的细胞周期阻滞和细胞分裂末期缢裂的抑制。尽管在各种癌症实体 中，持久性细胞被反复描述为细胞周期缓慢，但它们在黑色素瘤中的真正细胞身份和增殖表型仍然难以捉摸。我们首先通过DNA含量细胞周期分析表明，在 不同剂量下强制表达KDM5B会剂量依赖性地诱导各种基因不同的黑色素瘤细胞系的细胞周期延迟(图3a和补充图7a)。有趣的是，对单个FUCCI-WM164细胞 进行的延时细胞周期成像显示，与二甲基亚砜(DMSO)和Neg4对照相比，Cpd1处理使总细胞周期长度增加了43.8%，这是因为在G1期和S/G2/M期花费的时间更长(图3b和补充图7b、c)。在长达7天的时间里持续用Cpd1处理(以Neg4作为阴性对照)进行的纵向DNA含量细胞周期分析表明，Cpd1诱导的G1期和G2/M期延迟可以以时间上连续的方式发生(补充图7d)。总之，这些实验强调了黑色素瘤单细胞效应大小测量中异质性和时间可塑性的作用，特别是对于从单个时间点进行的表型细胞周期读数的解释。
为了进一步揭示KDM5B抗增殖作用的分子机制，我们对用Cpd1处理的WM3734细胞与用Neg4处理的对照细胞进行了单细胞延时显微镜观察(补充视频1-3)。 后对细胞数量的定量分析证实了细胞增殖减少(图3c)。有趣的是，我们观察到一些正在进行细胞分裂的细胞完成细胞缢裂的时间延长(图3d)。我们推测这种现象可能是由KDM5B在胞质分裂(分裂细胞物理分离的最终过程)中迄今未知的调节作用引起的。我们旨在通过对细胞间中间体进行免疫染色来对其进行定量，即代表富含微管的膜桥的结构，这些膜桥在两个子细胞膜完全分离 之前不久连接两个子细胞。事实上，我们发现一部分用Cpd1处理的WM164细胞 以及用强力霉素处理的WM3734细胞 中的中间体数量显著增加。
细胞 (图3e)。重要的是，在WM3734Tet3G-KDM5B-FKBP12细胞中，SLF’-沙利度胺诱导的KDM5B降解挽救了Cpd1介导的中间体增加(图3f)。在 的 Cpd1处理后，通过RNAseq和无标记定量质谱对KDM5B强制表达的WM3734细胞进行转录组和蛋白质组分析，发现11个基因/蛋白质有少量重叠，其中7个在胞质分裂过程中具有已知功能(图3g和补充数据1以粗体突出显示)。例如，AURKB、MKI67、KIF4A、UBE2C、RRM2、KIF1C1和ANLN归因于GO细胞骨架依赖性胞质分裂。对于一部分基因(AURKB、KIF4A、SHCBP1和UBE2C)的表达，我们发现在Cpd1处理的WM3734细胞以及强力霉素处理的WM3734Tet3G-KDM5B细胞中均有下调(图3h)。已知AURKB、KIF4A和UBE2C调节纺锤体组装并协调 的分裂。SHCBP1参与中间体组织和胞质分裂完成 。因此，无论使用何种模型，上述基因可能在功能上参与了观察到的中间体增加和细胞加倍延迟。 在Cpd1处理的WM3734细胞以及强力霉素处理的WM3734Tet3G - KDM5B细胞中均下调(图3h)。已知AURKB、KIF4A和UBE2C调节纺锤体组装并协调分裂 。SHCBP1参与中间体组织和胞质分裂完成 。因此，无论使用何种模型，上述基因可能在功能上参与了观察到的中间体增加和细胞加倍延迟。
我们的实验到目前为止表明，KDM5B的外源性表达可以使黑色素瘤在大多数肿瘤细胞中呈现慢周期肿瘤表型，其中不同的分子机制可能协同作用以防止细胞
图2 强制表达KDM5B的体外和体内效应。a 使用Cpd1的MTT分析从第-7天开始，然后加入MAPKi处理72小时。在MAPKi(5 μM PLX4720 + 0.5 μM GDC-0973)处理72小时后以及总共10天的Cpd1处理后读取数据。DMSO或无MAPKi的Cpd1处理10天后的细胞数量(左图)以及与“无MAPKi对照”相比MAPKi处理72小时后的细胞数量(右图)。均值±标准差(n = 3)，双侧t检验(****p ≤ 0.0001)。b KDM5B诱导后(9、16和20天)的集落形成生长。均值±标准差，双侧t检验。显示的是六个克隆中的一个。c KDM5B诱导52天后的软琼脂集落形成。显示的是一个代表性实验(n = 3)。均值±标准差；双侧t检验。d 异种移植的WM3734T&t36-KDM5B细胞的生长。第34天开始进行强力霉素处理。对照组有 只小鼠，治疗组有 只小鼠，均值±标准误，线性混合效应样条模型。e WM983B和WM1366细胞用 的Cpd1或Neg4连续处理7天和9天的集落形成生长分析(n = 3)。f 451Lu和耐药的451Lu BR细胞用10μM的Cpd1与DMSO或Neg4对照处理9、16和20天的集落形成生长分析(n = 2)。g 用 Cpd1连续处理19天后的二维集落形成。均值， 。h 在指定剂量的持续Cpd处理下30天的软琼脂集落形成( 个中的一个代表性实验)以及i 与接种前短期处理72小时且不继续处理的情况相比(均值， )。j 在第10天，10 μM的Neg4或Cpd1作用下WM3734球体的胶原侵袭。显示的是一个代表性实验( )。均值±标准差；双侧t检验。k 胶原包埋后第10天的WM3734黑色素瘤球体。I、m 异种移植的WM3734细胞(左，每组 只小鼠)和同基因CM细胞(右，对照组每组 只，治疗组每组 只小鼠)的生长。当肿瘤可触及开始进行Cpd1处理。均值±标准误，线性混合效应样条模型。源数据作为源数据文件提供。
增殖。关于潜在的临床意义，降低持久性细胞状态可塑性可以通过延迟肿瘤进展及时提供治疗益处。然而，如果通过利用状态特异性药物敏感性额外根除慢周期且可能参与肿瘤再增殖的持久性细胞状态，这种方法可能会更有效。
强制表达KDM5B会导致谱系重编程。
为了揭示强制表达KDM5B后细胞身份的潜在变化以及潜在的转录程序，我们对我们的基因和化学KDM5B诱导模型(Tet-On 3G和Cpd1)进行了直接的RNA测序。WM3734 细胞用强力霉素处理24、48和 小时，然后收获进行分析。同时，将未处理的WM3734和患者来源的短期培养的CSM152细胞用Cpd1处理，并在 小时后进行分析(补充数据2)。我们首先检查Cpd1是否也在转录水平上模拟Tet-On 3G介导的KDM5B诱导的效果。事实上，我们发现我们的两个模型都可以将一个先前发表的KDM5B靶基因基序(SCI-BETTA_KDM5B_TARGETS_DN(DN = “下调”)基序，79个基因)调节到相似的程度 (补充图8a)。随后的基因集富集分析(GSEA)以及Cytoscape可视化显示了一个转录图谱，该图谱与其他预期的KDM5B相关途径如染色体重塑或ATP酶代谢相匹配。此外，发现参与细胞周期/有丝分裂、DNA损伤反应、RNA加工和免疫反应的基因受KDM5B调节(补充图8b)。控制细胞周期和有丝分裂的转录本显示，从KDM5B诱导的24小时到48小时再到 小时，调控呈稳步增加且具有统计学意义，这表明对细胞增殖机制有根本的、随时间变化的动态影响(补充图8c)。
由于据报道KDM5B以高度保守的方式 指导发育过程，我们询问强制表达KDM5B是否会影响黑色素瘤细胞的分化状态。事实上我们观察到，无论是基因还是化学方法强制表达KDM5B，间充质(SARRIO_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_- TRANSITION_DN，145个基因 )和增殖(GERBER_- PROLIFERATION_SPOT A，405个基因 )基因基序都有明显下调(图4a，FWER 被认为具有统计学意义)。此外，在两个模型中黑素细胞分化基因都受到特异性调控(GO_PIGMENTATION 基因，图4b)。最引人注目的是，强制表达KDM5B后会出现时间依赖性的转录转变，随着时间的推移，细胞逐渐从未分化的、神经嵴样状态转变为过渡性黑素细胞和黑素细胞基因基序(图4c和补充表2)。因此， KDM5B敲低显示出向未分化状态的反向基因表达(图4c，补充图8d中的对照WB)。在一个独立的对照实验中，Cpd1再现了分化重编程，并且也是以时间依赖性方式发生的(补充图8e、补充表2和补充数据3)。重要的是，在患者来源的CSM152黑色素瘤细胞中，Cpd1同样诱导了与KDM5B相关的分化重编程(图4a、b和补充图8a、e)，并且在从人类肿瘤组织 分离的单个黑色素瘤细胞中的内源性基因表达的计算机模拟中也得到了证实 来自19个肿瘤的黑色素瘤细胞)。在这里，与具有未分化特征的细胞相比，具有黑素细胞基因特征的细胞中KDM5B表达明显更高(图4d)。
KDM5B是胞质分裂和分化基因转录的表观遗传决定因素。鉴于KDM5B作为一种组蛋白去甲基化酶在转录调控中具有直接作用，我们使用ChIP-Atlas 将“所有细胞类型类别”设置为KDM5B和H3K4me3 ChIP-Seq数据进行了计算机分析，以及来自乳腺癌 和黑色素瘤细胞 的H3K4me3 ChIP-Seq数据。这表明在许多胞质分裂基因(乳腺癌和黑色素瘤细胞系)和黑素细胞分化基因(黑色素瘤细胞系)中，KDM5B DNA结合基序与H3K4me3染色质标记之间存在相关性(图5a，b)。具体而言，这包括胞质分裂基因AURKB、KIF4A、SHCBP1和UBE2C，以及分化基因MITF、MLANA、NGFR、AXL、TYR、TJP1、CDH2、ZEB1和SMAD1，我们发现这些基因以Cpd1依赖性方式受到调控(图3g，h和4a-d)。
为了从功能上支持Cpd1对基因表达的观察到的影响确实依赖于KDM5B，我们对KDM5B进行了siRNA敲低，随后在同时进行Cpd1处理时测量了选定的胞质分裂和分化基因的转录表达(图5c、d)。正如预期的那样，与对照序列相比，在图3h中我们发现基因(和Cpd1介导的)KDM5B上调后下调的胞质分裂基因，在KDM5B的siRNA敲低后在mRNA水平上上调(例如，AURKB、KIF4A，图5d，Neg4处理)。相应地，我们发现在KDM5B诱导后上调的分化基因，在KDM5B敲低后下调。当我们用对照序列处理细胞并加入Cpd1时，我们再次看到了KDM5B诱导的预期下游效应，即胞质分裂基因的mRNA下调和分化基因的上调(灰色条)。当我们将Cpd1加入到KDM5B的siRNA敲低的细胞中时，Cpd1无法维持KDM5B蛋白水平(图5c，没有产生可以从蛋白酶体降解中保存下来的KDM5B蛋白)，因此，无法逆转KDM5B下游基因的siRNA依赖性调控(白色条)。
图3 KDM5B介导的细胞周期停滞和细胞分裂末期缢缩抑制。a 用碘化丙啶对Cpd1处理72小时后的WM3734细胞(上图)或Dox处理72小时后的WM3734 细胞(下图)进行细胞周期分析。显示的是代表性数据(n = 4)。b 通过对用Cpd1(10 μM)与DMSO或Neg4对照(10 μM)预处理72小时的FUCCI-WM164细胞进行实时细胞周期成像，定量分析G1期(上图)和S/G2/M期(下图)的细胞周期持续时间。散点图表示平均值±标准差(n = 3)；Kruskal-Wallis检验。c 对用Cpd1(10 μM)与DMSO或Neg4对照(10 μM)处理长达72小时的WM3734细胞数量进行延时成像分析(15个不同区域，n = 2)。d 对延时显微镜电影分析完成胞质分裂的时间(15个不同细胞， )。e 对Cpd1处理72小时后的WM164细胞(左)和Dox处理后的WM3734Tet3G-KDM58细胞(右)与各自对照中的中体进行定量和代表性免疫荧光染色。显示的是单个荧光通道:蓝色(DAPI，细胞核)；黄色( -微管蛋白，微管)；绿色(极光B激酶，中体)；红色(鬼笔环肽，F-肌动蛋白)。点图显示每个视野中中体/细胞的比例，12 - 16个视野，n 。平均值±标准差，左，单因素方差分析；右，双侧t检验。f KDMSB-PROTAC模型中中体减少的定量分析。KDM5B的蛋白酶体降解由与Cpd1同时应用的SLF’-沙利度胺(SLF’-t)诱导(“con”)或在Cpd1预处理3天后应用(“pre”)。Neg4用作对照。点图显示中体/细胞核的比例为中位数，带有四分位间距(4个盖玻片，n = 2；单因素方差分析)。g 用质谱和RNA测序检测到的用Cpd1(10 μM)处理WM3734细胞后显著调控基因的维恩图和基因本体分析。h 通过质谱和RNAseq(左， )或qPCR(右，平均值 标准差， )评估Cpd1处理的WM3734和Dox处理的WM37347Et3G-KDM5B细胞中选定的胞质分裂调节因子的下调情况。源数据作为源数据文件提供。
图4 KDMSB导致分化导向的表型转变。a、b 来自Dox处理72小时后的WM3734Tet3G-KDMSB细胞以及Cpd1处理72小时后的WM3734和CSM152细胞的SARRIO_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSTITION_DN GERBER_PROLIFERATION_SPOT A特征 (a)和GO_PIGMENTATION特征 (b)的热图；红色，上调；绿色，下调。显著性由FWER 表示。c WM3734Tei36-KDM58细胞在Dox处理24、48和72小时后的Tsoi分化轨迹 的热图(左)，WM3734 KDM58基因敲低(fsh)与对照(scr)细胞的热图(右)；红色，上调基因；绿色，下调基因。d 小提琴图显示根据单细胞RNA测序的人类黑色素瘤中的转录分化水平的内源性KDM5B表达水平。星号表示来自单因素方差分析和Dunnett多重比较检验的p值<0.0001。这里的比较是与未分化组进行的。
强制表达KDM5B会导致细胞谱系定向易感性。观察到的依赖KDM5B的细胞状态重编程不仅证实了向黑素细胞分化的进程，还可能使黑色素瘤细胞对继发的表型特异性药物敏感。我们试图利用3 - O -(3,4,5 - 三甲氧基苯甲酰基)-(-)-表儿茶素(TMECG)，一种先前描述的经酪氨酸酶(TYR)加工的抗代谢剂，它能以细胞谱系特异性方式消除黑色素瘤细胞 。因此，我们首先评估Cpd1处理是否真的能激活黑色素瘤细胞中的黑素细胞分化/色素沉着机制。事实上，我们发现，在具有色素沉着能力的黑色素瘤细胞中，Cpd1诱导黑素细胞主调节因子MITF以及其他下游分化基因如DCT、TYR和MART - 1/ MLANA的转录具有显著的时间依赖性(图6a)。相反，敲低KDM5B与分化基因表达的降低有关(图6b)。对WM3734 Tet3G - KDM5B细胞进行免疫印迹证实，MITF蛋白的表达随KDM5B剂量呈滴定式增加，而间充质细胞表型的典型标志物如CDH2、AXL、ZEB1或SMAD1蛋白则减少(图6c)。对于Cpd1，在蛋白质水平上这些标志物的调节也有类似趋势(图6d)。最后，Cpd1处理后同基因黑色素瘤的免疫染色切片(图2m)证实体内MITF蛋白表达增加(图6e，上排)。Fontana - Masson染色还显示细胞内黑色素生成局部增加(图6e，下排)。
图5 KDM5B依赖的胞质分裂和分化基因转录。对来自乳腺癌细胞系SUM158、SUM159、MCF7、HCC2157、147D和MDA231(GSE4607342)以及黑色素瘤细胞系MM27、MM13、MM16(GSE7185444)和A375(GSE99835 ))的KDM5B和H3K4me3 - ChIPseq数据中的胞质分裂和有丝分裂纺锤体组装基因(a)或分化基因(b)进行计算机分析以及ChIP - Atlas41。c在siRNA转染4天后，通过免疫印迹法确认MaMeI63a细胞中KDM58的敲低。d在KDM5B敲低4天后以及Neg4或Cpd1处理(10 μM)3天后，通过qPCR分析KDM5B靶基因中胞质分裂相关基因(AURKB、KIF4A)和分化相关基因(DCT、MelanA)的表达。显示的是一个代表性示例(平均值 标准差， )。源数据作为源数据文件提供。
我们接下来在临床前模型中测试Cpd1对谱系定向黑色素瘤细胞的致敏作用。我们在三种黑色素瘤细胞系(WM3734、MaMel63a、WM983B，图6f和补充图9)中体外测试了Cpd1与TMECG的组合。MTT分析表明，TMECG与Cpd1联合使用对先用Cpd1预处理3天的细胞更有效。这补充了我们之前的观察结果，即KDM5B定向的细胞重编程向细胞分化是一个时间依赖性过程(图4c和补充图8e)。单独的TMECG对细胞数量的影响有限，因此，在后续体内联合治疗中它被定义为仅次于Cpd1的单药治疗对照(图6g)。与单独使用Cpd1相比，其对体内肿瘤生长的影响 预先评估了载体对照(图2l)。为了研究TMECG和Cpd1体内时间顺序的影响，我们建立了一个治疗模型，其中将WM3734细胞异种移植到免疫缺陷的NMRI-(nu/nu)-裸鼠背部，历时20天以形成肿瘤(图6g，左)。Cpd1和TMECG同时或连续进行联合治疗，即在用TMECG处理前，先用Cpd1对肿瘤进行一周的预处理。与我们的体外观察结果一致，当已形成的肿瘤在开始进行状态特异性消除之前先诱导分化时，黑色素瘤肿瘤生长显著降低(图6g，右； )，Mann-Whitney检验)。在我们的动物实验方案时间范围内，Cpd1和TMECG的联合治疗未能减小肿瘤大小。在此模型中无法评估Cpd1在联合治疗情况下可能产生的长期效果。
总之，我们的研究为黑色素瘤的双重打击策略提供了概念验证，其中持续状态导向的转变限制了细胞状态可塑性，并使肿瘤细胞易于被分化特异性消除(图7)。
图6 强制表达KDM5B可促进TMECG对黑素细胞谱系的定向消除。a 通过qPCR评估Cpd1处理MaMel63a细胞24小时、48小时、72小时和7天后的mRNA定量。均值±标准差。显示的是一个代表性示例。b 在WM3734细胞中敲低KDM5B 5小时后，通过cDNA微阵列分析检测到的分化、胞质分裂和有丝分裂纺锤体组装基因的调控(n = 1)。c、d 在WM3734Te3G-KDM5B细胞中诱导KDM5B 24小时后(c)以及在MaMe163a细胞中用Cpd1处理72小时后(d)，对黑素细胞谱系和(去)分化标志物进行免疫印迹分析。显示的是代表性数据(n = 2)。e 对来自Cpd1处理组与对照组小鼠的黑色素瘤肿瘤移植物进行抗MITF免疫染色(上图)和Fontana-Masson染色(下图)。f WM3734细胞的MTT细胞活力测定。左图显示代表性示例(均值±标准差， )，右图显示相应的IC 值。TMECG与Cpd1同时给药(“con”)或在Cpd1预处理3天后添加(“pre”)。在TMECG处理72小时后进行读数。g 体内持久性状态导向治疗模型。左:免疫缺陷的NMRI-(nu/nu)-裸鼠治疗给药和时间安排的示意图。右:WM3734异种移植物的肿瘤体积(第30天为终点)。TMECG与Cpd1同时给药(“con”)或在Cpd1预处理一周后添加(“pre”)。均值±标准误(TMECG和Cpd1对照组6只小鼠，“con”组5只小鼠，“pre”组7只小鼠)。显著性通过双侧Mann-Whitney检验确定。源数据作为源数据文件提供。
图7 黑色素瘤中针对表型的双重打击策略。KDM5B持久性状态导向转变限制了肿瘤可塑性和异质性，并使黑色素瘤细胞倾向于进行谱系特异性消除。
讨论
除了肿瘤的遗传进化外，特别是细胞表型可塑性已成为癌症治疗中一个新出现的问题 。由于黑色素瘤细胞在不同的转录、细胞增殖和分化程序之间快速转换，这些表型可能会短暂重叠，并迅速适应任何专门针对单一耐药机制的策略 。因此，本研究的一个问题是，限制细胞表型状态的动态变化是否可以成为黑色素瘤双重打击策略的起点。慢周期KDM5B高表达的黑色素瘤细胞表型被用作概念验证的模型。 黑色素瘤。慢周期KDM5B高表达黑色素瘤细胞表型被用作概念验证模型。
到目前为止，黑色素瘤中慢周期KDM5B高表达持久性细胞的真实性质尚不清楚。我们的数据表明，KDM5B指导黑色素瘤细胞的转录特征从未分化向黑素细胞谱系分化转变。在治疗前诱导KDM5B改变了内在抗性黑色素瘤细胞的频率，类似于最近报道的DOT1L抑制状态 。在CRISPR-Cas9筛选中通过基因敲除抑制组蛋白H3K79甲基转移酶DOT1L有利于神经嵴细胞分化程序(NGFR 状态)，并增加了对BRAF抑制剂治疗预先产生抗性的细胞数量。未来在单细胞转录和蛋白质组水平上的研究必须弄清楚，KDM5B诱导和DOT1L抑制是否会驱动细胞特征朝着相同的终末阶段发展，以及这些效应在多大程度上取决于实际活跃的基因表达水平和表型重编程所需的时间。
根据关于KDM5B依赖性细胞命运决定和其他组织类型(如神经分化 或造血 )中细胞谱系定向的报道，我们的研究表明，KDM5B在黑色素瘤中作为分化和细胞分裂程序的高度动态协调者发挥作用。我们发现，KDM5B通过下调控制细胞骨架依赖性胞质分裂(如AURKB、KIF4A、UBE2C和SHCBP1 )的基因来有效抑制细胞增殖。我们的中体分析估计，相当一部分KDM5B过表达的黑色素瘤细胞需要更长时间才能完成细胞脱离，这可能是观察到的整体细胞周期延迟的原因。根据目前可用的基因谱数据(如TCGA)，大多数黑色素瘤中KDM5B不受失活突变的影响(根据CBioPortal，突变频率为5.9%)，这可能代表了黑色素瘤细胞的一种理想方式，无论其突变背景如何，都能在需要时确保缓慢循环状态。从概念上讲，这可能意味着黑色素瘤细胞利用缓慢循环的分化KDM5B高表达状态立即在选择性压力下存活，但必须再次降低KDM5B表达并恢复细胞周期进程，以支持更具增殖性的细胞表型，以确保长期肿瘤再增殖(可塑性成瘾)。
尽管我们认为KDM5B高表达表型是分化的，但我们意识到，由于黑色素瘤中描述细胞表型状态的任何术语都具有高度的不稳定性，因此需要谨慎使用。在长时间诱导KDM5B的情况下，我们观察到RNA特征和蛋白质标志物谱随时间的变化。根据选择用于实验读出的时间点，标志物组合，甚至细胞增殖等功能行为，对于评估特定细胞状态对肿瘤细胞存活或药物杀伤是有利还是不利可能会产生误导。在这方面，我们的结果揭示了KDM5B高表达的黑色素瘤细胞状态的“双面”作用。一方面，当慢周期状态持续时，黑色素瘤的生长和细胞侵袭受到损害。另一方面，黑色素瘤细胞可以利用这种状态立即在靶向或细胞毒性治疗中存活。然而，如此处所示，当KDM5B高表达状态定向转变与状态特异性消除策略(而不是非特异性减瘤药物)相结合时，控制肿瘤生长是可能的。事实上，现在可以设想多次应用细胞状态定向消除；特别是作为一种挽救策略或在现有癌症治疗后加深对残留疾病的反应。因此，我们计划在未来的研究中，理想情况下使用化学性质改善、溶解度优化的Cpd1版本，系统地测试Cpd1/TMECG与其他疗法的序贯治疗方案。
方法
黑色素瘤细胞系、患者样本及培养。以下人类黑色素瘤细胞系在含2% FBS替代物(Tu2 )加 L-谷氨酰胺或4% FBS替代物(Tu4 )的黑色素瘤培养基中于 培养:Wistar细胞系 BR 、WM164 、WM3734 、WM88 、WM983B BR 、WM983B 、RARS WM983B BR 。WM3734 、慢病毒感染的WM3734_sh_KDM5B_62和对照细胞以及WM3734 详情见文献 。商业细胞系MelJuSo(BRAF 、PTEN 、NRASQ61L)、MeWo 、SKMel5 、SKMel28 在含10% FBS的RPMI中培养。原发患者来源细胞系CSM027(BRAF 、 、 、MaMel63a 、NRAS )、ESO14028成纤维细胞和小鼠细胞系 亦在含10% FBS的RPMI中培养。451Lu BR和WM983B BR通过 PLX4720(维莫非尼异构体 )维持耐药性。使用jetPRIME 将siRNA载体(Flextube，Qiagen)转染以瞬时敲低KDM5B。人体组织研究和细胞系建立获宾夕法尼亚大学医学院、维斯塔研究所、维尔茨堡大学及杜伊斯堡-埃森大学医学院伦理委员会批准(编号:123/08_ff、11-4715、17-7391-BO)。细胞用PBS(Biochrom)中0.05%/0.02%胰蛋白酶/EDTA收获。细胞系身份经埃森大学医院病理科PCR DNA指纹图谱确认，并通过PCR常规检测支原体污染。
建立可诱导的Tet-On 3G-KDM5B和KDM5B-PROTAC
模型。克隆了慢病毒Tet-On 3G-KDM5B构建体用于诱导性KDM5B蛋白表达。克隆步骤由VectorBuilder规划。Tet-On反式激活蛋白由 -Hygro-CMV-Tet 载体编码。TRE反应载体包含一个 启动子，其后是人KDM5B基因转录变体1，NM_001314042.1(从pBIND-RBP2-H1(参考文献 )亚克隆)，或者作为对照的EGFP基因(分别为pLV-Puro-TRE3G-hKDM5B和pLV-Puro-TRE3G-EGFP)。简而言之，根据制造商的方案，使用JetPRIME Polyplus(美国纽约)将pLV-Hygro-CMV-Tet3G稳定感染WM3734细胞。经潮霉素B筛选和单细胞克隆后，WM 细胞用 -Puro-TRE3G-hKDM5B或pLV-Puro-TRE3G-EGFP稳定感染，随后进行嘌呤霉素筛选。双重感染的WM3734黑色素瘤细胞(WM3734 Tet3G-KDM5B或WM3734 )在Tu2%培养基中培养。为了实现强力霉素诱导的外源性KDM5B-FKBP12融合蛋白表达，基于pLV-Puro-TRE3G-hKDM5B克隆了慢病毒表达载体，并按上述方法感染和筛选WM3734细胞。按照标准方案 ，通过CRISPR/Cas9在WM3734Tet3G-KDM5B-FKBP12细胞中对内源性KDM5B进行基因敲除。根据已发表的程序 ，通过向培养基中添加 -沙利度胺诱导E3连接酶依赖性降解。
药物与化合物:氨苄青霉素(AppliChem，奥马哈)、杀稻瘟菌素(InvivoGen，圣地亚哥)、顺铂( 溶液，梯瓦制药，佩塔提克瓦)、环己酰亚胺(Sigma-Aldrich，圣路易斯)、二甲基亚砜(AppliChem，奥马哈)、强力霉素(AppliChem，奥马哈)、Fura-2 AM(赛默飞世尔，施韦特)、潮霉素(AppliChem，奥马哈)、MG132(Sigma-Aldrich，圣路易斯)、维莫非尼异构体PLX4720(Selleckchem，休斯敦)、GDC-0973/考比替尼(Selleckchem，休斯敦)、嘌呤霉素(默克，达姆施塔特)、曲美替尼(Selleckchem，休斯敦)、Neg4((氧杂环丁烷-2-基)甲基-4-(6-溴-2H-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2,7,7-三甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氢喹啉-3-羧酸酯，Chem-Div，圣地亚哥)及Cpd1(2-苯氧基乙基4-(2-氟苯基)-2,7,7-三甲基-5-氧代-1,4,5,6,7,8-六氢喹啉-羧酸酯，ChemDiv，圣地亚哥)。Neg4和Cpd1以 储备液溶于二甲基亚砜，培养基中按1:1000稀释。3-O-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-(-)-表儿茶素(TMECG)依文献 合成，由JN Rodríguez-López提供。
小分子化合物筛选。为了鉴定可调节黑色素瘤细胞中KDM5B表达水平的化合物，我们使用之前发表的KDM5B启动子-EGFP报告基因 筛选了一个小分子文库。其基本原理是找到能降低报告基因活性，从而使表达EGFP的细胞频率低于2%阈值的化合物(K/EGFP，阈值定义见参考文献 )。我们没有优先考虑导致K/EGFP增加的化合物，因为之前已证明这些化合物…… 小分子筛选。为鉴定调节黑色素瘤KDM5B表达的化合物，利用已发表的KDM5B-启动子-EGFP报告基因 筛选文库。旨在降低报告基因活性，使表达EGFP细胞频率低于2%阈值(K/EGFP，见文献 )。因先前证实增加K/EGFP的化合物可能具非特异性细胞毒性 ，故未优先筛选此类化合物。我们成功鉴定出能改变KDM5B转录水平的化合物。使用PerkinElmer Opera高内涵系统(含Columbus 2.4.0分析软件)进行共聚焦微孔板成像。主要参数为化合物 处理后，每细胞及每孔的K/EGFP水平与存活细胞总数的关系。通过Draq5死细胞滴定确定每孔1250个细胞的适宜数量。寡霉素 作阳性对照(降低K/EGFP比例)；曲古抑菌素A 作阴性对照(绝对增加K/EGFP且无显著死亡)；顺铂 作阴性对照(通过大量杀伤细胞相对增加 EGFP) 。反向筛选滤除非特异性效应:仅在WM3734 中而在WM3734 对照中未出现的命中视为特异性。
工作流程包括从几个知名化合物库中筛选7500种合成化合物，包括ENZO FDA批准药物库(ENZO，640种化合物)、Analyticon Discovery库(AD，2329种化合物)、ChemBioNet库(CBN，2816种化合物)、ComGenex库(CGX，2437种化合物)以及Sigma - Aldrich药理活性化合物库(LOPAC，1280种化合物)。其中一些化合物的作用机制已有报道，已知它们可调节激酶、蛋白酶、离子通道和表观遗传调节剂。共鉴定出339个初步命中化合物(AD:46种化合物；CBN:205种化合物；CGX:2种化合物；ENZO:18种化合物；LOPAC:68种化合物)，与二甲基亚砜对照相比，这些化合物使表达K/EGFP的细胞减少至<2%，且细胞数量变化不超过20%。在接下来的命中确认步骤中，在三个独立实验中对这339个命中化合物进行剂量反应滴定实验，每个化合物浓度均进行四次重复实验( ，以及 )。339种化合物中的9种的活性符合进一步研究标准，即具有可接受的剂量反应曲线质量和效力。在这9个经过验证的命中化合物中，我们选择了一种化合物，2 - 苯氧基乙基 - 4 - (2 - 氟苯基) - 2,7,7 - 三甲基 - 5 - 氧代 - 1,4,5,6,7,8 - 六氢喹啉 - 3 - 羧酸酯(称为Cpd1)，以分析其对黑色素瘤细胞的生物学影响。作为生物学测定的阴性对照，我们选择了一种结构类似化合物(Neg4)，其分子访问系统(MACCS)相似度为0.899，它未被鉴定为命中化合物(氧杂环丁烷 - 2 - 基)甲基 - 4 - (6 - 溴 - 2H - 1,3 - 苯并二氧杂环戊烯 - 5 - 基) - 2,7,7 - 三甲基 - 5 - 氧代 - 1,4,5,6,7,8 - 六氢喹啉 - 3 - 羧酸酯。
Cpd1的化学分析。在核磁共振仪(NMR)中对Cpd1(2 - 苯氧基乙基4 - (2 - 氟苯基) - 2,7,7 - 三甲基 - 5 - 氧代 - 1,4,5,6,7,8 - 六氢喹啉 - 3 - 羧酸酯，PubChem名称BAS00915510)的化学结构进行了分析(补充图10)。在MeOD中使用DRX600(600 MHz)光谱仪记录了 - NMR、 - NMR和 - NMR。
基于Fura-2的 成像。若未另行说明，细胞在含有 Neg4或Cpd1的细胞培养基中预处理3 - 4天。实验前，将细胞(80,000 - 100,000个)接种在 圆形(1.5号，#6310172，VWR)玻璃盖玻片 上，并在生长培养基(含有指定化合物)中于室温下用 Fura-2 AM(#F1221，赛默飞世尔科技 ，德国施韦特)加载 。测量在室温下于含有 葡萄糖、 HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、 和 或 以及 EGTA的林格氏缓冲液(pH 7.4)中进行。
使用配备pE-340 (CoolLED，安多弗，英国)LED光源、LED (激发滤光片: )和 (激发滤光片: )以及T400 LP二向色镜和 发射滤光片、sCMOS pco.edge相机和Fluar 物镜的蔡司Axiovert S100TV进行基于Fura-2的胞质 测量。在含有 的林格氏缓冲液中测量基础胞质钙水平，通过用毒胡萝卜素(Tg， )灌注无钙林格氏缓冲液来耗尽内质网钙库，并通过重新添加 来实现储存操纵性钙内流(SOCE)。使用VisiView®软件(Visitron Systems GmbH，普希海姆，德国)分析数据。使用方程 将获得的 荧光比率转换为校准数据，而 和 的值如Grynkiewicz等人 所述进行测定。
细胞数量和凋亡的测定。根据标准方案 ，通过MTT和结晶紫(CV)测定法评估细胞数量。使用LIVE/DEAD(赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)通过流式细胞术检测凋亡，或使用IncuCyte凋亡测定法(半胱天冬酶3，膜联蛋白V，艾森生物科学公司，美国密歇根州安阿伯)检测凋亡。
克隆形成、有限稀释和集落形成试验。二维克隆形成
在每24孔板接种2500个细胞(用于5 - 7 - 9天读数)或300个细胞(用于9 - 16 - 20天读数)后评估生长情况。对细胞进行处理和分析 通过结晶紫染色。黑色素瘤自我更新的定量通过有限(单细胞)稀释试验进行。简而言之，将细胞以每96孔板每四孔一个细胞的密度接种，并培养19天。通过显微镜手动计数评估集落数量。
在将2500个细胞嵌入六孔板中的0.35%软琼脂中并培养30 - 52天后评估三维集落形成。通过在1%软琼脂床上培养细胞来抑制贴壁依赖性生长，在顶部添加Tu2%或RPMI培养基并每周更换两次。对于用强力霉素诱导KDM5B，WM3734 Tet3G - KDM5B细胞在接种前用强力霉素预处理 ，然后在试验期间持续处理。对于用化学调节剂诱导KDM5B，黑色素瘤细胞要么在软琼脂中用指定浓度的Cpd1持续处理，直到集落大小达到 (第25天)，要么在接种到琼脂中之前用 预处理 (预处理)。通过显微镜评估集落数量。
胶原包埋的黑色素瘤球体和细胞侵袭试验。如先前 所述生成黑色素瘤球体。简而言之，在96孔板的每孔中，在一层非粘附性 琼脂糖上培养3,000个细胞 以形成球体。然后将球体单独收集并嵌入I型胶原混合物中以评估三维侵袭。在胶原包埋10天后，使用蔡司Axio Observer.Z1显微镜对球体进行成像。使用ImageJ 1.48 软件(美国国立卫生研究院)对球体侵袭进行定量。通过从侵袭面积中减去球体体积面积来量化归一化侵袭。在胶原包埋10天后显示黑色素瘤球体的代表性图片。Neg4与Cpd1(10μM)处理在细胞胶原包埋之前、球体形成完成之后或胶原包埋之前和之后进行。
组织免疫染色。将石蜡包埋的肿瘤或痣切成1.5、2.(5)或 切片。脱蜡和脱水后，如下所示或用硝酸银工作溶液和固红复染进行抗体染色。使用 物镜用Aperio ScanScope AT2(徕卡)扫描染色玻片，并在Aperio Image - Scope软件版本12.1.0.5029中选择选定区域。
KDM5B和MITF蛋白的免疫染色。细胞染色通过化学或荧光染色进行。对于KDM5B的化学免疫染色，将细胞接种在玻璃盖玻片上，在含有0.1% Triton X - 100的4%多聚甲醛中固定 ，并用含有0.1% Triton X - 100加5%牛血清白蛋白的PBS封闭30分钟。使用抗KDM5B NB100 - 97821(Novus Biologicals，美国密苏里州圣路易斯，1:1200)进行染色，并作为阴性对照，使用兔IgG(Dianova，西班牙卡斯特尔德费尔斯，1:1200)。随后根据制造商的方案应用Dako REAL检测系统(安捷伦，美国加利福尼亚州圣克拉拉)，并使用奥林巴斯BX51或蔡司AxioObserver.Z1显微镜进行评估。对于FFPE组织切片中KDM5B和MITF的免疫染色，载玻片根据制造商的方案在DAKO自动染色仪中使用相同的抗体或抗MITF ab12039(Abcam，英国剑桥，1:1000)进行处理。对于KDM5B的免疫荧光染色，培养的细胞在含有0.1% Triton X - 100的2%福尔马林中于室温(RT)固定15分钟，然后在含有0.1% Triton X - 100的5%牛血清白蛋白中于RT封闭 。随后与一抗(1:1200至1:20,000)或兔IgG(相应地为1:1200至1:20,000)在RT孵育 。Alexa Fluor 568山羊抗兔(1:600)用作二抗。使用蔡司AxioObserver.Z1显微镜和Zen软件版本2.6评估染色。图像处理在整个图像上均匀应用，并同样应用于对照。
中间体的免疫荧光染色。WM164，WM3734Tet3G - KDM5B -
FKBP12和WM3734 细胞在贴壁亚汇合培养中生长，分别用Cpd1(10μM)、二甲基亚砜、Neg4对照(10μM)或 强力霉素处理 。样品在BRB80缓冲液(80 mM K-PIPES，pH 6.8， EGTA)中用 多聚甲醛固定 ，然后用PBS洗涤三次，并用0.25% Triton X-100的PBS溶液通透处理5分钟。样品在AbDIL(抗体稀释封闭缓冲液，2% BSA，0.1% Triton X-100，0.1% 的PBS溶液)中于 孵育过夜。用于识别极光激酶B(1:100，AIM1，611082，BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖)、α-微管蛋白(1:400，Abcam，英国剑桥)和鬼笔环肽(1:100，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)的一抗在AbDIL中稀释并孵育过夜。在加入在含有 -二脒基- -苯基吲哚二盐酸盐(1:1000，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)的AbDIL中稀释(1:500)的二抗之前，样品洗涤三次，并在室温下孵育 。样品在PBS中冲洗三次，每次5分钟，并封固在MOWIOL封固介质( Tris-HCl pH 8.5，25%甘油)中。阳性极光激酶B和 -微管蛋白染色的中间体要么报告为每个视野中中间体/细胞的比例， 个视野，要么报告为中间体/盖玻片。一个视野由宽度为五幅图像 长度的图像组成。使用定制的尼康旋转盘共聚焦 或蔡司Axio Observer.Z1显微镜在 或 放大倍数下采集图像(尼康旋转盘共聚焦的数值孔径为1.49，AxioObserver.Z1为0.95或1.4)。使用Axio Scan Z1显微镜在 放大倍数下采集盖玻片(13 mm)图像。对于分析，每个盖玻片被细分为八幅图像。根据Shihan等人 的方法，在ImageJ 1.48x中通过DAPI计数对细胞计数进行归一化。图像处理在整个图像上均匀应用，并且同样应用于对照。 盘式共聚焦为1.49，AxioObserver.Z1为0.95或1.4)。使用Axio Scan Z1显微镜在 放大倍数下采集盖玻片(13毫米)图像。对于分析，每个盖玻片被细分为八张图像。根据Shihan等人 的方法，通过ImageJ 1.48x中的DAPI计数对细胞计数进行归一化。图像处理在整个图像上均匀应用，并同样应用于对照。
免疫染色定量。使用蔡司Axio Observer.Z1显微镜(数值孔径为0.8)在 放大倍数下拍摄免疫荧光照片。为了确定KDM5B信号的平均强度，使用CellProfiler版本3.1.8(美国马萨诸塞州剑桥市布罗德研究所)对每个独立实验的至少三张代表性照片中的核和细胞质KDM5B信号进行定量 。化学免疫染色图像的核色原强度定量采用之前发表的倒数强度法 。组织样本的免疫组织化学由认证的组织病理学家(K.G.)按照我们之前发表的标准进行评分 。
流式细胞术。KDM5B的流式细胞术分析如前所述进行 。简要地说，收集细胞并在含有0.1% Triton X - 100的2%福尔马林中于室温固定 ，随后在90%甲醇中于 通透 。一抗(NB100 - 97821，Novus Biologicals，美国密苏里州圣路易斯或兔IgG，Dianova，西班牙卡斯特尔德费尔斯)和二抗(Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG或Alexa Fluor 647山羊抗兔IgG，美国加利福尼亚州Life Technologies)在室温孵育 。在抗体孵育前后，细胞用含有 EDTA和 FBS的FACS缓冲液洗涤。样品使用Gallios流式细胞仪(美国加利福尼亚州布雷亚贝克曼库尔特公司)测量，并使用Kaluza 1.2(美国加利福尼亚州布雷亚贝克曼库尔特公司)或FlowJo V7.6.5(美国俄勒冈州阿什兰Tree Star公司)软件分析。基于DMSO对照设置门，将其设置为1% KDM5B高细胞。对于KDM5B启动子驱动的EGFP信号的流式细胞术检测，收获WM3734KDM5Bprom - EGPF细胞，用FACS缓冲液洗涤，并进行7 - AAD染色(美国加利福尼亚州圣地亚哥eBioscience公司)。为了定量，如前所述 应用K/EGFP信号强度的5%阈值。
DNA含量细胞周期分析。细胞周期分析通过碘化丙啶染色如前所述进行 。简而言之，每个T75培养瓶接种100,000个MelJuSo、WM9或SKMel5细胞，或每个 培养皿接种20,000个WM3734细胞，并在无FBS的培养基中饥饿5天。从第6天开始，细胞在有或无 FBS的情况下用 处理 。每个 培养皿接种WM3734 克隆(80,000个细胞)并饥饿5天。从第6天开始，在含有FBS的培养基中加入强力霉素 ，并每2 - 3天更换一次。处理6天后分析细胞。对于碘化丙啶染色，将细胞用胰蛋白酶消化并用含有 EDTA的PBS洗涤。然后细胞在室温用100%乙醇固定 ，随后在室温用RNase A处理 。加入终浓度为 的碘化丙啶。在Gallios细胞仪(美国加利福尼亚州布雷亚贝克曼库尔特公司)上以线性模式进行定量。使用FlowJo V7.6.5或Kaluza 1.2软件进行数据分析。
单细胞周期分析。为了生成表达FUCCI构建体的稳定黑色素瘤细胞系， 和 如前所述 被亚克隆到一个复制缺陷、自我失活的慢病毒表达载体系统中。慢病毒由共转染人胚肾293T细胞产生。制备了用于 (30/120)和 的高滴度病毒溶液，并用于共转导到黑色素瘤细胞系WM164中，通过单细胞 生成亚克隆。
延时显微镜观察。为了追踪细胞数量，每6厘米培养皿接种80,000个WM3734细胞，使用蔡司Axio Observer.Z1显微镜在每个条件下的15个不同区域，以 放大倍数在5天内每隔 拍摄图像。在处理0、24、48和 小时后，手动计数每个位置的细胞数量。通过测量细胞变圆与子细胞完全分离之间的时间(以分钟为单位)来确定细胞分裂时间。FUCCI-WM164 在24孔培养皿中生长，并用Cpd1(10μM)、Neg4或DMSO预处理 。每个实验中，从三个重复孔的五个不同位置，每隔 在 内采集延时图像。使用配备滨松ORCA-Flash2.8相机的活细胞奥林巴斯IX81倒置荧光相差显微镜，以 放大倍数拍摄电影。FUCCI探针荧光强度随时间的变化如先前发表的 那样计算，但有以下修改。使用IMARIS 8.4版(Bitplane)中的“斑点功能”确定细胞周期不同阶段的FUCCI荧光的总持续时间和轮廓。使用等于或小于 的斑点阈值，利用自回归运动算法追踪荧光FUCCI细胞核。然后，沿着荧光细胞核的轨迹创建感兴趣区域(ROI)，并在电影的整个持续时间内测量平均中心点强度。使用大于总电影持续时间50%的轨迹进行分析，以确保捕获完整的细胞周期轮廓。中断超过两帧的轨迹被忽略，并且忽略外周 边界 内重合的细胞，以避免包括部分轨迹轮廓。平均荧光强度值针对背景荧光进行校正，并用于计算总轨迹持续时间并生成强度随时间变化的图。 大于两帧的中断被忽略，并且忽略外周 边界 内重合的细胞，以避免包括部分轨迹轮廓。平均荧光强度值针对背景荧光进行校正，并用于计算总轨迹持续时间并生成强度随时间变化的图。
实时定量逆转录PCR(QPCR)。根据制造商的方案(Qiagen，荷兰芬洛)，使用RNeasy Mini试剂盒分离总RNA。二十纳克RNA用作定量PCR的模板，使用Precision OneStep qRT-PCR预混液(PrimerDesign，英国南安普顿)或Luna Universal One-Step RTqPCR试剂盒(NEB，美国马萨诸塞州伊普斯威奇)。使用StepOnePlus实时PCR系统(赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行定量PCR。热循环条件为 持续 ，然后在 下进行40个循环的 ，接着在 下进行 。使用StepOnePlus软件v2.1(赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行分析。使用 方法计算mRNA表达，并将其标准化为管家对照18S。所用引物列于补充表3中。
免疫印迹法。对于全细胞裂解物的免疫印迹分析，细胞用补充了磷酸酶抑制剂(完全片剂；罗氏诊断公司)的RIPA缓冲液(含 Tris-HCl，pH 6.8， 脱氧胆酸钠，0.1% SDS和1% Triton X-100)裂解，或按照REAP方案 进行裂解。样品(20 - 25 μg蛋白质)在8%聚丙烯酰胺 - SDS凝胶上分离，湿法转移到PVDF膜(德国卡尔斯鲁厄的Roth公司)上，并在含0.1%吐温20的5%牛奶中封闭 。一抗(Axl (8661)、CDH2 (13116)、微管蛋白(2148)、ZEB1/TCF8 (3396)、Smad1 (9743)和TJP1 (8193；均稀释1:1000，均购自英国剑桥的Cell Signaling公司)、FKBP12 (ab24373)、组蛋白H3 (ab1791，稀释1:5000)、组蛋白H3K4me3 (ab8580，稀释1:2000)、MITF (ab80651，稀释1:500)和Notch1 (ab52627，均稀释1:1000，均购自英国剑桥的Abcam公司)、KDM5B (NB100 - 97821，稀释1:2000，美国密苏里州圣路易斯的Novus Biologicals公司)和GAPDH (SC - 510，稀释1:5000，美国得克萨斯州达拉斯的Santa Cruz公司))在含0.1%吐温20和 牛奶的PBS中于 过夜孵育，或在 Net - G缓冲液(10 Net - G含有 EDTA、 Tris、0.5%吐温20和0.4%明胶)中孵育。印迹用PBS - T或NetG洗涤，然后用在含5%牛奶的PBS - T中稀释1:10,000的辣根过氧化物酶偶联二抗(抗兔(115 - 035 - 046)或抗鼠(115 - 035 - 003，美国宾夕法尼亚州西格罗夫的Jackson Immuno Research Laboratories公司))或NetG中进行 孵育，并进行进一步洗涤步骤。蛋白质印迹中的条带通过增强化学发光系统(WesternBright化学发光底物，美国加利福尼亚州门洛帕克的Advansta公司)可视化，并使用FUJI LAS3000系统捕获。使用ImageJ 软件(美国国立卫生研究院)进行数字定量分析。
泛素化测定。为了检测蛋白质泛素化，使用了美国科罗拉多州丹佛市Cytoskeleton公司的Signal - Seeker 泛素化检测试剂盒，按照制造商的方案进行操作。简而言之，在细胞裂解前，细胞用Cpd1或Neg4作为 的对照进行预处理。泛素化蛋白质免疫沉淀后，裂解物用抗泛素(试剂盒提供)、抗GAPDH或抗KDM5B抗体进行蛋白质印迹分析(见上文)。
体内研究。所有动物实验均按照机构和国家指南及法规进行。最大肿瘤生长为 的实验方案已获得德国北莱茵 - 威斯特法伦州自然、环境和消费者保护局(Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen - LANUV NRW)的批准，符合德国动物保护法(参考编号AZ 84 - 02.04.2014.A08 AZ 81 - 02.04.2018.A202)。未超过最大肿瘤生长。在先前实验中确定了Cpd1的最大耐受剂量。在此，直到 天， 的小鼠未表现出异常行为或体重减轻。通过在免疫缺陷的NMRI-(nu/nu)-裸鼠(6 - 8周龄，雌雄皆有)背部皮下注射 细胞于 培养基(含2% Tu2与Matrigel 的1:1混合物，BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖)中，生成人黑色素瘤细胞系WM3734或WM3734Tet3G - KDM5B的异种移植肿瘤。WM3734Tet3G - KDM5B异种移植模型:一旦通过卡尺测量肿瘤达到 (计算为 )，动物被随机分为两组，“对照”和“500 Dox”，并相应地在饮用水中补充2.5%蔗糖加 强力霉素(随意提供)。对照小鼠接受不含强力霉素的2.5%蔗糖替代水。每周换水两次。WM3734异种移植模型:当肿瘤可触及后，动物被随机分为四组，“对照Cpd1” /周(腹腔注射)，“对照TMECG” kg每周5次(腹腔注射)，“TMECG加Cpd1对照”(分别为10 mg/kg每周5次和 周)，以及“TMECG加Cpd1预处理”(分别为10 mg/kg每周5次，7天后开始和 周)。每周使用卡尺测量肿瘤生长三次。将肿瘤样本固定在福尔马林中用于组织学评估和免疫染色。通过在雌性C57BL/6N小鼠(6 - 8周龄)背部皮下注射 细胞于 培养基(含RPMI培养基与Matrigel®的1:1混合物，BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖)中，生成小鼠黑色素瘤细胞系 的异种移植肿瘤。一旦通过卡尺测量肿瘤达到 (计算为 )， 动物被随机分为两组，每组五只小鼠，“Cpd1”(100 mg/kg)每隔一天腹腔注射，以及“对照组”(PEG300 + IgG，每隔一天腹腔注射 )。给药持续至肿瘤达到最大体积。将肿瘤样本固定在福尔马林中用于组织学评估和免疫染色。
RNA测序转录谱分析。为了获取总RNA，将WM3734和CSM152(100,000个细胞)接种于一个 培养皿中，并用化合物1(10μM)或二甲基亚砜处理12、24、48或 小时。将WM (40,000个细胞)接种于一个 培养皿中，并用 强力霉素诱导24、48或 小时。将WM3734 或作为对照的WM3734 (175,000个细胞)接种于一个 培养皿中，并用 强力霉素诱导 小时。根据制造商的方案(Qiagen Venlo，荷兰)，使用RNeasy Mini试剂盒分离总RNA。使用在液体处理机器人Beckman FXP2上实施的Illumina TruSeq RNA Sample Preparation v2试剂盒(Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥)制备带条形码的链特异性mRNA-seq文库。将获得的文库等摩尔混合；将该混合文库的1.8 pM溶液加载到Illumina测序仪NextSeq 500上进行单向测序，生成5亿条长度为85个碱基的读数。使用Illumina bcl2fastq2 2.20.0.422版本对运行结果进行碱基识别和解复用。使用BWA mem 0.7.17版本，采用默认参数进行比对。比对的参考基因组为hg19，对于WM3734Tet3G-shJARID1B细胞则为hg38。最后，进行统计基因集分析以确定基因和转录本水平的差异表达。所有分析均使用Partek Flow v6默认设置。使用预排名工具版本4 - 6.012(美国马萨诸塞州剑桥市布罗德研究所)进行基因集富集分析(GSEA - http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)。使用所有在所有样本中平均读数超过1的基因，并根据 统计量进行排名。基因集由来自包括GO、Reactome、KEGG(2016年3月24日版本；http://download.baderlab.org/EM_Genesets/current_release/Human/symbol/)等多个数据库的精选通路组成，并使用Cytoscape v3.7.2(www.cytoscape.org； ，相似性截止值0.5)进行可视化。分别分析细胞系WM3734和CSM152的RNAseq，并合并分析结果，仅保留重叠网络。使用之前发表的基因集 在Partek Genomic Suite或R中生成热图。通过将平均表达量标准化为0，标准差为1，并使用Pearson差异算法和平均连锁进行层次聚类。来自TCGA 皮肤癌的RNAseq数据从单细胞门户(https://singlecell.broadinstitute.org)下载。小提琴图在BioVinci 3.0.0版本中生成。
微阵列转录谱分析。用 Trizol 试剂从黑色素瘤细胞(稳定感染 shKDM5B 的 WM3734 或作为对照的乱序(SCR) )中提取 RNA，然后按照试剂盒提供的规定方案，用 Qiagen RNeasy 迷你试剂盒进行清理和 DNase I 处理。在 Wistar 基因组学设施中使用 HumanWG - 6 v3.0 表达 BeadChip 系统(Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行微阵列转录分析。使用 Illumina GenomeStudio 基因表达模块版本 2009.2 并采用默认设置处理数据。
用于液相色谱-质谱联用(LC-MS)的样品制备和净化。对于LC/MS蛋白质组分析，每 个培养皿接种400,000个WM3734细胞，并在第4天用化合物1 或二甲基亚砜(DMSO)处理 。在通过在PBS中机械分离进行收获之前，细胞先用PBS洗涤一次。细胞在 下离心 ，随后的沉淀重悬于 微升裂解缓冲液(RIPA缓冲液( Tris-HCl，pH 6.8， 脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)和1% Triton X-100))中，并补充磷酸酶抑制剂(完全片剂，罗氏诊断公司)。在冰上孵育 后，裂解物在 下离心 ；上清液储存在 。接下来，样品用二硫苏糖醇(DTT)还原，用碘乙酰胺烷基化，随后在测序级赖氨酸C(和光纯药)和胰蛋白酶(普洛麦格公司，美国威斯康星州菲奇堡)存在下进行消化。最后，如 所述，酸化的胰蛋白酶消化物在自制的2盘C18 StageTips上进行脱盐。从StageTips洗脱后，样品用真空浓缩器(德国汉堡艾本德公司)干燥，肽溶解于 甲酸溶液中。
LC-MS/MS设置。实验在与EASY-nLC 1000液相色谱(LC)系统(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司)联用的Orbitrap Elite仪器(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司) 上进行。LC以单柱模式运行。分析柱是一根熔融石英毛细管 ，带有集成的PicoFrit发射器(新目标公司)，内部填充Reprosil-Pur 120 C18-AQ 树脂(迈施博士公司)。分析柱由柱温箱(索纳申公司)包裹，并连接到纳喷flex离子源(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司)。在数据采集期间，柱温箱温度调整为 。LC配备两种流动相:溶剂A(0.1%甲酸(FA)水溶液)和溶剂B(0.1% FA乙腈(ACN)溶液)。所有溶剂均为超高效液相色谱(UPLC)级(美国密苏里州圣路易斯市西格玛-奥德里奇公司)。肽以最大流速直接加载到分析柱上，该流速将 不超过设定的980巴压力限制(通常约为0.6 - 1.0微升/分钟)。随后，肽段在分析柱上通过运行溶剂A和溶剂B的 梯度进行分离(起始为7% B； 阶段为7 - 35% B梯度； 阶段为35 - 100% B梯度； 阶段的 )，流速为 分钟。质谱仪使用Xcalibur软件(版本2.2 SP1.48)运行。质谱仪设置为正离子模式。在前体离子扫描中，在Orbitrap分析仪(FTMS；傅里叶变换质谱)中，扫描范围为 ，分辨率为60,000，同时开启内部锁定质量选项(锁定质量为 ，聚硅氧烷；见参考文献 )。产物离子谱以数据依赖方式在离子阱(ITMS)中记录，扫描范围可变，扫描速率快速。电离电位(喷雾电压)设置为 。肽段使用由全前体离子扫描 离子或 )组成的重复循环进行分析，随后进行15次产物离子扫描 离子或 )，其中肽段根据其在全扫描中的强度(阈值为500计数)进行分离，以生成串联质谱(MS2)，从而实现肽段测序和鉴定。碰撞诱导解离(CID)能量设置为35%以生成MS2谱。在MS2数据采集期间，动态离子排除设置为 ，排除离子的最大列表包含500个成员，重复计数为1。启用了离子注入时间预测、FTMS的预览模式、单同位素前体选择和电荷状态筛选。仅考虑电荷状态高于1的离子进行碎裂。
使用MaxQuant进行肽段和蛋白质鉴定。将RAW光谱数据提交至MaxQuant(1.5.3.30)中的Andromeda 搜索，使用默认的 。激活无标记定量和运行间匹配功能 。将MS/MS光谱数据与Uniprot人类参考数据库(UP000005640_9606.fasta，70244个条目)进行比对。所有搜索均包括对污染物数据库的搜索(如MaxQuant中所实现的，245个条目)。污染物数据库包含已知的MS污染物，用于估计污染水平。Andromeda搜索允许蛋氨酸残基氧化(16 Da)和蛋白质N端乙酰化(42 Da)作为动态修饰，以及半胱氨酸的静态修饰(57 Da，用碘乙酰胺烷基化)。酶切特异性设置为“Trypsin/P”，允许两次错切。Andromeda搜索中的仪器类型设置为Orbitrap，前体质量容差设置为 (首次搜索)和 (主搜索)。MS/MS匹配容差设置为 。肽段谱图匹配FDR和蛋白质FDR设置为0.01(基于目标-诱饵方法)。最小肽段长度为七个氨基酸。对于蛋白质定量，允许使用唯一肽段和剃刀肽段。允许对修饰肽段进行定量。修饰肽段的最小分数为40。开启无标记蛋白质定量，考虑使用唯一肽段和剃刀肽段进行定量，最小比值计数为2。保留时间基于内置的非线性时间重缩放算法进行重新校准。MS/MS鉴定结果通过“运行间匹配”选项在LC-MS/MS运行之间进行转移，其中最大匹配时间窗口设置为 ，比对时间窗口设置为 。定量基于提取离子流的“最大值处的值”。可定量蛋白质至少需要两个定量事件。在Perseus v1.5.5.1中对结果进行进一步分析和过滤 。对于定量，我们将相关的生物学重复合并为分类组，仅研究在六个生物学重复中的至少五个中至少在一个分类组中发现的蛋白质。不同MS运行之间蛋白质组数量的比较(相对定量)仅基于MaxQuant计算的LFQ(MaxLFQ算法；见参考文献 )。
总生存曲线。总生存曲线是使用UCSC Xena 从TCGA数据集(http://cancergenome.nih.gov/)或从一个公开可用的数据集 计算得出的。对于Kaplan-Meier图，根据X-Tile版本3.6.1的切点 将患者分为KDM5基因低表达和高表达两组。如果患者捐赠了多个组织样本，则每位患者仅使用一个数据集。使用GraphPad Prism创建Kaplan-Meier生存曲线，并计算风险比(HR)以及来自对数秩检验的95%置信区间和 值。
统计分析。采用不成对 检验(学生 检验)比较两个独立组之间的平均差异。使用单向方差分析或双向方差分析来评估研究结果与多个不同治疗组之间的关联。在GraphPad Prism(6 - 8版本)中进行不成对 检验、单向和双向方差分析，检验在双侧显著性水平下进行，其中 的 值被认为具有显著性。随时间测量的小鼠肿瘤体积用于反映不同治疗对肿瘤生长趋势的影响。使用R v.3.1版本的线性混合效应模型，在个体动物水平上具有随机效应，比较不同治疗之间的肿瘤生长速度。通过Mann - Whitney检验评估终点时小鼠肿瘤体积之间的差异。对于基因集富集分析(GSEA)，标准化富集分数表示假阳性发现的概率以家族错误率(FWER)值给出。
黑色素瘤,KDM5B,Cpd1,酪氨酸酶,TMECG
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