SIX1的O-连接N-乙酰葡糖胺化增强其稳定性并促进肝癌增殖
发布时间：
2026-09-18 21:11
SIX1的O-连接N-乙酰葡糖胺化增强其稳定性并促进肝癌增殖
易楚 ，姜明作 ，吴楠 ，徐冰 ，李文娇 ，刘海明 ，苏松 ，史艳婷1，刘浩1，高晓亮1，付鑫1，陈迪1，李小伟3，王玮杰1，梁洁1，聂勇战1和樊代明
1. 癌症生物学国家重点实验室和国家消化系统疾病临床医学研究中心，第四军医大学西京消化病医院，西安，710032，中国。
2. 西北大学生命科学学院组织工程实验室，西安，710032，中国。
3. 中国北京100048，解放军总医院第六医学中心消化内科。
*这些作者对本文贡献相同。
// 通讯作者:梁洁(电子邮箱:liangjie@fmmu.edu.cn)、聂勇战(电子邮箱:yongzhan nie@fmmu.edu.cn)和樊代明(电子邮箱:daimingfan@fmmu.edu.cn)。
(c)作者。本文为开放获取文章，根据知识共享署名许可协议(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)发布。完整的条款和条件请见http://ivyspring.com/terms。
收稿:2020.02.21；录用:2020.06.17；发表:2020.08.02
摘要
普遍认为，异常代谢促进肿瘤生长。然而，癌细胞如何协调葡萄糖代谢与肿瘤增殖在很大程度上尚不清楚。眼无同源盒1(SIX1)是一种属于SIX家族的转录因子，据信在肿瘤中瓦伯格效应的调节中起重要作用。然而，SIX1在肝细胞癌(HCC)中的作用以及调节其活性的分子机制是否相似仍需进一步研究。
方法:采用蛋白质免疫印迹法检测HCC组织中SIX1和O-GlcNAcylation水平。利用CCK8、集落形成及小鼠肿瘤模型评估二者在HCC进程中的作用。通过质谱、免疫沉淀和定点诱变确认SIX1的O-GlcNAcylation。
结果:我们证明SIX1作为癌症中调节瓦伯格效应的关键转录因子，在体外和体内均促进HCC生长。此外，SIX1提高O-GlcNAcylation水平。SIX1亦被高度O-GlcNAcylation修饰，该修饰抑制其泛素化降解。276位定点诱变(T276A)降低O-GlcNAcylation水平并逆转SIX1的促肿瘤作用。
结论:SIX1的O-GlcNAcylation增强其稳定性并促进HCC增殖。本研究阐明了SIX1与O-GlcNAcylation的新型反馈回路，表明该修饰是协调葡萄糖代谢与肿瘤进展的关键机制。
关键词:SIX1，O-GlcNAc化，肝细胞癌，瓦伯格效应，泛素化
引言
代谢重编程在肿瘤进展中发挥着重要作用。在肝癌的异常代谢通路中，瓦伯格效应被广泛认为是肿瘤代谢的重要特征[1]。在这种效应下，肿瘤细胞消耗大量葡萄糖 但无法产生足够的能量，从而促进葡萄糖摄取和乳酸生成，并形成适合肿瘤细胞生存的微环境。肿瘤细胞对葡萄糖和谷氨酰胺摄取的迅速增加[2]，可改变癌细胞中的多条代谢和信号通路，包括: 例如，己糖胺生物合成途径(HBP)[3]。作为细胞代谢的关键途径，HBP 处于癌细胞代谢的核心。
由己糖胺生物合成途径提供底物的后续糖基化过程，即O-GlcNAc糖基化，也会在肿瘤发生过程中增加[4]。O-GlcNAc糖基化是一种翻译后修饰，可修饰蛋白质上的丝氨酸/苏氨酸残基，并与O-GlcNAc糖基化蛋白的表达、定位和功能相关[5]。这种修饰仅通过O-GlcNAc转移酶(OGT)的活性，将尿苷二磷酸N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)添加到广泛的蛋白质上，并可被糖苷水解酶O-GlcNAcase(OGA)逆转[6]。O-GlcNAc糖基化发生于多类蛋白质上，并作为协调细胞信号转导、转录、翻译和蛋白质降解等过程的介质[7]。已有报告显示，多种肿瘤中的O-GlcNAc糖基化水平升高[8-10]；此外，OGT在乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等多种癌症中也被发现表达增加[11-13]。然而，葡萄糖代谢如何调节O-GlcNAc糖基化，以及异常O-GlcNAc糖基化对癌症中葡萄糖代谢产生何种反馈作用，仍有待进一步研究。
SIX1 是属于 SIX 家族的转录因子，被认为在调控肿瘤中的 Warburg 效应方面发挥重要作用。SIX1 可与组蛋白乙酰转移酶 HBO1 和 AIB1 相互作用，激活一系列糖酵解基因的表达 [14]，从而刺激细胞糖酵解过程，并最终促进癌症进展。研究发现，SIX1 在多种癌症中呈过度表达 [15-17]，并且已知其参与肿瘤进展，包括增殖和转移 [18-21]。由于 HBP 取决于葡萄糖的可利用性，作为 Warburg 效应调节因子的 SIX1 是否也能影响 HBP 及随后的 O-GlcNAc 化修饰，目前仍不清楚；研究 SIX1、HBP 与 O-GlcNAc 化修饰之间的潜在关系，将有助于我们进一步理解 SIX1 在 HCC 中的功能。此外，研究发现 SIX1 受磷酸化和泛素介导的蛋白水解等翻译后修饰调控 [22, 23]。然而，O-GlcNAc 化修饰作为一种在代谢因子调控中发挥新兴作用的翻译后修饰，O-GlcNAc 化修饰与 SIX1 之间的关系尚未得到探讨；这种关系可能将 O-GlcNAc 化修饰与 Warburg 效应以及癌症发生过程中出现的其他关键分子通路联系起来。
在本研究中，我们探讨了 SIX1和O-GlcNAc糖基化在HCC进展中的潜在作用，并发现异常葡萄糖代谢与O-GlcNAc糖基化之间存在相关性。我们发现，在临床样本和HCC细胞系中，SIX1和O-GlcNAc糖基化水平均有所上调。我们还发现，SIX1能够提高O-GlcNAc糖基化水平，而高水平O-GlcNAc糖基化可通过抑制SIX1蛋白泛素化进程来增强SIX1的稳定性。此外，将第276位的苏氨酸突变为丙氨酸(T276A)会降低SIX1的O-GlcNAc糖基化并增强其降解。我们的数据首次证明，SIX1的O-GlcNAc糖基化可促进HCC进展，提示抑制OGT和SIX1可能成为治疗HCC的潜在策略。
方法
患者和组织样本
本研究在第四军医大学西京医院人体受试者保护委员会(中国西安)的监督下进行。从在西京医院接受手术的患者中获取了50对肝癌原发灶和癌旁正常组织样本。所有捐赠组织样本的患者及其亲属均签署了书面知情同意书。
细胞系与细胞培养
THLE-3、MHCC97H、HepG2、SMMC7721、Huh7、BEL7402和BEL7404细胞系保存在我们实验室。所有人类细胞系在过去三年内通过STR分析进行了鉴定，并在补充有10%胎牛血清(FBS)且无支原体的杜氏改良 Eagle 培养基(DMEM；美国Gibco公司)中培养。
O-GlcNAcase抑制剂噻美司特-G(TMG)和PUGNAc的终浓度分别为10 和 ，作用 。
过表达和敲低慢病毒购自吉凯基因公司。对于慢病毒感染，按照制造商的说明使用HitransG(中国吉凯基因)。细胞在OPTI-MEM(美国Gibco公司)中培养，并用慢病毒转导 。然后将稳定细胞系在含有 嘌呤霉素(德国默克密理博)的DMEM中培养1周。
对于瞬时转染，按照制造商的说明使用attractene试剂(德国QIAGEN公司)。SIX1和OGT siRNA购自中国吉凯基因，序列如下:SIX1 siRNA1: 5’CCA ACAAGCAGAACCAACUTT3’，SIX1 siRNA2: 5’GU CAGCAACUGGUUUAAGATT3’，OGT siRNA1: 5’TGAGCAGTATTCCGAGAAA 3’，OGT siRNA2: 5’CAATCATTTCATTGATCTT3’。
蛋白质免疫印迹法
使用补充有蛋白酶抑制剂(产品编号539134，德国默克密理博公司)的RIPA缓冲液提取总蛋白。等量的蛋白质样品 通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜上。然后，将一抗在 孵育过夜，二抗在室温下孵育 。所用的一抗包括小鼠抗- -肌动蛋白(美国西格玛公司，产品编号A2228)、抗O-连接N-乙酰葡糖胺化抗体、抗E-钙黏蛋白(美国艾博抗公司，产品编号ab2739、产品编号ab217038)、兔抗SIX1(美国 Proteintech公司，产品编号10709-1-AP)、抗葡萄糖转运蛋白1、抗己糖激酶2、抗谷氨酰胺果糖-6-磷酸转氨酶1、抗原癌基因c-myc、抗细胞周期蛋白D1(美国细胞信号技术公司，产品编号分别为12939S、2867T、5322S、13987和2978)。所用的二抗购自细胞信号技术公司，超敏增强型化学发光试剂购自4A生物技术有限公司。条带通过伯乐ChemiDoc XRS+成像系统获取，并使用Image Lab(伯乐公司)进行定量分析。
CCK8和集落形成实验
对于细胞计数试剂盒8(CCK8；日本同仁化学研究所)实验，将细胞以每孔3000个细胞的浓度接种到96孔板中。将细胞与CCK8试剂孵育 ，并通过在酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)中每 测量一次 处的吸光度来评估细胞活力，持续5天。
将细胞接种到6孔板中(每孔2000 - 3000个细胞)进行集落形成实验。2周后，用无水乙醇固定细胞，并用5%结晶紫染色。阳性细胞变蓝并进行计数。
皮下异种移植小鼠模型
动物实验经第四军医大学(中国西安)动物伦理委员会批准。BALB/c裸鼠购自第四军医大学(中国西安)实验动物中心。将经慢病毒转导的BEL7402和BEL7404细胞及阴性对照以每组 的剂量注射到皮下组织。4周后处死动物时分离肿瘤并称重。每周通过公式: 计算一次肿瘤体积[24]。
葡萄糖摄取测定
使用葡萄糖摄取测定试剂盒来 根据制造商的方案(产品编号J1341，美国Promega公司)测定葡萄糖摄取。简要地说，将20000个细胞接种到96孔板中。用 磷酸盐缓冲液洗涤细胞，并每孔加入 制备好的 。短暂振荡后，将细胞在室温下孵育10分钟。然后，依次加入 终止缓冲液、 中和缓冲液、 2 - 脱氧葡萄糖 - 6 - 磷酸检测试剂，随后短暂振荡混合。使用光度计上的 积分记录发光情况。将结果相对于每个对照组进行归一化，以计算葡萄糖摄取的相对变化。
实时定量聚合酶链反应
使用mRNA分离试剂盒(产品编号74134，德国Qiagen公司)分离总RNA，最终的RNA样品保存在 。使用cDNA合成试剂盒(产品编号6215A，日本Takara公司)，取 的总RNA用于合成cDNA。使用基因特异性引物测定mRNA的相对含量。以 -肌动蛋白作为mRNA检测的内参。所有步骤均按照制造商的方案进行。qPCR的引物序列见补充表S1。
免疫沉淀
用含有蛋白酶抑制剂(产品编号:539134，德国默克密理博公司)的IP裂解缓冲液(产品编号:87787，美国赛默飞世尔科技公司)收集细胞样品。然后将样品超声处理3秒，共三次，并与抗SIX1抗体(产品编号:12891，美国Proteintech公司)、OGT抗体(产品编号:D1D8Q，美国Abcam公司)、O - GlcNAcylation抗体(产品编号:ab2739，RL2，美国Abcam公司)在 下于 孵育。然后在 向样品中加入 磁珠(产品编号:LSKMAGG02，德国默克密理博公司)，孵育过夜。磁珠用PBS洗涤三次，然后煮沸用于进一步的蛋白质印迹分析。
泛素化检测
根据检测方案，使用泛素化检测试剂盒(货号:BK161，美国Cytoskeleton公司)。细胞在 平板中培养，并用蛋白酶体抑制剂(30 nmol/L，货号:539134，美国MedChemexpress公司)和去泛素化抑制剂(1:100，部件号:NEM09BB，N - 乙基马来酰亚胺和TPEN，美国Cytoskeleton公司)处理后进行裂解。然后使用提供的过滤柱塞完全压缩过滤器并收集流过的裂解物。将等分试样 的泛素化亲和珠悬浮液加入每个样品中以检测样品中的泛素化。此外，保存少量裂解物 作为western印迹输入裂解物对照。珠子用洗涤缓冲液洗涤 三次，并用洗脱缓冲液洗脱以获得样品。然后通过标准western印迹程序分析富集的蛋白质群体。
质粒构建和定点诱变
野生型SIX1质粒购自Genechem公司，使用GV141载体。通过PCR使用诱变寡核苷酸进行定点突变(将Thr276、Ser225和Thr252突变为丙氨酸)，并通过测序检查诱变后的质粒。载体、引物和序列信息显示在补充表S2中。
统计分析
所有体外实验均重复进行三次。数据以平均值 标准误表示，并通过学生独立样本t检验在两组之间进行比较。对照组与几个实验组之间的比较采用单因素方差分析。使用Kaplan-Meier方法绘制患者的总生存期(OS)并进行比较。 被认为具有统计学意义。
结果
SIX1表达上调并预示肝癌患者预后不良
通过蛋白质免疫印迹法检测肝癌组织中SIX1的水平。结果显示，肝癌组织中SIX1的表达高于正常组织(基于1.2倍变化，76%，50例中的38例)(图1A和B)。此外，我们观察到SIX1高表达患者的预后明显更差，高表达组的中位生存期为46.2个月，低表达组为71个月 。接下来，我们使用一组肝癌细胞系和永生化肝细胞系THLE3分析SIX1的表达水平。细胞系实验结果也证实，与正常对照相比，肝癌细胞中SIX1的蛋白水平升高(图1D)。之后，进行CCK8和集落形成实验以确定细胞生长和存活能力，这可以反映稳定SIX1操作细胞系中的增殖能力。蛋白质免疫印迹法证实了BEL7402和BEL7404细胞中SIX1操作的效率(补充图S1A)。与SIX1水平较低的细胞相比，SIX1水平较高的细胞中细胞生长增加和集落形成效率提高，证实了SIX1对增殖的促进作用(图1E和F)。此外，体内实验也 证实上调SIX1后总体肿瘤重量和体积也增加(图1G和H，补充图S1B和S1C)。总的来说，这些结果表明SIX1水平升高促进了肝癌的增殖。
SIX1激活HBP途径并提高肝癌细胞中的O-GlcNAcylation水平
HBP从糖酵解中分流出来，并控制随后一个重要的翻译后修饰，即O-GlcNAcylation [25]。越来越多的证据表明，HBP和OGT强调癌细胞增殖[26]，并且O-GlcNAcylation在细胞周期中波动[27]。我们已经证明了SIX1在肝癌增殖中的作用，并且有确凿的证据表明SIX1可以促进Warburg效应并增加几种糖酵解基因的表达。接下来，我们测试了SIX1、Warburg效应和肝癌细胞中整体O-GlcNAcylation之间是否存在联系。我们首先在对照细胞系与SIX1 KD细胞系培养后的培养基中测试葡萄糖水平，发现SIX1沉默后培养基中的葡萄糖水平升高(图2A)。Li等人证明GLUT1是SIX1的一个靶点，这意味着这种现象可能导致葡萄糖摄取改变[14]。在过表达SIX1与敲低SIX1的细胞上进行的葡萄糖摄取试验证实，SIX1可以促进肝癌细胞中的葡萄糖摄取，这表明SIX1也可能在肝癌细胞的代谢中发挥作用(图2B)。为了探索SIX1对肝癌中HBP途径的影响，我们检测了参与HBP途径的酶(补充图S2A)。我们使用实时PCR在过表达SIX1的细胞中发现3种糖酵解相关基因(GLUT1、GFAT1和HK2)的表达升高(图2C)。GLUT1、GFAT1和HK2的蛋白质水平显示出与mRNA结果相似的趋势(图2D)。此外，我们研究了不同SIX1表达水平的肝癌细胞中的O-GlcNAcylation水平。结果表明，与对照细胞相比，过表达SIX1的细胞中O-GlcNAcylation水平升高(图2E)，这表明SIX1促进肝癌中的O-GlcNAcylation水平。相反，SIX1沉默降低了肝癌中的O-GlcNAcylation水平。为了研究O-GlcNAcylation增加是由于整个途径的激活还是仅由于OGT或OGA酶，接下来我们在已建立的细胞系中测试了OGA和OGT蛋白质水平以及谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性，GFAT是催化己糖胺生物合成途径中第一步和限速步骤的酶。结果 表明GFAT活性波动(补充图S2B)，而OGT和OGA蛋白质水平保持不变(补充图S2C)。这些结果表明，OGT和OGA蛋白质水平不受SIX1的显著影响，这表明HBP途径的激活可能是肝癌中O-GlcNAcylation水平升高的主要原因。
O-GlcNAc糖基化上调促进肝癌进展
O-连接的N-乙酰葡糖胺化(O-GlcNAcylation)作为代谢与翻译后修饰之间的一种联系，已被揭示在多种癌症中发挥重要作用。此外，我们发现SIX1可提高肝癌细胞中的O-GlcNAcylation水平。为了确定SIX1是否通过上调O-GlcNAcylation促进肝癌发展，我们进一步探究了O-GlcNAcylation在肝癌中的作用。我们的结果显示，与正常组织相比，肝癌组织中的O-GlcNAcylation水平显著升高(图3A和B)。此外，肿瘤中O-GlcNAcylation高表达的患者预后比低表达患者更差 。细胞系实验结果也证实，肝癌细胞系中的O-GlcNAcylation表达水平显著高于永生化肝细胞系(图3D)。此外，我们通过其酶OGT和OGA调控O-GlcNAcylation水平(图3E)。如图3F所示，OGA抑制剂(TMG和PUGNAc)和OGT慢病毒显示出显著调控O-GlcNAcylation的能力。通过CCK8和集落形成实验，我们发现O-GlcNAcylation水平升高促进肝癌细胞生长(图3G和H)。此外，高O-GlcNAcylation组的小鼠肿瘤比对照组更大(图3I和J)。总之，这些数据表明高O-GlcNAcylation表达对肝癌细胞增殖至关重要。
图1. SIXI在肝癌中的表达及功能。A通过蛋白质免疫印迹法分析配对的肝癌标本及其癌旁组织中SIXI的水平。B配对的肝癌肿瘤组织和正常组织中SIXI表达的定量分析。C使用Kaplan-Meier Plotter数据库(n = 364)分析与SIXI表达相关的肝癌患者总生存(OS)曲线。D使用一组肝癌细胞系和永生化肝细胞系THLE3进行蛋白质免疫印迹法及SIXI表达的定量分析。E和F在操控SIXI后，使用CCK8(E)和集落形成(F)实验分析细胞生长。分别用SIXI过表达或敲低慢病毒转导BEL7402和BEL7404细胞。G在实验终点四周后测量裸鼠的肿瘤重量。H每周测量裸鼠的肿瘤体积(B、F(左图)、G中的数据采用Student’s t检验分析，D和F(右图)中的数据采用单因素方差分析，E和H中的数据采用双因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001)。
在肝癌中，SIX1通过O-GlcNAc糖基化直接被修饰
先前的一项研究表明，SIX1可以通过翻译后修饰进行调控，随后我们研究了O-GlcNAc糖基化是否也能调节SIX1。在我们的测试中，我们观察到原发性肝癌样本中SIX1表达与O-GlcNAc糖基化水平之间存在统计学上显著的正相关(图4A)。令人惊讶的是，我们还发现随着OGT的过表达，SIX1增加，而响应OGT敲低则减少(图4B)。此外，我们在一系列时间点使用OGA抑制剂TMG刺激O-GlcNAc糖基化后研究了SIX1水平。随着时间的推移，随着O-GlcNAc糖基化的上调，SIX1水平增加(图4C)。此外，我们研究了一些受SIX1调节的经典致癌因子。我们发现这些因子随着O-GlcNAc糖基化水平的升高而上调(图4D)。为了确定SIX1是否真的可以被O-GlcNAc糖基化修饰，进行了免疫沉淀实验。结果表明，SIX1可以在肝癌细胞中与OGT相互作用(图4E)。此外，从细胞中纯化总O-GlcNAc糖基化修饰的蛋白质，并用抗SIX1抗体进行免疫印迹检测。结果证实SIX1可以被O-GlcNAc糖基化修饰(图4F)。O-GlcNAc糖基化蛋白质的质谱分析还表明，SIX1是207种总潜在蛋白质之一(补充表S3)。基于这些结果，我们得出结论，SIX1可以直接与OGT结合并可以被O-GlcNAc糖基化修饰。 为了确定SIX1是否确实可以被O-GlcNAc糖基化修饰，进行了免疫沉淀实验。结果表明，SIX1可以在肝癌细胞中与OGT相互作用(图4E)。此外，从细胞中纯化总O-GlcNAc糖基化修饰的蛋白质，并用抗SIX1抗体进行免疫印迹检测。结果证实SIX1可以被O-GlcNAc糖基化修饰(图4F)。O-GlcNAc糖基化蛋白质的质谱分析还表明，SIX1是207种总潜在蛋白质之一(补充表S3)。基于这些结果，我们得出结论，SIX1可以直接与OGT结合并可以被O-GlcNAc糖基化修饰。
O-GlcNAc糖基化通过抑制泛素化来提高SIX1水平
随后，我们研究了O-GlcNAcylation如何调节SIX1表达水平。我们发现O-GlcNAcylation对SIX1的mRNA水平没有影响(图5A)。据报道，SIX1通过泛素-蛋白酶体途径降解[23]，我们推测O-GlcNAcylation可能抑制SIX1的泛素化。为验证这一假设，我们使用放线菌酮分析SIX1表达的降解情况。结果显示，高O-GlcNAcylation减缓了SIX1的降解，这表明O-GlcNAcylation可能通过影响其泛素化来调节SIX1的表达(图5B)。我们进一步分析了改变O-GlcNAcylation水平后SIX1的泛素化水平。在泛素化实验中，我们使用蛋白酶体和去泛素化抑制剂来积累并增加检测快速和瞬时修饰的机会。我们发现，当使用去泛素化和蛋白酶体抑制剂阻断泛素化降解过程时，之前观察到的SIX1随O-GlcNAcylation增加而增加的现象被阻断(图5C左图)。然后我们纯化了总泛素化蛋白，发现在相似的整体泛素化条件下，TMG处理组的SIX1泛素化水平低于对照组(图5C右图)。据报道，细胞分裂周期蛋白20同源物1(CDH1)是介导SIX1降解的泛素E3连接酶[23]。为了测试高O-GlcNAcylation是否能通过CDH1影响SIX1降解，我们在不同O-GlcNAcylation水平的细胞中纯化SIX1蛋白，并用抗CDH1抗体进行免疫印迹。结果显示，尽管输入样本中水平相似，但高O-GlcNAcylation组中CDH1与SIX1的共免疫沉淀比对照组减少(图5D)。此外，在过表达CDH1的BEL7402细胞中，随着TMG处理量增加检测SIX1表达。结果显示，高O-GlcNAcylation逆转了CDH1诱导的SIX1降解(图5E)。总体而言，我们的结果表明SIX1的O-GlcNAcylation可通过CDH1抑制SIX1依赖泛素化的降解。
图2. SIX1激活HBP途径并增加肝癌中的O-GlcNAc糖基化。分别用SIX1过表达或敲低慢病毒转导BEL7402和BEL7404细胞。A测量过表达或敲低SKI的细胞的细胞培养基中的葡萄糖水平。B在具有不同SIX1表达的细胞系中测定(某种酶)摄取水平。C用qPCR分析过表达或敲低SIX1的细胞中GLUT1、HK2和GFAT1的mRNA水平。D用蛋白质印迹法分析过表达或敲低SIX1的细胞中的GLUT1、HK2和GFAT1。E用蛋白质印迹法分析敲低或过表达SIX1的肝癌细胞中的O-GlcNAc糖基化。(数据通过学生t检验(BEL7402)和单因素方差分析(BEL7404)进行分析: 0.001)。
SIX1的苏氨酸276(Thr276)的O-GlcNAcylation位点突变降低了其稳定性
为了确定SIX1上O-GlcNAcylation位点的位置，我们使用了两个不同的在线数据库(YinOYang 1.2 Server和OGTSite)来预测SIX1中潜在的O-GlcNAcylation位点。结果表明，SIX1被预测有多个潜在的O-GlcNAcylation位点(图6A)。结果表明，苏氨酸276(Thr276)、丝氨酸225(Ser225)和苏氨酸252(Thr252)被O-GlcNAcylation修饰的可能性最高。为了进一步研究SIX1的O-GlcNAcylation潜在位点，在BEL7402细胞中表达了SIX1的单个位点突变体(T225A、T252A、T276A)。通过用O-GlcNAcylation抗体进行免疫沉淀，我们观察到T276A突变导致O-GlcNAcylation的最显著降低(图6B)，证实SIX1中的苏氨酸276(Thr276)是一个潜在的O-GlcNAcylation位点。为了研究T276的O-GlcNAcylation的潜在重要性，我们使用CRISPR-Cas9系统通过耗尽内源性SIX1建立了BEL7402-SIX1KO 细胞系。然后，我们用SIX1野生型(WT)或SIX1 T276A的异位表达拯救了BEL7402-SIX1KO，并在以下实验中使用这些细胞。我们发现，突变型SIX1在肝癌细胞中也能像野生型SIX1一样逆转O-GlcNAcylation水平(图6C)。在TMG处理后，野生型SIX1的水平显著高于突变体水平(图6D)。此外，发现在高O-GlcNAcylation下，野生型SIX1的半衰期比突变体长(图6E)。此外，我们发现高O-GlcNAcylation不能抑制T276A SIX1的泛素化(图6F，补充图S3)，这表明苏氨酸276(Thr276)对SIX1的泛素化很重要。为了测试苏氨酸276(Thr276)处的O-GlcNAcylation是否影响CDH1与SIX1的结合，我们在野生型和突变体组中进行了共免疫沉淀(co-IP)实验。我们发现，当野生型SIX1组受到TMG刺激时，CDH1从抗SIX1抗体拉下的复合物中解离。然而，当苏氨酸276(Thr276)发生突变时，高O-GlcNAcylation的抑制作用不显著(图6G)。此外，为了排除细胞特异性，我们使用了另一种细胞系HepG2来证实这些结论(补充图S4)。总之，这些数据强烈表明，苏氨酸276(Thr276)是SIX1的潜在O-GlcNAcylation位点，并且苏氨酸276(Thr276)处的O-GlcNAcylation保护SIX1不被降解。
O-GlcNAc糖基化修饰对于SIX1的促肿瘤作用是必需的
为了检测SIX1的O-GlcNAc糖基化修饰在肝癌中的作用，我们进行了功能缺失实验。我们使用慢病毒shRNA系统来评估O-GlcNAc糖基化修饰在肝癌发生发展中的作用。结果显示，在OGT敲低的细胞中，SIX1靶蛋白的表达水平也降低了(图7A)。CCK8和集落形成实验表明，OGT表达的敲低可以逆转SIX1过表达对细胞生长的影响(图7B和C)。重要的是，体内异种移植实验也证明，OGT敲低组的肿瘤体积比对照组小(图7D和E)。此外，我们检测了皮下肿瘤中SIX1、OGT、细胞周期蛋白D1、c-myc的表达以及O-GlcNAc糖基化水平，观察到与体外研究相似的结果(补充图S5)。功能缺失实验的结果表明，SIX1对肝癌细胞进展的促肿瘤作用依赖于O-GlcNAc糖基化修饰。
图3. SIX1通过调节O-GlcNAc糖基化修饰促进肝癌增殖。A通过蛋白质免疫印迹法分析配对的肝癌标本及其癌旁组织中总O-GlcNAc糖基化修饰水平。B配对的肝癌肿瘤组织和正常组织中O-GlcNAc糖基化修饰水平的定量分析。C使用组织芯片分析的免疫组化评分分析与O-GlcNAc糖基化修饰表达相关的肝癌患者总生存期(OS)曲线(n = 90)。D使用一组肝癌细胞系和永生化肝细胞系THLE3进行蛋白质免疫印迹法和O-GlcNAc糖基化修饰表达的定量分析。∎ O-GlcNAc糖基化修饰示意图。F使用OGA抑制剂(TMG和PUGNAc)或OGT慢病毒修饰O-GlcNAc糖基化修饰后，检测BEL7402或BEL7404细胞中O-GlcNAc糖基化修饰表达。G和H使用OGA抑制剂(TMG和PUGNAc)或OGT慢病毒修饰O-GlcNAc糖基化修饰后，通过CCK-8(G)和集落形成(H)实验分析细胞生长情况。I在实验终点四周后测量裸鼠肿瘤重量。J每周测量裸鼠肿瘤体积的曲线图。(B、H(下图)和I中的数据采用Student’s t检验分析，H(上图)和D中的数据采用单因素方差分析，G和J中的数据采用双因素方差分析。*p 。
讨论
瓦伯格效应是癌细胞的标志，其特征是即使在氧气供应充足的情况下，糖酵解速率也很高。据报道，SIX1是调节瓦伯格效应的关键转录因子[14]，并促进各种癌症的进展。我们的研究证明了SIX1的作用，并进一步证实了肝癌中SIX1/O-GlcNAcylation反馈环(图7F)。我们表明，SIX1可以促进肿瘤生长，并进一步增加HBP基因表达、葡萄糖摄取和O-GlcNAcylation水平。此外， SIX1第276位苏氨酸的O-GlcNAcylation保护其免受蛋白酶体降解并增加蛋白质稳定性。我们的数据确定了肝癌中葡萄糖代谢和翻译后修饰协调的一种先前未知的机制。
SIX1已被证明与包括肝癌在内的各种癌症有关[28,29]。据报道，SIX1在肝癌组织中过表达，与静脉浸润、TNM分期和总体生存率低呈正相关[17]。另一项研究进一步表明，抑制SIX1可降低肝癌细胞的增殖和转移能力[30]。在最近的一项研究中，Chen等人证明SIX1 可以降低肝癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[31]，表明其在联合治疗和药物开发中的重要作用。我们的研究还表明，SIX1在体外和体内均上调并促进肝癌的增殖。我们 发现，近76%(50个样本中的38个)的肝癌样本中SIX1蛋白表达高于配对的正常组织，这与之前的报道一致[17]。
图4. O-GiCNAcylation对肝癌中SIXI表达有反向作用。A 50个肝癌样本中O-GIcNAcylation与SIXI表达水平之间的关系。BEL7402和BEL7404如所示用OGA抑制剂处理或用OGT慢病毒转导(过表达或敲低)。B 通过蛋白质印迹分析在对O-GiCINAcylation进行不同操作的已建立肝癌细胞系中SIXI表达水平。C 在所示时间用OGA抑制剂(TMG)处理的BEL7402细胞中SIXI表达。D 在已建立的肝癌细胞系中分析SXI的直接靶基因。E 用抗OGT抗体进行免疫沉淀，然后用抗SIXI抗体进行蛋白质印迹。当SIXI用抗OGT抗体进行免疫沉淀和免疫印迹时进行相同实验。F 从细胞提取物中免疫沉淀的O-GlcINAcytation修饰蛋白通过抗SNI1免疫印迹进行分析。
图5. O-GlcNAcylation通过CDHI使SIXI稳定。A 如所示在肝癌细胞系中分析SIXI的mRNA水平。B 在BEL7402细胞中用CHX(10 µg/ml)处理所示时间后通过蛋白质印迹测定SIXI水平。C 在OGA抑制剂处理后的BEL7402细胞中检查SIX1的泛素化。MG132和NEM分别用于抑制蛋白酶体和去泛素化。D 在来自用DMSO或TMG处理的BEL7402的纯化SIXI免疫沉淀样品中检测CDH1。E 在BEL7402 CDHI过表达细胞中用增加量的TMG检查SVI表达。(A和E右面板的数据通过单因素方差分析进行分析，B的数据通过双因素方差分析进行分析，其余统计通过学生t检验进行分析。ns:无显著性差异，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001)。
图6. 苏氨酸276位点的突变降低了SIX1的O-GICNA糖基化修饰。A 顶部用黑色箭头法展示了通过YinoYang 1.2服务器(www.cbs.dut.desvrices/YinOYang)预测的SIX1的O-GICNA糖基化位点。绿色垂直线表示潜在的O-GICNAC修饰的丝氨酸/苏氨酸残基，水平波浪线表示修饰潜力的阈值。B 用表达胞嘧啶或O-GlcNAcylation位点突变体的质粒转染BEL7402细胞，通过蛋白质免疫印迹法分析IP-O-GlcNAcylation样品中SIX1蛋白的水平。C 使用CRISPR-Cas9系统建立SIX1 YMT和T276A细胞，并进行后续的异位表达。D 在BEL7402-SIX1KO细胞中，用VTP或276A SIX1表达质粒转染后检测野生型和T276A SIX1的表达(确实提到了DMSE TMG(ELAV)处理野生型和T276A SDX(SDLAV)，以及未处理的SDSS(SDS)(SDS)(SDS)(SDS)。SIX1表达质粒的SUIL表达质粒。MG132和NEM分别用于抑制蛋白酶体和去泛素化。G 在转染野生型或T276A SIX1表达质粒的细胞中检测CDH1。MG132和NEM分别用于抑制蛋白酶体和去泛素化。G 在转染野生型或T276A SIX1表达质粒的BEL7402-SIX1KO细胞中，在纯化的野生型和T276A SIX1 IP样品中检测CDH1。(E中的数据通过双向方差分析进行分析，* )。
之前的几项研究报道，SIX1在肝癌中发挥作用的分子机制是通过减弱肝癌细胞的干性以及调节p53、MMP9来介导的[32, 33]。然而，作为一种糖酵解调节因子，代谢是否是SIX1在肝癌进展中的介导因素尚未得到探索。由于SIX1与糖酵解之间的密切关系，我们推测SIX1在肝癌中可能也与糖酵解相关。在我们的研究中，我们证实了SIX1在葡萄糖代谢中的作用，并进一步发现了它与己糖胺生物合成途径(HBP)的正相关关系。我们证明SIX1可以增强HBP基因的表达水平以及随后的O-GlcNAc糖基化修饰。 这将细胞代谢与翻译后修饰动态联系起来。然而，SIX1与O-GlcNAc糖基化的确切调控机制仍需进一步研究。
作为代谢与细胞过程之间的一种联系，O-GlcNAc糖基化可以修饰大量蛋白质，并且被认为通过翻译后修饰在癌症发展中发挥重要作用[34 - 36]。我们研究小组之前的一项研究表明，胃癌组织中的O-GlcNAc糖基化高于相邻的正常组织[37]。在肝细胞癌中，Xu和Zhang等人分别发现HCC细胞系和肝癌组织中的OGT和O-GlcNAc糖基化高于各自的正常对应组织[38, 39]。Zhu等人证明O-GlcNAc糖基化在肝移植后肝细胞癌的肿瘤复发中起作用[40]。在我们的研究中，结果也表明HCC样本中的O-GlcNAc糖基化显著增加。通过进一步的体外和体内分析，我们发现O-GlcNAc糖基化显著促进了HCC细胞的增殖。 O-GlcNAc糖基化已被证明是对异常代谢信号作出反应的重要机制，并促进癌症进展。已经证明磷酸果糖激酶1、丙酮酸激酶和磷酸甘油酸激酶1受O-GlcNAc糖基化调节[41 - 43]。我们之前的研究表明，脂肪酸转运调节因子CD36的O-GlcNAc糖基化可以促进胃癌转移[44]。这些报道表明O-GlcNAc糖基化可以参与调节许多生物学因素。然而，癌症中糖酵解的主要调节因子SIX1是否能被O-GlcNAc糖基化调节尚不清楚。在
O-GlcNAc糖基化已被证明是对异常代谢信号作出反应的重要机制，并促进癌症进展。已证实磷酸果糖激酶1、丙酮酸激酶和磷酸甘油酸激酶1受O-GlcNAc糖基化调节[41-43]。我们之前的研究表明，脂肪酸转运调节因子CD36的O-GlcNAc糖基化可促进胃癌转移[44]。这些报告表明，O-GlcNAc糖基化可能参与调节许多生物学因子。然而，尚不清楚癌症中糖酵解的主要调节因子SIX1是否可被O-GlcNAc糖基化调节。在 在本研究中，我们发现SIX1在肝癌组织中与O-GlcNAcylation呈正相关。进一步的免疫沉淀和质谱研究表明，SIX1可以被O-GlcNAcylation直接修饰。我们还发现Thr276是SIX1潜在的O-GlcNAcylation位点。通过O-GlcNAcylation，可以防止SIX1的泛素化，从而促进肝癌细胞的增殖。此外，当这些细胞中OGT下调时，这种表型得以挽救，这表明正是这种修饰导致了恶性进展。尽管有证据表明Thr276是潜在的O-GlcNAcylation位点，且突变体T276A-SIX1的O-GlcNAcylation显著降低，但SIX1的O-GlcNAcylation并未完全消除，我们仍需要使用质谱法确定SIX1上O-GlcNAcylation的位点，以获得直接证据或鉴定其他O-GlcNAcylation位点。预计进一步的研究将揭示O-GlcNAcylation在调节细胞代谢中更广泛的作用。
图7. OGT的缺失逆转了SIX1过表达的促肿瘤作用。A. 对如所示处理的BEL7402细胞中SIX1下游因子蛋白水平和定量分析数据进行蛋白质免疫印迹检测。B和C. 对感染所示慢病毒的BEL7402细胞进行CCK8(B)和集落形成(C)测定。D. 在实验终点四周后测量裸鼠的肿瘤重量。E. 每周测量裸鼠的肿瘤体积。F. 肝癌进展中O-GlcNAcyation和SJXI的示意图模型。符号“G”表示O-GlcNAca，“Ubi”表示泛素。(A、C和D中的数据采用单因素方差分析，B、E中的数据采用双因素方差分析。*p < 0.05，**-p < 0.01)。
此外，有充分证据表明SIX1在癌症转移和上皮-间质转化(EMT)中发挥作用。Zhu等人证明，SIX1通过直接结合波形蛋白(Vimentin)的启动子区域，在转录水平上增强波形蛋白的表达，从而促进胃癌细胞的迁移和侵袭[45]。因此，未来阐明O-GlcNAcylation在SIX1转移作用中的功能将继续扩展SIX1和O-GlcNAcylation的网络。
综上所述，我们提出了肝癌中SIX1/O-GlcNAcylation反馈环的新调控途径。上调的SIX1增加葡萄糖摄取，并进一步提高肝癌细胞中O-GlcNAcylation的水平。此外，高O-GlcNAcylation抑制SIX1的泛素化，并维持SIX1及其下游因子的高表达，这进一步促进了肝癌的恶性表型。本研究表明，SIX1/O-GlcNAcylation可能是肿瘤增殖的重要途径，也是治疗肝癌的有前景的治疗靶点。
缩写
SIX1:眼无同源盒蛋白1；HCC:肝细胞癌；O-GlcNAc糖基化:O-连接的 -N-乙酰葡糖胺化；CCK8:细胞计数试剂盒8；OGT:O-GlcNAc转移酶；OGA:O-GlcNA糖苷酶；HBP:己糖胺生物合成途径；TMG:硫胺素-G。
补充材料
补充图和表。
http://www.thno.org/v10p9830s1.pdf
致谢
我们衷心感谢癌症生物学国家重点实验室的张瑞教授和胡四军教授给予的指导和技术支持。
伦理批准和参与同意
所有实验程序均获得西京医院机构审查委员会的批准。动物实验是在动物研究机构委员会的批准下，并按照国家实验动物护理和使用指南进行的。
资助
本研究受中国国家自然科学基金(项目编号:81730016、81772650、81972761)；空军军医大学博士研究生基金(项目编号:2019D02)资助。
竞争利益
作者声明不存在竞争利益。
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