泛素-蛋白酶体系统不调控猪精子获能过程中β-微精蛋白的降解
发布时间：
2026-09-20 21:07
泛素-蛋白酶体系统不调控猪精子获能过程中β-微精蛋白的降解
露西·图莫娃 ，米哈尔·齐戈 (通讯作者)，彼得·苏托夫斯基 (通讯作者)，马尔凯塔·塞德米科娃 和帕夫拉·波斯特莱罗娃
捷克生命科学大学农业生物学、食品与自然资源学院兽医科学系，捷克布拉格16500；tumovalucie@af.czu.cz(L.T.)；sedmikova@af.czu.cz(M.S.)
2美国密苏里大学动物科学系，密苏里州哥伦比亚65211；zigom@missouri.edu(M.Z.)；SutovskyP@missouri.edu(P.S.)
美国密苏里大学妇产科与妇女健康系，密苏里州哥伦比亚65211
4捷克科学院生物技术研究所生殖生物学实验室，BIOCEV，捷克韦斯特采25250
通讯作者:postlerova@af.czu.cz
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收稿日期:2020年5月7日；录用日期:2020年6月8日；发布日期:2020年6月10日 更新
摘要:精子获能是成功受精过程中的关键事件之一，与精子广泛的结构和功能重塑相关，始于精子质膜内蛋白质组成的改变。泛素-蛋白酶体系统(UPS)是一种负责蛋白质降解和周转的多蛋白复合物，参与获能过程。先前的研究表明，UPS调节获能诱导的精浆蛋白如SPINK2、AQN1和DQH从精子表面的脱落。精子表面蛋白质组成的改变也与猪β-微精蛋白(MSMB/PSP94)有关，MSMB/PSP94是一种精浆蛋白，被称为免疫球蛋白结合因子和运动抑制剂。在射出的公猪精子的顶体区域以及鞭毛中检测到了MSMB，而在体外获能(IVC)后，顶体区域的信号消失。通过基于图像的流式细胞术和蛋白质印迹检测，利用蛋白酶体干扰和泛素激活酶(E1)抑制条件研究了UPS在精子IVC过程中对MSMB降解的参与情况。我们的结果表明，在蛋白酶体抑制或E1抑制条件下，猪MSMB均未积累。此外，免疫沉淀研究未检测到精子MSMB的任何泛素化，在含有泛素化精子蛋白的亲和纯化组分中也未检测到MSMB。基于我们的结果，我们得出结论，在MSMB的情况下，UPS似乎不是调节机制，这为进一步研究提出了新问题。因此，获能诱导的精子表面精浆蛋白的加工可能比以前认为的更复杂，以非冗余的方式采用多种蛋白水解系统。
关键词:公猪；精子；获能； -微精蛋白；MSMB；PSP94；泛素-蛋白酶体系统
1. 引言
为获得受精能力，哺乳动物精子在睾丸后经历广泛的成熟过程以及亚细胞和分子变化。其中最重要的事件之一是精子获能 在雌性生殖道中[1]。获能是一个复杂的过程，它赋予精子结合透明带的潜力以及发生顶体胞吐作用的能力，进而穿透透明带并与卵母细胞融合[2]。
精浆蛋白参与获能过程，作为去能因子发挥作用，维持射精后精子在雌性生殖系统中的活力。这些蛋白质在射精时与精子表面结合，并参与输卵管精子储存库的形成和透明带结合[3,4]。在获能过程中，精子质膜会发生许多变化，去能因子的去除会导致精子表面蛋白的重新排列[2,5]。在获能过程中发生这种变化的一种蛋白质是 -微精蛋白(MSMB)，也称为前列腺分泌蛋白(PSP94)、免疫球蛋白结合因子[6]、精子运动抑制剂[7]或前列腺抑制素肽[8]。MSMB最初在人类精浆中被鉴定出来[9]，也在其他几个物种中被报道过[8,10,11]。人类MSMB在前列腺分泌物中含量很高[11]；然而，它也在其他体液中被发现。MSMB的确切作用仍有待阐明。有人认为在人类中它可能作为免疫球蛋白结合因子[6]以及胃癌疾病的标志物[12]。此外，已确定它能抑制前列腺肿瘤细胞生长[8]并保护前列腺细胞免受病原体侵害[13]。主要地，人类MSMB作为前列腺癌的标志物起着非常重要的作用[14 - 16]。精子MSMB可能在受精时参与精子与透明带之间的相互作用，以及在精子获能时调节精子超激活[11]。在最近的一项研究中，发现精子MSMB与CRISPs(富含半胱氨酸的分泌蛋白)相关联[17]，这些蛋白与配子结合和融合有关[18]。
猪 -微精蛋白与人类MSMB具有约50%的同源性[10]。在先前的研究中，猪MSMB主要在前列腺的分泌物和上皮中被发现[19 - 21]，以及在睾丸生精小管内的生殖细胞、附睾液和上皮、尿道球腺、尿道腺和精囊中。此外，在脑、肾和肌肉组织中也检测到了MSMB[22]。与人类相似，猪MSMB在精液中与免疫球蛋白结合因子同义，可能影响局部免疫[6]。猪MSMB还通过抑制钠钾泵作为精子运动抑制剂[7,10,23]。如上所述，猪MSMB已在许多生殖组织中被检测到，因此表明它在生殖过程中具有多种作用。先前也报道了MSMB在猪精子头部和鞭毛中的定位以及其获能后的命运[22]。
在获能过程中，MSMB从精子表面丢失的机制仍不清楚。泛素-蛋白酶体系统(UPS)被认为参与了精子表面其他精浆蛋白的调节，如SPINK2、AQN1[24]和DQH[25]。UPS是大多数细胞中的一种重要调节机制，它能对约75%的所有真核蛋白进行底物特异性蛋白水解[26]，包括对受精过程的调节[27-29]。UPS作为精子质量的控制机制发挥着重要作用[30]。在射出的精子中，UPS首先调节获能[29]，随后调节精子-透明带穿透[31]。UPS是一种复杂的多酶机制，由三种主要的泛素化酶——E1激活酶(UBA1)、E2缀合酶(UBC)和E3泛素连接酶(UBE)以及作为终点蛋白酶的26S蛋白酶体组成[28]。它通过对蛋白质进行翻译后修饰(即蛋白质泛素化)，在细胞蛋白质的循环利用和信号通路的调节中发挥着重要作用。泛素特异性标记被26S蛋白酶体降解的蛋白质，同时它也可能将蛋白质聚集体和细胞器导向自噬途径。典型的26S蛋白酶体由一个20S蛋白水解核心和一个19S调节颗粒组成，19S调节颗粒在20S桶的一端或两端进行封盖。19S颗粒负责识别多聚泛素链、蛋白质解折叠、去泛素化，并将解折叠的蛋白质呈递给 核心进行蛋白水解降解[26,28]。
先前的研究致力于阐明UPS在精子获能中的作用。发现几种公猪精子表面蛋白与精子蛋白酶体共纯化，这使得它们可能是精子中常驻UPS的作用靶点[32]。另一项研究表明，UPS在人类精子获能过程中对精子表面蛋白的去除和质膜重塑起着关键作用[33]。UPS对A激酶锚定蛋白的降解被证明对成功的超激活至关重要[34]。我们之前的结果表明，在获能过程中，UPS参与了诸如乳粘连蛋白MFGE8、ADAM5和ACRBP等蛋白质的区室化和加工，以及许多其他候选蛋白[35]。UPS还与精子粘附素的解聚和精子表面DQH蛋白的加工有关[25]，以及与最近发现的获能诱导的精子锌离子外流有关[36]。基于我们之前的结果，即一些蛋白质在体外培养过程中通过泛素化从精子表面被去除[24,25,35]，我们推测另一种精浆蛋白MSMB可能是精子获能过程中UPS的作用靶点。因此，本研究旨在检验这种可能性，以进一步探索UPS在精子获能中的复杂作用。
2. 结果
通过流式细胞术分析和蛋白质印迹检测，研究了体外精子获能过程中蛋白酶体抑制和E1抑制条件下猪 -微精蛋白(MSMB)的降解情况。此外，我们进行了间接免疫荧光染色，以监测公猪精子中MSMB的定位以及体外获能(IVC)后精子上抗MSMB抗体标记的变化。
2.1. 体外获能过程中猪精子中MSMB的定位与变化
MSMB定位于射出的精子以及体外获能的精子中。射出的精子在顶体区域显示出较高的MSMB标记强度(图1A)，而在体外获能的精子中信号强度降低(图1B)。各个体外获能精子处理组(即未抑制组、蛋白酶体抑制组、E1抑制组和溶剂对照组)之间的荧光强度没有显著差异(图S1)。
图1. 用特异性多克隆抗MSMB抗体(绿色)通过间接免疫荧光显微镜观察猪MSMB在射出的 和体外获能的 精子中的定位。细胞核用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)(蓝色)复染，顶体用PNA(花生凝集素)凝集素(红色)复染。
进行基于图像的流式细胞术(IBFC)以监测体外获能过程中MSMB的变化。对顶体完整的精子进行门控并进行进一步分析。MSMB标记的荧光强度直方图显示存在两个精子群体(图2A)。大多数射出的精子存在于高荧光强度群体中，并且在顶体区域有强烈标记(图2B)。在体外获能后的精子中，这种标记显著减少(图2B’)，导致出现第二个群体以及相应的具有较低中值荧光强度的IBFC直方图峰(图2A)。荧光强度的降低表明在体外获能过程中MSMB从顶体区域被去除。 在射出的精子中，将抗体诱导的荧光染色的平均值称为“强度平均值”设定为100%，其他体外获能精子处理组根据其强度平均值与之比较(图3A)。在未抑制的精子中，体外获能后MSMB荧光强度平均值显著降低 ，与射出的精子相比降至59.25±1.20%(图3)。而在蛋白酶体抑制(100μM MG132)下的体外获能精子显示MSMB的荧光强度平均值为 ，在泛素激活酶(E1)被 PYR41抑制的体外获能精子中，MSMB的荧光强度平均值等于 。在溶剂对照组 和其他体外获能处理组之间未发现统计学差异 (图3B)。
图2. 在无或有蛋白酶体(100μM MG132)/E1(50μM PYR41)抑制条件(包括溶剂对照)下精子体外获能过程中MSMB变化的代表性流式细胞术直方图。所有流式细胞术测量的平均值显示射出的精子具有较高的荧光强度(A)。射出的精子(B)、获能的精子(B’)以及用非免疫血清代替抗MSMB抗体孵育的阴性对照精子(B")的代表性图像库。细胞核用DAPI(蓝色)复染；用凝集素PNA(绿色)监测顶体完整性，并用MSMB-Cy5抗体(红色)结合情况。每次流式细胞术运行代表10,000个事件。该实验重复进行了4次。
| 抗体阳性标记精子组的统计特征 | |
| 精子群体 | 强度平均值(%) |
| 射出的 | 100 |
| 获能的，未抑制 | |
| 获能 + 100μM MG132 | |
| 获能 + 50μM PYR41 | 57.64 ± 1.40 |
| 获能的，溶剂对照 | 60.09 ± 3.12 |
图3. 体外获能(IVC)过程中MSMB去除的定量分析。射出精子的基线荧光强度平均值定义为100%，并将其与其他IVC精子组进行比较。(A) IVC精子处理组(即未抑制组、蛋白酶体抑制组、E1抑制组和溶剂对照组)荧光强度平均值的降低情况。(B) 所有处理组荧光强度平均值的图形表示。结果表示为四个独立生物学重复的平均值 。统计学显著性 用上标表示。
2.2. 公猪精子提取物中MSMB的检测
在还原条件下进行蛋白质免疫印迹检测，以检测和定量所有精子处理组中公猪精子蛋白提取物中的 MSMB免疫反应条带(图4)。在射出精子的蛋白质提取物中，MSMB的含量高于体外获能精子。为了验证每个样品的蛋白上样量并标准化MSMB含量，用抗 -微管蛋白抗体对膜进行再检测。
图4. 用特异性多克隆抗MSMB抗体对射出精子和体外获能精子的蛋白质提取物进行蛋白质免疫印迹检测，检测条件为非抑制、蛋白酶体抑制(100 μM MG132)和E1抑制(50 μM PYR41)，还包括溶剂对照(DMSO)。黑色箭头指示预期的约 的MSMB免疫反应条带。通过抗 -微管蛋白单克隆抗体DM1A确认蛋白上样量相等。SDS-PAGE在还原条件下进行，实验重复四次，密度定量见图5。
| 相对密度(%) | |
| 射出的 | 100 |
| 获能，无抑制 | 14.33 ± 5.35 |
| 获能 + 100 μM MG132 | 5.76 ± 4.17 |
| 获能 + 50 μM PYR41 | 3.91 ± 2.66 |
| 获能，溶剂对照 | 8.27 ± 2.16 |
图5. 图4中射出精子和所有获能精子处理组的蛋白质提取物中 免疫反应性MSMB条带的密度定量。印迹中MSMB的相对密度通过抗MSMB和抗 -微管蛋白抗体的光密度比值计算；射出精子样品中MSMB的量定义为100%，所有体外获能精子处理组与射出精子进行比较。结果以四个独立生物学重复的平均 表示。统计学显著性 用上角标表示。
射出精子样品中MSMB的含量定义为100%，所有体外获能精子处理组与射出精子进行相对比较(图5)。在未抑制的体外获能精子中，与射出精子相比，MSMB的量显著降低(14.33 ± 5.35%)。在 MG132蛋白酶体抑制的体外获能精子中，MSMB的量降至 ，而在用 PYR41抑制泛素激活酶(E1)时，MSMB的量降至 。在溶剂对照中，体外获能后MSMB的量降至 (图4和图5)。仅在射出精子和体外获能精子组之间的相对密度上发现了统计学显著差异，与处理 无关。在体外获能精子的不同处理组中未发现MSMB积累的统计学显著性( ，图5)。
2.3. 公猪精子提取物中MSMB多聚泛素化形式的检测
使用Signal-Seeker 泛素化检测试剂盒分离射精精子和体外获能精子提取物中的多聚泛素化蛋白，以监测潜在的MSMB(多聚)泛素化。用抗泛素抗体FK2进行蛋白质印迹法确认多聚泛素化蛋白的存在；然而，在含有泛素化蛋白的结合部分中，这些分离物没有MSMB(图6，泛素化蛋白-结合部分)。使用FK2抗体检测亲和纯化前的输入精子提取物中的泛素化蛋白。另外，从射精精子提取物中免疫沉淀MSMB，并用FK2抗体检测MSMB免疫沉淀物中的(多聚)泛素化蛋白(图6，IP MSMB)。通过检测 条带确认MSMB免疫沉淀物中存在MSMB，分别为17和 (黑色箭头)；然而，在MSMB免疫沉淀物中未用FK2抗体检测到(多聚)泛素化蛋白。免疫沉淀的阴性对照是通过仅将射精精子提取物与琼脂糖-蛋白A/G珠孵育，并使用兔免疫球蛋白代替抗MSMB抗体来进行的；孵育后洗脱液中未检测到多聚泛素化蛋白和MSMB(图S2)。
图6. 使用Signal-Seeker 泛素化检测试剂盒从整个射精精子和体外获能精子提取物中分离的(多聚)泛素化蛋白样品中猪MSMB的免疫检测(泛素化蛋白-结合部分)，同时对照检测多聚泛素化蛋白，并对射精精子提取物中MSMB免疫沉淀物(IP MSMB)中的泛素化蛋白进行反向检测，对照检测MSMB。黑色箭头显示MSMB(12、17和 )；星号表示抗体重链。
3. 讨论
获能是受精过程中的关键事件，对精子获得受精能力的最终成熟很重要。精子获能包括精子质膜的许多变化，以及去除去能因子，导致精子与透明带结合所需的精子表面蛋白重新排列[2,5]。泛素 - 蛋白酶体系统(UPS)作为一种底物特异性蛋白质降解工具，可能参与精子获能过程中精子表面蛋白的去除，因为已有报道称一些公猪精浆蛋白已与精子携带的蛋白酶体共纯化[32]。此外，在精子体外获能(IVC)过程中蛋白酶体抑制后，此类蛋白(SPINK2、AQN1和DQH)会积累[25,35]。在本研究中，我们旨在探讨MSMB在精子获能过程中被UPS泛素化和降解的可能性，因为此前有报道称IVC后MSMB从精子表面消失[22]。
猪MSMB是一种相对较小的蛋白质，在还原条件下于 处电泳迁移[22]。在我们之前的研究中，我们将猪MSMB定位在所有雄性生殖组织中，在上皮和前列腺分泌物中丰度最高。此外，在射出精子的表面，特别是在精子头部的顶体区域和鞭毛上发现了猪MSMB。在体外获能过程中，观察到这种蛋白质显著减少，特别是在顶体区域。此外，通过透射电子显微镜观察，MSMB不仅定位于精子表面，还定位于IVC精子的顶体内，提示其在精子成熟或受精中具有多种作用。这一发现可能是MSMB参与顶体胞吐后精子 - 卵母细胞结合的证据之一[22]，正如之前在人类中所提出的[11]。
猪MSMB被归类为精浆和精子的特异性蛋白质。如前所述，几种猪精子表面蛋白已与精子携带的蛋白酶体共纯化[32]，并在IVC过程中积累，这与IVC诱导的这些蛋白质的区室化变化有关[25,35]。在本研究中，我们观察到IVC过程中MSMB有相同的命运，但其蛋白质丢失的机制以及负责此过程的机制尚不清楚。因此，我们决定探索UPS参与去除MSMB的可能性，作为精子获能过程中UPS降解的另一个靶点。我们在蛋白酶体抑制条件下使精子获能，以防止潜在泛素化的MSMB降解，以及在泛素激活酶(E1)抑制条件下使公猪精子IVC，以防止IVC过程中MSMB可能的从头泛素化。我们的结果表明，与对照IVC相比，抑制蛋白酶体或E1均不会导致这些IVC精子中MSMB的积累。通过流式细胞术和蛋白质印迹这两种方法均一致获得了这些结果。由于通过泛素 - 蛋白酶体途径靶向降解的蛋白质需要用至少四个泛素分子的多泛素链进行标记[26]，我们使用重组UBA结构域进行多泛素化蛋白下拉，希望检测到MSMB的多泛素化形式。我们在多泛素化蛋白部分未检测到MSMB。即使采用替代方法，我们仍然无法在MSMB免疫沉淀中检测到泛素。我们表明这两种策略分别成功分离了多泛素化蛋白和MSMB。有趣的是，我们在射出精子提取物和MSMB免疫沉淀中均观察到多种形式的MSMB，即12、17和22 kDa，这与之前的研究[22]一致。由于泛素亲和纯化研究排除了这些可能是MSMB泛素化形式的可能性，因此除泛素化(例如糖基化)之外的MSMB的翻译后修饰(PTM)仍有待揭示。
得出这样的结论是非常合理的:泛素-蛋白酶体系统似乎不参与猪精子获能过程中 -微精蛋白的降解，至少如我们的结果所示，不是直接参与。基于图像的流式细胞术和蛋白质印迹检测并未证明体外培养期间蛋白酶体抑制后MSMB的积累。此外，我们在泛素化的精子蛋白中未发现MSMB，也未观察到体外培养期间MSMB降解减少 在蛋白酶体抑制下，在获能过程中从精子表面去除MSMB的机制问题仍有待探索，但毫无疑问，鉴定除泛素化之外的MSMB的翻译后修饰将对这一研究大有帮助。我们的研究提供了关于精子表面MSMB的重要信息，为进一步研究开辟了新途径。总之，这项研究以及之前对UPS调节的精子表面蛋白的研究表明，获能诱导的精子表面蛋白加工比以前认为的更为复杂，采用了多种非冗余的蛋白水解系统。
4. 材料与方法
4.1. 精液采集与处理
新鲜公猪精液购自授精站Skršín(NATURAL, spol. s.r.o.)以及国家猪研究与资源中心(美国密苏里大学哥伦比亚分校)。遵循了经批准的动物护理和使用方案。在光学显微镜下通过传统精子学方法评估射出精子的浓度和活力。仅将具有 活力精子且 形态异常的射精用于实验。
新鲜射精分为两半，第一半用于体外获能，见下文。第二半在温暖的磷酸盐缓冲盐水(PBS；美国密苏里州圣路易斯市Sigma - Aldrich公司)中洗涤三次 以从精子中分离精浆，然后将精子分为三组用于流式细胞术分析、免疫荧光染色和蛋白质提取，如下所述。
4.2. 蛋白酶体和E1抑制条件下的精子体外获能(IVC)
为了将它们与精浆分离，新鲜的未稀释精子在温暖的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲的乳酸盐-泰罗德培养基中洗涤三次 ，该培养基含有 聚乙烯醇(TL-HEPES-PVA)；含有 乳酸盐； -丙酮酸盐； )。最后一次洗涤后，精子重悬于含有2%( )牛血清白蛋白(BSA)的TL-HEPES-PVA培养基中。启动了四个处理组:(i)无蛋白酶体或E1抑制；(ii)加入溶解于二甲基亚砜(DMSO；Sigma-Aldrich)中的 MG132蛋白酶体抑制剂(ENZO Life Sciences，美国纽约州法明代尔)；(iii)加入溶解于DMSO中的 PYR41 E1泛素激活酶抑制剂(ENZO Life Sciences)；以及(iv)MG132和PYR41的0.1%(v/v)DMSO溶剂对照。
所有四个处理组在 时于 和 进行了获能处理。在体外受精后，精子样本在温热的磷酸盐缓冲盐水中洗涤三次，并进行流式细胞术定量、间接免疫荧光和蛋白质提取处理。遵循了所有适用的国际、国家和/或机构关于动物护理和使用的指南。所有涉及脊椎动物的研究均在密苏里大学动物护理和使用委员会(ACUC)(动物福利保证编号/ACUC协议#9500)批准的方案以及《实验动物饲养和使用指南》(NRC 2011)的严格指导下完成。公猪在密苏里大学国家猪研究资源中心(https://nsrrc.missouri.edu/)按照标准饲养方式饲养。本文不包含任何作者进行的涉及人类参与者的研究。
4.3. 流式细胞术分析的样本制备
每个处理组(射出精子和体外培养精子，添加或不添加蛋白酶体/E1抑制剂，包括溶剂对照)取约 个洗涤后的精子，用50%冰冷甲醇固定/通透15分钟，用PBS洗涤，然后在补充有0.1% Triton X-100的PBS(PBST)中用5%正常山羊血清(NGS；Sigma-Aldrich)封闭30分钟，室温下进行。 将用含1% NGS的PBST稀释的兔抗MSMB多克隆一抗(1:200稀释；定制，见[22])加入精子样本中，在 下孵育过夜。用正常兔血清作为阴性对照，方法同以前[25]。第二天，精子用含1% NGS的PBST洗涤，然后在室温下用与Cyanine5偶联的山羊抗兔二抗(GAR-Cy5；Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)在含1% NGS的PBST中1:150稀释孵育40分钟。为了评估顶体完整性，使用与Alexa Fluor 488偶联的花生凝集素(PNA-AF488；1:2500稀释；Molecular Probes，美国俄勒冈州尤金)，并用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二乳酸盐(DAPI；1:1500稀释；Molecular Probes)进行DNA染色。PNA-AF488和DAPI都与二抗混合并共同孵育。孵育后，精子在流式细胞术分析前用含1% NGS的PBST洗涤两次。
4.4. 基于图像的流式细胞术
如前所述[25,37]，在Amnis FlowSight成像流式细胞仪(美国德克萨斯州奥斯汀市AMNIS Luminex公司)上对荧光标记的样本进行测量。该仪器配备了一个20倍显微镜物镜(数值孔径为0.9)，成像速率高达每秒2000个事件。鞘液为PBS(不含 或 )。流动核心直径和速度分别为 和每秒 。使用INSPIRE 软件(美国德克萨斯州奥斯汀市AMNIS Luminex公司)获取原始数据。为了获得最高分辨率，相机设置为电荷耦合器件每像素 。样本与四台激光器同时进行分析，波长分别为: ，强度设置为 ； ，强度设置为 ； ，强度设置为 ；以及 (侧向散射)，强度设置为 。每个样本总共收集10,000个精子细胞。使用IDEAS®软件(版本6.2.64.0，美国德克萨斯州奥斯汀市AMNIS Luminex公司)对原始图像进行数据分析。使用单细胞群体门控对以下通道按频率显示平均像素强度的直方图:AF488(通道2)、DAPI(通道7)和Cy5(通道11)。然后使用各个通道的强度直方图绘制不同强度水平的亚群区域并进行视觉确认。DAPI(通道7)的强度用于不同实验组之间的直方图归一化。
4.5. 间接免疫荧光成像
使用标准程序[38]对射出的精子以及体外获能精子的所有处理组精子进行免疫荧光成像。将精子悬液调整至 个细胞 的浓度，制备精子涂片。样品在冷丙酮中固定 ，然后用PBS洗涤。将固定的精子与 抗MSMB兔多克隆一抗在湿盒中于 孵育过夜，该一抗用PBS按1:50稀释。作为阴性对照，精子样品仅用PBS孵育。用PBS洗涤后，样品与 与Alexa 488偶联的抗兔免疫球蛋白二抗(Alexa Fluor 山羊抗兔IgG(H + L)，Invitrogen)在PBS中按1:300稀释，在实验室温度下孵育 。之后，样品与用PBS按1:500稀释的罗丹明偶联的PNA凝集素(罗丹明花生凝集素，Vector Laboratories，美国加利福尼亚州伯林盖姆)孵育30分钟。样品用含有DAPI的封片剂(Vecta-Shield DAPI，Vector Laboratories)的 封片，并用蔡司共聚焦显微镜和ZEN 2.3软件(德国耶拿蔡司公司)成像。
4.6. 精子蛋白质提取
在蛋白质提取之前，所有实验组(射出的和体外培养的精子，添加或不添加蛋白酶体/E1抑制剂，包括溶剂对照)均在PBS中洗涤三次。约 个精子细胞在 两倍浓缩的还原上样缓冲液(0.5 M Tris-HCl pH 6.8(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市伯乐公司)；甘油；2% SDS(十二烷基硫酸钠)；0.05%溴酚蓝；5%巯基乙醇(西格玛奥德里奇公司))中裂解。样品在冰上放置 ，然后 然后，每隔 涡旋一次。之后，精子样品煮沸 ，并在 下离心2分钟。精子蛋白提取物进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。
4.7. 免疫沉淀
将抗MSMB的多克隆抗体(2 μL；[22])或作为对照的兔IgG(5 μg；Sigma-Aldrich)添加到含有蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete™，Mini；Roche，巴塞尔，瑞士)的IP裂解缓冲液(ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)中的 精子裂解物中，并在 下孵育 。然后使用与蛋白A/G偶联的琼脂糖珠(美国德克萨斯州达拉斯的Santa Cruz Biotechnology, Inc.)的 进行蛋白-抗体复合物沉淀。珠子用补充有 吐温20的PBS(PBS-吐温)洗涤两次，通过在还原SDS上样缓冲液中煮沸珠子5分钟来洗脱结合的蛋白。随后将悬浮液在 下离心 ，上清液进行SDS-PAGE，然后进行Western blot免疫检测。
4.8. 多聚泛素化蛋白的亲和分离
使用Signal-Seeker™泛素化检测试剂盒(产品编号BK161，美国科罗拉多州丹佛市细胞骨架公司)，按照制造商的方案从精子中分离泛素化蛋白。简要步骤如下:用提供的裂解缓冲液裂解5亿个精子，用提供的稀释缓冲液稀释5倍，然后在 下与泛素化亲和磁珠孵育过夜。第二天，用提供的洗涤缓冲液洗涤磁珠，通过将磁珠与SDS上样缓冲液孵育 来洗脱沉淀的多聚泛素化蛋白。上清液用于蛋白质免疫印迹检测。阴性对照是通过将精子蛋白裂解物与泛素化对照磁珠以相同方式孵育来进行的。
4.9. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹法
对于垂直电泳，使用Mini-PROTEAN Tetra系统(伯乐公司)和电极缓冲液(25 mM Tris，192 mM甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3)分离精子蛋白。精子样品在4%浓缩胶和15%或NuPAGE 4 - 12% Bis-Tris(英杰公司)的运行SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，使用Precision Plus Protein™双色标准品(伯乐公司)或Novex Sharp预染蛋白标准品(赛默飞世尔科技公司)作为分子量标准。电泳在电压 下运行 ，然后切换电压 并运行至前沿色带到达凝胶末端(约 )。之后，蛋白质在Tris - 甘氨酸转移缓冲液(25 mM Tris，192 mM甘氨酸，20%(v/v)甲醇，pH 8.3)中以恒定电流 电转移至硝酸纤维素膜Hybond™C(英国小查尔方特阿默舍姆公司)上，持续 。
4.10. 蛋白质免疫检测
将带有转移蛋白的硝酸纤维素膜用含5%脱脂奶粉(印迹级封闭剂脱脂奶粉，伯乐公司)的PBS -吐温(0.5%吐温20；西格玛 -奥德里奇公司)封闭1小时，然后与抗MSMB一抗(1:500稀释，兔多克隆抗体)和抗泛素抗体(FK2，1:250稀释，识别单泛素化和多泛素化缀合物的小鼠单克隆抗体；安捷伦生命科学公司)同时在含1%脱脂奶粉的PBS -吐温中孵育过夜。为了进行蛋白质标准化，将膜剥离并与抗α -微管蛋白DM1A单克隆抗体(1:5000稀释；西格玛 -奥德里奇公司)孵育。第二天，将膜在PBS -吐温中洗涤，然后在含1%脱脂奶粉的PBS -吐温中与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的种属特异性二抗如山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(1:3000稀释；伯乐公司)在实验室温度下孵育 。将膜在PBS -吐温中洗涤4次，在PBS中洗涤2次，与化学发光底物(超信号西皮克化学发光底物；赛默飞世尔科技公司)反应，并用Azure c600成像系统(Azure生物系统公司)筛选反应条带。
4.11. 统计分析
所有实验均重复进行四次。对于所有四个独立重复实验，进行了流式细胞术测量和转移蛋白的免疫检测。每个数据点表示为平均值 标准差。数据集通过Shapiro-Wilk正态性检验进行正态分布测试，并在GraphPad Prism 5(GraphPad Prism Software, Inc., La Jolla, CA, USA)中使用完全随机设计的单因素方差分析(ANOVA)进行处理。进行Tukey事后分析以比较各个处理组的平均值，显著性水平(α)为0.05。
补充材料:以下内容可在网上获取:http://www.mdpi.com/1422-0067/21/11/4151/s1，图S1。通过间接免疫荧光显微镜，用特异性多克隆抗MSMB抗体(绿色)检测猪MSMB在体外培养(IVC)蛋白酶体抑制(A, A’)、E1抑制(B, B’)精子以及载体对照的IVC精子(C, C’)中的定位。细胞核用DAPI(蓝色)复染，顶体用PNA(红色)复染。图S2。无抗体和有兔免疫球蛋白(IP IgG)的MSMB免疫沉淀(IP MSMB)的阴性对照。射精精子提取物仅与琼脂糖 - 蛋白A/G珠孵育；未检测到MSMB或用FK2抗体检测的多泛素化蛋白。星号表示免疫球蛋白的重链和轻链。
作者贡献:L.T.设计和/或进行免疫荧光成像、图像流式细胞仪和蛋白质印迹分析实验，起草并撰写了手稿。M.Z.分析数据并撰写了手稿。P.S.设计并分析基于图像的流式细胞仪数据，编辑了手稿并提供资金。M.S.解释数据，撰写手稿并提供资金。P.P.设计免疫沉淀实验，分析数据并撰写手稿。所有作者都已阅读并同意发表的手稿版本。
资金:这项工作得到了布拉格捷克生命科学大学内部资助机构(SV19 - 05 - 21230)、捷克共和国资助机构编号GA - 18 - 11275S、来自欧洲区域发展基金的BIOCEV项目(CZ.1.05/1.100/20.0109)以及生物技术研究所RVO: 86652036的支持。美国农业部国家粮食和农业研究所、美国农业部NIFA的农业和食品研究倡议竞争性赠款编号2015 - 67015 - 23231以及密苏里大学哥伦比亚分校F21C项目的种子资金提供了进一步支持。猪配子由密苏里大学国家猪资源与研究中心提供，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室(ORIP)的赠款U42 OD011140资助。
致谢:我们感谢Kathy Craighead提供编辑和文书协助，以及Miriam Sutovsky提供后勤和实验室管理支持。L.T.感谢布拉格捷克生命科学大学农业生物学、食品和自然资源学院以及Nadace Nadání Josefa, Marie a Zděrky Hlávkových对她访问密苏里大学的研究提供资金支持。
利益冲突:作者声明无利益冲突。资助者在研究设计、数据收集、分析或解释、手稿撰写或决定发表结果方面没有参与。
参考文献
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