微管蛋白结合辅因子C(TBCC)可抑制人乳腺癌细胞的肿瘤生长并增强其化学敏感性
发布时间：
2026-09-21 15:29
微管蛋白结合辅因子C(TBCC)可抑制人乳腺癌细胞的肿瘤生长并增强其化学敏感性
鲁巴·哈格 - 斯利曼*、斯特凡妮·埃尔沃、伊娃 - 洛雷·马泰拉、让 - 法比安·劳里耶、查尔斯·迪蒙泰
摘要
背景:微管被认为是乳腺癌患者的主要治疗靶点。尽管微管在包括细胞运动、细胞分裂和细胞内运输等生物学功能中起着至关重要的作用，但尚未被视为影响肿瘤细胞侵袭性的关键因素。为了评估微管质量和动力学对乳腺癌细胞表型和敏感性的影响，我们靶向了微管蛋白结合辅因子C(TBCC)，它是一种关键蛋白质，可使 和 微管蛋白正确折叠成具有聚合能力的微管蛋白异二聚体。
方法:我们构建了TBCC含量增加的人乳腺癌细胞变体。通过分析增殖、细胞周期分布和有丝分裂持续时间来研究TBCC对细胞表型的影响。在接种乳腺癌细胞的小鼠体内监测肿瘤的生长情况。分别通过延时显微镜和裂解物分级分离研究微管动力学和不同微管蛋白组分。通过流式细胞术研究体外对抗微管药物的敏感性。通过对植入肿瘤细胞的小鼠进行治疗来测定体内化疗敏感性。
结果:TBCC过表达影响微管蛋白组分分布，不可聚合微管蛋白含量较高，可聚合二聚体和微管含量较低。过表达TBCC的细胞中微管动力学降低。含有大量TBCC的细胞中细胞周期分布发生改变，G2-M期细胞百分比更高，S期细胞百分比更低，进入有丝分裂的速度也更慢。虽然TBCC含量增加对体外细胞增殖影响不大，但当将过表达TBCC的细胞作为异种移植物植入体内时，我们观察到相对于对照组，肿瘤生长明显延迟。过表达TBCC的变体在体外和异种移植物中均显示出对抗微管药物的敏感性增强。
结论:这些结果强调了肿瘤细胞中微管蛋白含量精细调节的重要作用，以及微管蛋白二聚体含量失调对肿瘤细胞表型和化疗反应的重大影响。更好地了解癌细胞中微管细胞骨架如何失调将极大地有助于更好地理解肿瘤细胞生物学和耐药表型的特征。
背景
微管对于活细胞至关重要，因为它们参与许多生物学功能，包括细胞运动、细胞分裂、细胞内运输、细胞结构以及其他特定细胞类型的功能[1]。它们在细胞分裂中的动态特性使微管成为抗癌药物的主要靶点。常用的药物分为紫杉烷类和长春花生物碱两大主要类别，已知它们分别通过稳定或破坏微管来抑制微管动态，从而抑制中期到后期的转变，阻断有丝分裂并诱导细胞凋亡[2]。紫杉烷类和长春花生物碱是用于治疗乳腺癌的众多药物之一[3]。然而，对抗癌药物的耐药性正在出现，这就需要了解和识别其背后的机制。导致耐药表型的机制之一是微管动态特性的改变。微管有两种主要的动态行为。首先，它们表现出动态不稳定性，这包括在缓慢伸长和快速缩短状态之间明显随机的转变[4]。另一个重要特性是踏车行为，由于微管相对两端关键亚基浓度的净差异，微管蛋白亚基不断地从聚合物的一端流向另一端[5]。
* * 通讯作者:rhs08@hotmail.com
法国里昂第一大学细胞分析实验室，INSERM U590，69008里昂
微管由 -微管蛋白异二聚体组成，其正确折叠涉及许多伴侣蛋白以及蛋白质辅因子 。微管蛋白合成后，被胞质伴侣蛋白隔离，以进行正确折叠，并为与微管蛋白结合辅因子TBC的进一步相互作用做好准备[8,9]。 -微管蛋白和 -微管蛋白折叠成二聚体的正确途径相互依赖，并且涉及五个TBC(TBCA至TBCE)。TBCB和TBCA分别与 -和 -微管蛋白结合，形成的复合物作为微管蛋白肽在细胞质中的储存库[10,11]。然后， -和 -微管蛋白分别被递送至TBCE和TBCD，在那里它们与TBCC形成超复合物(TBCE/ -微管蛋白/TBCC/TBCD/ -微管蛋白)。在 -微管蛋白水解GTP后，该复合物释放出活化的 -微管蛋白异二聚体，其可以很容易地聚合成微管 。
关于TBCs在癌症中的作用，人们所知甚少。已有研究表明，在MCF7和HeLa细胞中抑制TBCA会改变微管结构，导致细胞周期在G1期停滞并引发细胞死亡[14]。已发现TBCB和TBCE在体外发生物理相互作用并诱导微管解聚[15]。除了在微管正确折叠中的作用外，这些辅助因子可能还具有涉及微管的其他作用。最近有研究表明，微管通过将TBCD转运到细胞膜，在那里它与黏附连接和紧密连接相互作用，从而参与细胞脱离的机制[16]。据描述，TBCD与ADP核糖基化因子样2(Arl2)相互作用，使其从 微管蛋白异二聚体中解离[17]。一项对拟南芥的研究表明，TBCC在释放有活性的 -微管蛋白可聚合异二聚体中起重要作用[18,19]。另一项在X连锁视网膜色素变性2(RP2)中进行的研究表明，负责光感受器细胞进行性退化的RP2与TBCC具有相似的序列。发现这两种蛋白质都是GTP酶的激活剂，但只有TBCC能够催化微管蛋白的异二聚化[20]。
由于TBCC对于微管蛋白的正确折叠及其聚合成微管至关重要，并且关于这种蛋白质，人们所知甚少 在乳腺癌中，我们有兴趣研究TBCC过表达对肿瘤细胞表型以及微管含量、动力学和对抗微管药物反应的影响。我们发现，在我们的模型中，过表达TBCC会影响乳腺癌细胞的细胞周期分布，同时细胞周期G2-M期的细胞百分比增加，有丝分裂减缓。微管的动力学降低，可聚合微管蛋白的含量减少。最后，过表达TBCC的细胞在体内和体外对微管靶向剂都更敏感。
方法
质粒构建
使用pcDNA6/V5-His A质粒克隆从hTerT-HME-1人乳腺上皮细胞(ATCC)中提取的 人TBCC cDNA(NM_003192)。按照制造商的说明，使用Trizol试剂(Invitrogen，法国塞尔吉蓬图瓦兹)提取mRNA。然后按照制造商手册中的描述，使用莫洛尼白血病病毒逆转录酶(Invitrogen，法国塞尔吉蓬图瓦兹)在 下进行1小时逆转录为cDNA。然后根据制造商的说明(德国耶拿生物科学公司)，使用高保真聚合酶，通过全长 正向引物GCCAATATG-GAGTCCGTCAG和反向引物CAACTGCTTAGTCC-CACTGGA扩增获得的cDNA。PCR条件为:在 下变性 进行30个循环，在 下退火 ，在 下延伸 。纯化的扩增子亚克隆到pGEMTeasy中，然后使用EcoRI(法国Fermentas)以正义方向亚克隆到pcDNA6中(命名为pcDNA6/C+)。
细胞培养与转染
MCF7(人乳腺腺癌，ATCC)细胞和转染细胞在补充有青霉素 、链霉素 和胎牛血清(10%)的DMEM中于 在含有 的湿润气氛中培养。按照制造商的说明，使用脂质体(Invitrogen，法国塞尔吉蓬图瓦兹)用pcDNA6/C+或空的pcDNA6转染细胞。通过杀稻瘟菌素选择( - 1004，法国欧罗美迪)获得稳定的转染子。对两个批次群体中的每一个进行细胞群体克隆，并根据蛋白质TBCC的不同表达水平选择每个群体的3个代表性克隆进行进一步表征。命名为MC+1、MC+2和MC+3的克隆代表过表达TBCC的克隆。命名为MP6.1、MP6.2和MP6.3的克隆代表对照克隆。
蛋白质免疫印迹分析
蛋白质提取和蛋白质免疫印迹分析按照之前描述的方法进行[21]。使用的抗体有抗 III - 微管蛋白(克隆号Tuj1，1/2500；法国里昂Cova - lab公司)、抗p53(克隆号DO7，1/1000；丹麦Dako公司)、抗 - 肌动蛋白(克隆号AC - 15，1/5000)、抗 - 微管蛋白(克隆号DM1A，1/1000)、抗 - 微管蛋白(克隆号2.1，1/1000)、抗酪氨酸化 - 微管蛋白(克隆号TUB - 1A2，1/1000)和乙酰化 - 微管蛋白(克隆号6 - 11B - 1，1/1000)，均购自法国圣康坦法拉维耶的西格玛奥德里奇公司。抗TBCC的多克隆抗体(1/800)和抗TBCD的多克隆抗体(1/3000)由美国纽约大学医学中心的N. Cowan慷慨提供，抗Arl2的多克隆抗体(1/1000)和抗谷氨酸化微管蛋白的多克隆抗体(1/1000)分别由美国亚特兰大埃默里大学医学院的R. Kahn和法国格勒诺布尔生物活性分子筛选中心的L. Lafanechère慷慨提供。蛋白质的表达水平以 - 肌动蛋白为对照进行标准化。
RNA干扰实验
由Sigma-Aldrich公司(法国圣康坦法拉维耶)设计了靶向TBCC的5’-CUGAG-CAACUGCACGGUCA-3’脱盐双链小干扰RNA(siRNA)及其相应的乱序序列。按照制造商的方案，使用脂质体转染试剂(法国赛尔日蓬图瓦兹英杰公司)，在连续两天将siRNAs(200 nM)转染到 的MCF7、MP6.1或MC + 1细胞中。转染后第三天进行蛋白质免疫印迹分析或流式细胞术实验。
细胞增殖分析
使用甲基噻唑基四氮唑(MTT)和BrdU检测法评估细胞增殖。对于MTT检测，将 细胞接种于6孔板中，并在 孵育。每隔 ，持续一周，向每块板的每孔中加入MTT 。在 孵育2小时后，去除上清液，用 异丙醇 - 溶解甲臜晶体并扫描平板。用酶标仪(Labsystem Multiskanner RC)分光光度法测量吸光度，并通过减去在540和 波长处读取的吸光度来获得MTT值。基于非放射性BrdU的细胞增殖检测(瑞士巴塞尔罗氏公司)按照制造商的方案进行。将处理和未处理的细胞(每孔 个细胞)接种于96孔塑料板中，并在48、72、96和168小时后进行检测。处理的细胞暴露于 或 吉西他滨(美国印第安纳州礼来公司)中一周。通过在酶标仪上测量450处的吸光度来确定BrdU掺入DNA的情况。
通过流式细胞术分析细胞周期分布
细胞分别与 紫杉醇(百时美施贵宝公司，美国纽约)或 1 nM 长春瑞滨(皮尔法伯制药公司，法国布洛涅)一起孵育 。然后收集经处理和未经处理的细胞，并与含有 0.05% 诺乃洗涤剂 P40 的碘化丙啶(0.05 )溶液在 孵育 1 小时。使用 FACS Calibur 流式细胞仪(BD 生物科学欧洲公司，比利时埃伦博德海姆)对细胞进行分析，并使用 Modfit LT 2.0 软件(Verity 软件公司，美国托普瑟姆)确定细胞周期分布。对于 siRNA 转染的克隆，在第一次转染 后研究细胞周期。
长时间延时显微镜观察与有丝分裂分析
将 细胞接种于 细胞培养皿中，置于在 环境下维持于 的培养基中，并使用位于法国里昂第一大学量子计量中心的倒置延时显微镜(Olympus IX50)进行观察。使用由美国国立卫生研究院(NIH)位于贝塞斯达的ImageJ软件驱动的型号为CFW - 1308M的1360X1024数字相机(Scion公司，美国弗雷德里克)，每2分钟采集一次图像，共采集24小时。使用美国国立卫生研究院(NIH)位于贝塞斯达的ImageJ软件对MP6.1和MC + 1克隆中的每一个分析30次完整的有丝分裂。
免疫荧光
将暴露于或未暴露于 紫杉醇24小时的细胞(MP6.1和MC + 1)在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟，并用0.1% PBS - Triton X - 100溶液通透处理。使用含有0.1%牛血清白蛋白和1%胎牛血清的溶液封闭非特异性位点。细胞与抗 微管蛋白的1:100抗体(克隆2.1，Sigma Aldrich)或抗TBCC的单克隆抗体(Abnova，台湾)的1:30稀释液孵育，然后与二抗FITC抗体(Dako，丹麦)孵育。使用二氨基苯基吲哚(DAPI)(罗氏，德国曼海姆)进行DNA染色。
在法国里昂第一大学的量子计量中心，使用激光扫描共聚焦TCS Sp2 DMRXA显微镜x63物镜(徕卡微系统公司；德国韦茨拉尔)获取图像。
可溶性未折叠微管蛋白、可聚合的 -微管蛋白异二聚体和微管的分离与定量
收获 细胞，经 缓冲液 冻融裂解。 下 离心15分钟。上清液于 超速离心 ，转速为 )，分离为含有“可溶性微管蛋白”的上清液和含有“微管”的沉淀。将微管部分重悬于 的裂解缓冲液中，并将 的上清液与 的GTP在 下孵育30分钟，以使微管蛋白聚合，然后在 下以 超速离心45分钟。所得沉淀包含“可聚合微管蛋白”(PT)异二聚体，上清液包含“不可聚合微管蛋白”(NPT)异二聚体，包括与微管结合辅因子复合的微管蛋白肽。按照制造商的建议(瑞典阿默沙姆生物科学公司AB)，将不同部分的微管蛋白在银染凝胶上进行电泳。染色后，在 处观察到的可聚合微管蛋白异二聚体的单条带证实了纯化的成功(数据未显示)。使用MP6.1和MC + 1这两种细胞系重复进行了三次实验。使用
ImageJ软件(美国国立卫生研究院)对蛋白质印迹进行光密度定量分析。
延时荧光显微镜观察及微管动力学分析
将 细胞接种于底部带有 圆形玻片的6孔板中，并按照制造商的说明，使用脂质体(Invitrogen)将pAcGFP1 - 微管蛋白载体(Clontech)转染到细胞中。将含有细胞的玻片置于法国里昂克劳德·伯纳德大学量子计量中心的延时倒置显微镜(Olympus IX50)中，在 气氛下，于 温度的培养基中培养。使用由美国国立卫生研究院(NIH，贝塞斯达)的ImageJ软件驱动的美国弗雷德里克Scion公司的CFW - 1308M 1360X1024数字相机，通过德国哥廷根蔡司公司的 油浸物镜对细胞进行成像。每隔4秒拍摄30张细胞微管的照片。使用ImageJ®软件随时间跟踪细胞外周板层区域中单个微管正端的位置，并使用Microsoft Excel电子表格将其绘制成位置与时间的关系图，以生成每个微管的“生命历程图”。生长和缩短速率及持续时间通过回归分析得出。任意两个连续点之间 的差异被视为生长或缩短事件。转变为解聚或缩短被称为灾难，从缩短到生长或暂停的转变称为拯救。单位时间内的灾难和拯救频率分别通过从生长和暂停到缩短的转变次数以及从缩短和暂停到生长的转变次数除以生长和暂停的总时间来计算。动态性表示微管末端的总微管蛋白交换，通过将生长和缩短的总长度之和除以微管寿命来计算。该实验在两个克隆MP6.1和MC + 1的50个微管上进行了两次。 该实验在两个克隆MP6.1和MC + 1的50个微管上进行了两次。
体内生长分析
从Charles River Laboratories(法国阿尔布勒)购买的雌性CB17/SCID小鼠在我们研究所的动物设施中在无病原体条件下饲养。动物的处理符合欧盟关于实验动物护理和使用的指南以及法国法律。动物饲养在常规环境中。食物和水的供应不受限制。所有使用的小鼠在细胞注射时为5至6周龄。本研究获得当地动物伦理委员会的批准。小鼠被分为六组，每组六只，分别对应注射MP6.1、MP6.2、MP6.3、MC + 1、MC + 2和MC + 3细胞。将 细胞与50%基质胶(比利时BD Biosciences公司)混合后皮下注射到小鼠体内。六只小鼠被分为治疗组和未治疗组。在治疗组中，在同一天和一周后腹腔注射剂量为 的紫杉醇。每周称小鼠体重并使用电子卡尺测量肿瘤大小两次。然后将肿瘤视为球体，根据公式 (其中 为平均半径)计算体积。当肿瘤的任何一个直径超过 ，或者观察到动物有任何潜在痛苦，或者体重减轻超过10%时，对动物实施安乐死。
结果
稳定克隆中的TBCC蛋白表达
建立了六个过表达蛋白TBCC的MCF7细胞稳定克隆(命名为MC +)，并与用空载体转染的对照细胞克隆(命名为MP6)进行了表征比较。其中，相对于三个对照细胞克隆，TBCC水平高的三个克隆按表达递减顺序命名为 和 并进一步研究(图1)。从用空载体转染的MCF7获得的三个克隆命名为MP6.1、MP6.2和MP6.3并用作对照。
微管蛋白结合辅因子C(TBCC)过表达对相关蛋白表达水平的影响
我们研究了TBCC过表达对TBCD和ADP - 核糖基化因子样2(Arl2)蛋白质含量的影响，TBCD和Arl2是TBCC在 -微管蛋白二聚体折叠途径中的两个重要伙伴。在 克隆中TBCD增加，但在另外两个克隆 和 中没有增加。相反，相对于MP6的三个对照克隆，Arl2在 的三个克隆中增加(图1)。最后，我们研究了肿瘤抑制蛋白p53的表达水平，发现与MP6细胞相比，MC +细胞的三个克隆中p53略有增加(图1)。
图1微管蛋白结合辅因子C(TBCC)对相关蛋白表达水平的影响。对克隆的总细胞提取物进行蛋白质印迹分析，显示TBCC过表达对TBCC、TBCD、Ar12和p53表达水平的影响。β-肌动蛋白用作参考蛋白。MC+1、MC+2和MC+3代表用pcDNA6/C+稳定转染的MCF7细胞。MP6.1、MP6.2和MP6.3代表用空pcDNA6稳定转染的MCF7细胞。
TBCC蛋白含量对增殖率的影响
当我们通过MTT法检测MC + 1和MP6.1细胞的体外增殖率时，我们发现MC + 1细胞在120和144小时时的体外增殖率略高于对照细胞，但在更早的时间点则不然。通过比较因活线粒体形成甲臜晶体而染成蓝色的分裂细胞数量，从视觉上证实了这一结果。通过对吸光度光密度的量化证实了这些观察结果，绘制的曲线(图2A)显示了这两种细胞系之间的显著差异。在 、MP6.2和MP6.3克隆上证实了这些结果。当我们使用BrdU掺入法检测MC + 1和MP6.1细胞的增殖率时，我们发现两个克隆之间的增殖率没有显著差异。在其他克隆MC + 2、MC + 3、MP6.2和MP6.3上也证实了这一点(图2B)。
微管蛋白结合辅因子C(TBCC)蛋白含量对细胞周期分布和有丝分裂持续时间的影响
为了探究增殖速率的差异是否与细胞周期分布的差异相关，我们 通过碘化丙啶和流式细胞术研究了 和MP6.1细胞中处于S期和G2-M期的细胞百分比(图2C)。我们观察到，与MP6.1细胞 相比，MC+1细胞处于S期 的细胞百分比更低，显著降低了 (图2C)。与MP6. 相比，这种差异还伴随着处于G2-M期 的细胞百分比更高，显著增加了 (图2C)。该实验在MP6.2、MP6.3、MC+2和MC+3克隆上进行，上述结果得到了证实。
为了将这些表型行为与TBCC蛋白含量的增加联系起来，我们在MP6.1和MC+1细胞中使用靶向TBCC的siRNA进行瞬时转染，抑制TBCC的蛋白表达。我们设计的靶向TBCC的siRNA在MCF7细胞上通过蛋白质免疫印迹法得到了验证。与乱序siRNA相比，该序列抑制了TBCC(-48%， )(数据未显示)，并用于抑制MC+1和MP6.1中的TBCC。在MC+1和MP6.1细胞中，TBCC蛋白的抑制导致S期细胞百分比显著增加，G2-M期细胞百分比显著降低(图2C)。
为了解释在 细胞中观察到的G2 - M期百分比增加的现象，我们与对照相比研究了前期 - 中期、后期 - 末期和完整有丝分裂的持续时间。我们发现MC + 1细胞完成有丝分裂需要更多时间(71分钟，而MP6.1细胞为57分钟)。这个较长的时间主要是由于后期 - 末期持续时间更长，为37分钟，而MP6.1细胞为20分钟，而不是前期 - 中期的差异(图2D)。过表达TBCC的细胞在有丝分裂过程中进展缓慢，这可以解释细胞周期G2 - M期细胞的高百分比。
图2 TBCC对MC+1和MP6.1细胞增殖率、细胞周期分布和有丝分裂持续时间的影响。(A)添加MTT后，MC+1和MP6.1中溶解的甲臜晶体在540和690nm处测得的吸光度光密度。图下方的图形表示每天添加甲基噻唑基四氮唑(MTT)共一周后，含有MC+1和MP6.1的孔中被甲臜晶体染色的情况。呈现的结果是三个实验的平均值。*:在 95%置信水平下，通过学生t检验，数值与MP6.1有显著差异。条形表示标准差。(B)MC+1和MP6.1细胞一周的增殖能力(BrdU标记)。呈现的结果是三个实验的平均值。条形表示标准差。(C)用碘化丙啶孵育后，MC+1和MP6.1细胞的细胞周期分布。MC+1、MP6.1、MC+1 + siRNA SCR、MC+1 + siRNA TBCC、MP6.1 + siRNA SCR和MP6.1 + siRNA TBCC中处于细胞周期S期和G2-M期的细胞百分比。表示为+siRNA SCR和+siRNA TBCC的细胞分别是用乱序siRNA和靶向TBCC的siRNA瞬时双重转染的细胞。实验在第一次转染后48小时进行。呈现的结果是三个实验的平均值。* - 在≥95%置信水平下，通过学生t检验，数值有显著差异。条形表示标准差。(D)经过24小时的延时显微镜分析后，MC+1和MP6.1细胞中前期-中期、后期-末期和完整有丝分裂的持续时间(分钟)。*:在≥95%置信水平下，通过学生t检验，数值与MP6.1有显著差异。条形表示标准差。
肿瘤的体内进展
为了研究TBCC对乳腺癌细胞肿瘤发生的影响，我们将六个克隆MP6.1、MP6.2、MP6.3、MC + 1、MC + 2和MC + 3注射到 SCID小鼠体内，并监测它们的体内进展和肿瘤形成。一个月后，对照克隆能够形成200至 的肿瘤。然而，MC +克隆在体内的生长能力较低，肿瘤体积从1到 不等(图3)。
微管蛋白结合辅因子C(TBCC)在细胞质中的定位
通过对MP6.1和MC + 1细胞进行免疫荧光研究了TBCC过表达对TBCC细胞质分布的影响。第一步，我们观察到细胞质中 -微管蛋白的分布不受TBCC过表达的影响。这是通过使用针对 -微管蛋白的抗体进行免疫荧光完成的，图像显示MP6.1和MC + 1细胞之间的细胞质染色相似(图4A)。TBCC在正常表达和高表达细胞中分布相似。染色发现是细胞质的，然而在每个细胞系的所有细胞中并未观察到(图4B)。我们发现MC + 1细胞中染色的细胞比对照细胞多。在将TBCC的荧光图像与DAPI图像叠加后，我们观察到TBCC染色强烈的细胞是处于有丝分裂的细胞。这个结果表明TBCC在进行有丝分裂的细胞中表达更高。在暴露于紫杉醇 24小时的 细胞中得到了证实(图4C)。已知紫杉醇可稳定微管并使细胞停滞在中期。我们通过免疫荧光显微镜观察到，停滞在有丝分裂中的细胞被抗TBCC抗体强烈染色。
图3体内肿瘤进展。皮下注射MC + 1、MC + 2、MC + 3、MP6.1、MP6.2和MP6.3细胞后，每隔2 - 3天测量一次肿瘤生长进展，持续一个月。给出的结果是三只小鼠的平均值。条形表示标准差。
TBCC含量对不同微管蛋白及亚细胞微管蛋白组分的影响
我们研究了TBCC过表达可能对总 和 微管蛋白以及对 微管蛋白的不同翻译后修饰(如乙酰化、酪氨酸化和去酪氨酸化(Glu) 微管蛋白)，以及最终对 III微管蛋白亚型产生的影响。我们观察到，过表达TBCC的克隆与对照之间，总 微管蛋白和酪氨酸化 微管蛋白的表达没有显著差异(图5A)。关于Glu 微管蛋白和 III微管蛋白，我们观察到两者之间的表达存在异质性 MP6和MC+克隆使得无法根据与TBCC状态相关的简单特征得出结论(图5A)。然而，关于 -微管蛋白和乙酰化 -微管蛋白，我们观察到 克隆中相对于MP6克隆的表达增加。
此外，我们研究了MC+1和MP6.1细胞中可溶性可聚合 -异二聚体(PT)、可溶性不可聚合微管蛋白(NPT)以及微管微管蛋白(MT)的不同库。通过一系列超速离心对MP6.1和MC+1裂解物进行分级分离后，获得了不同的微管蛋白库。我们观察到，MCF7细胞中TBCC水平的改变并未改变 -微管蛋白的总量，尽管它增加了 -微管蛋白的总量(图5B)。TBCC蛋白的过表达显著增加了NPT部分，显著降低了PT部分，而对微管微管蛋白含量的影响较小，微管微管蛋白含量略有下降。NPT和PT部分的表达谱对于 -微管蛋白和 -微管蛋白是相似的，但在 -微管蛋白的情况下不太明显(图5B)。对不同部分中 和 -微管蛋白表达水平的定量证实了免疫印迹中观察到的结果(图5C)。
TBCC的过表达降低了微管动力学
在对 细胞 进行pAcGFP1- 微管蛋白瞬时转染后，测定了TBCC过表达对微管动态不稳定性的影响。与MP6.1细胞相比，MC + 1细胞中的微管生长和缩短更慢，长度更短，动态性明显更低。测定了MP6.1和 细胞中动态微管的参数(表1)。平均生长速率从MP6.1细胞中的 显著降低至 细胞中的 ，降幅为 0.05。平均缩短速率以及单个生长和缩短的平均长度略有降低。与平均生长持续时间和平均暂停持续时间相比，平均缩短持续时间略有增加，平均生长持续时间和平均暂停持续时间从对照细胞中的 和 显著增加至 细胞中的 和 ，分别增加了 和 。MC + 1细胞的生长运动比对照细胞慢，这是生长速率缓慢和动态性较低的原因。灾难频率和救援频率是研究微管动态性的重要参数。灾难频率是微管从暂停或生长状态转变为缩短状态的频率。救援频率是微管从缩短状态转变为生长或暂停状态的频率。如上所述，MC + 1细胞的缩短速率与对照细胞相似，但生长速率降低。这表明MC + 1细胞中缩短的微管要么生长时间更长(高生长持续时间)，要么处于暂停阶段(高暂停持续时间)。与对照细胞相比， 细胞中基于时间的灾难频率略有增加，而救援频率显著增加了 。这可以解释为，MC + 1细胞的微管在短距离内(小于0.5 )有微小的生长和缩短运动，这些运动未计入生长和缩短事件以及微管的整体动态性中。动态性从MP6.1中的 显著降低至MC + 1细胞中的 。 的这种降低代表微管在2分钟的生长或缩短事件中移动的总距离更小。
图4 TBCC在MC+1和MP6.1细胞中的定位。(A) DNA(DAPI，蓝色)和β-微管蛋白(FITC，绿色)染色后MC+1和MP6.1细胞的代表性图像 (B) DNA(DAPI，蓝色)和TBCC(FITC，绿色)染色后MC+1和MP6.1细胞的代表性图像 (C) 在暴露于10 nM紫杉醇24小时的MC+1细胞中DNA(DAPI，蓝色)和TBCC(FITC，绿色)染色的代表性图像。
图5 TBCC对不同微管蛋白含量和亚细胞微管蛋白组分的影响。(A) MC+1、MC+2、MC+3、MP6.1、MP6.2和MP6.3克隆的总细胞提取物的蛋白质印迹分析，显示TBCC过表达对 -微管蛋白、 -微管蛋白、酪氨酸化 -微管蛋白、去酪氨酸化(Jul)α-微管蛋白、βIII-微管蛋白和乙酰化 -微管蛋白表达水平的影响，β-肌动蛋白用作参考蛋白。(B) 对应于MC+1和MP6.1细胞中不可聚合微管蛋白异二聚体(NPT)、可聚合微管蛋白(PT)异二聚体、微管异二聚体(MT)和微管蛋白总库中 -微管蛋白和 -微管蛋白表达水平的代表性印迹。这些组分是经过一系列超速离心后获得的。(C) NPT、PT和MT组分中 -微管蛋白和 -微管蛋白水平的蛋白质比率(MC+1对MP6.1)。给出的结果是三个实验的平均值。条形表示标准差。
对吉西他滨和抗微管化合物的体外反应
由于TBCC是一种主要蛋白质，参与微管蛋白正确折叠成微管的途径，我们研究了过表达TBCC的乳腺癌细胞对抗微管药物的反应。这些药物在G2-M期阻断细胞周期。我们用无毒剂量的 紫杉醇或 长春瑞滨孵育MC+1和MP6.1细胞24小时，观察到过表达TBCC的细胞对这些处理引起的G2-M期阻断比MP6.1细胞更敏感。紫杉醇和长春瑞滨处理后，MC+1细胞分别有79%和83%的细胞处于G2-M期。对照细胞也被阻断，但最高百分比为55%(图6A)。用 紫杉醇和 长春瑞滨处理24小时后，MC+1和MP6.1细胞在细胞周期亚G0期的百分比增加。然而，这种增加没有统计学意义，并且在 细胞中略高于MP6.1细胞(图6B)。除了抗微管药物，我们还研究了细胞对吉西他滨(一种S期特异性抗代谢物)的反应，发现MC+1细胞对吉西他滨的敏感性低于MP6.1细胞，在1 剂量时差异显著(图6C)。这些实验在MP6.2、MP6.3、MC+2和MC+3克隆上进行，上述结果得到了证实。
表1 MC+1和MP6.1细胞中微管动力学参数
| 参数 | MP6.1 | MC+1 | 变化 | |
| 平均速率(μm/分钟±标准误) | 增长 | 16.41 ± 1.99 | 10.54 ± 0.37 * | -36% |
| 缩短 | 15.25 ± 2.14 | 14.35 ± 1.53 | ||
| Mean length (μm ± SE) | 增长 | 2.38 ± 0.49 | 2.14 ± 0.51 | |
| 缩短 | 2.40 ± 0.39 | 2.29 ± 0.10 | ||
| Mean duration (min ± SE) | 增长 | 0.15 ± 0.02 | 0.22 ± 0.01 * | 47% |
| 缩短 | 0.16 ± 0.01 | 0.17 ± 0.01 | ||
| 暂停 | 0.25 ± 0.01 | 0.37 ± 0.02 * | 48% | |
| 平均频率(分钟 标准误) | 挽救 | 9.20 ± 0.53 | 14.20 ± 0.24 * | 54% |
| 灾难 | 4.64 ± 0.70 | |||
| 动态性(μm/分钟±标准误) | 8.80 ± 1.02 | 6.09 ± 1.06 * | -31% | |
*:通过学生氏 检验，在 置信水平下，这些值与MP6.1有显著差异。数值以平均 表示
体内治疗敏感性
我们将六个克隆体MP6.1、MP6.2、MP6.3、MC+1、MC+2和MC+3注射到SCID小鼠体内，并监测它们在体内的进展和肿瘤形成情况。与MC+1、MC+2和MC+3克隆体相比，对照克隆体能够形成肿瘤，而MC+1、MC+2和MC+3克隆体在体内的生长能力较低。在用紫杉醇治疗时，注射了 克隆体的小鼠与注射了MP6克隆体的小鼠相比，对治疗表现出更高的敏感性(图6D)。
讨论
微管结合辅助因子 是一种关键蛋白质，对于 -微管蛋白和 -微管蛋白正确折叠以形成能够聚合成微管的异二聚体至关重要。在本研究中，主要目的是研究TBCC过表达对MCF7细胞增殖、细胞周期分布和肿瘤发生的影响，以及对 微管含量和动力学的影响。由于抗微管药物是乳腺癌的常用治疗方法，我们在体内和体外研究了我们的模型对这些治疗的反应。除此之外，发现 和 微管蛋白的表达水平与预测许多癌症的治疗反应有关[22,23]。 微管蛋白的一些翻译后修饰，如去酪氨酸化，在乳腺癌中发生率很高[24]。微管蛋白在许多癌症中的这种差异表达水平使其成为治疗靶点。
MCF7细胞中TBCC的过表达深刻改变了微管蛋白单体在细胞组分中的分布，减少了其微管的含量和动态性，但并未阻止细胞完成有丝分裂并正常增殖。然而，我们必须强调，转染细胞与对照之间观察到的TBCC含量差异相当小，这表明更高的表达水平可能与细胞存活不相容。TBCC的过表达对微管蛋白组分有重大影响，不可聚合组分大幅增加，可溶性微管蛋白二聚体组分随之减少。不可聚合微管蛋白组分包括 -微管蛋白/TBCE/TBCC/TBCD/β-微管蛋白复合物中的微管蛋白池、与TBCB或TBCE或TBCE/TBCC/TBCD/ -微管蛋白结合的 -微管蛋白池，以及与TBCA或TBCD或 -微管蛋白/TBCE/TBCC/TBCD结合的 -微管蛋白池。 微管蛋白形成可聚合异二聚体的可用性降低可能是由于大量单体包含在含TBCC的复合物中。值得注意的是，与普遍接受的微管蛋白教条相反，MC +细胞似乎在总 -微管蛋白和 -微管蛋白含量之间存在不平衡。传统上认为这种不平衡对哺乳动物细胞是致命的。然而，在这个模型中，含量增加可归因于 -微管蛋白非功能部分的特定富集。
在有丝分裂期间，特别是在后期染色体运动水平，微管通过解聚而解体并释放游离异二聚体。释放的异二聚体可被细胞质中过量的TBCC直接招募。事实上，如在被紫杉醇阻断有丝分裂的细胞中观察到的，TBCC在有丝分裂期间似乎大量存在于细胞质中。我们假设MC+细胞中不可聚合和可聚合微管蛋白的可溶量与细胞对微管的需求之间存在平衡。我们还观察到TBCC含量对微管动力学有强烈影响。在有丝分裂开始时，间期微管网络解体，同时微管聚合物总量减少，微管动力学增加[25]。在一些细胞中，动力学增加是由于灾难频率增加和拯救频率降低，而不是生长和缩短速率的变化[26,27]。在我们的研究中，我们发现 细胞中的微管生长和缩短比MP6.1细胞更慢且时间更短。与MP6.1细胞相比， 细胞中的动力学显著降低。这些观察结果与观察到的微管蛋白组分变化一致。可聚合微管蛋白二聚体的相对缺乏可以解释生长减少和整体动力学降低的原因。
图6 TBCC蛋白含量对体外和体内治疗反应的影响。(A) 用10 nM紫杉醇和1 nM长春瑞滨处理24小时后，MC+1和MP6.1细胞在细胞周期G2-M期的百分比。给出的结果是三个实验的平均值。柱状图表示标准差。*:通过学生t检验，在≥95%置信水平下，这些值与MP6.1有显著差异。(B) 用10 nM紫杉醇和1 nM长春瑞滨处理24小时后，MC+1和MP6.1细胞在细胞周期Sub-G0期的处理细胞与未处理细胞的比例。用碘化丙啶孵育后研究细胞周期。给出的结果是三个实验的平均值。柱状图表示标准差。(C) 在MC+1和MP6.1细胞中，用0.5和1 nM吉西他滨处理一周后，通过BrdU标记法检测的增殖反应(处理细胞与未处理细胞)。给出的结果是三个实验的平均值。*:通过学生t检验，在≥95%置信水平下，这些值与MP6.1有显著差异。柱状图表示标准差。(D) 在第0天皮下注射MC+1、MC+2、MC+3、MP6.1、MP6.2和MP6.3细胞后，每隔2 - 3天测量肿瘤生长进展和对紫杉醇的反应(空箭头)。在第0天和第7天，以10 mg/kg的剂量腹腔注射紫杉醇(黑色箭头)。给出的结果是三只未处理或处理小鼠的平均值。柱状图表示标准差。
纺锤体中高度动态的微管在有丝分裂的所有阶段都是必需的[2]。在前中期，微管的动力学对于探测细胞质并在其动粒处附着到染色体非常重要[28]。任何一条无法附着到纺锤体上的染色体都足以阻止细胞过渡到后期，因此在中期 - 后期转变时或之前被阻断，并随后发生凋亡[29,30]。在我们的研究中，MC+细胞中动力学的降低并不影响前期和中期的进程，仅影响后期 - 末期的转变。我们观察到后期 - 末期的持续时间显著增加，这是MC+细胞中有丝分裂较慢的原因。 这意味着动态性较低的微管影响了有丝分裂，但没有导致阻断或细胞死亡。MC+细胞在细胞周期中的分布与对照细胞不同，它们在G2 - M期的细胞百分比更高，而在S期的百分比更低。通过瞬时转染靶向TBCC的siRNA抑制TBCC蛋白，我们得到S期细胞百分比增加，G2 - M期细胞百分比降低，从而证实了TBCC参与了观察到的细胞周期改变。
先前的出版物表明，微管的动态性取决于微管的组成，并与 -微管蛋白的翻译后修饰相关。去酪氨酸化微管(Glu微管)对末端介导的解聚具有增强的稳定性，然而仅去酪氨酸化不足以赋予这种增强的稳定性[31]。微管蛋白去酪氨酸化在乳腺癌中频繁发生，并与肿瘤侵袭性相关[24]。 和 -乙酰化微管蛋白丰度的降低与白血病细胞凋亡增强有关[32]。乙酰化 -微管蛋白存在于微管中，在解聚条件下，这些微管比大多数细胞质微管更稳定[31,33]。乙酰化对微管稳定性和动态性的直接影响的存在仍存在争议[34]。在我们的研究中，我们研究了去酪氨酸化(Glu) -微管蛋白、酪氨酸化 -微管蛋白和乙酰化 -微管蛋白的表达水平。对于未修饰的酪氨酸化微管蛋白和在 细胞中相对于 细胞增加的乙酰化微管蛋白，获得了可重复的结果。MC +细胞中乙酰化 -微管蛋白表达水平增加的结果可以解释为这些细胞试图保护其微管。MC+细胞中的微管动态性降低，其生长速率降低不足以补偿其持续缩短事件。作为防止过度解聚的一种手段， 的微管可能已经掺入了乙酰化 微管蛋白，以便获得更强的抗解聚稳定性。先前有报道称，肿瘤细胞中III类β微管蛋白的高表达与非小细胞肺癌对紫杉烷化疗的耐药性相关[35]。在这里我们无法进行任何相关性分析，因为我们模型中III类β微管蛋白的表达谱尚未确定。
MCF7细胞(人乳腺腺癌)源自浸润性导管癌类型的癌症[36,37]。MCF7细胞的体内侵袭和转移过程取决于许多影响细胞的因素，如类固醇激素、生长因子、癌基因和肿瘤抑制基因[38]。在我们的 研究发现，与MP6细胞相比，MC+细胞在体内的肿瘤生长有限。由于与对照细胞相比，MC+细胞在体外的增殖活性并未降低，且其体积也未改变(数据未显示)，我们推测，体内生长的减少可能至少部分是由于 细胞侵袭和转移能力的潜在丧失，而非增殖率降低所致[39]。对从小鼠体内提取的肿瘤中TBCC、 微管蛋白和 微管蛋白的表达水平进行研究发现， 细胞在体内保持了与体外报道相同的变化(数据未显示)。为了了解TBCC在侵袭表型中的潜在作用，我们通过定量RT-PCR研究了13种不同的人乳腺癌细胞系中TBCC基因的表达水平，这些细胞系的体外侵袭特性已有报道[40]。我们发现，TBCC表达最高的四个细胞系(MCF7、MDA-MB361、MDA-MB453和UACC812)体外侵袭能力较低，而其他九个高侵袭性细胞系的 表达较低(补充文件1)。虽然这一观察结果不能让我们得出TBCC的直接作用，但它表明TBCC可能通过微管或其他未确定的途径(如与Arl2蛋白相互作用)参与肿瘤侵袭性。需要注意的是，在过表达TBCC的细胞中，我们注意到Arl2和肿瘤抑制因子p53的表达水平略有增加。ADP核糖基化因子样2(Arl2)蛋白是一种GTP酶，属于ADP核糖基化因子(ARF)家族[41,42]，在微管动力学中起作用[21,42]。已知Arl2直接与TBCD结合，并可抑制TBCD使 微管蛋白异二聚体解离[17]。过表达Arl2的MCF7细胞在体内生长能力较低[43]。然而在体外，MC+细胞在细胞周期、微管动力学、对抗微管药物的反应方面与过表达Arl2的细胞有很大不同[21]。因此，一个可能的假设是，在体内，一种涉及TBCC和p53的机制或Arl2与TBCC之间的相互作用参与了MC+细胞侵袭性的丧失。
基于微管靶向药物在一般癌症治疗尤其是乳腺癌治疗中的成功和有效性，微管仍然是迄今为止确定的最佳癌症靶点[44]。尽管紫杉醇和长春瑞滨在微管作用机制上有所不同，但它们在低但具有临床相关性的浓度下的细胞效应是降低微管动力学，诱导有丝分裂停滞。来自紫杉烷家族的紫杉醇与 -微管蛋白结合，导致 紫杉醇低浓度效应 为抑制微管动力学且不影响其含量，导致有丝分裂停滞及凋亡[46]。长春瑞滨高亲和力结合微管正端、低亲和力结合侧面并致解聚[46,47]；但低浓度时仅阻断有丝分裂而微管不解聚[48]。故解聚化合物在低浓度下亦可稳定微管动力学[49]。本研究发现， 细胞较MP6细胞体外对诱导有丝分裂阻滞更敏感。紫杉醇 与长春瑞滨 的低无毒浓度在MC+细胞中引发的G2-M期阻滞强于MP6细胞，且亚毒性处理未显著增加亚G0期细胞比例，三个克隆结果一致。体内实验证实 细胞对紫杉醇敏感性增强。我们提出两种解释:一是MC+细胞基础微管动态性低于MP6；二是其G2-M期细胞占比高，即药物靶细胞比例大。结果表明乳腺肿瘤TBCC含量显著影响其对微管结合剂的体内外敏感性。测试吉西他滨(S期特异性抗代谢物)反应时，MC+1细胞敏感性低于MP6.1，在 时差异显著。此较低敏感性源于 细胞基础S期比例较低。不同反应表明细胞模型依细胞周期分布响应处理。因此，其他靶向细胞周期的抗癌治疗可能对该模型产生有趣效果。
结论
结果表明，MCF7细胞中TBCC过表达影响微管蛋白库及动力学，进而调控有丝分裂、肿瘤生长及抗微管药敏感性。TBCC适度增加导致不可聚合微管蛋白库增多、动力学降低，引起后期-末期延长并减缓体内生长。G2-M期MC+细胞比例升高，使其成为抗微管药物更佳靶点。这凸显了微管网络在肿瘤侵袭表型中的重要性。尽管现有化合物多靶向动力学，改变微管蛋白库亦为可行策略。未来可探索TBCC潜在伙伴，研究其与微管结合蛋白的相互作用，并开发能稳定胞内TBCC以持续发挥作用的配体。 附件1:TBCC表达水平与乳腺癌细胞系体外侵袭能力的相关性。基因表达值以HME细胞中TBCC表达为基准计算。cDNA水平按Saussede-Aim等(2009)方法，经18S核糖体基因标准化。参考文献:Saussede-Aim J, Matera EL, Herveau S, Rouault JP, Ferlini C, Dumontet C. 长春瑞滨通过AP-1位点诱导β3-微管蛋白基因表达。抗癌研究2009, 29: 3003-3009。
附加文件1:TBCC表达水平与乳腺癌细胞系体外侵袭能力的相关性。基因表达值是相对于HME细胞(人乳腺上皮细胞)中TBCC的表达水平计算得出的。cDNA水平按照Saussede - Aim等人在2009年所描述的方法，以18S核糖体基因的表达进行标准化。Saussede - Aim J，Matera EL，Herveau S，Rouault JP，Ferlini C，Dumontet C:长春瑞滨通过AP - 1位点诱导β3 - 微管蛋白基因表达。抗癌研究2009，29:3003 - 3009。
致谢
感谢L. P. Jordheim博士和A. Beghin博士的严格评审。
作者贡献
RHS和CD构思设计实验并撰写手稿。RHS、SH进行体内研究及数据分析；RHS、SH、ELM、JFL开展体外研究，RHS分析其数据。CD提供试剂/材料/工具。所有作者审阅批准终稿。
利益冲突
鲁巴·哈格-斯利曼获黎巴嫩国家科学研究中心资助。
收到日期:2009年12月7日 接受日期:2010年4月12日
发表日期:2010年4月12日
参考文献
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微管蛋白结合辅因子C,乳腺癌,微管蛋白,紫杉醇
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