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重组单个核小体H3.1 (K4I)
在体内,组蛋白被染色质中的DNA包裹着。因此,在体外研究中,核小体是比组蛋白和组蛋白衍生的肽更具有生理意义的底物。更重要的是,一些组蛋白甲基转移酶在HMT检测中使用核小体底物时,其活性和特异性明显增强,如DOT1L和NSD家族酶。核小体也被广泛用于组蛋白甲基转移酶筛选试验,以确定用于药物发现的小分子抑制剂。组蛋白主要通过其PTMs和调节这些修饰的酶的改变与肿瘤发生有关,这表明它们可能破坏这些标记的阅读、书写和/或擦除。组蛋白H3的突变在罕见的小儿胶质瘤和肉瘤中发生,具有很高的遗传渗透率。在H3变体中,突变最常见的是赖氨酸到蛋氨酸(K-M)的突变,偶尔也会出现甘氨酸突变(G34R/V/W/L)。据研究人员说,H3K4的突变:在这个部位的总共9个突变中,有8个是K4M/I的替代。观察到更多的K-to-M/I突变,提出了与已知的K-to-M/I变化相关的功能效应(即以主导方式阻断野生型组蛋白上相应赖氨酸的甲基化的功能)可能扩展到其他情况。
重组单个核小体H3.1(K4I)由167bp的601个DNA和各两个分子的组蛋白H2A组成,包括氨基酸1-130(末端)(登录号NM_003512),H2B包括氨基酸1-126(末端)(登录号NM_003518),H3. 1包括氨基酸1-136(末端)(登录号NM_003529),有一个点突变Lys4Ile,和H4包括氨基酸1-103(末端)(登录号NM_003548)。所有这些组蛋白都在大肠杆菌细胞中表达。组蛋白八聚体的分子量为108kDa。

组单个核小体H3.1 (K4I)DNA凝胶 重组单个核小体H3.1 (K4I)在2%琼脂糖凝胶上运行,并用溴化乙锭染色。泳道1。DNA标志物。泳道2: 601 DNA,用于组装核小体。泳道3。完整的单个核小体H3.1(K4I)。完整的单个核小体H3.1(K4I)的迁移率比游离的601 DNA高很多。琼脂糖凝胶显示,几乎所有的601 DNA都包裹了组蛋白八聚体,形成核小体。

组单核细胞H3.1 (K4I) 12.5% SDS-PAGE 考马斯染色 分子量:108 kDa 纯度:>95%。重组单个核小体H3.1(K4I)的西方印迹检测 在含有50 mM Tris-HCl pH 8.6, 0.02% Triton X-100, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP和50 µM SAM的反应缓冲液中,将2 µg重组单个核小体H3.1(K4I)分别与0或10 nM MLL2复合物在室温下孵育3小时。一半的反应在12.5%的SDS-PAGE凝胶上运行,分别用H3K4me2抗体(型号:39679)和抗H4抗体(型号:39269)检测。H4被检测为加载对照。重组单个核小体H3.1(型号:81070)和组蛋白H3.1(型号:31294)被用作阳性对照。结果显示,当Mononucleosomes H3.1(K4I)与MLL2复合物孵化时,没有H3K4me2产物产生。
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