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Arf1磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒
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Arf1磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒

Arf1磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒,Arf1 Pull-Down Activation Assay Biochem Kit (Bead Pull-Down Format) ,非常适合开始WB和SDS-PAGE实验类型。更多视频请关注视频号【艾维缔】。哔哩哔哩【IVDSHOW】。抖音【军哥聊表观】。
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哺乳动物 Ras 相关小 G 蛋白的 ADP 核糖基化因子(Arf)亚家族最初因能刺激许多 GPCR 所使用的 Gsα 亚基在霍乱毒素介导下发生 ADP 核糖基化而得名 (1)。 Arf GTPases 根据其大小和氨基酸相似性被分为三类(2):一类(Arf1 和 Arf3)、二类(Arf4 和 Arf5)和三类(Arf6)。 Arf1 在蛋白质从内质网(ER)通过高尔基体到质膜的前向(和逆向)运输过程中发挥作用,它激活脂质修饰酶,并招募促进分泌囊泡发育、裂解和在分泌区之间运输所需的蛋白质(3、4,综述见 5)。  Arf1 还被证明具有维护高尔基体和 ER 结构完整性的功能(6)。

Arf1 与其他小 G 蛋白一样,在非活性 GDP 结合态和活性 GTP 结合态之间循环。 效应蛋白优先与 GTP 结合态的 Arf1 结合,而不是 GDP 结合态的 Arf1,这为 Arf1 在细胞中发挥作用奠定了基础。 效应蛋白与 Arf1-GTP 的这种高度特异性结合已被用于开发亲和沉淀检测方法,以监测 Arf1 的活化(7)。

细胞骨架的 Arf1 激活测定生化试剂盒™ 利用了效应蛋白 GGA3(高尔基定位的含γ-耳的 Arf 结合蛋白 3)的 Arf1 蛋白结合域 (PBD),该蛋白已被证明能特异性结合 Arf1 的 GTP 结合形式(7, 8)。 我们将在大肠杆菌中表达的纯化 GGA3-PBD(氨基酸 1-316)共价连接到本试剂盒提供的彩色 sepharose 珠上(图 1)。 使用这些珠子,研究人员就能 "下拉 "Arf1-GTP,并在随后使用本试剂盒提供的 Arf1 特异性抗体进行 Western 印迹步骤,量化活性 Arf1 的水平。这种检测方法为分析各种系统中的细胞 Arf1 激活水平提供了一种简单的手段。 典型的 Arf1 下拉实验见图 2,使用的是加载 GTPgS 和 GDP 的 MDCK 细胞提取物或通过血清饥饿诱导分化的 C2C12 肌母细胞提取物。

图 1. Arf1磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒中的谷胱甘肽琼脂糖珠颜色鲜艳,使试剂盒易于使用。

结果示例。图 2 显示了典型的 Arf1 pull-down试验,使用的是 GTPγS 和 GDP 加载的 MDCK 细胞提取物或通过血清饥饿诱导分化的 C2C12 肌母细胞提取物。

上图:使用第六部分:对照反应(参见产品手册)中所述的方法,用 GTPγS 或 GDP 加载 MDCK 细胞裂解液(500 µg)。 

底部:C2C12 细胞裂解物(500 µg 来自未处理细胞(FBS)或血清饥饿 1 小时细胞(SF)的 C2C12 细胞裂解物(500 µg)。 所有提取物均与 20 μg GGA3-PBD 珠子孵育,并按第六部分:牵引检测中所述进行处理。 将所有珠子样品重悬于 20 µl 的 2x 样品缓冲液中,然后在 4-20% SDS-PAGE 凝胶上分离,转移到 PVDF 上,用 1:250 稀释的抗 Arf1 抗体进行探针检测,并按第六部分:步骤 4 中所述进行化学发光检测(见产品手册)。

References

  1. Kahn, R. A., and Gilman, A. G. (1986) The Protein Cofactor for ADP-ribosylation of Gs by Cholera Toxin is Itself a GTP Binding Protein. J. Biol. Chem. 261, 7906-7911.
  2. Tsuchiya, M., Price, S. R., Tsai, S-C, Moss, J. and Vaughan, M. (1991) Molecular Identification of ADP-Ribosylation Factor mRNAs and Their Expression in Mammalian Cells. J. Biol. Chem. 266, 2772-2777.
  3. Wang, G., and Wu, G. (2012) Small GTPase regulation of GPCR anterograde trafficking. Trends Pharmacol. Sci. 33, 28-34.
  4. Volpicelli-Daley, L. A., Li, Y., Zhang, C-J, and Kahn, R. A. (2005) Isoform-selective Effects of the Depletion of ADP-Ribosylation Factors 1-5 on Membrane Traffic. Mol. Biol. Cell. 16, 4495-4508.
  5. D’Souza-Schorey, C., and Chavrier, P. (2006) ARF proteins: Roles in membrane traffic and beyond. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 347-358.
  6. Lippincott-Schwartz, J., Cole, N. B., and Donaldson, J. G. (1998) Building a secretory apparatus: role of ARF1/COP1 in Golgi biogenesis and maintenance. Histochem. Cell Biol. 109, 449-462.
  7. Yoon, HY, Bonifacino, J. S., and Randazzo, P. A. (2005) In Vitro Assays of Arf1 Interaction with GGA Proteins. Methods Enzymol. 404, 316-332.
  8. Takatsu, H., Yoshino, K., Toda, K., and Nakayama, K. (2002) GGA proteins associate with Golgi membranes through interaction between their GGAH domains and ADPribosylation factors. Biochem. J. 365, 369-378.

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FAQ

Author Title Journal Year Article Link
Nawrotek, Agata et al. PH-domain-binding inhibitors of nucleotide exchange factor BRAG2 disrupt Arf GTPase signaling Nature Chemical Biology 2019 ISSN 1552-4469
Abdul-Salam, Vahitha B. et al. CLIC4/Arf6 Pathway: A New Lead in BMPRII Inhibition in Pulmonary Hypertension Circulation Research 2019 ISSN 1524-4571
Romani, Patrizia et al. Extracellular matrix mechanical cues regulate lipid metabolism through Lipin-1 and SREBP Nature Cell Biology 2019 ISSN 1476-4679
Yu, Qingfeng et al. A NAV2729-sensitive mechanism promotes adrenergic smooth muscle contraction and growth of stromal cells in the human prostate Journal of Biological Chemistry 2019 ISSN 1083-351X
Sasai, Miwa et al. Essential role for GABARAP autophagy proteins in interferon-inducible GTPase-mediated host defense Nature Immunology 2017 ISSN 1529-2916
Ríos, Amelia et al. Participation of Rho, ROCK-2, and GAP activities during actin microfilament rearrangements in Entamoeba histolytica induced by fibronectin signaling Cell Biology International 2008 ISSN 1065-6995

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