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Arf6磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒
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Arf6磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒

Arf6磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒,Arf6 Pull-Down Activation Assay Biochem Kit (Bead Pull-Down Format) ,非常适合开始WB和SDS-PAGE实验类型。更多视频请关注视频号【艾维缔】。哔哩哔哩【IVDSHOW】。抖音【军哥聊表观】。
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哺乳动物 Ras 相关小 G 蛋白的 ADP 核糖基化因子(Arf)亚家族最初因能刺激许多 GPCR 所使用的 Gsα 亚基在霍乱毒素介导下发生 ADP 核糖基化而得名 (1)。 Arf GTP 酶根据其大小和氨基酸相似性被分为三类(2):一类(Arf6 和 Arf3)、二类(Arf4 和 Arf5)和三类(Arf6)。 Arf6 的主要作用之一是将蛋白质从质膜转运到内细胞隔室(如 GPCR),并且似乎在某些 GPCR 的前向转运中发挥作用(3、4)。 与 Arf1 一样,Arf6 也部分通过激活改变局部膜环境的脂质修饰酶发挥作用(3)。

Arf6 和其他小 G 蛋白一样,在非活性 GDP 结合态和活性 GTP 结合态之间循环。 效应蛋白优先与 GTP 结合态而非 GDP 结合态的 Arf6 结合,为 Arf6 在细胞中的功能提供了基础。 效应蛋白与 Arf6-GTP 的这种高度特异性结合已被用于开发亲和沉淀检测方法,以监测 Arf6 的活化(5)。

细胞骨架的Arf6磁珠激活Pull-Down试剂盒利用了效应蛋白 GGA3(高尔基定位的含γ-耳的 Arf 结合蛋白 3)的 Arf6 蛋白结合域 (PBD),该蛋白已被证明能特异性结合 Arf6 的 GTP 结合形式(5, 6)。 我们已将在大肠杆菌中表达的纯化 GGA3-PBD(氨基酸 1-316)共价连接到本试剂盒提供的彩色sepharose珠上(图 1)。 使用这些珠子,研究人员就能 "下拉 "Arf6-GTP,并在随后使用本试剂盒提供的 Arf6 特异性抗体进行 Western 印迹步骤,量化活性 Arf6 的水平。这种检测方法为分析各种系统中的细胞 Arf6 活化水平提供了一种简单的手段。 典型的 Arf6 下拉实验见下图 2,使用的是 GTPγS 和 GDP 加载的 MDCK 细胞提取物或收获后悬浮的 MDCK 细胞提取物,或培养在涂有纤维连接蛋白的培养皿上的 MDCK 细胞提取物(例如,见参考文献 7、8)。

图 1. Arf6磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒中的谷胱甘肽琼脂糖珠颜色鲜艳,使试剂盒易于使用。

结果示例。图 2 显示了典型的 Arf6 pull-down试验,使用的是 GTPγS 和 GDP 加载的 MDCK 细胞提取物或通过血清饥饿诱导分化的 C2C12 肌母细胞提取物。

上图:使用产品手册第六部分:对照反应中所述的方法,用 GTPγS (GTP 通道)或 GDP (GDP 通道)加载 MDCK 细胞裂解液(500 µg)。 

底部: 从悬浮 2 小时(Sus)或在组织培养板(Rp)上生长的细胞中提取的 MDCK 细胞裂解物(500 微克)。 所有提取物均与 20 μg GGA3-PBD 珠子孵育,并按产品手册第六部分:Pulldown Assay 中所述进行处理。 将所有珠子样品重悬于 20 µl 的 2x 样品缓冲液中,然后在 4-20% SDS-PAGE 凝胶上分离,转移到 PVDF 上,用 1:250 稀释的抗 Arf6 抗体进行探针检测,并按照产品手册第 VI 章:步骤 4 中所述进行化学发光检测。

References

  1. Kahn, R. A., and Gilman, A. G. (1986) The Protein Cofactor for ADP-ribosylation of Gs by Cholera Toxin is Itself a GTP Binding Protein. J. Biol. Chem. 261, 7906-7911.
  2. Tsuchiya, M., Price, S. R., Tsai, S-C, Moss, J. and Vaughan, M. (1991) Molecular Identification of ADP-Ribosylation Factor mRNAs and Their Expression in Mammalian Cells. J. Biol. Chem. 266, 2772-2777.
  3. D’Souza-Schorey, C., and Chavrier, P. (2006) ARF proteins: Roles in membrane traffic and beyond. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 347-358.
  4. Wang, G., and Wu, G. (2012) Small GTPase regulation of GPCR anterograde trafficking. Trends Pharmacol. Sci. 33, 28-34.
  5. Cohen, L. A., and Donaldson, J. G. (2010) Analysis of Arf GTP-binding protein function in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 48, 14.12.1-14.12.17.
  6. Takatsu, H., Yoshino, K., Toda, K., and Nakayama, K. (2002) GGA proteins associate with Golgi membranes through interaction between their GGAH domains and ADPribosylation factors. Biochem. J. 365, 369-378.
  7. Balasubramanian, N., Scott, D. W., Castle, J. D., Casanova, J. E., and Schwartz, M. A. (2007) Arf6 and microtubules in adhesion-dependent trafficking of lipid rafts. Nat. Cell Biol. 9, 1381-1391.
  8. Goldfinger, L. E., Ptak, C., Jeffery, E. D., Shabanowitz, J., Hunt, D. F., and Ginsberg, M. H. (2006) RLIP76(RalBP1) is an R-Ras effector that mediates adhesiondependent Rac activation and cell migration. J. Cell Biol. 174, 877-888.

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Arf6磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒 CNBK033-01 20次 2-8°C
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FAQ

Author Title Journal Year Article Link
Wang, Yilin et al. Cytohesin-2/ARNO: A Novel Bridge Between Cell Migration and Immunoregulation in Synovial Fibroblasts Frontiers in Immunology 2022  
Oga, Takafumi et al. Genomic profiles of colorectal carcinoma with liver metastases and newly identified fusion genes Cancer science 2019 ISSN 1349--7006
Abdul-Salam, Vahitha B. et al. CLIC4/Arf6 Pathway: A New Lead in BMPRII Inhibition in Pulmonary Hypertension Circulation Research 2019 ISSN 1524-4571
Yu, Qingfeng et al. A NAV2729-sensitive mechanism promotes adrenergic smooth muscle contraction and growth of stromal cells in the human prostate Journal of Biological Chemistry 2019 ISSN 1083-351X
Früh, Simon et al. The catalytic function of the gephyrin-binding protein IQSEC3 regulates neurotransmitter-specific matching of pre- and post-synaptic structures in primary hippocampal cultures Journal of Neurochemistry 2018 ISSN 1471-4159
Krey, Jocelyn F. et al. ELMOD1 stimulates ARF6-GTP hydrolysis to stabilize apical structures in developing vestibular hair cells Journal of Neuroscience 2018 ISSN 1529-2401
Herlemann, Annika et al. Inhibition of smooth muscle contraction and ARF6 activity by the inhibitor for cytohesin GEFs, secinH3, in the human prostate American Journal of Physiology - Renal Physiology 2018 ISSN 1522-1466
Chen, Yu Ju et al. RAS SF4 controls SOCE and ER-PM junctions through regulation of PI(4,5)P2 Journal of Cell Biology 2017 ISSN 1540-8140
Berg-Larsen, Axel et al. Differential Regulation of Rab GTPase Expression in Monocyte-Derived Dendritic Cells upon Lipopolysaccharide Activation: A Correlation to Maturation-Dependent Functional Properties PLoS ONE 2013 ISSN 1932-6203
Ríos, Amelia et al. Participation of Rho, ROCK-2, and GAP activities during actin microfilament rearrangements in Entamoeba histolytica induced by fibronectin signaling Cell Biology International 2008 ISSN 1065-6995

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