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Arf6磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒
哺乳动物 Ras 相关小 G 蛋白的 ADP 核糖基化因子(Arf)亚家族最初因能刺激许多 GPCR 所使用的 Gsα 亚基在霍乱毒素介导下发生 ADP 核糖基化而得名 (1)。 Arf GTP 酶根据其大小和氨基酸相似性被分为三类(2):一类(Arf6 和 Arf3)、二类(Arf4 和 Arf5)和三类(Arf6)。 Arf6 的主要作用之一是将蛋白质从质膜转运到内细胞隔室(如 GPCR),并且似乎在某些 GPCR 的前向转运中发挥作用(3、4)。 与 Arf1 一样,Arf6 也部分通过激活改变局部膜环境的脂质修饰酶发挥作用(3)。
Arf6 和其他小 G 蛋白一样,在非活性 GDP 结合态和活性 GTP 结合态之间循环。 效应蛋白优先与 GTP 结合态而非 GDP 结合态的 Arf6 结合,为 Arf6 在细胞中的功能提供了基础。 效应蛋白与 Arf6-GTP 的这种高度特异性结合已被用于开发亲和沉淀检测方法,以监测 Arf6 的活化(5)。
细胞骨架的Arf6磁珠激活Pull-Down试剂盒利用了效应蛋白 GGA3(高尔基定位的含γ-耳的 Arf 结合蛋白 3)的 Arf6 蛋白结合域 (PBD),该蛋白已被证明能特异性结合 Arf6 的 GTP 结合形式(5, 6)。 我们已将在大肠杆菌中表达的纯化 GGA3-PBD(氨基酸 1-316)共价连接到本试剂盒提供的彩色sepharose珠上(图 1)。 使用这些珠子,研究人员就能 "下拉 "Arf6-GTP,并在随后使用本试剂盒提供的 Arf6 特异性抗体进行 Western 印迹步骤,量化活性 Arf6 的水平。这种检测方法为分析各种系统中的细胞 Arf6 活化水平提供了一种简单的手段。 典型的 Arf6 下拉实验见下图 2,使用的是 GTPγS 和 GDP 加载的 MDCK 细胞提取物或收获后悬浮的 MDCK 细胞提取物,或培养在涂有纤维连接蛋白的培养皿上的 MDCK 细胞提取物(例如,见参考文献 7、8)。
图 1. Arf6磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒中的谷胱甘肽琼脂糖珠颜色鲜艳,使试剂盒易于使用。
结果示例。图 2 显示了典型的 Arf6 pull-down试验,使用的是 GTPγS 和 GDP 加载的 MDCK 细胞提取物或通过血清饥饿诱导分化的 C2C12 肌母细胞提取物。
上图:使用产品手册第六部分:对照反应中所述的方法,用 GTPγS (GTP 通道)或 GDP (GDP 通道)加载 MDCK 细胞裂解液(500 µg)。
底部: 从悬浮 2 小时(Sus)或在组织培养板(Rp)上生长的细胞中提取的 MDCK 细胞裂解物(500 微克)。 所有提取物均与 20 μg GGA3-PBD 珠子孵育,并按产品手册第六部分:Pulldown Assay 中所述进行处理。 将所有珠子样品重悬于 20 µl 的 2x 样品缓冲液中,然后在 4-20% SDS-PAGE 凝胶上分离,转移到 PVDF 上,用 1:250 稀释的抗 Arf6 抗体进行探针检测,并按照产品手册第 VI 章:步骤 4 中所述进行化学发光检测。
References
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产品组分
内容 |
型号 |
规格 |
储存温度 |
Arf6磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒 | CNBK033-01 | 20次 | 2-8°C |
Arf6磁珠激活下拉(Pull-Down)试剂盒 | CNBK033-02 | 80次 | 2-8°C |
操作手册 |
1 | 1 |
常温 |
注意事项
保存建议 | 厂家推荐蓝冰运输。当您收到产品后,按照说明书建议保存于-20°C。 |
FAQ
Author | Title | Journal | Year | Article Link |
---|---|---|---|---|
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