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All in One mRNA Synthesis Kit 【ARCA, T7, poly(A)】
产品简介
All in One mRNA Synthesis Kit 【ARCA, T7, poly(A)】试剂盒用于在体外快速合成ARCA加帽和poly(A)加尾的mRNA。通过使用T7 RNA聚合酶,Cap0类似物(ARCA,货号B8175)以共转录方式被掺入mRNA 5'端,形成Cap0结构。ARCA的添加保护mRNA免于降解并确保高翻译效率。经过短暂的DNase I处理以去除模板DNA后,加帽的mRNA可以利用Poly(A)聚合酶在3'端进行加尾。聚腺苷酸化(即Poly(A)尾的添加)使mRNA更加稳定并提高mRNA的翻译起始效率。
该试剂盒有诸多应用,例如体外翻译、反义RNA和RNAi实验、RNA疫苗,RNA结构和功能研究,核酶生物化学,RNase蛋白质实验和基于探针的杂交印迹。
每次标准反应为20 μL,该试剂盒可进行25次反应。对于每次的标准反应,1 μg 的对照模板可产生25-180 μg 的RNA。
产品组分
第一组分内容【mRNA合成(ARCR加帽)】 |
型号:K1063-01(25次) |
型号:K1063-02(100次) |
储存温度 |
T7 RNA Polymerase Mix | 50 ul | 200 ul |
-20℃ |
10X Reaction Buffer | 50 ul | 200 ul | -20℃ |
ATP (20 mM) |
50 ul |
200 ul | -20℃ |
GTP (20 mM) |
50 ul |
200 ul | -20℃ |
UTP (20 mM) |
37.5 ul |
150 ul | -20℃ |
CTP (20 mM) |
50 ul |
200 ul | -20℃ |
Cy3-UTP(10 mM) | 25 ul | 100 ul | -20℃ |
Contro Template(0.5 ug/ul) | 5 ul | 20 ul | -20℃ |
RNase-free H2O | 0.5 ml |
2 ml |
-20℃ |
第二组分内容【mRNA加尾】 |
型号:K1063-01(25次) |
型号:K1063-02(100次) |
储存温度 |
E-PAP(2 units/ul) | 100 ul | 400 ul | -20℃ |
5X E-PAP Buffer | 600 ul | 2.4 ml | -20℃ |
ATP Solution(100 mM) | 100 ul | 400 ul | -20℃ |
25 mM MnCl2 | 250 ul | 1 ml | -20℃ |
Nuclease-free Water | 2 ml | 8 ml | -20℃ |
说明书 |
1份 | 1份 |
室温 |
文件资源
文件下载 | 文件内容 | 资源说明 |
![]() |
K1063-All in One mRNA Synthesis Kit 【ARCA, T7, poly(A)】 | 操作手册 |
![]() |
K1063-All in One mRNA Synthesis Kit 【ARCA, T7, poly(A)】相关说明 | 宣传单页 |
注意事项
保存建议 | 厂家推荐蓝冰运输。当您收到产品后,按照说明书建议保存于-20°C。 |
警告 | 一般仅供科研使用,请勿用于临床与诊断。 |
FAQ
1) RNA产物片段大于预期。
如果电泳显示产物条带大于预期,可能原因:①质粒模板可能没有完全线性化;② 有义链3’端为突出结构;③RNA存在未完全变性的二级结构。
建议确认模板结构,并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测RNA产物。
2) RNA产物片段小于预期。
如果电泳显示产物条带小于预期大小,可能原因:①模板序列中包含类似于T7 RNA 聚合酶的终止序列;②模板中GC含量高形成高级结构;③RNase污染。
不同的聚合酶识别不同的终止序列,若含是模板中含终止结构,建议尝试不同的RNA 聚合酶。如果模板为高GC,建议加入SSB蛋白,以提高转录效率。出现产物条带与预期不一致,请跑变性胶检测产物 。
3) 产物电泳拖尾现象。
电泳过程中有拖尾现象,可能原因:①实验操作过程被RNA酶污染;②DNA模板被 RNase污染。体系中的RNA酶抑制剂只能抑制痕量的RNA酶残留,建议重新纯化模板DNA,并在实验过程中使用RNase- free的枪头和EP管,佩戴一次性乳胶手套和口罩,所有试剂均用RNase-free H2O配制。
4) 模板中间有一段Poly T中止序列,后面的序列可以转录出来吗?
模板中有发卡结构会影响转录,序列一般不会影响转录。
5) 模板一定要是双链吗?
至少T7启动子要是双链的。
6) 合成的RNA如何纯化?是否有配套的过柱纯化盒子?
可使用RNA Clean and Concentrator Kit(K1069)进行RNA纯化。
7) 使用线性化的质粒时,线性化质粒的方法有哪些?
酶切(注意选择酶切位点时不要选择3’端突出的酶切位点)、反向PCR(得到的就 是PCR产物)。
8) 使用质粒作为模板时,在线性化的过程中,为什么需要使用平末端或者5’ 突出末端的限制性内切酶进行线性化?
原因和环状质粒为模板相似,都是会因为没有终止子而无限循环下去,从而导致生 成的产物片段大小不一。
9) sgRNA条带模糊。
sgRNA是100nt左右的单链RNA,在水溶液中容易形成二级结构,因此电泳时会位置会 发生变化,采用加速冷冻或者甲酰胺变性凝胶电泳可以改善电泳结果。
10) 体外转录试剂盒适用的片段范围是多少?
最小做过21bp的siRNA,最大做过10kb。
11) 针对大片段和小片段,转录的效率如何?
大片段会出现条带弥散的情况,因为片段越长酶越容易从模板上脱落,所以得到的 产物条带就不是那么集中,其他竞品公司的产品也会出现类似的情况。短的模板小于300nt的,较短的转录其实对反 应有抑制作用,所以要适当延长反应时间,可以过夜16h。因为模板和酶进行结合时识别启动子的过程需要时间,所 以模板太短时会对反应造成抑制作用,同时建议增加模板量至2μg。
12) 模板中存在高级结构(高GC或是茎环结构),怎么做可以提高产量?
提高温度,如果有很多高级结构存在可以建议加入SSB蛋白。
13) 模板中存在类似于T7终止序列(也是一种茎环结构)怎么做可以提高产量 ?
降低反应温度。
14) 产物纯化方式比较。
酚/氯仿抽提的优点是便宜,但是有可能会残留游离的核苷酸。柱提法优点可以将游 离的核苷酸去除干净,但价格相对较贵。切胶回收的方法得到的产物更加均一。磁珠法优点是快速且回收效率高, 可达到90%以上。
15) 得到的产物量无法达到说明书说的100-150ug可能的原因及建议。
(1) 产物长度小于300nt时,建议提高产物的投入量至2μg,适当延长反应时间。
(2) 阳性对照,试剂盒中提供的阳性模板大小在
1) RNA产物片段大于预期。
如果电泳显示产物条带大于预期,可能原因:①质粒模板可能没有完全线性化;② 有义链3’端为突出结构;③RNA存在未完全变性的二级结构。
建议确认模板结构,并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测RNA产物。
2) RNA产物片段小于预期。
如果电泳显示产物条带小于预期大小,可能原因:①模板序列中包含类似于T7 RNA 聚合酶的终止序列;②模板中GC含量高形成高级结构;③RNase污染。
不同的聚合酶识别不同的终止序列,若含是模板中含终止结构,建议尝试不同的RNA 聚合酶。如果模板为高GC,建议加入SSB蛋白,以提高转录效率。出现产物条带与预期不一致,请跑变性胶检测产物 。
3) 产物电泳拖尾现象。
电泳过程中有拖尾现象,可能原因:①实验操作过程被RNA酶污染;②DNA模板被 RNase污染。体系中的RNA酶抑制剂只能抑制痕量的RNA酶残留,建议重新纯化模板DNA,并在实验过程中使用RNase- free的枪头和EP管,佩戴一次性乳胶手套和口罩,所有试剂均用RNase-free H2O配制。
4) 模板中间有一段Poly T中止序列,后面的序列可以转录出来吗?
模板中有发卡结构会影响转录,序列一般不会影响转录。
5) 模板一定要是双链吗?
至少T7启动子要是双链的。
6) 合成的RNA如何纯化?是否有配套的过柱纯化盒子?
可使用RNA Clean and Concentrator Kit(K1069)进行RNA纯化。
7) 使用线性化的质粒时,线性化质粒的方法有哪些?
酶切(注意选择酶切位点时不要选择3’端突出的酶切位点)、反向PCR(得到的就 是PCR产物)。
8) 使用质粒作为模板时,在线性化的过程中,为什么需要使用平末端或者5’ 突出末端的限制性内切酶进行线性化?
原因和环状质粒为模板相似,都是会因为没有终止子而无限循环下去,从而导致生 成的产物片段大小不一。
9) sgRNA条带模糊。
sgRNA是100nt左右的单链RNA,在水溶液中容易形成二级结构,因此电泳时会位置会 发生变化,采用加速冷冻或者甲酰胺变性凝胶电泳可以改善电泳结果。
10) 体外转录试剂盒适用的片段范围是多少?
最小做过21bp的siRNA,最大做过10kb。
11) 针对大片段和小片段,转录的效率如何?
大片段会出现条带弥散的情况,因为片段越长酶越容易从模板上脱落,所以得到的 产物条带就不是那么集中,其他竞品公司的产品也会出现类似的情况。短的模板小于300nt的,较短的转录其实对反 应有抑制作用,所以要适当延长反应时间,可以过夜16h。因为模板和酶进行结合时识别启动子的过程需要时间,所 以模板太短时会对反应造成抑制作用,同时建议增加模板量至2μg。
12) 模板中存在高级结构(高GC或是茎环结构),怎么做可以提高产量?
提高温度,如果有很多高级结构存在可以建议加入SSB蛋白。
13) 模板中存在类似于T7终止序列(也是一种茎环结构)怎么做可以提高产量 ?
降低反应温度。
14) 产物纯化方式比较。
酚/氯仿抽提的优点是便宜,但是有可能会残留游离的核苷酸。柱提法优点可以将游 离的核苷酸去除干净,但价格相对较贵。切胶回收的方法得到的产物更加均一。磁珠法优点是快速且回收效率高, 可达到90%以上。
15) 得到的产物量无法达到说明书说的100-150ug可能的原因及建议。
(1) 产物长度小于300nt时,建议提高产物的投入量至2μg,适当延长反应时间。
(2) 阳性对照,试剂盒中提供的阳性模板大小在1.9kb左右,对于阳性对照的实验设 计可以在选择反应2h后从20μL的体系中取出5-10μL确定产量,剩下的体积继续反应至实验组的反应时间相同后确 定产量。
(3) 不同的纯化方式产生的损失是不同的。
(4) 可以重新纯化模板。
(5) 确定模板定量以及其完整性。
(6) 尝试其它的启动子和RNA聚合酶。
16) 可以用于合成mRNA吗?
可以,但是要自己购买帽子类似物,说明书中提供的加帽RNA体系就是合成mRNA的体 系,里面GTP和加帽类似物的浓度比例建议为1:4。
17) 模板投入量增加为2μg时,NTP的量以及DNA酶的量是否需要调整?
模板投入量增加为2μg时,NTP的量不用调整,若担心模板消化不彻底,可将DNA酶 的量从1μL提高至3μL。
18) 对照组投入0.5μg产出是多少?
Control Template的长度约500bp,投入0.5μg,产出约150-200μg,最低130μg( 转录后直接用Qubit测量浓度)
左右,对于阳性对照的实验设计可以在选择反应2h后从20μL的体系 中取出5-10μL确定产量,剩下的体积继续反应至实验组的反应时间相同后确定产量。
(3) 不同的纯化方式产生的损失是不同的。
(4) 可以重新纯化模板。
(5) 确定模板定量以及其完整性。
(6) 尝试其它的启动子和RNA聚合酶。
16) 可以用于合成mRNA吗?
可以,但是要自己购买帽子类似物,说明书中提供的加帽RNA体系就是合成mRNA的体 系,里面GTP和加帽类似物的浓度比例建议为1:4。
17) 模板投入量增加为2μg时,NTP的量以及DNA酶的量是否需要调整?
模板投入量增加为2μg时,NTP的量不用调整,若担心模板消化不彻底,可将DNA酶 的量从1μL提高至3μL。
18) 对照组投入0.5μg产出是多少?
Control Template的长度约500bp,投入0.5μg,产出约150-200μg,最低130μg( 转录后直接用Qubit测量浓度)
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