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细胞膜碘化物荧光探针DiR
细胞膜荧光探针DiR,碘化物是用于标记细胞膜的荧光探针,DiA,DiI,DiO,DiD和DiR染料是用于标记细胞膜和其他疏水结构的亲脂荧光染料家族。当掺入膜中或与亲脂性生物分子如蛋白质结合时,这些对环境敏感的染料的荧光大大增强,尽管它们在水中是弱荧光的。它们具有高消光系数,极性依赖性荧光和短激发态寿命。一旦应用于细胞,这些染料在细胞质膜内横向扩散,导致整个细胞在其最佳浓度下均匀染色。DiI(橙色荧光),DiO(绿色荧光),DiD(红色荧光)和DiR(深红色荧光)的独特荧光颜色为活细胞的多色成像和流式细胞分析提供了便利的工具。DiO和DiI可分别与标准FITC和TRITC滤波器一起使用。其中DiD被633 nm He-Ne激发光激发,并且具有比DiI更长的激发和发射波长,为标记具有显著内在荧光的细胞和组织提供了有价值的替代方案。由于红外光通过细胞和组织的有效传输以及红外范围内的低水平自发荧光,DiR可用于体内成像或示踪。
图1. 使用DiR(Cat No. 22070)对HeLa细胞质膜进行活体染色。细胞核用Hoechst 33342(Cat No. 17530)共同染色。
图2. 使用DiR(Cat No. 22070)对HeLa细胞质膜进行活体染色。
图3. 用DIR-RGD-NP对微瘤进行染色。解剖的肠子和连接的肠系膜的荧光光谱图像。显示的图像来自mCherry通道(红色;左栏)和DIR通道(绿色;中栏)。合并的图像(右栏)显示在接受DIR-RGD-NP的动物中,mCherry和DIR信号(白色箭头)有最佳的共定位。每种给药系统都有一个代表性的动物;(可溶性DIR和DIR-NP为n = 4;DIR-RGD-NP为n = 12)。
图4. DIR-RGD-NP在体内的保留增强,并有更好的共聚焦作用。肿瘤建立后(ROI~40,000),给小鼠注射四次可溶性DIR、DIR-NP或DIR-RGD-NP,每隔一天给一次。显示的图像是合并的图像,表明在接受DIR-RGD-NP的动物中,mCherry和DIR信号(黄色)的最佳共定位。每种给药系统都有一个代表性的动物;(可溶性DIR和DIR-NP为n = 4;DIR-RGD-NP为n = 12)。
图5. DIR-RGD-NP对肿瘤和肿瘤相关血管的染色和勾勒。肿瘤建立后(ROI~40,000),给予小鼠四次DIR-RGD-NP的剂量,隔天一次(n = 12)。(A-D)与肠道相比,大体的肿瘤出现明显的染色。染色是肿瘤相关血管(白色箭头)的特异性,可以很容易地与正常血管(黄色箭头)形成对比;(E,F)膈肌下的肿瘤也同样被染色;(F)由于DIR染色的血管(白色箭头),微转移(蓝色箭头)是可见的,与正常血管(黄色箭头)形成对比。
图6. DIR-RGD-NP的一次性给药可以保持检测的特异性。(A) 肿瘤建立后(ROI~40,000),给小鼠注射一次DIR-RGD-NP(表1中的 "高剂量";n = 4)。立体图像显示用白光检测微转移。白色箭头指向微转移灶。M,肠系膜;I,肠道。(B) i, 体外成像和剖开的肿瘤中mCherry和DIR信号的共定位;ii, 剖开的肿瘤中DIR强度和穿透力的量化。
图7. 用DIR-RGD-NP划定肿瘤相关的血管。(A) 肿瘤血管的勾勒。肿瘤的白光图像显示,只有当染料在RGD包被的纳米颗粒中被施用时,才有肿瘤相关血管的轮廓;(B)体外成像和剖开的肿瘤中mCherry和DIR信号的共定位(从顶部:2毫米、5毫米和10毫米大小);(C)DIR MFI的量化,数据显示平均值± SEM,*p<0. 002与可溶性DIR相比,P < 0.0237与DIR-NP相比;(D)DIR强度和横断面肿瘤的渗透率的量化;A、B和D中显示了每种递送系统的代表性动物;(可溶性DIR和DIR-NP的n = 4;DIR-RGD-NP的n = 12)。
图8. 通过白光识别微转移。立体图像比较了所述纳米粒子平台的特异性和敏感性(完整数据见表2)。方形区域和白色箭头指向微转移。M,肠系膜;I,肠道;每个递送系统的代表动物显示;(可溶性DIR和DIR-NP的n = 4;DIR-RGD-NP的n = 12)。
样本分析
1.制备DiO,DiI DiD,DiS或DiR膜染色溶液:
1.1制备DMSO或EtOH储备溶液:储备溶液应在DMSO或EtOH中以1-5mM制备。
注意:储备溶液的未使用部分应储存在-20℃。避免反复冻融循环。
1.2准备工作溶液:将储备溶液(步骤1.1)稀释到合适的缓冲液中,如无血清培养基,HBSS或PBS,制成1至5uM的工作溶液。
注意:对于不同的细胞类型或实验条件,应根据经验确定工作溶液的最终浓度。建议在至少超过十倍范围的浓度下进行测试。
2.将细胞染成悬浮液:
2.1在染料工作溶液中悬浮细胞,细胞密度为1×106 / mL(来自步骤1.2)。
2.2在37°C孵育2-20分钟,最佳培养时间取决于细胞类型。 首先孵育20分钟,然后优化以获得均匀的标记。
2.3将标记的悬浮管以1000至1500rpm离心5分钟。
2.4去除上清液,轻轻地将细胞重新悬浮在预热(37°C)的生长培养基中。
2.5按步骤2.3和2.4洗涤两次。
3.染色贴壁细胞:
3.1在无菌玻璃盖玻片上培养贴壁细胞。
3.2从生长培养基中取出盖玻片,去除多余的培养基。将盖玻片放在湿度箱中。
3.3将100μL染料工作溶液(来自步骤1.2)吸到盖玻片的角落,轻轻搅拌直至所有细胞都被覆盖。
3.4将盖玻片在37°C孵育2-20分钟,最佳培养时间根据细胞类型而变化。开始孵育20分钟,然后优化以获得均匀的标记。
3.5排出染料工作溶液,用生长培养基清洗盖玻片两到三次。 对于每个洗涤循环,用预热的生长培养基覆盖细胞,孵育5-10分钟,然后去除培养基。
4.显微镜检测:
4.1表1总结了DiD,DiO,DiI,DiS和DiR滤波器组的选择。
4.2对于同时检测多种染料,可提供如下多波段滤波器组:
a)DiI和DiO = Omega XF52,Chroma 51004
b)DiI和DiD = Omega XF92,Chroma 51007
c)DiI,DiO和DiD = Omega XF93,Chroma 61005
5.流式细胞仪检测:
用DiO,DiI,DiD,DiS和DiR标记的细胞可分别使用常规FL1,FL2,FL3和FL4流式细胞仪检测通道进行分析。
图3-图8参考文献如下:
Source: Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model by Alvero et al., Scientific Reports, Jan. 2017.
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