本文中，我们会为老师详细解析在做完m⁶A测序后，如何对差异甲基化的基因进行验证。简单来说就是IP后如何进行qPCR 实验。文中的表述：MeRIP-qPCR与m⁶A-IP-qPCR等同。

【确定样本起始量和IgG】

在进行讲解之前，我们要回答的第一个问题就是，用多少RNA来做后期验证呢？举个例子，假如要验证10个基因，究竟需要多少total RNA或polyA的RNA才合适呢？

我们先进行一个简单的计算，常规的RT-qPCR 1个反应（1个复孔）需要的total RNA至少0.1-1μg左右。我们按照最小反应起始量来算的话，那么1个反应需要至少100ng的total RNA，3个技术重复（3个复孔），总计total RNA为300ng。

我们知道total RNA中绝大部分为rRNA，那么只有不到5%的RNA为我们需要研究的对象。PCR反应需要引物跟目标序列区域进行充分碰撞，那么如果只使用mRNA会大大降低一次PCR反应的起始量。通过计算我们认为5-10ng做1次PCR反应较为合理。也就是1个样本中验证1个基因不做生物学重复只做3个复孔需要至少15ng的mRNA或300ng的total RNA。那么3个生物学重复就需要9个反应，总计45-90ng mRNA或900ng的total RNA。

根据上面的推算，IP下来的mRNA若有500ng，可以验证6-12个基因左右（1个基因3个生物学重复，每个重复3个复孔即技术重复，所以一个基因总计9次反应）。哺乳动物IP效率在10-20%左右，植物在20-40%左右（最高可达50%）。那么假设要验证6-10个基因，哺乳动物需要至少2.5-5μg的mRNA和100-200μg的total RNA，植物样本至少需要1.25-2.5μg的mRNA和50-100μg的total RNA。若加入IgG抗体这个步骤，则需要对total RNA的起始量再次翻倍。

但是如果total RNA太少该怎么处理呢？没关系，可以直接用m⁶A抗体对total RNA进行IP，而且不用打断。

那么接下来在进行讲解前的第二个问题就是，明明我们做高通量测序只有一个input文库和一个IP文库，为何我们做MeRIP-qPCR 要加入IgG抗体呢（如下图所示）？；

那是因为高通量测序可以对所有被m⁶A抗体富集下来的RNA进行全转录层面的扫描分析，一旦m⁶A抗体有非特异性富集，在数据呈现上我们可以明显发现reads的分布比较乱且没有规律，而特异性富集则reads几乎富集在哺乳动物的3’ UTR区和植物的5’ UTR和3’ UTR区。所以这就是测序不需要IgG文库，而我们做m⁶A-IP-qPCR 需要IgG富集的原因。

搞定了样本起始量和IgG的问题后，我们具体来看下步骤：

【步骤详解】

第一步，先对RNA进行特异性富集。至于打断或不打断，都是可行的。假如要打断的话请在打断之前，确认研究对象只是mRNA还是lncRNA。若只研究mRNA 可以先用oligodT磁珠进行富集后再进行打断。如果是lncRNA和mRNA都要研究，则需要先用试剂盒将total RNA的rRNA先消化干净，再进行打断。如果是进行高通量测序打断长度约为100nt左右，而qPCR 则需要长度至少在200nt以上，部分论文甚至打断长度在300-500nt左右甚至都不打断。一般根据文献中的资料显示，IP下来的片段用引物扩增出来的长度在130-150左右，所以100nt不到的长度要设计出合适的引物会非常困难。除非是用5’RACE扩增，否则还是建议大于200nt。当然了，如果不打断的话设计引物就会比较方便。当然如果total RNA本身量比较少，建议老师直接用m⁶A抗体对total RNA进行富集。

第二步，对RNA进行抗体孵育和特异性富集。打断完了RNA我们会得到长度约为200-300的RNA片段。如果是不打断则是较为完整的RNA全长。这时候我们可以分出约占m⁶A-IP部分RNA只有10%的RNA作为input。当然如果是细胞样本比较充足，Input和IP的比例可以直接是1:1。如果按照1:1:1，简单来说用于m⁶A IP的RNA有,3μg，那么Input、IP和IgG的RNA都在1μg左右（无论是total RNA还是mRNA）。

第三步，洗脱和逆转录扩增。接下来我们需要对m⁶A抗体和IgG抗体上洗脱下来的RNA，以及input的RNA，按照常规试剂盒要求进行洗脱，并用随机引物进行逆转录。

第四步，设计MeRIP-qPCR 的特异性引物。由于m⁶A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区，所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基化区域来进行。如果某几个常见的基因在不同文献里频繁出现，那么文献里列出来的引物可以被我们直接拿来引用。通常最后PCR产物长度最低会在130-150bp左右。这里需要注意的是，IP下来的RNA需要用随机引物进行逆转录，而第四步中设计的引物用的是特异性引物，这个大家要注意区分和甄别。

第五步，使用上一步设计好的引物，对input、m⁶A-IP和IgG-IP中的RNA进行qPCR反应并计算相应的CT值。

所以到这里我们的实验部分已经完成了，简单总结下就是想要做够10个左右基因的验证，必须至少提供>200μg的total RNA以上。富集的RNA类型根据自己要求出发，如polyA RNA或rRNA-depleted RNA等，最后就是打断成200-300nt左右的长度。用于qPCR的RNA一共分成3类，即Input、m⁶A-IP和IgG-IP，其中input占m⁶A-IP起始量约10%。如果用数字来表示那就是input需要100ng，m⁶A在IP前需要1μg，IgG在IP前也需要1μg。如果IP:Input:IgG=1:1:1，则不需要做特别复杂的换算。部分课题组甚至会舍弃IgG，只有IP和Input，分别为1:1。

所以接下来我们就要详细讨论下m⁶A-IP-qPCR 是如何计算相对表达量的。MeRIP-qPCR 是m⁶A-IP-qPCR 的另一种说法。所以从名称上我们就能发现，m⁶A-IP-qPCR基本和常规的RIP-qPCR相似。当然在讨论RIP-qPCR之前，我们先来看看常规的RT-qPCR 是如何计算相对表达量的。

【基于传统RT-qPCR原理MeRIP-qPCR解读】

关于RT-qPCR的方法学论文很多，所以这里关于实验部分就不细讲了。计算基因的绝对定量需要加入外参基因，所以暂且我们先来看看相对表达量，也就是RT-qPCR传统的2^-△△Ct法是如何计算的。

假设验证一个基因，那么3个生物学重复（biological replication）是必须的，每个生物学重复要做3个复孔，我们也称之为技术重复（technical replication）。那么一个基因总共要做9个反应。

每1个样本的1个基因做3个复孔，内参基因和目的基因的Ct值分别取均值，最后得到Ct内参和Ct目的。如哺乳动物会选择GAPDH作为内参基因。其公式为：

ΔCt=Ct_目的-Ct_内参

处理组和对照组的所有样本都要这样计算。例如，处理组和对照组分别有3个和3个样本（即3个生物学重复），你会分别得到处理组的3个ΔCt和对照组的3个ΔCt。

然后用t检验下3个处理组样本的ΔCt和3个对照组样本ΔCt之间是否有统计学差异。将处理组的3个ΔCt取均值得到ΔCt_处理组，将对照组的3个ΔCt取均值得到ΔCt_对照组。最后来计算ΔΔCt和相对表达量（即2的-ΔΔCt次方），公式分别为：

ΔΔCt=ΔCt_处理组-ΔCt_对照组

相对表达量=2^{（-ΔΔCt）}

也就是处理组中某基因的表达量是对照组中表达量的2^-ΔΔCt倍。我们假设ΔCt_处理组和ΔCt_对照组分别是7和10，那么ΔΔCt=-3，最后相对表达量为8（2的3次方）。

我们从传统的RT-qPCR会发现，每个样本都要做一个内参基因，如上面提到的哺乳动物会选择GAPDH，而miRNA则会选择U6。那么我们的m⁶A-IP-qPCR 是不是也需要内参基因，根据我们查阅的大量文献来看，绝大部分是没有的，少量文献也会使用到内参基因或者我们称之为negative control gene。

那么是不是m⁶A-IP-qPCR 就真的没内参了呢？其实也不是！实际上我们会发现整个input充当了内参基因的概念，一个基因的甲基化水平是无法直接用RIP下来的RNA在做qPCR后直接用Ct值高低来衡量的，需要input中的RNA作为背景。而IgG抗体的加入则是为了排除m⁶A抗体非特异性结合情况发生。由于有时候m⁶A抗体不同厂家、保质期、蛋白性能等因素可能会产生非特异性结合的结果，这时候就需要用IgG来排除这部分的干扰。目前市面上使用的绝大部分m⁶A抗体为兔抗，那么尽量在使用IgG做对照时也使用兔抗来源的IgG。

那么我们首先依旧是与传统的RT-qPCR相似，用相应的软件实时监测扩增曲线。溶解曲线必须是单峰，以保证引物特异性扩增。然后就是校准每一个样本的平均Ct值，以消除样本准备过程中的差异。

接下来我们就要开始对每个样本中，RIP和input的3个技术重复得到的Ct值计算平均值，再对3个生物学重复样本中的Ct平均值再去计算其Ct平均值，得到Average Ct _RIP和Average Ct _input。最后计算稀释系数，即input dilution factor，也就是input的RNA占m⁶A-IP的RNA有多少比例。根据上面的示例，也就是input RNA=100ng而m⁶A-IP RNA=1μg，那此处的稀释系数=10%。最后根据这些数值，我们可以计算出归一化后的ΔCt值，也叫ΔCt _{normalized RIP}。

ΔCt _{normalized RIP} = [Average Ct _RIP - Average Ct _input - log₂^{（input dilution factor）}]

这里为什么归一化后的ΔCt _{normalized RIP}还要减去log₂^{（input dilution factor）}呢？那是因为需要减去input的噪音，排除其干扰。由于RNA样本特别稀少，所以在做实验的时候往往会把input的使用量按照一定比例减少。如本文中input的占比就只有10%，那么稀释倍数（Input Dilution Factor）就是0.1。最极端的情况，就是RNA十分的富余，所以当input的比例理论上和m⁶A-IP及IgG-IP的比例一样时，那么log₂^{（input dilution factor）}=0，也就无需相减了。所以加入稀释系数的校正，目的就是为了达到input:m⁶A-IP:IgG-IP=1:1:1的效果。同样如果前期IP和Input比例为1:1，则不需要考虑这些复杂的换算了。

下一步就是要计算在RIP下来的RNA中某一个基因占input中这个基因有多少的百分比。换句话说就是有input中的某个基因究竟有百分之多少发生了甲基化，所以这里我们用%input来表示。基本上到这一步，部分老师不想做IgG验证的，会把这个数据直接放在论文里，但是我们建议还是要加入IgG的部分。当然这一步需要进行线性归一化处理，方法与上面的RT-qPCR 类似，其公式为：

%_input = 2^{（-ΔCt normalized RIP）}

由于无法判断m⁶A抗体是否存在非特异性富集的情况，所以要过滤这些噪音还需要使用兔抗IgG再对RNA进行一次富集。这时候就需要对ΔCt再次进行背景去除。其中需要检测的目的基因在IgG中的ΔCt值就是ΔCt _{negative control} 。其公式为：

ΔCt _{normalized RIP/negative control} = ΔCt _{normalized RIP} - ΔCt _{negative control}  

最后一步就是最激动人心的一刻，那就是计算甲基化富集倍数，也叫Fold Enrichment，其公式为：

Fold Enrichment = 2^{（-ΔCt normalized RIP/negative control）}

那么不加IgG可以直接将结果用于论文中的数据呈现吗？其实在部分的高分文章中我们也发现不用IgG直接进行验证的，即用%input数据直接用于表示甲基化比例。但是为了保险起见，我们还是强烈推荐老师加入IgG组的数据用于后期校正。

那么还有没有更暴力的方法呢？答案是肯定的！但是前提条件就是Input和IP比例保持一致即1:1，且前期直接对total RNA进行富集（不需要额外富集一次mRNA或lncRNA），使用以下简便的计算公式：

Control: ΔCT=CT(IP)-CT(Input)

Treatment: ΔCT=CT(IP)-CT(Input)；

2 ^{(ΔCT Treatment -ΔCT Control)}

你Get到了MeRIP-qPCR 正确的打开方式了吗？

本文方法参考来自以下几篇文献，若要了解详细的方法，老师可以自行下载对应文献查看。

注意事项：

1. m⁶A抗体富集这部分的protocol，请参考m⁶A研究方法的权威，m⁶A-seq的发明人以色列特拉维夫大学医学院的Gideon Rechavi教授发表在Nature Protocols（Pubmed id：23288318）的文章。这里面会有非常详细的步骤教你如何做m⁶A抗体去IP带有甲基化修饰的RNA。到时候注意打断长度为200-300nt即可，打断需要做几次条件实验。也就是说除了打断长度转换成200-300nt，富集到的RNA从上机测序变为PCR外，其他所有步骤全部一样。当然如果没有打断条件，可以直接对total RNA进行富集且不打断。文章中的生物信息部分可以忽略不计；
2. 在实际操作中，也有人试验过在不打断RNA的情况下进行m⁶A IP，所得到的结果也符合要求。若要不打断，则对m⁶A抗体质量要求较高，建议选择【猛戳⇒】Anti-N6-methyladenosine (m6A) antibody 型号：ab151230 和 SYSY m6A Antibody 型号：202003级别的同类抗体，用DEPC水稀释，具体参见下表；
3. IP下来的产物可使用体积比为25:24:1的酚：氯仿：异戊醇抽提RNA，也可直接加入Trizol试剂进行提取；
4. 实验过程中注意在RNase free的实验台上操作；
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参考文献：

1.Castellanosrubio, A, et al. A novel RT-qPCR-based assay for the relative quantification of residue specific m⁶A RNA methylation. Scientific Reports 9.1 (2019).

2.Weng, HY., et al. METTL14 Inhibits Hematopoietic Stem/Progenitor Differentiation and Promotes Leukemogenesis via mRNA m⁶A Modification. Cell Stem Cell 22.2 (2017).

3.Ma, CH., et al. RNA m⁶A methylation participates in regulation of postnatal development of the mouse cerebellum. Genome Biology 19.1 (2018): 68.

4.Liu, J., et al. m⁶A mRNA methylation regulates AKT activity to promote the proliferation and tumorigenicity of endometrial cancer. Nature Cell Biology 20 (2018): 1074

5.Weng, YL., et al. Epitranscriptomic m⁶A Regulation of Axon Regeneration in the Adult Mammalian Nervous System. Neuron 97.2 (2018): 313.

6.Gagliardi, M., et al. RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology 1480 (2016): 73.

7.Dominissini, D, et al. Transcriptome-wide mapping of N⁶-methyladenosine by m⁶A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing. Nature Protocols 8.1 (2013): 176-189.

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