后生动物核糖核酸酶MRP的组成及RNA结合特异性
发布时间：
2026-03-04 09:42
后生动物核糖核酸酶MRP的组成及RNA结合特异性
摘要
图形摘要
引言
收稿日期:2025年3月7日。修订日期:2025年7月29日。编辑决定日期:2025年7月31日。录用日期:2025年8月7日
© 作者 2025年。由牛津大学出版社出版。
刘源 ，何世阳 ，朴卡云 ，郑珊珊 ，陈美娟 ，布莱奥妮·布拉施 ，谢姆·谢卢菲 ，尼古拉·斯拉沃夫 ，威廉·F·马兹洛夫 ，耶尔内·穆恩191,2,3,*
美国加利福尼亚大学河滨分校生物化学系，邮编92521
美国加利福尼亚大学河滨分校RNA生物学与医学中心，邮编92521
美国加利福尼亚大学河滨分校干细胞中心，邮编92521
美国东北大学，生物工程、生物学、化学与化学生物学系，单细胞蛋白质组学中心，巴尼特研究所，波士顿，马萨诸塞州02115
英国剑桥大学临床医学院血液学系，HUGO基因命名委员会，剑桥郡，CB2 0AW
美国北卡罗来纳大学教堂山分校生物与基因组科学综合项目，邮编27599
美国北卡罗来纳大学教堂山分校生物化学与生物物理学系，邮编27599
*通信作者。电子邮箱:jernej.murn@ucr.edu
核糖核酸酶(RNase)MRP是一种保守的基于RNA的酶，因其在真核生物核糖体RNA(rRNA)成熟过程中的关键作用而闻名。然而，这种多亚基核糖核蛋白复合物在高等真核生物中的组成和RNA底物特异性仍然是个谜。在这里，我们鉴定出NEPRO和C180RF21(我们分别将其重新命名为RMP64和RMP24)作为后生动物RNase MRP的组成亚基。这些蛋白质是RNase MRP所特有的，在密切相关的核糖核酸酶P中不存在，核糖核酸酶P负责加工转运RNA(tRNA)前体和tRNA样底物。我们发现RMP64和RMP24是RNase MRP的整合亚基，稳定其催化RNA，并且是rRNA成熟和细胞增殖所必需的。利用这些发现，我们确定了每种酶在体内的广泛RNA结合靶点，包括核苷酸分辨率下的潜在切割位点。我们的研究结果鉴定出了首个后生动物RNase MRP特异性蛋白质亚基，并定义了这种必需酶在哺乳动物细胞中的RNA靶向范围。
18S、5.8S和28S核糖体RNA(rRNA)的成熟始于多顺反子前体rRNA(pre-rRNA)的内切核酸酶切割，并通过外切核酸酶修剪继续进行，以产生形成功能性核糖体所必需的成熟rRNA [1]。将pre-rRNA切割成注定要整合到人类核糖体小亚基或大亚基中的部分，是由一种人们了解甚少、进化上古老的基于RNA的酶RNase MRP介导的(图1A)[1,2]。这种必需的真核核糖核蛋白(RNP)已知至少由九个蛋白质亚基(POP1、POP5、RPP14、RPP20、RPP25、RPP29、RPP30、RPP38和RPP40)和一种催化RNA(称为RMRP)组成[3,4]。虽然RNase MRP在rRNA加工中的作用已得到充分证实 ，但其完整组成、RNA底物库以及在哺乳动物细胞中的其他功能仍未完全了解[4,8]。RMRP的体内或启动子区域以及某些RNase MRP蛋白质亚基中的突变突出了RNase MRP在人类细胞中的重要作用，这些突变会导致各种多效性疾病，包括以骨骼异常、免疫系统缺陷和癌症风险增加为特征的软骨毛发发育不全[9-17]。
RNase MRP在结构和进化上与另一种必需的基于RNA的酶RNase P相关，RNase P是生命所有三个域中前体转移RNA(pre-tRNA) 末端成熟所必需的[4,5]。酵母中的结构研究表明，这两种核糖核蛋白在RNA部分使用相似的催化核心并共享大多数蛋白质亚基(图1B)[4,7,18]。然而，一些RNA元件和少数蛋白质亚基在酵母中区分了RNase MRP和RNase P [7,18]。这些差异被认为是酶的RNA底物识别不同模式的基础:RNase P“测量”L形的pre-tRNA样结构，而酵母RNase MRP识别单链RNA底物中的短共有序列[7,19-23]。虽然已经鉴定出一种人类RNase P特异性蛋白质(RPP21；与酵母中的Rpr2同源)[24]，但未发现人类RNase MRP特异性蛋白质，尽管酵母中存在两种这样的蛋白质Rmp1和Snm1(图1B)[4,25,26]。尽管RNase MRP在rRNA加工中起着重要作用，并且与RNase P有着明确的进化关系，但长期以来，RNase MRP特异性亚基的明显缺失限制了我们对该酶在高等真核生物中独特特征的理解[3,4]。
一个令人烦恼的问题是关于RNase MRP在高等真核生物中的纯粹存在:为什么在人类细胞中，对一种RNA底物的简单水解切割需要一种半兆道尔顿的基于RNA的催化剂？RNase MRP被认为在真核生物中作为一种类似RNase P的酶出现，以满足对pre-rRNA加工的新需求[5]。这可以解释它在大约二十亿年前最早的真核生物中致力于pre-rRNA加工的原因[27]。然而，很难想象RNase MRP会在高等真核生物中维持其单底物特异性，特别是考虑到酵母中已经鉴定出至少另外两种RNase MRP底物，CLB2和CTS1信使RNA(mRNA)，并且哺乳动物细胞中的其他几个位点特异性pre-rRNA切割是由仅蛋白质的核酸酶催化的[28-30]。可以想象，RNase MRP持续存在反映了对多种RNA底物进行加工的需求，可能具有一定程度的序列特异性[19]。确定这些底物及其由RNase MRP加工的目的应该有助于解读这种核糖核蛋白的体内功能。
在此，我们利用结构预测在多细胞动物中发现了两种核糖核酸酶MRP特异性蛋白质亚基。我们通过分析RMP64和C18ORF21(最近分别重新命名为RMP64和RMP24，见“材料与方法”部分)的蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA相互作用、在核糖体RNA前体加工中的关键作用以及对细胞增殖的需求，验证了它们是哺乳动物核糖核酸酶MRP的独特亚基。我们利用这一发现来区分核糖核酸酶P和核糖核酸酶MRP，并确定它们在体内RNA靶标的完整清单，以及核苷酸分辨率下假定切割位点的位置。这些结果揭示了多细胞动物核糖核酸酶MRP的组成和RNA结合特异性。
材料与方法
细胞培养与处理
HEK293T细胞在补充有10%胎牛血清(Cytiva，SH30910.03)和100 U/ml青霉素-链霉素(Gibco，15140122)的DMEM中，于37°C和5% 条件下培养。mESC E14细胞在补充有15%胎牛血清(Cytiva，SH30910.03)、1%非必需氨基酸(Gibco，11140 - 050)、0.1%β-巯基乙醇(LifeTech，21985 - 023)、106 U/ml白血病抑制因子(MiltenyiBiotec，130 - 095 - 775)和100 U/ml青霉素-链霉素(Gibco，15140122)的DMEM中于 和 条件下培养。
为诱导降解标签介导蛋白消耗，将dTAG - 13(Tocris，6605)和dTAG - V1(Tocris，6914)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，并以最终浓度 (dTAG - 13)和1000 nM(dTAG - V1)作为等摩尔混合物使用指定时间。
对于小干扰RNA转染，将HEK293T细胞接种于六孔板中，24小时后当汇合度约为40%时，使用DharmaFECT 4转染试剂(Mirus，T - 2001 - 01)与靶向RMP24的小干扰RNA(siRNA)池(Horizon，M - 016886 - 01 - 0005)或非靶向siRNA池(Horizon，D - 001206 - 13 - 05)以50 nM进行转染。
为监测细胞生长速率，将细胞以每孔5000个接种于48孔板中。在每个指定时间点，通过用0.25%胰蛋白酶 - EDTA(Gibco, 2661762)消化单个孔中的细胞进行收获，然后使用血细胞计数器(Fisher Scientific, 0267151B)计数。通过台盼蓝(Sigma, T8154 - 100ML)染色确定细胞活力。
为获得可降解Rmp64或RPP21的细胞系，如先前所述[31]，将含降解标签(FKBPF36V)的敲入盒纯合引入mESC E14细胞中Rmp64基因的最后一个编码外显子或HEK293T细胞中RPP21基因的第一个编码外显子。通过转染将修饰质粒pCRIS - PITChv2 - BSD - dTAG(Addgene, 91792)、pCRIS - PITChv2 - dTAG - BSD(Addgene, 91795)和pX333(用于同时递送PITCh和基因靶向gRNA；Addgene, 64073)引入细胞。
通过用从pLEX_305 - C - dTAG质粒(Addgene, 91798)产生的慢病毒感染来生成HEK293T可降解Rmp64细胞系，以驱动Rmp64的降解标签(dTAG)诱导表达，并通过转染将修饰的pX333(用于递送RMP64基因靶向gRNA；Addgene, 64073)引入细胞以敲除内源性RMP64基因。
通过用由修饰质粒pUltra-hot(Addgene，24130)制备的慢病毒感染并基于樱桃蛋白的表达进行分选，获得了稳定表达Flag-HA-RPP25的HEK293T细胞以及稳定表达Flag-HA-Rpp25、Rpp14-3×Flag、Rpp21-3 Flag、Rmp24-3 Flag或Rmp64-3 Flag的E14小鼠胚胎干细胞。
前体rRNA转录的代谢标记和可视化
放射性标记
如先前所述[32]，用 对前核糖体 RNA 进行代谢标记，并做了细微修改。简而言之，将可降解 RMP64 的 HEK293T 细胞培养在六孔板中，并在指定时间内用 DMSO 或 dTAG 处理。用放线菌素 D(5 )处理的细胞作为阴性对照。标记前，将细胞在补充了 10% 透析胎牛血清(Gibco，A3382001)的无磷酸盐 DMEM(Gibco，11971025)中饥饿培养 。标记时，将细胞在含有 的 -正磷酸(Revvity，NEX053H001MC)的相同培养基中孵育 。按照制造商的说明，使用 TRIzol 试剂(Invitrogen，15596018)提取总 RNA。将 RNA 样品在含有 0.4 M 甲醛/50% 甲酰胺/1 × TT 缓冲液(30 三(羟甲基)甲基甘氨酸， 三乙醇胺)/0.5 mM 乙二胺四乙酸(EDTA)的 中，于 加热 ，然后冷却至室温。将每个样品 15 微升在 1% 琼脂糖/0.4 M 甲醛/1 × TT 凝胶(15 厘米 × 15 厘米 × )上，在 TT 缓冲液中进行分离，先以 运行 ，接着以 运行 。然后使用 Bio-Rad Model 583 凝胶干燥仪将凝胶干燥 。将干燥的凝胶在放射自显影片盒(Fisher Scientific，FBAC810)中，于 下与存储磷屏(GE Healthcare，0146 - 931)过夜曝光。第二天使用 Typhoon 成像仪(Cytiva)对磷屏进行成像。
5-乙炔基尿苷标记和免疫荧光
对于新转录RNA的免疫荧光分析，用二甲基亚砜(DMSO)或dTAG处理的可被RMP64降解的HEK293T细胞用 - 乙炔基尿苷(5-EU；耶拿生物科学公司，CLK-N002-10)脉冲标记30分钟。标记后，细胞用4%甲醛固定，用基于皂素的洗涤缓冲液[0.1%皂素，0.1%牛血清白蛋白(BSA)，0.01% 于磷酸盐缓冲盐水(PBS)]通透处理，并在室温黑暗条件下与点击反应混合物(1 mM硫酸铜，43 mM Tris，129 mM氯化钠，5.6 mM抗坏血酸钠，和50 μM CalFluor 488叠氮化物；Vector Laboratories公司，1369-1)孵育30分钟。随后细胞用洗涤缓冲液( EDTA， 于PBS)洗涤一次，再用PBS洗涤一次，用5%胎牛血清(FBS)于PBS封闭，并在 用一抗孵育过夜。洗涤后，细胞在室温下用荧光染料偶联的二抗孵育 ，然后用含有DAPI的VECTASHIELD抗褪色封片剂(Vector Laboratories公司，H-1200-10)封片。使用徕卡DMi8显微镜采集图像。用放线菌素D(5 ，30分钟)处理的细胞用作阴性对照。
十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析
蛋白质印迹分析如先前所述[32]进行。简要地说，全细胞裂解物在15%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并在 转移至支持的硝酸纤维素膜(Bio-Rad公司)上1.5小时。然后膜在含有吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TBST；137 mM氯化钠，20 mM Tris，pH 7.6，0.1%吐温-20)中的 脱脂奶粉中封闭 ，用TBST冲洗三次，每次5分钟，然后在 用一抗(1:1000于3% BSA于TBST中)孵育过夜。印迹在TBST中洗涤5分钟，共三次，在含有5%牛奶的TBST中用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育 ，然后在显影前再次洗涤。通过将印迹与HRP偶联的β-肌动蛋白抗体(1:15000于5%牛奶于TBST中)孵育15分钟来检测β-肌动蛋白，然后洗涤并用SuperSignal™ West Pico PLUS化学发光底物(赛默飞世尔科技公司，34578)检测HRP信号。
免疫荧光
免疫荧光分析如先前所述[32]进行。简要地说，细胞在室温下用4%甲醛于PBS中固定10分钟，用0.5% Triton X-100于PBS中通透处理，用5%胎牛血清于PBS中封闭，并在 用一抗孵育过夜。然后细胞在室温下用荧光染料偶联的二抗孵育 ，并用含有DAPI的VECTASHIELD抗褪色封片剂(Vector Laboratories公司，H-1200-10)封片。使用徕卡DMi8显微镜拍照。
抗体
本研究使用了针对NPM1(Santa Cruz Biotechnology，sc-70392)、RPP20(Santa Cruz Biotechnology，sc-244043)、RPP40(Proteintech，11736-1-AP)、RPP21(Proteintech，16377-1-AP)、RPP25(Sigma，HPA046900-100UL)、RMP24(Sigma，HPA065505-100UL)、HA标签(Cell Signaling Technology，3724S)、FLAG标签(Sigma，F1804-200UG)、α微管蛋白(Santa Cruz Biotechnology，sc-5286)和β肌动蛋白(Sigma，A3854)的抗体。
定量聚合酶链反应(qPCR)分析
qPCR按照先前描述的方法进行[32]。简要地说，根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(赛默飞世尔科技，15596018)和Direct-zol RNA微量制备试剂盒(Zymo Research，R2050)从样品中提取总RNA。按照制造商的说明，使用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara，RR037A)从等量的RNA制备互补DNA(cDNA)。使用PowerUp SYBR Green Master Mix(赛默飞世尔科技，A25742)和补充表S2中列出的寡核苷酸引物，在CFX Connect实时PCR检测系统上于 的退火温度进行qPCR。相对mRNA水平分别以HEK293T和mESCs中人ACTB或小鼠Actb基因的表达进行标准化。
Northern分析
如前所述[6]，使用琼脂糖/甲醛凝胶进行Northern印迹分析。补充表S2中列出的所有Northern探针均为DNA寡核苷酸(赛默飞世尔科技公司产品)，按照制造商的说明，使用T4多核苷酸激酶(新英格兰生物实验室公司产品，货号M0201L)，用 γ-ATP(珀金埃尔默公司产品，货号NEG502A250UC)对其5’端进行标记。简要步骤如下:将10 - 20μg总RNA在 于 甲醛/50%甲酰胺/1×TT(30 mM三羟甲基甘氨酸，30 mM三乙醇胺)/0.5 mM EDTA中加热5分钟，在热循环仪中冷却至室温，然后在 TT中于 在1%琼脂糖/0.4 M甲醛/1×TT凝胶(15 cm×15 cm×0.5 cm)上分离 ，随后在 进行 。凝胶用去离子水冲洗，在 中轻轻摇晃浸泡 ，再次用去离子水冲洗，然后在 SSC中轻轻摇晃15分钟。RNA在室温下于 SSC中通过毛细作用转移至Hybond N + 膜(Cytiva公司产品，货号RPN203B)上，过夜。转移后，膜在1200 下交联两次，然后在 的杂交缓冲液(英杰公司产品，货号AM8670)中于 预杂交 。然后探针(ITS1_3′端，mITS1_3′端)在 与膜杂交过夜。第二天，膜依次用洗涤缓冲液1( SSC，0.1% SDS)、洗涤缓冲液2(1×SSC，0.1% SDS)和洗涤缓冲液3(0.1 SSC)各洗涤一次，每次30分钟。然后在放射自显影片盒(Fisher Scientific公司产品，货号FBAC810)中于 使用存储磷光屏(通用电气医疗集团产品，货号0146 - 931)对膜进行显影过夜。第二天，用Typhoon成像仪(Cytiva公司产品)对磷光屏进行成像。
RNA荧光原位杂交
荧光原位杂交(FISH)探针购自Integrated DNA Technologies公司，列于补充表S2中。根据www.biosearchtech.com/stellarisprotocols网站上提供的制造商说明，用菁染料Cy5或Cy3标记的RNA FISH探针检测用二甲基亚砜(DMSO)或dTAG处理的HEK293T Rmp64可降解细胞以及用siCTRL或siRMP24转染的野生型HEK293T细胞。
从细胞裂解物中进行免疫共沉淀
共免疫沉淀实验如前所述进行[32]。简要地说，收获E14小鼠胚胎干细胞，用PBS洗涤一次，并在补充了cOmplete蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Millipore Sigma，11697498001)的全细胞裂解缓冲液(20 mM HEPES-KOH，pH 7.9，10%甘油，300 mM KCl，0.1% IGEPAL，1 mM二硫苏糖醇(DTT))中于 在 裂解。通过在 以 离心30分钟清除上清液中的碎片。然后将裂解物与等体积的补充了cOmplete蛋白酶抑制剂鸡尾酒的无盐裂解缓冲液(20 mM HEPES-KOH，pH 7.9，10%甘油，0.1% IGEPAL，1 mM DTT)混合，将最终盐浓度降低至 (IP缓冲液)，加入ANTI-FLAG® M2亲和凝胶(Milli-pore Sigma，A2220)，并在 旋转 。免疫沉淀后，用IP缓冲液彻底洗涤珠子，并用 Flag(DYKD-DDDK)肽(GenScript，RP10586)在热混合器中于 洗脱结合的蛋白质，以 振荡 。通过蛋白质印迹分析洗脱物。
蛋白质复合物纯化
为了纯化Flag-HA-RPP25、Flag-HARpp25、Rpp21-3×Flag、Rmp64-3×Flag和Rmp24-3×Flag的蛋白质复合物，每次实验收获约1000万(用于抗Flag免疫沉淀)或3亿(用于抗Flag免疫沉淀后再进行抗HA免疫沉淀)个HEK293T细胞或E14小鼠胚胎干细胞，在液氮中速冻，并储存在 直至使用。将细胞重悬于缓冲液A(20 mM HEPES-KOH，pH 7.9，10%甘油，300 mM KCl，0.1% IGEPAL，1 mM DTT，完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒；每 个细胞使用 的缓冲液A)中，并在 旋转 。将裂解物在 以 离心 ，收集上清液，然后加入 抗Flag® M2亲和凝胶(Millipore Sigma，A2220)，混合物在 旋转 。然后用缓冲液1(20 mM HEPES-KOH，pH 7.9，10%甘油，300 mM KCl，0.1%吐温-20，1 mM DTT，完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒)洗涤亲和凝胶四次，接着用缓冲液2(20 mM HEPES-KOH，pH 7.9，10%甘油，150 mM KCl，0.1%吐温-20，1 mM DTT，完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒)洗涤四次。用Flag肽(150μg/ml；GenScript，RP10586)在热混合器中于 洗脱结合的蛋白质，以 振荡 。通过质谱分析洗脱的蛋白质。对于串联亲和纯化，将Flag洗脱液与抗HA磁珠(Thermo Fisher Scientific，88837)混合，并在 旋转 。磁珠用缓冲液2洗涤四次，通过在热混合器中以1400 rpm振荡磁珠在 以 使用HA肽(200μg/ml；GenScript，RP11735)洗脱蛋白质。然后通过质谱分析洗脱的蛋白质。
免疫沉淀质谱分析
将洗脱样品的一半与 二硫苏糖醇(DTT)和5%十二烷基硫酸钠(SDS)混合，然后在 下孵育 ，以使蛋白质还原和变性。按照SP3样品制备方法[33]，向样品中加入SP3磁珠和100%乙腈以沉淀蛋白质。用纯乙腈和70%乙醇分别洗涤SP3磁珠两次以纯化样品。将它们用 三乙胺碳酸氢盐重悬。样品在 胰蛋白酶 存在下于 过夜消化。将胰蛋白酶消化后的样品干燥浓缩，并在 中用 甲酸(FA)重悬。对于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析，每个样品的 通过与nLC Vanquish Neo超高效液相色谱联用的Exploris 480质谱仪进行分析。使用 柱(Aurora Ultimate C18 )分离肽段。流速为 ，采用70分钟梯度(65分钟有效梯度)。溶剂A为水中含0.1% FA，溶剂B为含 的80%乙腈，在 中。梯度步骤如下:(i)在65分钟内从14%升至36%以分离胰蛋白酶肽段；(ii)用 的B冲洗5分钟以去除柱上残留。
基于串联质谱(MS/MS)的蛋白质组学数据在以数据依赖采集(DDA)模式运行的Orbitrap Exploris 480质谱仪上采集。离子源在正离子模式下以 喷雾电压运行。离子传输管的温度为 。全扫描参数如下:MS1扫描分辨率为120000，扫描范围为350 - 1200 m/z；最大进样时间自动模式；标准自动增益控制(AGC)目标。选择强度阈值为 、电荷态为+2至+5的前体进行碎裂，排除持续时间为 。数据依赖的MS2扫描以 的循环时间进行。MS2扫描设置为 隔离窗口、36%高能碰撞解离(HCD)碰撞能量、45000分辨率、最大进样时间自动模式和200% AGC目标。
原始数据用MaxQuant(v2.6.1.0)进行分析。从小鼠蛋白质数据库UniProt(2025)下载数据。对于胰蛋白酶肽段，最大错切数设置为2。添加氧化(M)和乙酰化(蛋白质N端)作为可变修饰。每个肽段的最大修饰数设置为5。在将肽段汇总为蛋白质之前，应用5%的肽段错误发现率(FDR)和5%的蛋白质FDR。
RNA免疫沉淀和定量PCR
简要地说，将表达野生型(WT)、Rpp14 - 3×Flag、Rpp21 - 3×Flag、Rmp64 - Flag和Rmp24 - 3 Flag的小鼠胚胎干细胞(mESCs)接种于10厘米培养皿中，当细胞密度达到80%时收获，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，并以1200转/分钟的转速离心5分钟以形成细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于 预冷的缓冲液A(20 mM HEPES - KOH，pH 7.9，10%甘油，300 mM KCl，0.1% IGEPAL，1 mM二硫苏糖醇(DTT)，完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒)中，并在 下旋转 。将裂解物在 下以 在 离心，收集上清液，取 等份与 的TRI试剂混合，并在 保存作为输入对照。将剩余的裂解物与 的抗Flag® M2亲和凝胶(密理博西格玛，A2220)混合，并在 下旋转 。然后用缓冲液1(20 mM HEPES - KOH，pH 7.9，10%甘油，300 mM KCl，0.1%吐温 - 20，1 mM DTT，完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒)洗涤亲和凝胶四次，接着用缓冲液2(20 mM HEPES - KOH，pH 7.9，10%甘油，150 mM KCl，0.1%吐温 - 20，1 mM DTT，完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒)洗涤四次。用Flag肽(150μg/ml；金斯瑞，RP10586)在热混合器中于 洗脱结合的核糖核蛋白(RNPs)，以1250转/分钟振荡 。对于每个样品，取 的Flag洗脱液与500 l的TRIzol试剂(赛默飞世尔，15596018)混合，并在 保存。根据制造商的说明，使用Direct - zol RNA微量制备试剂盒(Zymo Research，R2050)分离RNA。按照制造商的说明，使用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara，RR037A)从等量的RNA制备cDNA。在CFX Connect实时PCR检测系统上，使用PowerUp SYBR Green Master Mix(赛默飞世尔，A25742)和补充表S2中列出的寡核苷酸引物，在 的退火温度下进行定量聚合酶链反应(qPCR)。将相对RNA水平标准化为肌动蛋白基因的表达水平。通过将从亚基过表达细胞中纯化的RNA中Rpph1和Rmrp的水平标准化为输入，并将其与非过表达(WT)细胞中的富集水平进行比较，来定量它们的相对富集。
AlphaFold预测方法和Foldseek搜索
使用AlphaFold 2 [34]通过谷歌Colab笔记本(https://colab.research.google.com/github/ sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb)[35]，采用默认参数，但指定使用Amber松弛所有预测结构，生成核糖核酸酶P(RNases P)或线粒体RNA加工酶(MRP)单个蛋白质亚基的预测。使用AlphaFold3 [36](https://alphafoldserver.com/welcome)采用默认设置生成人类RNase MRP的预测。在提供RNases P或MRP亚基的全长序列后，预测十个结构，并与ChimeraX [37]进行比对以评估预测的收敛性。ChimeraX也用于制备所有结构图形。
我们使用了Foldseek网络界面(https://search.foldseek.com/search)[38]，以酿酒酵母Rmp1和Snm1蛋白的实验确定结构(PDB: 7C7A)[7]作为查询。
单核苷酸分辨率紫外线交联和免疫沉淀
所有iCLIP实验均按照iCLIP2方案[39]重复进行。简要地说，稳定表达Flag标签的Rmp64、Rpp14、Pop5或Rpp21的E14小鼠胚胎干细胞在10厘米培养皿中培养，当汇合度达到85%时收获。细胞用冰冷的PBS洗涤，并在冰上以 的紫外线照射。照射后的细胞刮下，分装到三个 管中，并在 以 离心 。去除上清液，细胞沉淀在液氮中速冻，并储存在 直至使用。使用抗Flag抗体(Millipore Sigma, F1804)对交联的RNP复合物进行免疫沉淀。完整的iCLIP实验，包括对制备的cDNA文库进行深度测序，每个亚基重复进行四次。
iCLIP数据处理
iCLIP数据的处理基本上与之前描述的[40]相同。使用FastQC(v0.11.9, https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)评估数据质量，并使用FASTX Toolkit(v0.0.13, http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/.参数: -Q 33 -q 10 -p 100)提供高质量数据。利用Flexbar(v3.5.0)[41, 42]根据索引对数据进行解复用，然后使用STAR基因组比对器v2.7.3a[43]将其映射到mm10基因组。使用Umi_tools v1.0.1[44]去除PCR重复。使用PureCLIP v1.3.1(参数: -ld -nt 8)[45]识别高置信度交联位点。如前所述[40]，保留在至少两个重复中识别的交联位点，并将其扩展到 -nt区域。使用GENCODE(vM25)综合基因注释对结合位点进行注释。使用bedtools v2.31.1[46]通过将读取向上游移动1个核苷酸来识别真正的交联位点，并通过以RPM(每百万读取数)对整个文库进行归一化来生成Bigwig文件。图中所示的IGV版本2.9.4[47, 48]轨迹是所有四个重复的总结。核糖核酸酶MRP特异性峰是在Rmp64、Rpp14和Pop5中识别的峰，但不在Rpp21 iCLIP数据集中，而核糖核酸酶P特异性峰是在Rpp21、Rpp14和Pop5中识别的峰，但不在Rmp64 iCLIP数据集中。
基因命名法
与HUGO基因命名委员会(HGNC)协调，我们提议并获得批准将NEPRO正式命名为RMP64(HGNC:56 432)，将C18orf21命名为RMP24(HGNC:56 433)。这些新符号反映了它们与核糖核酸酶MRP的特定关联(例如，RMP24代表核糖核酸酶MRP亚基p24)，并遵循核糖核酸酶P/MRP亚基的既定惯例。在这次咨询过程中，我们还提议重新命名唯一已知的核糖核酸酶P特异性亚基RPP21，HGNC批准将其名称从“核糖核酸酶P/MRP亚基p21”更改为“核糖核酸酶P亚基p21”。
RPP根符号本身是在20世纪90年代末引入的，用于命名几个缺乏已确定酵母同源物的核糖核酸酶P亚基。值得注意的是，Eder等人[49]和Jarrous等人[50]首先在人类中使用基于Rpp的命名法来描述现在所知的RPP20(POP7的别名)、RPP30、RPP38和RPP40。他们还指出Rpp14和Rpp25编码假定的核糖核酸酶P亚基，后来的其他研究[51,52]证实了这一点。此后，HGNC采用了RPP根符号来表示六个亚基:RPP14/RPP21/RPP25/RPP30/RPP38和RPP40。其余四个人类亚基——POP1/POP4/POP5和POP7——是根据它们与酵母POP基因(“前体RNA的加工”)的明显同源性命名的。
当核糖核酸酶P和核糖核酸酶MRP共享多个亚基变得明显时[53]，HGNC更新了共享亚基的基因名称(但不是符号)以反映这一点(例如，RPP14，以前是“核糖核酸酶P亚基p14”，变成了“核糖核酸酶P/MRP亚基p14”)。相比之下，RMP根符号保留用于编码核糖核酸酶MRP特有的亚基的基因。虽然RMP符号是新用于人类基因的，但它并不是新出现的:酵母核糖核酸酶MRP特有的亚基Rmp1在2005年在酿酒酵母中被命名[26]，这提供了先例和进化连续性。
HGNC维护经过策划的基因组页面，列出核核糖核酸酶P(https://genenames.org/data/genegroup/#!/group/3374)、核糖核酸酶MRP(https://genenames.org/data/genegroup/#!/group/3375)复合物的亚基。
我们还注意到另外两个小组大约在同一时间报告了RMP24和RMP64的发现[54,55]。此外，Ming Lei小组通过对人类核糖核酸酶MRP的综合结构研究独立鉴定出了相同的亚基。为了尽量减少混淆并统一该领域，我们通过HGNC协调了这些基因的命名。
结果
结构同源性鉴定后生动物核糖核酸酶MRP的两个新候选亚基
最近在酿酒酵母中的冷冻电镜研究揭示了核糖核酸酶P和核糖核酸酶MRP核糖核蛋白之间相当大的整体结构相似性，以及从它们的共同祖先继承下来的保留的催化RNA核心(图1B)[7,18]。此外，这些分析揭示了新RNA元件以及两个蛋白质亚基Rmp1和Snm1的纳入，这有助于将酵母核糖核酸酶MRP确立为一种具有与核糖核酸酶P不同底物特异性的酶。尚不清楚酵母核糖核酸酶MRP特异性蛋白质的假定直系同源物是否可能是后生动物核糖核酸酶MRP的组成部分。
由于基于序列搜索Rmp^{1}或Snm^{1}的人类直系同源物未发现明显候选物，我们询问基于它们的结构同源性是否可能存在此类蛋白质。我们使用Foldseek在核糖核酸酶MRP中的两种酵母蛋白质的冷冻电镜结构中查询数千种实验确定或计算预测的蛋白质结构[38]。该搜索确定，在所检查的所有后生动物物种中，研究较少的核仁蛋白NEPRO的N端螺旋束明显是与酵母Rmp^{1}最接近的结构匹配物，尽管氨基酸序列保守性有限(图1C和补充图S1A和B)。对酵母Snm^{1}蛋白质的类似搜索揭示了与两个人类蛋白质的最广泛同源性:核糖核酸酶P特异性亚基RPP21和一种未表征的蛋白质C18ORF21(图1D)。有趣的是，在酵母中，核糖核酸酶MRP特异性的Snm^{1}在结构上与核糖核酸酶P特异性的Rpr2最同源(补充图S1C)，并且这两种蛋白质在它们的核糖核蛋白复合物中在Pop4和Pop3之间的位置相似(图1B)[7,18]。因此，RPP21及其同源物C18ORF21分别在后生动物核糖核酸酶P和核糖核酸酶MRP中占据相同的相对位置是合理的(补充图S1D - F)。我们向HGNC提议了基因符号RMP64(用于NEPRO)和RMP24(用于C18ORF21)，HGNC正式批准了这些命名。在本文的其余部分使用此命名法(见“材料和方法”部分)。
我们使用AlphaFold生成了与人类核糖核酸酶MRP先前注释的亚基复合的人类RMP64和RMP24的结构预测(补充图S2A)[3]。这些预测表明，包括RMP64和RMP24在内的十二个蛋白质亚基依次相互接触，并紧密包裹在RMRP周围，这与酵母核糖核酸酶MRP的直系同源蛋白相互连接以稳定酵母核糖核酸酶MRP催化RNA Nme1的方式非常相似(图1B和补充图S2A)[7, 18]。然而，与酵母中核糖核酸酶MRP的钩状结构不同，人类核糖核酸酶MRP的预测一致表明，RNP的构象更加封闭、刚性，这是由RMP64和RMP24与RMRP以及它们彼此之间的广泛相互作用所稳定的(补充图S2A - C)。此外，所有预测都表明，人类RMRP和酵母Nme1中催化(C)结构域的结构几乎相同，同时表明这两个物种之间特异性(S)结构域的拓扑结构完全不同(补充图S2D)[3, 7, 18, 59]。
将酿酒酵母核糖核酸酶MRP全酶的冷冻电镜结构与其人类对应物的结构预测进行比较，结果表明，两种核糖核酸酶MRP特异性亚基整合到酶中的方式存在显著相似性。在人类和酵母中，RPP29/Pop4的延伸N端结构域围绕着RMP64/Rmp1螺旋束的一侧，而POP1/Pop1从相反侧接触该束(图1E和补充图S2A)。所有生成的预测进一步表明RMP64与RMRP之间存在紧密相互作用，并将RMP64定位在催化RNA假结的顶部(图1E和补充图S2C)。这类似于酵母核糖核酸酶MRP中Rmp1的位置，它形成底物结合凹槽的一部分，并有助于识别单链RNA底物(补充图S2B)[7, 18]。在酶的另一端，Snm1在酵母中与Pop4和Pop3相互作用的方式与预测的RMP24在人类中与RPP29和RPP38相互作用的方式相似(图1B和F，以及补充图S2A)。然而，与Snm1与酵母核糖核酸酶MRP RNA的相互作用相比，预测表明RMP24与人类核糖核酸酶MRP RNA之间的接触要广泛得多(图1F和补充图S2B和C)。
这些分析共同确定了后生动物核糖核酸酶MRP的两个新候选亚基，并预测了它们在核糖核蛋白中的特定结构作用。
RMP64和RMP24是核糖核酸酶MRP的组成成分，但不是核糖核酸酶P
为了确认RMP64和RMP24在核糖核酸酶MRP中的预测亚基状态，我们试图在人和小鼠细胞中验证每种蛋白质与该酶已知亚基的关联。我们使用亲和纯化质谱法(AP-MS)来富集和检测与不同异位表达的带标签的核糖核酸酶P和/或核糖核酸酶MRP亚基稳定结合的蛋白质，我们将这些亚基用作诱饵。对HEK293T或小鼠胚胎干细胞(mESCs)中由共同亚基RPP25形成的复合物进行串联AP-MS分析，发现在高度富集且特异性富集的蛋白质中，有所有注释为两种酶共有的亚基、核糖核酸酶P特异性的RPP21，以及RMP64和RMP24(图2A和B)。这些蛋白质在我们从mESCs中纯化的其他复合物中也有过度表达，只是在以Rmp64或Rmp24为核心的复合物中未检测到Rpp21，反之亦然，在Rpp21复合物中未检测到Rmp64或Rmp24(图2C - E)。我们使用免疫共沉淀/蛋白质免疫印迹分析来验证Rmp64和Rmp24的共存，但在同一蛋白质复合物中未检测到Rpp21(图2F)。
图1. 结构同源性鉴定出后生动物核糖核酸酶MRP的两个新候选亚基。(A) 示意图，显示注释的核糖核酸酶MRP切割位点在47S前体rRNA的ITS1内的位置。(B) 酵母核糖核酸酶P(PDB: 6AH3，左)、酵母核糖核酸酶MRP(PDB: 7C79，中)和人核糖核酸酶P(PDB: 6AHR，右)的低温电子显微镜(cryo-EM)结构，以及酵母和人中已知的核糖核酸酶P和核糖核酸酶MRP亚基列表。标签(P)或(MRP)分别表示核糖核酸酶P或核糖核酸酶MRP特有的亚基。(C, D) Foldseek分别将人RMP64和RMP24鉴定为酵母Rmp1和Smn1的结构同源物。使用Rmp1(C)和Smn1(D，两者PDB: 7C7A)的低温电子显微镜结构作为查询。显示了人RMP64和RMP24收敛片段的10个AlphaFold2(AF2)预测的叠加。还使用每种蛋白质的相同片段(一个AF2预测)将它们与Rmp1和Snm1的低温电子显微镜结构进行比对，如图所示。(E) 酵母Rmp1与Pop1、Pop4和Nme1相互作用的界面(PDB; 7279，上)与10个人RMP64与POP1、RPP29和RMRP相互作用的AlphaFold3(AF3)预测(下)的比较。使用pnenel(B)中列出的所有人亚基、RMP64和RMP24的全长序列生成了10个人核糖核酸酶MRP的AF3预测。预测在RMP64上进行比对。仅显示RMP64及其相互作用亚基的收敛片段。(F) 与图(E)相同，但显示酵母Smn1与Pop4、Pop3和Nme1相互作用的界面(PDB: TC79，左)与人RMP24与POP1、RPP29和RMRP相互作用的10个AF3预测(右)的比较。人核糖核酸酶MRP的预测在RMP24上进行比对，仅显示RMP24及其相互作用亚基的收敛片段。
图2. RMP64和RMP24是核糖核酸酶MRP而非核糖核酸酶P的组成成分。在HEK 2937细胞(A)和小鼠胚胎干细胞(mESCs)(B)中，对串联亲和纯化的蛋白复合物(抗Flag免疫沉淀后进行抗HA免疫沉淀)中检测到的每种蛋白质的汇总强度进行质谱分析的结果，该复合物来自RPP25和mock对照。核糖核酸酶P共有的核糖核酸酶MRP蛋白亚基用红色突出显示，核糖核酸酶P特有的RPP21用绿色突出显示，两个新鉴定的核糖核酸酶MRP特有的亚基RMP64和RMP24用蓝色突出显示。在mESCs中，对RMP64(C)、RMP24(D)或Rpp21(E)和mock对照的亲和纯化蛋白复合物(抗Flag免疫沉淀)中检测到的每种蛋白质的丰度进行质谱分析的结果。核糖核酸酶P和MRP的蛋白亚基如(A)和(B)图中那样突出显示。(F) 从稳定表达 Flag-Rmp64的mESCs裂解物中，内源性核糖核酸酶P和/或MRP蛋白亚基与Rmp64的共免疫沉淀。通过蛋白质印迹分析检测沉淀的蛋白质。(G) 对来自mESCs裂解物中与Flag标签的Rpp21、Rpp14、Rmp64或Rmp24共沉淀的Rmrp和Rpph 1进行RNA免疫沉淀(RIP)分析。使用定量聚合酶链反应(qPCR; )确定每个RIP实验中Rmrp或Rpph1相对于野生型(WT)对照的相对倍数变化。数据表示为平均值 标准差。*, ; **, (双尾学生 检验)；ns，无显著性差异。
鉴于核糖核酸酶P和线粒体RNA加工酶(MRP)分别使用不同的催化RNA分子，即RPPH1和RMRP，我们推断任何线粒体RNA加工酶特异性蛋白质亚基应优先与后者结合。值得注意的是，对小鼠胚胎干细胞(mESCs)中的Rmp64或Rmp24进行的RNA免疫沉淀(RIP)分析显示，与Rpph1相比，这两种蛋白质对Rmrp的结合偏好压倒性地强，而Rpp21对Rpph1表现出预期的特异性(图2G)。因此，Rmp64和Rmp24与所有已知的线粒体RNA加工酶亚基以及它们彼此之间和与线粒体RNA加工酶RNA的强关联，支持了我们的结构分析，并将Rmp64和Rmp24鉴定为后生动物线粒体RNA加工酶的特异性蛋白质亚基。
线粒体RNA加工酶在体内的RNA结合特异性
我们询问新鉴定的亚基与线粒体RNA加工酶而非核糖核酸酶P的特异性结合是否可用于阐明线粒体RNA加工酶在哺乳动物细胞中的RNA靶向特异性。我们认为在酵母中，前体核糖体RNA(pre-rRNA)的ITS1区域的短单链片段——酵母线粒体RNA加工酶的已知底物——除了与Nme1 RNA相互作用外，还通过与几个蛋白质亚基的直接接触深入酶的催化中心(图1A和补充图S2B)[7]。事实上，一项关于酵母线粒体RNA加工酶结构组织的早期研究表明，可以使用紫外线介导的交联在体外成功捕获其蛋白质亚基与底物RNA之间的许多相互作用[22]。为了在体内检测哺乳动物线粒体RNA加工酶潜在的蛋白质-RNA底物相互作用，我们对小鼠胚胎干细胞中标记的核糖核酸酶P和/或线粒体RNA加工酶亚基进行了单核苷酸分辨率紫外线交联和免疫沉淀(iCLIP)[39, 60]。
我们通过使用严格但非变性的条件实现了与RNA交联的大多数核糖核蛋白(RNP)蛋白质亚基的共纯化，先前已证明这些条件可保留相对稳定的小核核糖核蛋白(snRNP)复合物(补充图S3A)[6l]。高浓度的盐和去污剂使弱结合蛋白质的共纯化最小化，但保留了核糖核酸酶P或线粒体RNA加工酶更稳定的亚基间相互作用，这从iCLIP实验之间模式相似的多个放射性条带中可以明显看出(图3A和补充图S3A)[39, 61]。我们从广泛分布的交联RNP复合物中制备了cDNA文库，以最大限度地提高回收的蛋白质-RNA相互作用的多样性(补充图S3A)。
数据分析揭示了数千种蛋白质-RNA相互作用，其中大多数在每个iCLIP数据集中都具有高重现性(补充图S3B)。具有最多独特交联事件的结合位点均匀地位于核糖核酸酶P和/或线粒体RNA加工酶的催化RNA上，来自Rmp64 iCLIP的交联选择性地映射到Rmrp，来自Rpp21 iCLIP的交联映射到Rpph1，而对Rpp14或Pop5的分析显示它们与两种催化RNA都有强结合(图3B)。对与Rmrp或Rpph1交联的进一步检查揭示了不同iCLIP数据集中复杂但非常相似的RNA结合模式，这与捕获的全RNP范围而非仅仅亚基特异性的蛋白质-RNA相互作用一致(图3C和补充图S3A)。为了将一个交联峰归因于核糖核酸酶P或线粒体RNA加工酶，我们要求它在(i)四个独立的iCLIP数据集中的恰好三个中被检测到，并且(ii)在一个但不是两个酶特异性亚基数据集中被检测到，即Rpp21或Rmp64但不是两者都被检测到(图3A)。这一要求通过忽略那些非特异性的(例如由于高表达转录本的偶然结合而在每个iCLIP数据集中被检测到)或特定于亚基但不是RNP复合物的(例如Rmp64可能在线粒体RNA加工酶之外的细胞中出现并且可能独立结合RNA)[56]结合位点，确保了结合位点的有效性。
除了催化RNA的结合外，我们还检测到核糖核酸酶P和MRP与其他几种RNA的相互作用，包括rRNA、tRNA和mRNA，以及不同类型的短链和长链非编码RNA(图3B、补充图S3C和D以及补充表S1)。为了评估这些相互作用在多大程度上可能表明核糖核酸酶P和MRP对特定RNA底物的识别，我们首先检查了每种酶与其已知RNA靶标的结合情况。我们发现，Rpp14、Rpp21和Pop5，但不是Rmp64，iCLIP cDNA广泛映射到tRNA长度上的多个位置，这与前体tRNA是核糖核酸酶P而非核糖核酸酶MRP的主要底物一致(图3D、补充图S3E和补充表S1)[3,5,62]。这包括在注释的成熟tRNA片段上游正好有一个突出的交联峰，这与不同生物体中核糖核酸酶P的结构研究一致，这些研究显示或预测了在催化中心与前体tRNA底物的 前导序列有关键的蛋白质相互作用[20,21]。我们还研究了与核糖核酸酶P的另一种已记录的RNA底物Malat1的相互作用，其保守的三螺旋 末端是由核糖核酸酶P识别和切割类似tRNA的结构产生的[63,64]。令人惊讶的是，我们在 -kb Malat1转录本上发现了一个主要的核糖核酸酶P特异性结合位点，正好位于一个短的富含A的区域内注释的核糖核酸酶P切割位点处(补充图S3F)。
虽然核糖核酸酶P主要根据底物的形状并作为分子尺子来识别其底物[20,21,65]，但除了它对酵母中一个宽松定义的共有序列5’-*RCRC-3’(其中*是切割位点，R是一个非必需嘌呤)的偏好外，关于核糖核酸酶MRP对底物的识别仍然知之甚少，其中+4位的胞嘧啶特别重要[7,23]。为了判断iCLIP是否像在核糖核酸酶P的情况下那样，根据交联模式识别核糖核酸酶MRP底物，我们检查了前体rRNA，它是哺乳动物细胞中唯一真正的核糖核酸酶MRP底物(图1A)[6]。尽管背景信号很高，但我们基于Rmp64、Rpp14和Pop5但不是Rpp21的iCLIP数据集中存在的峰，在13-kb前体rRNA转录本上确定了一个单一的核糖核酸酶MRP特异性交联位点(图3E)。值得注意的是，这个位点位于1-kb ITS1片段中，在5.8S rRNA上游145个核苷酸处，靠近小鼠中核糖核酸酶MRP切割位点的先前映射以及人类前体rRNA中的直系同源序列(图1A和3E)[1,6,66-68]。
我们还注意到，ITS1中交联位点紧下游的RNA序列可能满足已报道的酵母核糖核酸酶MRP的底物识别要求，相对于+1位的峰，在+2和+4位含有胞嘧啶(图3E)[7,23]。事实上，对所有确定的核糖核酸酶P或核糖核酸酶MRP特异性结合位点的考虑表明，后者在结合峰紧下游的富含U/C的基序中明显富集，在+4位显示出最大富集，而核糖核酸酶P特异性峰没有这种趋势(图3F)。该分析表明，iCLIP可能像在已知RNA底物的情况下一样(图3D和E以及补充图S3E和F)，在候选RNA底物的切割位点处捕获交联(图3F)。未来的研究有必要调查所确定的靶RNA的潜在核糖核酸酶P或MRP依赖性切割，以及这种切割事件的生物学意义。
RMP64和RMP24是哺乳动物核糖核酸酶MRP进行前体rRNA加工所必需的
为了解RMP64和RMP24对哺乳动物核糖核酸酶MRP酶活性的贡献，我们评估了它们在人或小鼠细胞中缺失的影响。我们使用条件性dTAG方法通过靶向蛋白质降解快速且几乎完全去除了RMP64，而我们通过siRNA介导的基因沉默最有效地耗尽了RMP24(图4A和B)[31, 69]。正如从绝大多数定位于核仁的核糖核酸酶MRP的亚基所预期的那样，这两种蛋白质都明显定位于核仁[70, 71]，尽管在HEK293T细胞中耗尽它们时，两者对核仁大小或数量均未产生任何明显影响(图4C和D)。此外，RMP64或RMP24的缺失导致RMRP水平大幅下降，但RPPH1水平未下降(图4E - G)，这与预测的两种蛋白质各自在核糖核酸酶MRP核糖核蛋白复合物中与RMRP形成的直接稳定相互作用一致(图1E和F，以及补充图S2C)。
图3. 核糖核酸酶P和MRP的体内RNA结合特异性(A)用于确定核糖核酸酶P和MRP的RNA结合特异性的iCLIP策略的示意图(B)每个iCLIP数据集中的前RNA结合位点。显示了具有最高独特cDNA标签数量(每个结合位点)的40个结合位点，按标签计数从左到右排序。显示了各个结合位点的Gencode vM25注释。(C)每个iCLIP数据集中显示的Rmrp和Rpph1上的交联图谱。每条轨迹中的数字是每百万值的计数。(D)iCLIP数据的比例元转录本分析，显示tRNA上交联事件的位置频率。数据点表示在tRNA长度的每百分比上汇总的标准化交联事件。RPM，每百万读数。(E)小鼠Rn45S转录本(NR_046233.2)的ITS1片段中的交联图谱，突出显示了唯一的核糖核酸酶MRP特异性位点(红色矩形)及其与5.8S rRNA的距离。先前绘制的核糖核酸酶MRP切割位点在小鼠转录本(灰色箭头)[68]和人类转录本的直系同源部分(灰色矩形)[6, 67]上分别表示。黄色矩形和黑色虚线箭头分别表示推定的核糖核酸酶MRP共有识别序列和切割位点。(F)热图显示核糖核酸酶P(左)和核糖核酸酶MRP(右)结合位点最大值下游10个核苷酸处所示三聚体集合的位置频率。热图上方的图描绘了不同三聚体集合的平均富集情况。
我们询问关键核糖核酸酶MRP底物前体rRNA的加工是否也受到影响。使用扩增跨越ITS1中核糖核酸酶MRP切割位点区域的引物对核RNA进行qPCR分析发现，在核糖核酸酶P特异性RPP21蛋白缺失时差异不大，但表明当RMP64或RMP24缺失时切割严重受损(图4H和补充图S4A)。Northern印迹分析证实，在HEK293T和mES细胞中RMP64缺失时早期前体rRNA加工受阻，显示47S/45S rRNA和其他rRNA前体的积累，这与核糖核酸酶MRP对ITS1片段切割缺陷一致(图4I和补充图S4B)[6, 72]。通过荧光原位杂交分析也观察到了ITS1保留前体rRNA的积累，这是由其以降低的速率持续转录驱动的(补充图S4C和D)，该分析揭示了RMP64缺失细胞的核仁中ITS1信号大幅增加(补充图S4E)。
最后，我们发现RMP64或RMP24的快速缺失导致增殖停滞，但在实验结束前的几天内保持细胞活力(补充图S4F和未显示的数据)。观察到的持久细胞活力与先前的研究一致，这些研究表明通过抑制rRNA生物合成(包括通过抑制rRNA转录和下游加工)而停滞的细胞能够长期存活[73 - 77]。综上所述，我们的结构分析(图1)、蛋白质 - 蛋白质和蛋白质 - RNA相互作用研究(图2和3)以及体内功能研究(图4)阐明了后生动物中核糖核酸酶MRP的组成和功能，为更好地理解这种基于RNA的RNA加工关键调节因子铺平了道路。
讨论
尽管后生动物核糖核酸酶MRP在核糖体RNA(rRNA)加工中起着关键作用，具有古老的进化起源，且与一系列严重使人衰弱的疾病相关，但它仍然是一种组成和底物特异性尚不清楚的酶。我们发现了两种后生动物特异性的核糖核酸酶MRP蛋白亚基，RMP64和RMP24，它们在整个后生动物中保守，这为核糖核酸酶MRP的结构和功能表征提供了关键的分子切入点。这包括解决一个长期存在的问题，即区分核糖核酸酶MRP与其结构和进化上密切相关的核糖核酸酶P的蛋白质组成。为了进行这些研究，我们生成了可快速、按需耗尽核糖核酸酶P或MRP的细胞系，以及一个带有每种酶注释交联位点的候选RNA底物数据库。
我们确定人类核糖核酸酶MRP的两个亚基RMP64和RMP24分别是酵母Rmp1和Snm1最接近的预测结构同源物，尽管序列保守性较差。事实上，直系同源亚基之间的相似性仅限于将每个酵母亚基锚定到核糖核酸酶MRP复合物中的结构元件:RMP64/Rmp1中的N端四桶束以及RMP24/Snm1中的N端螺旋和β折叠(图1C和D)。值得注意的是，相同的结构元件一直被预测以与酵母复合物中相当的相对位置将RMP64和RMP24锚定到人类核糖核酸酶MRP复合物中，并促进与相邻亚基和催化RNA的许多相似相互作用(图1E和F，以及补充图S2B和C)。然而，预计RMP64(其大小是酵母中Rmp1的两倍多)和RMP24与催化RNA形成的接触比它们的酵母对应物要广泛得多(图1F和补充图S2B和C)，并且它们直接相互作用以“封闭”该酶的一般钩状结构(图1B和补充图S2A)[7, 18]。我们预测这些后生动物特异性的蛋白质 - RNA相互作用有助于催化RNA的稳定，这与哺乳动物细胞中RMP64或RMP24耗尽的影响一致(图4)。因此，核糖核酸酶MRP从其与核糖核酸酶P的最后一个共同祖先进化而来，似乎延续了在真核生物中逐渐变得更大且蛋白质含量更高的轨迹(图1B和补充图S2A)[7, 78]。
关于核糖核酸酶MRP的生物学功能，一个紧迫的问题围绕着其RNA靶向库。尽管在酵母中已鉴定出两种mRNA底物 ，但由于缺乏对该酶组成的了解以及它与核糖核酸酶P共享已知蛋白质亚基，因此在高等生物中了解核糖核酸酶MRP的RNA结合特异性变得复杂[3]。我们通过将鉴定核糖核酸酶MRP特异性蛋白质亚基与iCLIP相结合来规避这些问题，以便在全转录组范围内发现核糖核酸酶P或核糖核酸酶MRP特异性RNA结合位点(图3A)[39, 60]。引人注目的是，该分析不仅捕获了核糖核酸酶P(tRNA和Malat1)和核糖核酸酶MRP(前体rRNA)的已知RNA底物，而且在每种情况下还精确地在预期的切割位点指向一个突出的交联峰(图3D、E和补充图S3F)。这一结果表明，在每种酶的催化核心处，蛋白质亚基与RNA底物在体内具有特别高效的交联，这与酵母核糖核酸酶MRP的体外交联实验结果一致[22]。推广到我们所有鉴定出的核糖核酸酶MRP靶位点，这种交联偏好将指向哺乳动物核糖核酸酶MRP的富含嘧啶的共有序列(图3E和F)，假设为5’-*YCYC-3’(其中*是潜在的切割位点， 是非必需嘧啶)，这与为酵母核糖核酸酶MRP确定的 -*RCRC-3 共有序列形成对比[7, 22]。
我们将Rmrp和Rpph1鉴定为结合最紧密的RNA分子，在一些最强结合位点映射到超过一百万个独特的iCLIP cDNA(图3B)。尽管这样的读取深度可能看起来过高，但为了可靠地鉴定许多较弱的交联RNA靶标，这是必要的。奇怪的是，一些最强的交联峰位于三个核糖核酸酶P RNA样基因Rprl1 - 3的转录本上，它们与Rpph1同源但比Rpph1短(图3B)[80, 81]。尽管这些转录本尚未进行功能表征，但它们以高度组织特异性的方式表达，并且推测与核糖核酸酶MRP一样，代表核糖核酸酶P功能多样化的一个例子[80, 81]。我们关于Rprl1 - 3转录本与核糖核酸酶P的多个亚基在体内结合但不与核糖核酸酶MRP特异性的Rmp64结合的证据表明所形成的核糖核蛋白具有功能潜力。这是值得注意的，因为在包括人类在内的其他高等脊椎动物中也发现了RPPH1以及RMRP的同源物[80, 81]。
图4. 哺乳动物核糖核酸酶MRP在rRNA前体加工过程中需要RMP64和RMP24。(A) 使用dTAG系统[31, 69]在HEK293T细胞(左)或mESCs(右)中对HA标记的RMP64进行快速蛋白亚基耗竭改造。在通过免疫印迹分析之前，HEK293T细胞用dTAG处理48小时，mESCs按所示处理。肌动蛋白用作上样对照(n = 3)。(B) 在转染后2天使用siRNA在HEK293T细胞中耗竭RMP24( )。(C) 用二甲基亚砜(DMSO)或dTAG处理2天后，使用抗HA抗体通过免疫荧光分析(A)组中的工程化HEK2937细胞。分别使用靶向内源性核磷蛋白(NPM1)和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗体来可视化核仁和细胞核。(D) 与(C)组一样，只是在分析前用siRNA在野生型HEK293T细胞中耗竭RMP24 2天。(E - G) 如(C)组中RMP64的耗竭或如(D)组中RMP24的耗竭会降低RMRP的稳态水平，但不会降低RPPH1的稳态水平。通过定量聚合酶链反应(qPCR)(E)或荧光原位杂交(FISH)(F, G)分析细胞(n = 3)。(E)组中的数据表示为平均值 标准差。(H) 对缺乏RPP21、RMP64或RMP24的细胞(n = 3)中rRNA前体的核糖核酸酶MRP靶向位点进行qPCR分析。数据表示为平均值 标准差。(I) 急性耗竭RMP64后人细胞中rRNA前体加工中间体的Northern印迹分析。对经过dTAG诱导的RMP64降解改造的HEK293T细胞用DMSO或dTAG处理1或2天。提取总RNA并使用针对5′外部转录间隔区(5’ETS)、ITS1的5’端、ITS1的中间、ITS1的3’端和ITS2的探针进行Northern印迹分析，如示意图(左)所示。黑色条代表典型的rRNA前体中间体；橙色条和星号表示基于先前研究[6, 72, 77]的非典型或其他加工的物种。每个图下方显示用亚甲蓝染色的膜(聚焦于18S和28S rRNA)作为上样对照。通过安捷伦生物分析仪评估，所有RNA样品的RNA完整性数值(RIN)均为9.3或更高。(C)、(D)、(F)和(G)中的比例尺为25微米。
我们的研究发现，每种核酸内切酶基本上都有所有典型以及众多新的候选RNA底物，核糖核酸酶MRP共有80种，核糖核酸酶P有311种(包括124种tRNA)，涵盖了多种不同的RNA生物类型(补充图S3C和补充表S1)。鉴定出的靶RNA及其推定的切割位点为进一步深入研究这些必需核糖核蛋白体在体内的神秘功能提供了宝贵资源。我们的研究结果表明，与之前的认识相比，核糖核酸酶MRP和核糖核酸酶P在哺乳动物细胞中已被用于更广泛的其他作用。我们推测，这些新获得的功能促成了保留这些酶并使其继续进化的压力。也可以想象，与核糖核酸酶MRP RNA和RMP64突变相关的人类病理学受到此类功能受损的影响 。
虽然我们的数据并未直接涉及真核生物核糖核酸酶P和核糖核酸酶MRP结构复杂性的进化原理，但这一主题已在多篇综述中进行了讨论[3, 4, 8, 84]。值得注意的是，有人提出建设性中性进化是核糖核酸酶P和核糖核酸酶MRP获得其精细结构的一种可能机制——通过中性突变和相互作用的积累，这些突变和相互作用增加了分子复杂性，但没有立即带来选择优势[84 - 87]。这些特征可能在进化过程中一直存在，就这些酶而言，可能被保留、借用或进一步完善以支持其他细胞功能。特别是，扩展的蛋白质成分被认为可以稳定催化RNA结构，使其能够结合更大、更多样化的RNA底物，促进与其他细胞机制的调控相互作用，并允许复合物具有组成灵活性[4, 10, 81, 84, 88, 89]。我们对哺乳动物核糖核酸酶MRP和核糖核酸酶P众多新的RNA靶点——候选底物的鉴定，支持了这样一种观点，即它们的功能需要大量的底物通用性和时空调控(例如核糖核酸酶MRP在核仁外的重新定位)。我们进一步假设，核糖核酸酶MRP特异性蛋白质亚基RMP24和RMP64有助于这些调控和功能适应，相对于核糖核酸酶P，有助于使核糖核酸酶MRP的活性多样化。我们对核糖核酸酶MRP特异性亚基的表征，以及每种酶的定义RNA靶向库和可诱导消耗的细胞系，为进一步探索这些问题提供了有价值的工具。
用于分析数据和生成图表的原始代码可在https://github.com/Shiyang - He/ MRP - Composition - and - RNA - binding - specificity以及https:// doi.org/10.5281/zenodo.16747756获取。
致谢
我们感谢Murn和Cheloufi实验室的成员进行的有益讨论。我们感谢Mary Hamer、David Carter和Melanie Oakes在实验方面提供的帮助。
作者贡献:J.M.构思了这项研究。Y.L.、S.H.和J.M.设计了实验和数据分析。Y.L.、S.H.、K.P.、S.Z.、M.C.和J.M.进行了所有实验。S.H.进行了生物信息学分析。B.B.协调了与HGNC的基因命名咨询。S.C.、N.S.和W.F.M.提供了关键试剂并给予指导。J.M.获得了资金并监督了这项工作。J.M.在所有其他作者的参与下撰写了手稿。
补充数据
补充数据可在NAR在线获取。
利益冲突
N.S.是Parallel Squared Technology Institute的创始董事兼首席执行官，该机构是一家非营利性研究机构。作者声明他们没有其他竞争利益。
资金
这项工作部分得到了美国国家科学基金会授予J.M.和S.C.的一项资助(2054195)，以及美国国立卫生研究院NIGMS授予N.S.的一项MIRA奖(R35GM148218)。S.H.和M.C.得到了加利福尼亚再生医学研究所的TRANSCEND奖学金(奖项编号EDUC4 - 12752)的支持。J.M.得到了美国国立卫生研究院授予的GM144693资助，S.C.得到了美国国立卫生研究院授予的GM151004资助。B.B.和HGNC得到了美国国立卫生研究院(国家人类基因组研究所)授予的U24HG003345资助。内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。支付本文开放获取出版费用的资金由美国国立卫生研究院授予的GM144693资助提供。
数据可用性
本研究中生成的高通量测序数据已存入GEO，登录号为GSE290995。AP - MS原始文件可在PRIDE蛋白质组学平台获取，登录号为PXD061658。
References
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后生动物,RMP64,RMP24,RNase P,iCLIP
表观信息
2026-10-14
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