TREK K2P通道的热敏性受PKA开关控制，并依赖于微管网络
发布时间：
2026-03-05 21:18
TREK K2P通道的热敏性受PKA开关控制，并依赖于微管网络
索恩克·科代罗 D - 玛丽安娜·穆辛斯基
收到日期:2024年12月19日 / 修订日期:2025年4月23日 / 接受日期:2025年4月28日
© 作者 2025
摘要
温度感知是动物感知的重要组成部分，使个体能够避免接触疼痛或致命的温度。中枢和外周神经元中的许多温度传感器是离子通道。在这里，我们聚焦于K2P通道的热敏性TREK/TRAAK亚家族——唯一已知的 选择性热敏通道。C末端结构域对于TREK通道的温度激活至关重要，但温度感知机制和温度传感器的性质尚不清楚。我们研究了所有K2P通道亚家族代表的热敏性，确定TREK - 1和TREK - 2是仅有的热敏性K2P通道，而机械门控亚家族的第三个成员TRAAK则不显示温度依赖性。我们通过交换C末端将TREK - 1的热敏性转移到TRAAK通道，证明C末端结构域足以赋予热敏性。通过逐步截短C末端，我们分离出一个由18个氨基酸组成的特定温度响应元件(TRE)，这是哺乳动物热敏通道中的一个独特特征。在这个TRE中既有微管相关蛋白2(MAP2)的结合结构域，也有PKA磷酸化位点。微管网络的药理学破坏以及MAP2结合位点的缺失抑制了温度响应，而PKA激活则完全消除了温度敏感性。因此，与微管网络的连接使TREK通道具有热敏性，这并非通道本身所固有，而PKA介导的磷酸化状态则充当一个开关，决定TREK通道是否具有热敏性。
关键词 热敏性. 离子通道 - K2P通道 - TREK - 微管网络 - 温度感知
引言
感知温度对恒温动物至关重要。为维持恒定体温，主要由下丘脑视前区(POA)中的热敏神经元进行感知[47]。为在环境温度变化时维持体温并避免有害温度，热敏神经元位于背根神经节(DRG)和三叉神经节(TG)[53]，其中不同的离子通道介导温度感知。生物过程温度敏感性的一个衡量指标是在温度改变 时过程速率的变化，以Q10值表示。每个酶或离子通道的Q10值最高可达3 [32, 62]。实际上只有极少数离子通道对温度敏感，其Q10值有时高于20。主要参与者是瞬时受体电位(TRP)通道家族的成员，这些通道受到深入研究，例如，编码TRPV1的基因破坏会导致有害热感知的严重受损[13, 20]，而其对应物TRPM8的敲除会导致冷觉抑制[7, 18, 24]。其他几个TRP通道也会被温度变化激活(TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM3、TRPA1和TRPC5；[53])，但尽管进行了深入搜索，在这些通道中尚未鉴定出明确的温度传感器。
除了“经典”的温度敏感TRP通道外，其他离子通道家族的成员也已被证明会被温度变化激活:电压依赖性 通道 [78]， 激活的 通道TMEM16 A(也称为anoctamin 1)[15]，以及STIM1/Orai对[71]。K2P通道的TREK/TRAAK亚家族成员是仅有的已知热敏性 选择性通道。重要的是，与上述热敏性离子通道不同，这些 通道的激活会抑制神经元活动[38]。
& 索恩克·科代罗
s.cordeiro@physiologie.uni-kiel.de
1 德国基尔大学理学院，基尔，德国
虽然所有其他 通道均由四个形成孔道的亚基组成，因而具有四聚体对称性，但K2P通道仅由两个亚基组成，带有四个跨膜结构域和两个串联的孔道片段。根据其激活机制的同源性和相似性，哺乳动物K2P通道家族的15个成员被细分为六个亚组——弱内向整流器(TWIK)、机械门控(TREK/TRAAK)、碱性激活(TALK)、 激活(TRESK)、酸抑制(TASK)和氟烷抑制(THIK)亚家族[26, 33]。
TREK/TRAAK亚家族的所有成员均在视前区、背根神经节和三叉神经节的热敏神经元中表达[41, 43, 64, 67, 72]。TREK/TRAAK通道对哺乳动物的温度依赖性行为至关重要。在啮齿动物中敲除这些通道中的一个或多个会导致热感觉发生显著变化[38, 51, 56]。
TREK/TRAAK通道受多种物理和细胞刺激的调节，即温度、机械应力、细胞内pH、花生四烯酸和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸等脂质种类，以及G蛋白偶联受体(GPCR)介导的磷酸化和蛋白质-蛋白质相互作用[26]。值得注意的是，缺少细胞内C末端的截短型TREK-1通道在静息状态下活性降低[54]，并且对上述刺激的反应受损:温度激活降低[41]、机械敏感性降低[54]、对细胞内环境酸化的敏感性降低[42]，以及对花生四烯酸和 等脂质的敏感性降低[14]。因此，对于大多数生理调节剂的作用而言，C末端至关重要[6, 26]。然而，C末端结构域(CTD)如何感知温度以打开通道的机制仍不清楚。
在此，我们研究了温度诱导的TREK-1 K2P通道激活机制，并确定了其温度激活所需的温度响应元件(TRE)。我们证明热敏性不是TREK-1通道的固有特性，而是需要通过微管衔接蛋白介导与细胞骨架接触。最后，我们描述热敏性受通道的PKA介导的磷酸化状态控制，使细胞能够根据其当前状态调节热敏性。
材料与方法
分子生物学
通道构建体被亚克隆到含有巨细胞病毒启动子的表达载体pFAW中。所有K2P通道对应于人类异构体TREK-1(KCNK2；NM_001017425)、TREK-2(KCNK10；NM_021161)、TRAAK(KCNK4；NM_033310)、TALK-2(KCNK17；NM_031460)、TRESK(KCNK18；NM_181840)、TWIK-1(KCNK1，NM_002245)、TASK-3(KCNK9，NM_001282534)和THIK-1(KCNK13，NM_022054)。为了进行对照测量，使用了较长的人类TRAAK异构体2(AF247042)和小鼠TRAAK(KCNK4；NM_008431)。为了对温度敏感性进行受体偶联调节，将小鼠多巴胺受体D1(Drd1，NM_001291801)与TREK-1通道共表达。为了测量同聚体TWIK-1通道，通过将异亮氨酸293和294替换为丙氨酸来破坏内体/溶酶体回收基序。如Sandoz等人[59]所述，通过将R357、K362、R363和K364替换为脯氨酸来破坏MAP2结合位点。通过使用QuikChange方法(Strata-gene)进行定点诱变引入氨基酸替换。通过用终止密码子和适当的限制性位点替换相应的氨基酸三联体来截断通道。通过在TREK-1、TRAAK、TALK-2和TASK-3中通过L311/R312/V313(TREK-1)、L257/R258/V259(TRAAK)和G271/R272/V273(TALK-2)中的沉默突变插入MluI限制性位点并通过替换Phe246(TASK-3)来构建嵌合通道。因此，嵌合体由TREK-1(M1-V313)/TRAAK(V260-V393)、TRAAK(M1-V259)/TREK-1(I314-K426)、TALK-2(M1-V273)/TREK-1(I314-K426)和TASK-3(M1-A245)/TREK-1(V313-K426)组成。通过将TRAAK和TREK-1与由XhoI限制性位点后跟10个氨基酸(GGGGSGGGGS)组成的接头序列连接来构建异聚体通道。
细胞培养
HEK293细胞保存在补充有 胎牛血清和青霉素 - 链霉素 的杜氏改良 Eagle 培养基(DMEM)中，置于 培养箱中，温度为 。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)对细胞进行瞬时转染。对于电生理测量，在实验前至少 将转染的细胞用胰蛋白酶消化并接种到 盖玻片上。
电生理学
大多数电生理测量是在膜片钳技术的全细胞配置下进行的，使用EPC10放大器(HEKA)和PatchMaster软件(HEKA)。细胞通过在-100至+60 mV之间的斜坡协议( 持续时间，每 一次，保持电位 )或通过一系列矩形脉冲( 持续时间，在-80至 之间，以20 mV增量，保持电位 )进行刺激。当用细胞内溶液(以mM计)填充时，移液管电阻为1 - 3 MΩ: HEPES，用KOH调节pH至7.3。对于TWIK - 1通道的测量， 被 取代，因为TWIK - 1通道几乎没有 电导。基于 的细胞内溶液也用于在对照测量中测量预激活的TRAAK通道。如有需要，细胞内溶液中包含3 mM MgATP和0.3 mM NaGTP。浴液包含(以mM计):135 葡萄糖，10 HEPES，用 调节pH至7.3。在细胞膜上和内向外模式下的测量使用以下浴液(mM):140 KCl， 葡萄糖，10 HEPES，用KOH调节pH至7.3。所有调节剂都添加到浴液中以获得指定的最终浓度。温度通过连接到珀尔帖元件并由温度控制器(TEM - 01D，npi electronics)控制的水加热和冷却浴槽室进行改变。快速温度变化通过安装在记录室附近的卤素灯(欧司朗，15 V，150 W)加热获得，加热速率在0.04至 之间。
化学试剂
福斯高林、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯、长春花碱和H - 89购自开曼化学公司，MgATP、NaGTP、GMP PNP、3 - 异丁基-1 - 甲基黄嘌呤、秋水仙碱、细胞松弛素B、花生四烯酸和BL - 1249购自西格玛奥德里奇公司。GTPγS购自耶拿生物科学公司，ML335购自Tocris Bioscience公司。
计算模型
使用TREK - 1b(O95069 - 1)、TREK - 2b(P57789 - 4)、TRAAK同工型1(Q9 NYG8 - 1)、TALK - 2(Q96 T54 - 3)、TASK - 3(Q9 NPC2)和THIK - 1(Q9HB14)的氨基酸序列，通过Alphafold 3服务器测试版[1]计算同源二聚体结构模型。使用默认设置生成五个模型，并使用PyMOL 2.5.0开源版本[58]对模型进行分析和可视化，显示TREK - 1的46 - 374位残基、TREK - 2的46 - 397位残基和TRAAK的1 - 319位残基。
##数据分析
所有数据均以平均值 标准误表示。温度激活的倍数变化通过将最大激活电流除以温度升高前的基础电流来估算。Q10值通过以下公式计算: 其中 和T2是不同时间点的温度，I1和I2是在 测量的相应电流。使用Igor Pro(版本6.3.7.2)和Inkscape(版本1.3.2)进行图形展示。对于个体内数据比较，使用Igor Pro软件(WaveMetrics)进行Wilcoxon秩和检验。如果 ，则差异被认为是显著的， 和 的值分别用*、**和***表示。所有结果总结在表S1中。
结果
仅TREK - 1和TREK - 2是热敏性K2P通道
我们系统地研究了所有六个K2P通道亚家族成员的热敏性，重点关注已报道有温度敏感性的TREK/TRAAK亚家族。我们测量了在瞬时转染的HEK293细胞中表达的通道在加热、快速加热或冷却浴液时的电流响应。TREK - 1和TREK - 2通道均表现出随温度升高而强烈激活，而其他亚家族的代表则未被激活(图1A)。图S1A显示了部分K2P通道温度依赖性激活的时间进程。TREK - 1和TREK - 2通道激活的Q10值分别达到 和> 15，但强烈依赖于温度和加热速度(图S1B)。因此，我们没有使用Q10值，而是确定了整个温度范围内最大温度激活电流的倍数变化。
TREK - 1和TREK - 2通道表现出明显的温度依赖性激活，电流的倍数变化分别为 和 。升高温度并未激活任何其他测试的K2P通道。它们显示出TRAAK的倍数变化为 ，TALK - 2为1.88 ，TRESK为 ，TASK - 3为 ，THIK - 1为 ，TWIK - 1为 (图1B)。令人惊讶的是，TREK/TRAAK亚家族的第三个成员TRAAK对温度不敏感。通过已知的药理学TREK/TRAAK通道激活剂(10 μM BL - 1249)随后激活通道来测试TRAAK通道的功能。这一观察结果与Kang等人[36]之前的研究相冲突，他们报告说TRAAK通道被升高的温度激活。然而，该研究使用的是在COS7细胞中表达的小鼠TRAAK，它与人类同源物在CTD序列上有所不同(图S2A)。为了排除物种依赖性效应，我们还测量了小鼠TRAAK通道的温度激活。与我们之前在人类TRAAK中的结果一致，不存在温度依赖性激活， 的倍数变化明显低于TREK - 1和TREK - 2通道的相应值(图S2C)。为了排除细胞背景的可能影响，我们还测定了在COS7细胞中表达的人类TRAAK通道的温度敏感性，再次未发现激活(倍数变化 ；图S2C)。此外，我们排除了TRAAK通道剪接变体2中存在的较长N端的影响，其也未被温度激活(图S2C，倍数变化 )。为了最终防止由于TRAAK通道在基础状态下开放概率极低而错过可能的温度激活电流，我们在移液管溶液中使用 进行测量，其打开了选择性过滤器[61]。在这些条件下，TRAAK通道也没有热敏感性，倍数变化为 (图S2B)。
图1 TREK/TRAAK亚家族以及所有其他K2P亚家族代表性成员的温度敏感性。A从在室温(黑色)和 (红色)下用K2P通道转染的HEK293细胞记录的示例性全细胞电流迹线。电流通过在 - 100和 之间的斜坡协议引出。如
TRAAK通道在全细胞配置中未显示电流，这些通道在温度升高后被 BL - 1249激活。 测试的 通道温度激活的倍数变化(作为在 测量的最大电流相对于温度激活前的基础电流进行归一化)
值得注意的是，在其他K2P亚家族的代表中，只有TWIK - 1介导的电流也对升高的温度有反应。然而，TWIK - 1通道不是被激活，而是在持续加热到 去极化时失活(图S3)，导致电流下降到低于室温下的初始电流。TWIK - 2通道也有这种现象的描述[55]。
因此，我们发现TREK - 1和TREK - 2通道是仅有的被升高温度激活的K2P通道。
温度敏感性并非TREK - 1通道所固有
温度诱导的电流随时间增加揭示了两个特征:TREK通道的激活比温度升高慢，并且在全细胞配置中进一步保持温度时电流会降低(图2A)。为了表明即使在电流完全降低后通道仍然具有功能，我们加入了BL-1249(图S4C)。电流激活时间过程中的延迟几乎与加热速度无关，在开始升温后最早1分钟达到最大值(图S1A、S4A；比较加热速率为 和 时的时间过程)。因此，最大电流时的温度也显著取决于加热速度(图S4B；注意 和 时的最大电流)。我们测试了选择性过滤器的激活状态是否会影响这种温度响应(图S5)。通过T157C突变对C型门进行预激活或通过ML335激活，这使得通道对电压和许多其他刺激大多不敏感[40, 61]，并没有改变温度响应的时间过程；正如预期的那样，在完全开放的G152I突变体中没有测量到额外的电流增加[6, 40]。TREK-1通道对低于室温的冷却也很敏感，这会导致电流降低(图2D)。细胞冷却导致TREK-1通道几乎完全关闭，随后加热像往常一样激活通道，在 时达到最大值(图S4B)。采用这种温度方案(即在加热前冷却到 )，最大电流也在大约 后达到，表明在所应用的温度范围内不存在特定的温度激活阈值。
图2 TREK-1通道的温度响应取决于激活过程中的记录模式。A TREK-1通道全细胞记录中温度激活的时间过程。在快速升温时，温度最大值和电流最大值之间存在延迟。使用斜坡方案 引发电流，并将在 测量的电流随时间绘制。B 比较细胞膜片上模式(实心圆)与内向外配置中温度激活的时间过程，显示在达到最大激活后膜片切除时的失活(空心圆；箭头标记切除时刻)。在对称的 溶液中使用斜坡方案测量电流。 内向外模式下随温度升高测量的电流时间过程。由于没有激活电流，升温后通过 BL-1249激活通道作为对照(箭头)。D 与 中测量方式相同的温度激活时间过程，但在升温前包括冷却到 的步骤。E 在生理相关温度范围(35至 )内细胞膜片上记录的温度激活。电流测量方式与 相同。插图显示了在同一膜片上在 (黑色)和 (红色)测量的示例性斜坡。F 与 中测量类似的电流响应相对于温度的绘制。红色圆圈和线条显示单个细胞，黑色圆圈和线条显示五个细胞的平均值和标准误差
为了测试细胞内因子在温度激活机制中可能的参与情况，我们在不同的膜片配置下测量了TREK - 1通道。重要的是，在细胞膜上测量时，长时间加热后观察到的热敏感性得以保留，此时电流最大值在恒定温度下保持稳定(图2B；变化倍数 )。相比之下，在膜片切除后形成内面向外的配置时，通道立即且完全失去了它们的温度敏感性(图2B)。当从一开始就在内面向外的配置下进行测量时，通道没有显示出热敏感性，正如之前报道的那样[36, 41](图2C；变化倍数 )，但它们仍然具有功能，因为它们可以被其他刺激激活，即花生四烯酸或BL - 1249(图2C)。因此，连同温度升高后电流激活开始的延迟，这种对细胞完整性的依赖性表明温度激活不是通道的固有特性。
由于到目前为止我们使用了10到 的宽温度范围来表征电流的温度激活，因此出现了一个问题，即TREK通道是否在生理相关温度范围内被激活。因此，我们在细胞膜配置下于 测量了TREK - 1通道，并进一步将温度升高到约 。确实，诱导出了一个小但明显的温度依赖性电流增加(图2E)。绘制从室温升高到 以及从35升高到 所诱导的电流增加，得到了一个线性关系，这意味着TREK - 1通道的温度传感器在21到 之间以及在正常体温附近的温度，即35 - 40°C时同样活跃(图2F)。
TREK - 1通道的C末端结构域包含一个温度响应元件
我们试图确定TREK通道中负责热敏感性的通道区域。之前有报道称，TREK - 1通道的C末端对于它们的温度激活是不可或缺的，并且C末端结构域(CTD)与成孔核心之间的解耦也会导致热敏感性的丧失[6, 第41页]。
我们在上面已经表明TRAAK通道不具有热敏感性(图1和图S2)。对两个C末端的序列比较表明，在该亚家族中，只有TREK - 1通道中直到已知PKA位点的近端部分是相似的，并且TRAAK序列接着是一个富含脯氨酸的区域(图S6A)，预计该区域不会形成 螺旋。我们还比较了TREK - 1和TRAAK通道的Alphafold 3模型，结果表明TREK - 1通道很可能具有一个延伸到N372的细长螺旋C末端，而TRAAK的C末端在A290远端是无序的，这对应于TREK - 1中PKA识别位点的开始(图S6B)。
为了证明TREK C末端对温度激活的重要性，我们构建了嵌合通道，其中两个通道的整个C末端在两个通道之间进行了交换(在TREK - 1的V313残基和TRAAK的V259残基之后)，分别产生了构建体TREK - 1/ctTRAAK和TRAAK/ctTREK - 1(图3A)。实际上，C末端的交换导致了它们热敏感性的交换。虽然TREK - 1/ctTRAAK通道随着TRAAK C末端的引入完全失去了热敏感性(倍数变化 )，但热敏感性随着TREK - 1的C末端转移到了TRAAK/ctTREK - 1通道，其激活与TREK - 1野生型通道相当(图3A，B；野生型TREK - 1的倍数变化为12.45±2.65，TRAAK/ctTREK - 1的倍数变化为10.77±2.01)。通过将各自的孔形成核心连接到TREK - 1 C末端来转移热敏感性仅在TREK/TRAAK亚家族内有效，因为其他嵌合通道未能产生对温度敏感的通道(即具有TREK - 1 C末端的TALK - 2或TASK - 3核心通道；TALK - 2/ctTREK - 1通道的倍数变化为2.81 ，TASK - 3/ctTREK - 1通道的倍数变化为 ；图3B)。
图3 TREK-1通道C末端温度响应元件(TRE)的鉴定。A 用TRAAK通道C末端的TREK-1核心通道嵌合构建体转染的HEK293细胞在室温(黑色轨迹)和 (红色轨迹)下测量的示例性电流迹线。 BL-1249(蓝色轨迹)用于显示嵌合TREK-1/ctTRAAK通道的功能。B 柱状图显示了TREK-1和TRAAK野生型以及不同嵌合通道在温度升高时通道激活的倍数变化。C 串联的TRAAK-TREK-1通道在室温(黑色轨迹)和 (红色轨迹)下测量的示例性电流迹线。D TREK-1 C末端序列的一部分，带有已知的PKC和PKA磷酸化位点。AKAP150和MAP2的结合基序用黑色框标记，鉴定出的TRE用红色框标记。剪刀表示截断位点。下面显示了截断的TREK-1通道的示例性电流迹线(黑色轨迹:在室温下；红色轨迹:在37 下；插图:用 BL-1249进行的对照)。E 柱状图显示了截断的TREK-1通道在温度升高时激活的倍数变化
由于K2P通道形成二聚体以构建功能性通道，同聚体通道有两个相同的C末端。然而，已知TREK/TRAAK通道可以在其亚家族内形成异聚体通道[9, 39]。我们打算研究一个天然的热不敏感C末端对整个通道热敏感性 的影响，并构建了TREK-1亚基与热不敏感的TRAAK通道亚基的串联通道。有趣的是，TRAAK和TREK-1亚基的串联体没有被温度激活，这表明一个TREK-1亚基不足以赋予异二聚体通道温度敏感性(倍数变化 ，图3B、C)。
为了进一步缩小负责热敏感性的区域，我们逐渐截短了TREK-1的C末端(图3D)。所有截短的构建体仍具有功能，并受BL-1249调节(图3D中R326Stop的插图)。在精氨酸326处截短完整的TREK-1 C末端(R326Stop)导致热敏感性完全丧失( 的倍数变化，图3D，E)。在丙氨酸338处截短(A338Stop，倍数变化1.93±0.07)时，热敏感性仍然丧失。相比之下，仅截短最后70个氨基酸(Q356Stop)对TREK-1通道的热敏感性影响很小(倍数变化 )。因此，从A338到F355的18个氨基酸片段必定包含TREK-1通道的温度响应元件(以下简称TRE)。
PKA介导的磷酸化状态调节热敏感性
除了已知的PKC和PKA磷酸化位点外，TREK-1 C末端附近还包含与相互作用蛋白AKAP5(小鼠中的AKAP150)和微管相关蛋白2(MAP2)的结合位点(图3D；[59, 60])。对TRE的序列分析表明，这些先前描述的可修饰元件中有两个位于该区域:S348处的PKA磷酸化位点和E350 - Q375的MAP2结合域。TREK-1通道在两个丝氨酸(S315和S348；[48, 54])处受PKC和PKA磷酸化调节。因此，我们试图使用药理学调节剂研究激酶对TREK-1通道热敏感性的影响。TREK-1中的PKA位点S348(较短同工型中的S333)在另一个热敏感K2P通道TREK-2中也存在(此处为S364)，而在热不敏感的TRAAK通道中不存在(图S2A)。相比之下，PKC磷酸化位点S315(较短同工型中的S300)在TREK-2(S331)以及TRAAK(S287)中存在，尽管据描述在TRAAK通道中它没有功能[28]。
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA； )激活PKC，虽然降低了基础电流，但对温度激活影响很小(倍数变化 ；图4)。相比之下， 毛喉素/100μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Forsk/IBMX)激活PKA显著抑制了基础电流，并额外消除了TREK-1通道的温度激活(倍数变化 ；图4)。这不是由于通道功能障碍，因为它们仍可被BL-1249药理激活。用PKA抑制剂H-89预孵育完全阻止了Forsk/IBMX对热敏感性的这种抑制作用(倍数变化12.89±6.07；图4插图)。单独用1μM H-89抑制PKA没有效果，甚至增强了温度激活( 的倍数变化；图4D)。因此，TREK-1通道的热敏感性由PKA磷酸化状态特异性控制，PKA激活足以消除温度响应。重要的是，这种PKA介导的磷酸化本身不能构成温度依赖性步骤，因为用H89抑制PKA后热敏感性得以保留。
此外，我们将TREK-1通道中的PKA磷酸化位点突变为天冬氨酸以模拟磷酸化状态(S348D)或突变为丙氨酸以模拟去磷酸化状态(S348A)。与Forsk/IBMX对PKA的激活作用类似，S348D突变导致基础电流显著降低，并完全消除了温度激活，这支持了PKA介导的磷酸化程度对TREK通道热敏感性的重要性(倍数变化: ；图4)。同样，与H-89对PKA的抑制作用一致，S348A突变对热敏感性没有影响(倍数变化6.07±1.46；图4D)。
最后，我们通过共表达多巴胺受体1(Drd1)作为 偶联受体的一个例子，通过生理途径激活PKA。与预期一致，与未表达Drd1的细胞相比，通过受体介导的cAMP合成激活PKA会抑制温度激活并降低温度激活电流(倍数变化2.92±0.43，图4C、D)。
与细胞骨架的接触对于温度激活是必要的
通过与突触体脑蛋白进行免疫共沉淀实验[59]，已证明MAP2与TREK-1中的MAP2结合位点(E350-Q375)之间存在相互作用。由于MAP2将相关的相互作用伙伴连接到细胞骨架，MAP2结合位点与TRE(E339-Q356)的重叠表明，MAP2介导的TREK-1通道与细胞骨架之间的接触可能参与温度传感。为了确定细胞骨架的不同部分中哪一部分与TREK-1 C末端相连，我们使用秋水仙碱( )和长春花碱 破坏微管网络，并用细胞松弛素 破坏肌动蛋白细胞骨架的聚合(图5A、B)。
图4 PKA磷酸化特异性抑制TREK-1通道的热敏感性。A药理学激酶调节后TREK-1基础电流和温度激活电流的示例。插图显示了在应用Forsk/IBMX之前用H-89预孵育的细胞的示例(黑色轨迹:室温；红色轨迹: )。B如A中所示的激酶调节下温度激活电流的时间进程。C与G蛋白偶联多巴胺受体1(Drd1)共表达的TREK-1电流的示例电流轨迹和时间进程，暴露于多巴胺和温度升高。由于没有激活电流，温度升高后用 BL-1249激活通道(蓝色轨迹/箭头)。D条形图显示激酶调节或Drd1受体激活后温度激活的倍数变化
有趣的是，干扰肌动蛋白细胞骨架对温度激活的影响很小(倍数变化6.74±1.39)，而微管网络的解体导致温度激活受到抑制(秋水仙碱和长春花碱的倍数变化分别为 和 )。
由于微管的形成需要与微管蛋白结合的GTP水解，我们还在移液管溶液中加入了不可水解的GTP类似物。无论是在存在GTPγS的情况下，还是用GMP PNP代替GTP的情况下，我们都没有测量到任何温度激活的TREK-1电流(图5C、D；GTP的倍数变化为8.02±1.53，GTPγS的倍数变化为2.76±0.7，GMP PNP的倍数变化为2.74±0.68)。
桑多兹等人[59]表明，将TREK-1通道C端对应于R357、K362、R363和K364的氨基酸替换为脯氨酸会阻碍MAP2的结合。我们使用这个破坏了MAP2结合位点的突变体来测试TREK-1/MAP2相互作用对温度敏感性的贡献。这显著降低了通道的热敏感性(图5A、B；倍数变化4.47±0.92)，再次表明微管的完整性对于TREK-1通道的温度敏感性是必要的。
图5 TREK-1通道的热敏感性取决于C端与微管网络的连接。A 对细胞骨架进行药理调节或MAP2结合基序突变后，温度刺激的TREK-1电流示例(黑色轨迹:室温；红色轨迹:在 )。B 柱状图显示了在 分析的如 中测量的温度激活倍数变化。C 在移液管溶液中使用不可水解的GTP类似物GTPγS或GMP PNP测量的TREK-1通道电流轨迹(黑色轨迹:室温；红色轨迹:在 )。D 柱状图显示了在存在GTP及其不可水解类似物的情况下温度激活电流的倍数变化
讨论
在本研究中，我们报道了哺乳动物热敏离子通道中首个局部化的TRE。我们确定通道C端的一个区域对其热敏感性不可或缺。特别是，PKA磷酸化位点和MAP2结合位点对于TREK通道的温度激活至关重要。
在哺乳动物中，温度感知主要由温度敏感离子通道介导，主要是TRP通道家族的成员。尽管进行了大量研究，但其热敏性的分子基础尚未完全阐明。讨论了两种热敏性的一般机制:全局机制与局部机制[3]。一种代表全局机制的假说是通道比热容量的温度依赖性变化[17,75]。这将使温度依赖性门控转变无需特定的温度响应元件(TREs)，并且开放和关闭状态的总热容量也可以通过例如通道远处部分的结合事件、突变或缺失来改变。例如，Chowdhury等人[16]能够通过合理设计参与门控转变的氨基酸位置获得温度门控的Shaker 通道，强调了溶剂化变化对通道热容量的重要性。相比之下，局部机制需要存在一个定义明确的TRE，该TRE响应其刺激来控制通道门。在温度敏感离子通道中都可以找到这两种机制的例子。在大多数热TRP通道中，蛋白质非常不同部分的变化会阻碍热敏性，并且迄今为止尚未鉴定出明显的温度传感元件。在经过充分研究的TRPV1通道中，孔区域似乎至关重要，因为S6和孔的细胞外部分[30,31]或孔塔[19,73]中的突变或缺失会损害其温度敏感性。此外，Zhang等人[77]能够通过简单地交换它们的孔结构域将TRPV1的温度敏感性转移到Shaker 通道，支持了这些通道中存在局部热传感器的观点。与此相反，TRP通道的细胞内部分，例如锚蛋白重复结构域(ARD)和TM1之间的膜近端结构域[74]和C末端[10]，也被发现会影响TRP通道的温度敏感性。在双向热激活和冷激活的TRPA1通道中，N端电压传感样结构域(VSLD)的缺失仅消除了热敏感性，但冷敏感性似乎分布到连接子和CTD，N端ARD和VSLD结构域可能有贡献[35,46]。此外，最近在不同温度下生成的TRPV1和TRPV3通道的冷冻电镜结构也表明这些通道存在全局温度激活[37,49,63]。据我们所知，仅在一种离子通道中鉴定出了代表真正局部温度敏感机制的蛋白质明确界定区域:在波氏硅杆菌的细菌 通道中，连接CTD与孔的亚稳结构域中的一段短 氨基酸序列被证明根据其无序程度控制温度依赖性电压门控[4]。
几项研究表明TREK通道对温度敏感，但温度激活机制仍然未知 。与先前的研究一致，我们测量了TREK - 1和TREK - 2通道的Q10值高达20[36,41]。来自不同K2P亚家族的所有其他测试代表均未被温度激活，并且Q10值低于4。令人惊讶的是，这个K2P亚家族的第三个成员TRAAK，与TREK - 1和TREK - 2密切相关，并未被温度激活。据推测，TRAAK通道是热敏的，尽管其激活阈值 高于TREK - 1和TREK - 2通道[36]。然而，尽管我们在两种表达系统(HEK293和COS7细胞)中测试了人和小鼠的TRAAK通道，但在加热到 及更高温度时我们未发现任何热敏性。
除热敏性外，TREK-1通道的C末端对于整合各种刺激也非常重要[41]，包括细胞内pH值[42]、多不饱和脂肪酸[54]、PIP2[14]和磷酸化[27,48]，并且它为相互作用蛋白提供结合位点[59,60]。通过将TREK-1的含TRE的C末端与非热敏性TRAAK通道的C末端进行交换，我们能够将热敏性转移到TRAAK通道，反之亦然，使TREK-1通道对温度不敏感。这表明TREK-1 C末端不仅是TREK/TRAAK亚家族中温度敏感性所必需的，而且是充分的。将温度敏感的TREK-1和TREK-2通道的C末端与TRAAK通道的C末端进行比较，发现只有TREK-1和TREK-2通道具有特别延长的M4螺旋(图S6B、C)。TRAAK通道C末端的 螺旋结构的破坏正好位于TRE的中心，这表明这些可能是其功能的先决条件。有趣的是，由一个TRAAK亚基和一个TREK-1亚基形成的异源通道对温度不敏感，这表明温度激活需要两个TREK C末端。与此一致的是，Bagriantsev等人[6]表明，两个TREK-1亚基的串联体，其中一个具有未偶联的C末端，其温度响应减弱。然而，对于通过C末端的其他激活刺激，只有一个C末端就足够了(例如，PKA、pH值、PLD2[9,39])，这表明存在通过CTD激活通道的不同刺激机制。这对相应组织中天然异源通道可能出现的特性有很大影响。
通过进一步逐步截断，我们因此将TREK-1 CTD中对温度激活至关重要的TRE分离为18个氨基酸(A338-F355)。重要的是，这个螺旋区域包括PKA磷酸化位点，并与将TREK-1 C末端连接到细胞骨架的MAP2结合位点重叠。
一般来说，温度敏感通道在它们是内在温度敏感还是需要辅助因子方面存在差异。例如，TRPV1、TRPV3或TRPM8通道在脂质双层中重组后仍然具有正常的温度敏感性，因此可以假设这些通道是内在温度依赖性的[12,49,76]。相比之下，TRPV4通道与TREK-1通道一样，当去除其细胞环境时会失去温度敏感性[69]。当在切除的膜片中测量TREK通道时不存在温度激活这一事实[36,41]，以及我们在全细胞测量和内向外膜片切除时观察到温度激活电流降低，这与传递热敏性的细胞内因子的丧失是一致的。此外，在TREK-1中看到的温度升高开始后激活的时间延迟可能暗示涉及其他过程，而TRPV1活性紧密跟随温度升高的速率[12]。为了阐明TREK-1温度激活的机制，我们研究了细胞骨架的不同成分作为假定的MAP2结合伙伴的作用以及激酶磷酸化的相关性。相应地，我们发现微管动力学决定了TREK-1通道的温度激活。当我们通过药理学方法操纵不同的细胞骨架成分时，只有微管的破坏或对其合成的干扰，即通过不可水解的GTP或GTP-PNP，会阻碍热敏性。
温度对微管的灾难与救援之间的平衡(即微管的解聚和组装)有强烈影响，较高温度会促进救援。值得注意的是，微管相关蛋白(MAP)在一个称为选择性稳定和保护的过程中调节微管的动力学，例如防止冷诱导的解聚(见[5, 21, 22]综述)。家族成员微管相关蛋白2(MAP2)在神经元中表达，并已证明在从小鼠大脑获得的裂解物中与TREK - 1通道共同免疫沉淀[2, 59]。我们的结果表明，通过突变TREK - 1通道C末端的MAP2结合区域来断开MAP2和TREK - 1通道之间的连接，完全抑制了热敏感性。这意味着温度变化会导致TREK - 1通道的温度响应元件(TRE)与微管网络之间的连接发生改变，进而导致TREK - 1通道随着温度升高而激活，并在冷却时关闭。
有趣的是，除了调节组装/解聚的基本温度依赖性外，家族成员微管相关蛋白6(MAP6)已被描述为在较低温度下与微管结合的温度传感器[23]。从机制上讲，已表明在高温下特定结构域从β结构线性展开为低温下的无序状态，这种结构特征也存在于MAP2/微管相关蛋白tau(tau)亚家族中[23]。
此外，TREK - 1通道的这种非内在温度激活受细胞当前状态的调节，以蛋白激酶A(PKA)活性为反映。PKA的药理学或受体介导的激活特异性地消除了温度激活，而蛋白激酶C(PKC)激活虽然也抑制基础电流，但对通道的温度依赖性没有影响。Maingret等人[41]先前曾推测PKA介导的磷酸化可防止温度激活，他们使用环磷酸腺苷(cAMP)在不同温度下抑制通道。在PKA位点突变体S333A(本研究中使用的TREK - 1同工型中的S348A)中不存在这种抑制作用，并被解释为PKA激活导致温度激活的逆转。然而，PKA介导的磷酸化本身不可能是温度敏感步骤，否则在我们的实验中，H - 89对PKA的抑制或模拟去磷酸化的突变体S348A也应该导致热敏感性的抑制。因此，PKA对TREK - 1通道的磷酸化仅改变通道的状态，使其对温度激活不敏感。磷酸化起到分子开关的作用，使细胞能够通过改变PKA介导的磷酸化程度来调节TREK - 1的温度敏感性，从而将其与活跃的信号通路耦合。
TREK - 1通道的C末端、细胞骨架和PKA催化结构域之间的接触可能由MAP2介导[45, 52]。因此，MAP2是TREK - 1通道温度依赖性激活的关键参与者，并且在将PKA募集到TREK - 1 C末端方面至关重要。当S348去磷酸化时，通道与微管网络相连且对温度敏感；磷酸化后，连接可能改变或丧失，通道不再对温度敏感。
已经表明，在TREK通道中机械激活诱导从低活性“向下”构象到高活性“向上”构象的构象变化，其中近端C末端结构域(CTD)靠近内膜小叶[11, 25]。对于包括温度和去磷酸化在内的其他刺激也有此推测[33, 44, 66]。可以推测MAP2介导的与细胞骨架的接触将TREK - 1通道稳定在温度诱导的高活性“向上”构象中[44]。然而，磷酸化将有利于低活性“向下”状态[66]，从而关闭温度激活。
TRPV1通道在背根神经节/三叉神经节(DRG/TG)神经元和视前区(POA)的热敏神经元中均有表达[41, 43, 64, 67, 72]，因此可能参与外周和中枢的温度感知。在DRG/TG神经元中，TRPV1通道的对应物是TRPV1通道，因此，这些神经元在静息状态下对中等温度敏感，因为TRPV1通道激活对它们的刺激会被TRPV1通道激活所抑制。然而，TRPV1通道通过蛋白激酶A(PKA)介导的磷酸化对温度变化敏感，例如在持续炎症中[8, 29]，其中前列腺素等介质激活PKA[34]，相应地，许多研究将炎症期间的热痛觉过敏与TRPV1通道联系起来[68]。相反，TRPV1通道通过PKA介导的磷酸化对温度变化脱敏([41]及本研究)，TRPV1通道热敏感性的抑制也可能导致前列腺素介导的痛觉过敏。因此，温度感受器纤维的放电阈值可能受两种拮抗通道磷酸化状态平衡的控制。
在视前区，核心体温受到密切监测，但体温设定点并非固定不变；例如，在睡眠期间，设定点会降低，而在发烧时则会升高[50, 65]。由细菌等病原体引起的发烧是由前列腺素E2等热原介导的，它通过 偶联 前列腺素受体抑制cAMP/PKA途径。已经确定， 受体激活会导致“温敏”视前区神经元亚群的放电率降低，从而导致随后的产热[47, 57, 58]。对此类神经元的模型模拟表明，温度激活的TRPV1通道的表达能够在生理温度范围内 降低其放电率；[70])。因此，在PKA介导的磷酸化受到抑制时TRPV1通道的热激活可能有助于炎症条件下视前区神经元温度设定点的变化。
补充信息 在线版本包含可在https://doi.org/10.1007/s00424-025-03089-1获取的补充材料。
致谢 我们感谢Michaela Unmack、Sandra Grüssel、Ria Neumann和Petra Breiden提供的出色技术支持。这项工作至少部分得到了德国研究基金会(RU2518)的资助。分别含有MAP2和THIK-1基因的质粒是Florian Lesage和Stephen Tucker惠赠的。
作者贡献 数据采集和图表准备，SC、MM；概念构思，SC、MM；撰写稿件，SC、MM。
资金 由Projekt DEAL促成并组织的开放获取资金。这些研究得到了德国研究基金会通过研究单元2518的支持。
K2P通道,TREK‑1,TREK‑2,PKA磷酸化,微管,MAP2
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2026-10-14
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