CD38介导的代谢重编程促进肿瘤中调节性T细胞的稳定性和抑制功能
发布时间：
2026-03-10 21:05
CD38介导的代谢重编程促进肿瘤中调节性T细胞的稳定性和抑制功能
伊希塔·萨卡尔 ，德巴什里·巴萨克 ，普斯彭杜·戈什 ，阿努帕姆·高塔姆 ，阿尔皮塔·布胡米克 ，普拉文·辛格 ，安韦莎·卡尔 ，肖恩·马哈蒂 ，斯内汉舒·乔杜里 ，拉格纳吉塔·恰克拉波蒂 ，苏米亚·蒙达尔 ，拉马努吉·慕克吉 ，希卡尔·梅赫罗特拉 ，赛卡特·马宗德 ，尚塔努·森古普塔 ，桑迪普·保罗 ，希尔帕克·查特吉
在肿瘤微环境(TME)中，调节性T细胞(T )会调整其代谢以在低葡萄糖、高乳酸的条件下生存，但具体机制仍不清楚。我们的研究发现，CD38通过消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化形式) ，将乳酸衍生的丙酮酸重定向为磷酸烯醇丙酮酸并绕过三羧酸(TCA)循环，从而成为这种适应性变化的关键调节因子。这可防止 -酮戊二酸的积累，后者通过在Foxp3基因座诱导高甲基化而使 不稳定。用烟酰胺单核苷酸恢复NAD 可逆转这种适应性变化，使调节性T细胞回到TCA循环并降低其抑制功能。在携带YUMM1.7黑色素瘤的小鼠中，小分子CD38抑制可选择性地使肿瘤内的调节性T细胞不稳定，引发强大的抗肿瘤免疫反应。这些发现表明，靶向CD38-NAD 轴可破坏 的代谢适应性，并提供一种增强抗肿瘤反应的策略。
引言
调节性T细胞 对于维持外周免疫耐受至关重要，但在癌症免疫治疗中 却是一个重大挑战。在肿瘤微环境(TME)中， 利用各种抑制机制来阻碍对肿瘤控制至关重要的T细胞功能 。在一部分胃癌患者中，程序性细胞死亡蛋白1(PD1)治疗后，调节性T细胞已被证明会促进癌症的高度进展，这是由于 的扩增，而 具有高度抑制性(1)。虽然 消耗方法可增强T细胞的效应功能并产生有前景的抗肿瘤反应，但由于 的全身丧失导致严重自身免疫的发生，其临床应用受到限制。因此，确定选择性靶向肿瘤内 的策略对于成功的癌症免疫治疗至关重要。
T细胞的代谢适应性使细胞能够根据环境变化或功能需求在不同代谢途径之间进行调整和转换，这对于引发组织特异性免疫反应至关重要(6)。研究表明，在复杂且通常具有敌意的肿瘤微环境中，调节性T细胞会经历特定的代谢适应以维持其存活和功能(7 - 11)。已经证明，虽然低葡萄糖、高乳酸的肿瘤微环境会损害效应T细胞的功能( )， 会调整其代谢机制和营养感应途径以利用乳酸，满足其生物能量需求(7, 8, 12, 13)。这些适应对于维持肿瘤内 的细胞特性和抑制功能也至关重要(8)。然而，重新编程 代谢机制，使其能够采用支持其在肿瘤微环境中功能和存活的代谢特征的细胞机制仍不清楚。
使用 L - 乳酸来了解肿瘤内 的乳酸代谢的研究揭示了一条促进磷酸烯醇丙酮酸(PEP)生成的替代途径，这表明向糖异生转变(8)。糖异生所必需的PEP可以通过胞质苹果酸脱氢酶将三羧酸循环衍生的苹果酸转化为草酰乙酸(OAA)，然后通过胞质磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 - C(PEPCK - C)转化为PEP，或者通过丙酮酸羧化酶(PC)将线粒体丙酮酸转化为OAA，随后通过线粒体PEPCK - M生成PEP(14, 15)。这就提出了一个问题，即肿瘤内 在利用乳酸以满足其代谢需求时是否更喜欢一种途径而不是另一种途径。这种偏好可能会产生重大后果，因为促进三羧酸循环可能会增加关键中间代谢物的水平，包括 - 酮戊二酸 ，从而影响其抑制潜力和稳定性(11, 16)。最近的一项研究表明，与主要使用氧化磷酸化(OXPHOS)来支持其抑制活性的脾脏 相比，肿瘤微环境中的 线粒体质量和呼吸作用降低(9)。此外，肿瘤内 线粒体OXPHOS的降低已被确定对其抑制功能至关重要(9, 11)。这些发现表明，肿瘤微环境中的肿瘤内 必须适应机制，以确保通过满足其生物能量需求的途径有效利用乳酸，同时保持稳定性和功能。然而， 中乳酸代谢的这一决策过程的调控机制仍知之甚少。
CD38是一种胞外核苷酸酶，由于其烟酰胺腺嘌呤二核苷酸酶(NADase)活性，已成为T细胞中一个重要的代谢检查点，该活性调节细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化形式) 库(17 - 19)。研究表明， 上CD38表达升高会影响线粒体代谢，进而影响其在肿瘤部位的功能(19, 20)。最近，在从不同恶性肿瘤患者中分离出的 中报道了CD38表达升高(21, 22)。然而，CD38在肿瘤部位 的代谢适应和功能调节中的作用仍未完全了解。我们的研究结果表明，CD38表达通过调节细胞内 水平来调节 的稳定性和抑制活性。CD38介导的 中 含量降低限制了三羧酸循环(TCA)介导的 -酮戊二酸的生成，从而保留了Foxp3基因的抑制性甲基化模式。我们的观察结果表明，CD38 - NAD 轴通过将 的利用重定向到磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的生成而不是为TCA循环提供燃料，从而决定了 中的乳酸通量，从而支持 在肿瘤部位的功能。
癌症生物学与炎症性疾病科，卓越的IICB转化研究单位，印度科学与工业研究理事会 - 印度化学生物学研究所，加尔各答700032。 科学与创新研究学院(AcSIR)，加济阿巴德201002，印度。 图宾根大学，生物信息学与医学信息学研究所，Sand 14，72076图宾根，德国。 国际马克斯·普朗克研究学院“从分子到生物体”，马克斯·普朗克生物学研究所图宾根，马克斯 - 普朗克环5，72076，图宾根，德国。 印度科学与工业研究理事会 - 基因组学与综合生物学研究所，新德里110020，印度。 传染病与免疫学系，印度科学与工业研究理事会 - 印度化学生物学研究所，加尔各答700032。 印度加尔各答IPGME&R和SSKM医院泌尿外科。 印度加尔各答R.G. Kar医学院及医院。 南卡罗来纳医科大学。 印度加尔各答JIS大学JIS高等研究与技术中心健康科学与技术中心。*通讯作者。电子邮件:schatterjee@iicb.res.in
†当前地址:印度加尔各答奇塔拉南詹国家癌症研究所。
结果
肿瘤内调节性T细胞表达CD38并表现出独特的转录特征
为了阐明CD38在肿瘤内 中的功能相关性，我们首先检查了它们在肿瘤部位的丰度。对乳腺癌和肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)患者的肿瘤组织和配对的外周血样本分析显示，以 和FoxP3 表达为特征的 浸润在肿瘤组织中明显高于外周血(图S1，A和B)，如先前报道(23, 24)。然而，在分析CD4 FoxP3 细胞时，我们注意到与外周血中的 相比，肿瘤内 上CD38的表达更频繁(图1，A和B)。
为了证实这一观察结果，我们使用了各种临床前模型，其中小鼠被皮下植入B16-F10黑色素瘤、YUMM1.7黑色素瘤或EL-4胸腺瘤。正如预期的那样，与脾脏和引流淋巴结(DLN)相比，肿瘤部位 的丰度明显更高(图S1，C至E)。值得注意的是，在所有评估的肿瘤类型中，与脾脏和DLN相比，表达CD38的 在肿瘤部位显著富集(图1，C至E)。此外， 在皮肤和肝脏等非淋巴组织中很少见(图S1，F至H，以及图1，C至E)。在评估CD38表达水平时，我们发现肿瘤内 的CD38表达明显高于其淋巴和非淋巴对应物(图1，F至H)。总之，这些发现表明肿瘤内 具有强烈的表达CD38的倾向，这与外周组织中CD38表达明显较低的调节性T细胞形成鲜明对比。
鉴于最近的研究强调了肿瘤内 之间的高度异质性，我们试图确定这些细胞中CD38的表达模式，并探索相关的转录特征。为了实现这一目标，我们分析了来自乳腺癌患者的肿瘤浸润淋巴细胞的公开单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据(GSE 114727)(25)。在应用严格的质量控制和过滤后，总共17,645个CD3 T细胞进行了无监督聚类分析，识别出12个不同的T细胞簇(图S1I)。在这些簇中，簇1和8被表征为 ，其特征是CD3G、CD4和决定子集的主转录因子FOXP3的富集表达(图S1，J和K)。为了进一步研究转录多样性，我们对来自簇1和8的3127个调节性T细胞进行了重新聚类，揭示了肿瘤内 的五个不同亚簇(图1I)。簇0和3分别占总 的36.65%和12.98%，在CD38表达上高度富集(图1，J和K)。此外，与 中优越的抑制功能和稳定性相关的基因，包括ICOS、ID3、PIM2、TIGIT、MCL1、IL2RA、ISG15和CREM，在表现出高CD38表达的簇0和3中占主导地位(图1L)。簇0通过表达额外的T细胞抑制相关基因如RGS1、IFIT1和CRIP1进一步与簇3不同。与簇0和3相反，其他三个簇(1、2和4)显示出非常低的CD38表达。簇2由于其SELL、CCR7和KLF2的表达而被表征为“淋巴结归巢调节性T细胞”。簇1和4仍然未定义，但在PRMD1、FKBP5、GPX(簇1)和BTG2(簇4)的表达上富集，这些基因与 功能和稳定性相关(图1L)。总体而言，这些数据表明相当一部分肿瘤内 表达CD38，并且表达CD38的 含有与 增强的抑制功能和稳定性相关的基因。
CD38 T 表现出优越的抑制活性
在表达CD38的 中发现与增强免疫抑制相关的基因表达丰富后，我们接下来研究了它们的抑制潜力。由于从肿瘤部位获取足够的 用于功能研究存在技术挑战，我们首先检查了体外分化的 是否也表达CD38。我们观察到，未成熟的CD4 细胞分化为 时几乎不表达CD38，而CD38 细胞的频率在 中显著更高，占iTregs群体的 至 (图2A和图S2A)。值得注意的是，在肿瘤条件培养基(TME)(图S2B)或低氧条件下(图S2，C和D)进行 分化后， 的频率无法进一步增加，这表明如先前报道(20,26)，转化生长因子- (TGF- )足以诱导 上的CD38表达。
鉴于 上CD38的表达，我们检查了表达CD38的 亚群是否也具有如肿瘤内CD38 中观察到的抑制基因特征。我们根据CD38表达对iT 进行分选，并分析 和 亚群中的免疫抑制基因表达。我们发现，与 中的 相比，与 的免疫抑制潜力相关的Ctla4、Icos、IL2ra、Ikzf2、Nrp1、Entpd1(基因编码CD39)和Lag3基因在CD38 iT 中的表达明显上调(图S2B)。接下来，我们将分选的 和 与从野生型(WT)B6小鼠纯化的未成熟T细胞进行抑制试验。我们观察到，在所有测试比例下， 在抑制T细胞增殖和效应细胞因子产生方面均优于 (图2，C和D)。值得注意的是，这种差异抑制能力不是由于活力差异，因为两个亚群在试验后仍具有同等活力(图S2E)。相反，CD38 iT 的优越功能部分可归因于它们对FoxP3表达的增强保留，因为 iT 在长时间培养时更容易失去FoxP3表达(图2，E和F)。
为了进一步确认CD38在调节 抑制潜能中的作用，我们将来自 和野生型B6小鼠的初始CD 细胞分化为 ，并评估它们的抑制潜能。我们注意到，尽管CD38 和野生型CD4 T细胞在分化为 方面没有明显差异(图S2F)，但 在抑制T细胞增殖和效应细胞因子产生方面比野生型 效果更差(图2，G和H)。
图1. 肿瘤内调节性T细胞显示CD38表达升高。(A至E) 在[(A)和(B)] 患有(A) 乳腺癌(Ca)和(B) 肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)的患者的肿瘤组织和配对血液样本中评估 区室(CD4*FoxP3 T细胞)内FoxP CD38 T细胞的频率；[[C()至(E)] 来自皮下接种15天的B6小鼠的非淋巴组织、淋巴组织和肿瘤组织，这些小鼠患有(C) B16-F10黑色素瘤、(D) YUMM1.7黑色素瘤和(E) EL-4胸腺瘤。相邻的柱状图表示来自9个(A)、12个(B)、4个(C)、4个(D)和4个(E)样本的累积数据。(F至H) 在来自(F) B16-F10、(G)YUMM1.7和(H) EL-4胸腺瘤小鼠的 中评估CD38的荧光强度。柱状图表示来自四个([F)至(H)]独立实验的累积数据。(I) t分布随机邻域嵌入(t-SNE)表示突出显示了从CD3G T细胞的单细胞RNA测序(scRNA-seq)簇中识别出的五个 亚群。(J) t-SNE图显示关键基因的单细胞转录水平，颜色表示它们的表达:蓝色表示CD3G和CD4，绿色表示FOXP3，红色表示CD38。(K) 饼图描绘了五个乳腺癌样本中识别出的五个调节性T细胞簇的相对丰度。(L) 热图显示了在所有识别出的调节性T细胞簇中，按log 倍变化排名的前100个差异表达基因。* ；**** 。FMO，荧光减一。
图2. CD38赋予调节性T细胞(Tregs)卓越的抑制功能。(A) 将来自B6小鼠的初始CD4 T细胞分化为效应T细胞(Teff)或调节性T细胞(Tregs)，并评估CD38表达。柱状图显示了11个实验的累积数据。(B) 对CD38 和CD38 诱导性调节性T细胞(iTregs)中的各种基因进行定量聚合酶链反应(qPCR)分析。数据代表五个独立实验的结果。(C) 用抗CD3/CD28(各1 μg/ml)激活CellTrace Violet(CTV)标记的初始T细胞，同时存在荧光激活细胞分选(FACS)分选的CD38 和CD38 诱导性调节性T细胞，持续3天。通过CTV稀释评估CD8* T细胞增殖。柱状图显示了四个实验的数据。(D) 用(C)中的上清液测量干扰素 - (IFN - )水平。(E) 在诱导性调节性T细胞(iT )分化第3天(左)以及分选到CD38 和CD38 亚群后，再在白细胞介素 - 2(IL - 2)中培养2天(右)时的CD4 FoxP3 T细胞频率。柱状图代表四个实验的数据。(F) 在IL - 2中培养2天后，CD38 和CD38 诱导性调节性T细胞中的FoxP3表达。柱状图显示了四个独立实验的数据。(G) 用抗CD3/CD28激活CTV标记的初始T细胞，同时存在野生型(WT)和CD38 - 诱导性调节性T细胞，持续3天。通过CTV稀释评估CD8 T细胞增殖。相邻柱状图代表五个独立实验的数据。n.s.，无显著性差异。(H) 用(G)中的上清液评估IFN - γ水平。(I) 用对照短发夹RNA(shRNA)或CD38 shRNA转导的人诱导性调节性T细胞(ITregs)与CTV标记的初始T细胞在抗CD3/CD28存在下共培养3天。通过CTV稀释评估CD8* T细胞增殖。相邻柱状图代表五个独立实验的累积数据。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.005；****P < 0.007;
最后，我们试图确定从人 细胞分化而来的 是否也表达CD38，以及CD38是否对其抑制功能有贡献。从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)中纯化的 细胞分化为 或诱导性调节性T细胞(iT )(图S2G)，并评估CD38表达。与小鼠诱导性调节性T细胞(iT )中的发现一致，与效应T细胞(Teffs)相比，人诱导性调节性T细胞(iT )上的CD38表达占主导(图S2H)。短发夹RNA(shRNA)介导的人诱导性调节性T细胞(iT )中CD38的敲低显著降低了它们的抑制功能(图2I和图S2I)，强调了CD38在调节人诱导性调节性T细胞(iTregs)功能中的关键作用，这与在小鼠诱导性调节性T细胞(iTregs)中的观察结果一致。总之，这些发现表明 上的CD38表达对其免疫抑制潜力至关重要，并有助于维持FoxP3表达，突出了其在 稳定性和功能中的关键作用。
表现出有限的线粒体活性，这对其抑制功能至关重要
鉴于 中的代谢异质性及其对其功能特征的影响，我们研究了 和 在代谢上是否存在差异。我们发现，通过测量细胞外酸化率(ECAR，一种糖酵解的指标)评估的葡萄糖代谢，在CD38 中显著高于 中的葡萄糖代谢(图3，A至C)。然而，除了Ldha在CD38 iT 中显著上调外，编码各种糖酵解酶的基因在CD38 和CD38 iT 中的表达相当(图S3A)。数据表明，正如最近在具有不同葡萄糖代谢倾向的 亚群中报道的那样，糖酵解酶水平不太可能解释这些细胞中葡萄糖代谢的差异(8)。 与低葡萄糖亲和力的 高度相似，据报道后者具有卓越的抑制功能和FoxP3稳定性(8)。
由于发现氧化代谢在调节 功能中至关重要(27,28)，我们接下来通过测量 和 的耗氧率(OCR)来确定它们的氧化磷酸化。与早期研究 相反，我们注意到，尽管 具有高抑制潜力，但与 相比，其线粒体呼吸下降，表明 中的线粒体活性降低(图3，D至G)。进一步分析表明， 中观察到的线粒体氧化磷酸化降低并非由于电子传递链(ETC)复合物的表达降低(图S3B)。接下来，为了证实CD38在影响 中线粒体代谢中的作用，我们测量了从野生型或CD38 B6小鼠分化而来的 中的氧化磷酸化。我们观察到，从 细胞分化而来的iT 与野生型 相比具有更高的线粒体呼吸(图3，H至K)，表明CD38限制了 中的线粒体活性。这些观察结果突出了CD38在 中施加的复杂代谢调节，其限制了糖酵解和氧化代谢。然而，这些代谢特征与 抑制功能的相关性尚不清楚。
糖酵解和氧化磷酸化通过丙酮酸的氧化及其随后进入三羧酸循环相偶联，产生还原当量[ (NADH)的还原形式和黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)]用于电子传递链中的氧化还原反应。任何限制丙酮酸在三羧酸循环中的利用并随后为电子传递链产生还原当量的障碍都可能影响整个代谢回路。我们认为 中代谢活性降低可能是由于其线粒体活性受限，这可能对其增强的抑制能力很重要。为了验证这种可能性，我们采用了一种间接方法，即使用药理学抑制剂抑制电子传递链的不同复合物，并评估线粒体代谢在调节 抑制能力中的相关性。在iT 分化48小时时，分别使用鱼藤酮或抗霉素A抑制电子传递链的复合物I或复合物III，对 的活力或FoxP3表达没有影响(图S3，C和D)。有趣的是，在鱼藤酮存在下分化的 具有高度免疫抑制性，因为与用鱼藤酮处理的iT 共培养的T细胞的增殖和干扰素 (IFN- )产生均显著降低。相反，在 分化过程中抑制复合物III会损害其抑制潜力(图3，L和M)。考虑到电子传递链通过复合物I部分起作用，导致三羧酸循环中间体 -KG、琥珀酸和2-羟基戊二酸积累，从而促进 功能障碍，如报道的那样(28)，因此推测复合物III抑制介导的iT 功能障碍。为了进一步证实CD38-NAD 轴介导的线粒体活性限制对于 的卓越抑制功能至关重要，我们使用WT和 重复了实验。虽然 表现出受损的抑制潜力，但当在复合物I抑制剂(鱼藤酮)而非复合物III抑制剂(抗霉素A)存在下分化时，它们的抑制功能显著恢复到与WT 相当的水平(图S3E)。这些发现强烈表明， 增强的抑制功能是由CD38-NAD 轴调节的受限线粒体活性驱动的。
为了阐明鱼藤酮介导的超免疫抑制是否部分归因于三羧酸循环中间体生成减少，我们进行了代谢组学分析。尽管柠檬酸盐水平很高，但在鱼藤酮存在下分化的 中，下游代谢物 -KG和琥珀酸显著降低(图3，N至R)。相应地，鱼藤酮处理的 中的氧消耗率水平显著降低，而其细胞外酸化率水平有适度增加，可能是为了补偿其生物能量需求(图S3，F和G)。
由于在表达CD38的 细胞中已报道存在线粒体损伤(20)，我们研究了单独的CD38介导的线粒体功能障碍是否足以赋予 细胞抑制功能，而不依赖于FoxP3表达。然而，与 相比， 细胞未表现出任何显著的抑制功能(图S3，H至J)。总体而言，这些数据表明线粒体氧化代谢在调节 的抑制功能中起关键作用，并且CD38限制氧化代谢，赋予 更高的免疫抑制能力。
CD38介导的细胞内NAD 池耗竭通过调节线粒体代谢来调节 的功能和稳定性
CD38是一种NAD酶，据报道可维持细胞内NAD 池(29)。细胞内NAD 含量通过作为各种脱氢酶的辅酶来调节多种代谢过程，包括三羧酸循环，这些脱氢酶催化 还原为 ，随后用于电子传递链中的氧化还原反应(30)。为了阐明CD38是否通过调节细胞内 池来影响线粒体代谢，我们首先检查了 和 中的 含量。我们发现 中的 水平显著较低，尽管 和 之间参与 生物合成的基因表达相当，这表明 中 水平降低是CD38介导的 利用的结果(图4A和图S4A)。此外，与 相比， 中的 水平也较低(图S4B)。接下来，我们检查了 中低 含量是否与线粒体代谢降低相匹配。代谢组学分析显示，与 相比， 中 的线粒体代谢物，包括柠檬酸、 -酮戊二酸、富马酸和苹果酸水平显著较低(图4B)。
图3. CD38表达限制Treg中的线粒体代谢。(A至G)将 分选到CD38 和CD38 亚群中，用于测定:(A)对葡萄糖、寡霉素和2-脱氧葡萄糖的细胞外酸化率(ECAR)；(B)添加葡萄糖后的糖酵解速率；(C)糖酵解能力；(D)基础条件下及对所示不同抑制剂的氧消耗率(OCR)；(E)基础呼吸能力；(F)最大呼吸能力；以及(G)备用呼吸能力。数据代表四个[(A)至(G)]独立实验。(H至K)评估野生型和CD38 Treg的(H)基础条件下及对所示抑制剂的OCR、(I)基础呼吸能力、(J)最大呼吸能力和(K)备用呼吸能力。数据代表四个[(H)至(K)]独立实验。(L和M)在存在或不存在鱼藤酮(Rote；1 μM，在48小时添加)和抗霉素A(Anti；1 μM，在48小时添加)的情况下分化Treg。洗涤后，将它们与经CTV标记的T细胞在T细胞激活混合物(抗CD3/CD28)存在下共培养3天。(L)通过CTV稀释评估CD8 T细胞增殖。相邻的柱状图显示来自四个独立实验的数据。(M)使用(L)中的上清液测量IFN-γ水平。(N至R)基于质谱(MS)测定在存在或不存在鱼藤酮(Rote；1 μM，在48小时添加)的情况下分化的iTreg中所示细胞内代谢物。数据代表四个独立实验。* ；** ；*** 。
为了确定 在调节线粒体活性以及随后在高表达CD38的 的抑制功能中的作用，我们在iT 分化过程中通过补充NAD 前体烟酰胺单核苷酸(NMN)来补充细胞内 水平。补充NMN确实增加了 中的细胞内 水平，但对 的活力或分化没有不利影响(图S4，C至E)。补充NMN恢复了CD- 中的线粒体代谢，各种三羧酸循环代谢物水平的增加和线粒体呼吸的改善证明了这一点；然而，它对 的糖酵解没有影响(图4，C至G和图S4F)。
接下来，我们试图确定通过补充细胞内 含量来恢复 中的线粒体活性是否会影响其抑制功能。NMN处理显著降低了 的抑制功能，并且发现该效应具有剂量依赖性(图4，H和I，以及图S4，G和H)。即使在较高剂量的NMN下，我们也未发现细胞活力降低或Tregs分化缺陷(图S4，I和J)。与NMN类似， 的另一种前体烟酰胺核糖(NR)的补充也影响了CD38 iT 的抑制潜力(图S4，K和L)。这些数据共同表明， 中CD38的表达对于维持其细胞内 水平至关重要，而这反过来又支持其线粒体代谢。这一过程可能对 的稳定性和功能至关重要。
接下来，我们旨在阐明线粒体活性降低促进CD38 iT 卓越功能和稳定性的机制。多项研究已确定Foxp3基因座的去甲基化，特别是在三个特征明确的保守非编码区域(CNS1至CNS3)，是控制 分化、稳定性和功能的关键表观遗传修饰(31 - 34)。因此，我们首先评估了Foxp3基因座的CpG甲基化。与 相比， 中CNS2以及CNS1和CNS3的甲基化程度较低(图S4M)。在比较 和 时，我们发现与 相比，CD38 iT 中所有三个CNS区域的甲基化程度都非常低，这突出了 卓越稳定性和功能的机制基础(图4J)。
由于三羧酸循环代谢物α-酮戊二酸( -KG)已被证明可调节DNA甲基化，包括Foxp3基因座中的区域(11)，我们试图确定 中Foxp3基因座低甲基化状态的维持是否归因于其降低的α-酮戊二酸( -KG)水平。为此，我们用细胞可渗透的α-酮戊二酸( -KG)补充 诱导性调节性T细胞(iTregs)培养物，随后评估中枢神经系统区域的甲基化和抑制功能。我们观察到补充α-酮戊二酸( -KG)显著增加了Foxp3基因座CNS2和CNS3的甲基化，并使CD38 诱导性调节性T细胞(iTregs)功能受损(图4，K和L)。值得注意的是，补充烟酰胺单核苷酸(NMN)的CD38 诱导性调节性T细胞(iT )，其α-酮戊二酸( -KG)水平升高，在Foxp3基因座的中枢神经系统区域也表现出甲基化增加(图4M)。为了进一步研究烟酰胺单核苷酸(NMN)或α-酮戊二酸( -KG)诱导的高甲基化是否会破坏FoxP3表达，我们评估了补充后 中的FoxP3水平。虽然在早期时间点(处理后24小时)FoxP3表达未受影响，但在额外培养2天后观察到显著降低，这进一步证明了烟酰胺单核苷酸(NMN)或α-酮戊二酸( -KG)介导的中枢神经系统区域高甲基化会使 随着时间的推移易发生FoxP3丢失和功能不稳定(图S4，N和O)。总体而言，这些数据表明 中的CD38作为一个代谢检查点，调节细胞内 含量以确保线粒体代谢受限和三羧酸循环代谢物的产生，特别是α-酮戊二酸( -KG)，其会对 的稳定性和功能产生不利影响。
CD38 -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 轴重定向乳酸代谢以在 中生成磷酸烯醇式丙酮酸
乳酸的摄取和代谢是肿瘤内α-酮戊二酸( )的一个标志(7, 8)。鉴于CD38表达在重塑 的代谢特征中起独特作用，我们探讨了该轴是否有助于乳酸的有效代谢，使 能够保持其特性和功能。与先前的研究(8)一致，我们观察到与 相比，诱导性调节性T细胞(iT )摄取乳酸的倾向更大(图S5A)。 和 之间的乳酸摄取相当(图S5B)。由于乳酸代谢已被证明会深刻影响 的功能，我们假设尽管乳酸摄取相当，但 和CD38 代谢乳酸的能力可能不同，从而导致不同的功能结果。
乳酸的代谢命运通常由两种酶决定:丙酮酸脱氢酶(PDH)和丙酮酸羧化酶(PC)(15)。PDH将乳酸衍生的丙酮酸转化为乙酰辅酶A(CoA)，以便进一步进入三羧酸循环，而PC则促进乳酸衍生的丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)，随后草酰乙酸被磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)转化为磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，用于糖异生(15)。为了评估这些酶在 和 中乳酸代谢的贡献，我们首先在无葡萄糖培养基中用均匀标记的 L-乳酸孵育细胞18小时，追踪乳酸的代谢命运。我们追踪了 掺入乙酰辅酶A和PEP的情况，分别反映了乳酸进入三羧酸循环或糖异生的情况。值得注意的是， iT 显示出 向PEP(M+3)的分配显著更高，而 在乙酰辅酶A(M+2)中的 标记虽有增加但不显著(图5，A和B)。这些发现表明乳酸的代谢途径存在差异，CD38 iT 有利于糖异生，这一特征在肿瘤内 中也有观察到。相比之下， 似乎优先参与三羧酸循环。此外，与之前将低 水平与乳酸氧化为丙酮酸减少相关的报道一致(7)，我们观察到与 相比， 中 掺入丙酮酸的量有适度但不显著的减少(图5C)。
接下来，为了评估PC介导的乳酸在糖异生中的代谢途径是否是维持
图4. CD38-NAD 轴调节调节性T细胞中的线粒体代谢和抑制功能 - (A和B)将分选到CD38 和CD38 亚群中的 用于确定:(A)细胞内NAVb 水平，以及(B)使用质谱法测定所示细胞内代谢物。(C至G)将通过荧光激活细胞分选术(FACS)分选的CD38 调节性诱导T细胞(riTregs)在存在或不存在烟酰胺单核苷酸(NMN，500μM)的情况下培养过夜，并用于(C)使用质谱法测定所示细胞内代谢物，(D)基础条件下以及对所示抑制剂反应后的耗氧率(OCR)，(E)基础呼吸能力，(F)最大呼吸能力，以及(G)备用呼吸能力。(H至I)将在存在或不存在NMN的情况下培养过夜的 调节性诱导T细胞(Tirags)与经羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CTV)标记的初始T细胞在T细胞激活鸡尾酒(抗CD3/CD28)存在下共培养3天，并评估(H)通过CTV稀释对反应性CD8 T细胞增殖的反应，以及(I)测量(H)中所示实验上清液中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。(I)对CD38 和CD38 调节性诱导T细胞进行基于定量聚合酶链反应(qPCR)的叉头框蛋白3(Foxp3)基因座中枢神经系统(CNS)区域的CpG甲基化分析。(K和L)将在存在或不存在细胞可渗透的α-酮戊二酸(α-KG，100μM)的情况下培养过夜的CD38 调节性诱导T细胞用于评估(K)Foxp3基因座中枢神经系统区域的CpG甲基化，以及(L)在T细胞激活条件下与初始T细胞共培养3天后通过测量反应性 T细胞增殖来评估抑制潜力。(M)对补充有NMN的CD38 调节性诱导T细胞进行基于qPCR的Foxp3基因座中枢神经系统区域的CpG甲基化分析。数据代表三个(A)、三个(B)、六个(C)、四个[(D)至(I)]、五个[(J)和(K)]以及三个[(L)和(M)]独立实验。 。
《科学进展》|研究论文
图5. CD38对于调节性T细胞(Tregs)利用乳酸的代谢适应性及维持抑制功能至关重要。(A至C)在含有 L-乳酸的无葡萄糖培养基中过夜培养的 和 中，(A)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、(B)乙酰辅酶A和(C)丙酮酸的同位素异构体分布。(D和E) 在无葡萄糖、含L-乳酸的培养基中分化，并分选到CD38 群体中。然后在相同的含L-乳酸的培养基中用指定的抑制剂处理过夜，并用于在T细胞激活混合物(抗CD3/CD28)存在下与CTV标记的初始T细胞共培养3天，并通过(D)通过CTV稀释评估 T细胞增殖，以及(E)测量(D)中所示实验上清液中的IFN-γ水平。(F)在用指定的RNA干扰介导的敲低后，将初始T细胞与在无葡萄糖、含L-乳酸的培养基中分化的CD38 Tires共培养3天后，通过CTV稀释评估T细胞增殖。(G至J)诱导性调节性T细胞(iTregs)在无葡萄糖、含1-乳酸的培养基中分化，并分选到CD38 群体中，然后用烟酰胺单核苷酸(NMN)和指定的抑制剂进行过度拟合处理。然后评估细胞的(G)基础条件下以及对指定抑制剂反应后的耗氧率(OCR)，(H)Foxp3基因座CNS1区域的CpG甲基化，(I)CNS2区域的CpG甲基化，以及(J)CNS3区域的CpG甲基化。(K和L)在无葡萄糖、含L-乳酸的培养基中分化的经NMN处理和未处理的CD38 iTregs在抗CD3/CD28存在下与CTV标记的初始T细胞共培养3天。(K)通过CTV稀释评估 T细胞的增殖，并且(L)使用(K)中的上清液测量IFN-γ水平。数据代表三个[(A)至(C)]、三个[(F)至(J)]、四个[(D)和(E)]以及四个[(K)和(L)]独立实验。* ；** ；*** ；***** 。
，我们阻断了该酶并检查了其功能。值得注意的是，在乳酸培养基甚至完全培养基(CM)中培养的 中抑制丙酮酸羧化酶(PC)显著抑制了它们的功能，而在用丙酮酸脱氢酶(PDH)抑制剂处理时，功能没有明显受损(图5，D和E，以及图S5，C和D)。通过使用靶向PC和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的RNA干扰进一步证实了糖异生在促进 功能方面的关键作用(图5F和图S5E)。
为了探究 中丙酮酸羧化酶(PC)将乳酸盐导入糖异生的潜在机制，我们研究了细胞内 池是否起决定性作用。由于丙酮酸脱氢酶(PDH)是一种依赖 的酶，我们推测CD38通过消耗 池，促使乳酸盐通过PC而非PDH被利用。为了阐明这一点，我们在富含乳酸盐的培养基中培养 i 时添加了烟酰胺单核苷酸(NMN)，并检测了它们的功能。我们观察到，在富含乳酸盐的培养基中培养的CD38 iT 中添加NMN可改善其线粒体氧化磷酸化(OX-PHOS)，并逆转Foxp3基因座处的DNA低甲基化(图5，G至J)。在富含乳酸盐的培养基中培养的CD38 iT 中抑制PC而非PDH时，也观察到了类似的效果(图5，G至J)。此外，与OXPHOS增加和中枢神经系统甲基化一致，添加NMN减轻了CD38 iT 的抑制功能(图5，K和L)。最后，我们评估了在富含乳酸盐的条件下， (其细胞内NAD 水平固有升高)中的OXPHOS。我们的研究结果表明，在存在乳酸盐的情况下，CD38缺陷增强了OXPHOS(图S5，F至I)，突出了CD38-NAD 轴在调节 中乳酸代谢的关键作用。总之，这些发现确立了CD38-NAD 轴是 代谢适应性的关键决定因素，使它们能够在富含乳酸盐的肿瘤微环境(TME)中茁壮成长。
小分子靶向CD38可减轻 功能并改善小鼠的抗肿瘤反应
在确定CD38对于在富含乳酸盐的环境中维持 功能和稳定性至关重要后，我们接下来试图将我们的发现扩展到肿瘤微环境(TME)。为此，用其同源抗原激活gp100反应性T细胞受体(TCR)转基因CD8 T细胞(Pmel T细胞)3天，并将其与经CellTrace Violet(CTV)标记的野生型(WT)或 以1:1的比例过继共转移到皮下接种肿瘤10天的B16-F10黑色素瘤荷瘤小鼠体内。在过继转移后48小时取回时，未与调节性T细胞(iTregs)一起转移的Pmel T细胞在肿瘤部位明显丰富，比在脾脏和引流淋巴结中更丰富，这可能是由于抗原驱动增殖。将这些细胞与WT i 共转移显著降低了它们在TME中的频率。然而，当Pmel T细胞与 共转移时，仅观察到适度降低(图6A)。与这些发现一致，对转移的 群体的分析显示，与WT 相比，肿瘤部位 的频率大幅降低，而它们在脾脏和引流淋巴结中的频率保持相当(图6B)。这些发现表明，CD38缺陷损害了TME中的 功能，从而允许Pmel T细胞有更大的增殖。
鉴于CD38在 功能和稳定性中起关键作用，我们接下来探讨了小分子抑制CD38是否能增强抗肿瘤反应。为了研究这一点，我们首先在肿瘤衍生上清液(TDS)存在的情况下，对体外分化的 进行了这种方法的测试。我们观察到，与在CM中分化的 相比，在TDS中分化的 具有适度但显著更强的抑制作用。用78c抑制CD38(以下简称CD38i)降低了在TDS和CM中分化的 的抑制功能(图6C)。与在CM中分化的 相比，在TDS中分化的 的功能损害更明显，这表明 根据碳源经历不同的代谢适应，这使得它们对CD38抑制介导的功能损害有不同的敏感性。与这些发现一致，与在CM中分化的 相比，在 TDS中分化的 表现出严重的功能损害(图S6A)。
接下来，我们评估了CD38i处理的iTregs中Foxp3基因座的甲基化状态。在CM和30% TDS条件下分化的 中，CD38i处理诱导了Foxp3基因座CNS2区域的高甲基化。在 TDS中分化的 中，CNS2的高甲基化更明显，进一步支持了在这些细胞中观察到的CD38抑制后的严重功能损害(图6D)。
最后，考虑到缺氧在促进TME内 功能方面已确立的作用(35,36)，我们评估了CD38抑制对在缺氧条件下分化的 的影响。与我们对TDS培养的iT 的观察结果相似，CD38抑制显著损害了在缺氧条件下分化的 的抑制功能(图S6B)。
为了评估CD38i的治疗效果，我们将携带人类相关突变(BrafV600E；Cdkn2a ；Pten ；酪氨酸酶:CreERT2)的YUMM1.7小鼠黑色素瘤肿瘤皮下移植到B6小鼠体内。我们每周用CD38i治疗小鼠一次，直到载体对照处理的小鼠的肿瘤体积达到人道终点。我们观察到CD38i治疗显著延迟了肿瘤生长(图6E)。对 群体的分析表明，CD38i治疗显著降低了肿瘤内 的频率，而不影响脾脏或DLN中 的频率(图6F)。肿瘤内 的减少改善了肿瘤部位的 与 的比例(图6G)，并显著增加了肿瘤部位多功能 细胞的比例(图6，H至J)。
为了进一步研究CD38i是否直接影响肿瘤内 的稳定性，我们在另一组YUMM1.7荷瘤小鼠中重复了该实验。在安乐死的前一天，我们腹腔注射了5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)。BrdU掺入分析显示，肿瘤微环境中的CD38 比CD38 增殖性更强(图6K)。CD38i治疗显著降低了它们的增殖(图6L)。这些数据表明，抑制CD38会使肿瘤内的 在代谢上无法在肿瘤微环境中茁壮成长，导致稳定性丧失和增殖减少。
讨论
了解免疫细胞如何在代谢上适应其局部微环境(这会影响它们的功能和持久性)，对于设计调节宿主对各种病理状况的免疫反应的策略变得至关重要。先前的研究已经证明了 的代谢可塑性，使它们能够以组织特异性的方式重新调整其代谢特征(7, 13, 37)。值得注意的是，肿瘤内的 已显示出对利用乳酸的代谢依赖性，从而保持其细胞特性和功能(7, 8)。然而，使肿瘤内的 能够重新调整其代谢以利用乳酸从而支持其在肿瘤微环境中的功能的确切机制仍不清楚。本研究表明， 中的CD38-NAD 轴在指导乳酸的代谢途径中起关键作用，这对于确保 在肿瘤微环境中的稳定功能和存活似乎至关重要。
图6. 靶向CD38的小分子损害肿瘤内调节性T细胞并引发抗肿瘤反应。(A) 来自皮下接种10天的B16F10黑色素瘤小鼠的过继转移Pmel(CD8*Vp13*)T细胞的频率。相邻柱状图代表来自 小鼠的数据。(B) 柱状图描绘了(A)中荷瘤小鼠供体 群体(Foxp3 CTV)的频率。(C和D) 在有或没有CD38i的情况下，调节性T细胞在完全培养基(CM)或30% TDS中分化，并通过检查共培养中CTV标记的CD8 T细胞的增殖来评估(C)抑制潜力，以及(D) Foxp3基因座的CNS1、CNS2和CNS3区域的CpG甲基化。数据代表四个(C)和三个(D)独立实验。(E至J) 皮下接种YUMM1.7黑色素瘤肿瘤的C57BL/6小鼠(每组 只小鼠)用载体对照或CD38i(15 mg/kg，腹腔注射，每周一次)处理，并评估(E)肿瘤生长；(F) 脾脏、引流淋巴结和肿瘤部位的T 频率；(G) 肿瘤部位T 与T 比值的评估；以及[(H)至(J)] 肿瘤部位的CD T细胞在体外再刺激后共同产生不同效应细胞因子的能力。TNF-α，肿瘤坏死因子 。(K和L) (K) CD38 和CD38 肿瘤内调节性T细胞以及(L) 来自对照和CD38i处理小鼠的肿瘤内调节性T细胞中的BrdU掺入。代表性数据来自五个[(E)至(L)]独立样本。 ** *** *** 。FSC-A，前向散射面积。
虽然 表现出组织特异性的代谢适应性，但肿瘤微环境(TME)中的过程似乎更为复杂，这主要归因于肿瘤内 中观察到的独特代谢特征(7, 9, 10)。新出现的证据表明，乳酸是肿瘤内 的主要碳源。因此，为了有效代谢乳酸并支持它们在TME中的功能和存活，这些细胞必须采用与外周 不同的机制，外周 通常依赖于乳酸以外的碳源(27)。最近一项研究肿瘤内 中乳酸钠的代谢通量的研究发现了一个有趣的现象:肿瘤内 倾向于从三羧酸循环(TCA)衍生来的苹果酸生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)并促进糖异生(8)。这一发现表明，肿瘤内 中线粒体TCA循环中乳酸衍生的丙酮酸的稳定掺入可能受到限制，因为一部分苹果酸被转运出线粒体以促进糖异生。同样，其他研究小组的研究也表明肿瘤内 中线粒体功能和适应性受损，发现线粒体异常会增强它们的抑制功能(9, 11)。我们的数据与之前的研究一致，将CD38定位为肿瘤内 线粒体活性的关键调节因子。我们发现 中线粒体活性受限部分是由于CD38介导的细胞内 含量的消耗。我们推测，表达CD38的 中 含量的减少阻碍了它们有效驱动TCA循环的能力，因为关键的脱氢酶反应受到关键辅酶 供应有限的限制。我们观察到高表达CD38的 中各种TCA循环代谢物水平降低，通过补充 前体烟酰胺单核苷酸(NMN)和烟酰胺核糖(NR)来补充细胞内 水平可以改善这种情况。由于其II型取向，CD38长期以来一直被认为是一种外核苷酸酶，其催化结构域面向细胞外。然而，最近的研究结果表明它具有III型取向，催化结构域面向细胞质(38, 39)。这种双重取向为CD38调节细胞内 水平提供了一种机制，如在 和其他细胞类型中观察到的那样(40)。在本研究中，我们观察到CD38介导的细胞内 水平调节通过调节TCA循环衍生的 -酮戊二酸( -KG)的产生来影响 的抑制功能，这反过来又通过影响Foxp3基因座中枢神经系统区域的甲基化来影响诱导性调节性 (iT )的稳定性。通过评估在NMN和 -KG存在下分化的 的稳定性，证实了这一观点，这使得 在延长的培养期内更容易失去FoxP3表达。
我们的数据揭示了肿瘤中 代谢的一个非常关键的方面。我们发现，受限的线粒体代谢对于 控制三羧酸循环产生的 -酮戊二酸水平至关重要，据报道，这通过促进Foxp3基因座的甲基化来影响 的稳定性和功能(11)。当 在乳酸培养基或肿瘤条件培养基(TCM)中培养以模拟肿瘤微环境中可用的碳源时，由于维持影响三羧酸循环的低 水平，CD38主要将乳酸衍生的丙酮酸的代谢途径导向磷酸烯醇式丙酮酸，而不是它们在三羧酸循环中的完全氧化。此外，我们注意到在乳酸培养的 中，PC介导的丙酮酸向草酰乙酸的转化更受青睐，这表明CD38介导的低 含量重塑了 的代谢特征，使其经历支持糖异生的替代代谢途径。这种代谢转向对于以乳酸为食的 似乎极其关键，因为增加细胞内 含量会使乳酸衍生的丙酮酸进入三羧酸循环的方向重新定向，导致FoxP3基因座处的甲基化显著增强，随后影响 的功能。需要注意的是，与在CM中培养的 相比， 补充介导的代谢调节导致表达CD38的 功能受损，在乳酸或TCM中培养的 中非常明显。这些差异可能是由于 根据环境中可用的营养物质采用了不同的代谢特征，如先前报道的 。
最后，该研究调查了靶向CD38以增强抗肿瘤免疫力的治疗潜力。对荷瘤小鼠进行CD药理抑制导致肿瘤内 显著减少， 与 的比率提高，肿瘤生长延迟。这些发现表明，抑制CD38可能是一种可行的策略，通过影响 的代谢适应性来破坏肿瘤微环境中 介导的免疫抑制。值得注意的是，抑制CD38选择性地破坏了肿瘤内表达CD38的 的增殖，而外周 不受影响。与我们的观察结果类似，在多发性骨髓瘤患者中用 单克隆抗体isatuximab靶向 已被证明可减轻 介导的抑制，并同时改善自然杀伤(NK)和 T细胞的效应反应，且无任何全身毒性(22)。此外， 也被认为在调节髓源性抑制细胞和终末耗竭T细胞的功能中起作用，这两者在抑制持久的抗肿瘤反应中都很关键(17, 43)。因此，我们提出小分子靶向CD38可以减轻肿瘤部位的免疫抑制环境，为 和 细胞建立有效的抗肿瘤反应营造有利环境。
总体而言，研究结果强调了CD38在调节肿瘤内 的功能和代谢适应性方面的关键作用。通过调节 水平和线粒体活性，CD38确保了 的稳定性和抑制能力，进而支持肿瘤生长。该研究结果为靶向CD38以调节 功能和提高抗肿瘤免疫力的潜在治疗干预铺平了道路。
材料与方法
小鼠
C57BL/6小鼠在CSIR - 印度化学生物学研究所(IICB)的无病原体设施中饲养繁殖。CD38 小鼠购自杰克逊实验室(缅因州巴尔港)。所有实验方案均经印度CSIR - IICB机构动物伦理委员会批准(参考编号:IICB/AEC/Meeting/ Sep/2019/13)。随机选择6至8周龄的雄性和雌性小鼠进行实验。在肿瘤对照实验中，纳入相同年龄组的等量雄性和雌性小鼠。
人类样本
在获得所有人类患者的书面知情同意后，由医务人员采集接受过新辅助化疗的MIBC和乳腺癌患者(包括三阴性乳腺癌(TNBC)和非TNBC)的手术切除肿瘤组织(在生理盐水中1至 )和外周血(在肝素管中3至 )，分别获得印度加尔各答IPGME&R和SSKM医院机构审查委员会(IRB)(参考编号:IPGME&R/IEC/2020/624)以及印度加尔各答R.G. Kar医学院和医院(2023年6月15日备忘录编号:RKC/892)的伦理批准。人类样本的使用符合印度加尔各答CSIR - IICB的安全规定。
细胞系
B16 - F10和YUMM1.7黑色素瘤细胞系购自美国典型培养物保藏中心。EL4购自印度浦那国家细胞科学中心。所有细胞系在使用前使用Myco - Alert支原体检测试剂盒(Lonza)确认无支原体污染。所有体内实验使用4至6代之间的细胞。
TDS的制备
将YUMM1.7黑色素瘤细胞(每只小鼠 )皮下注射到C57BL/6野生型小鼠的侧腹。当肿瘤体积达到 时对小鼠实施安乐死。将肿瘤解离成单细胞悬液，并以 个细胞 的浓度接种于完全RPMI 1640培养基中。在 培养箱中过夜培养后，将培养基离心、过滤并储存在 以备将来使用。
Tregs分化和培养条件
使用美国赛默飞世尔科技公司的Dynabeads非接触式小鼠CD4 T细胞分离试剂盒，从6至8周龄小鼠的脾细胞中分离出幼稚CD4 T细胞。这些细胞在包被有小鼠抗CD3 ( ) 和抗CD28 ( ) 的情况下，[使用转化生长因子- 、白细胞介素-2 (IL-2; )、抗小鼠干扰素- 和抗小鼠白细胞介素-4 ] 分化为诱导性调节性T细胞 (iTregs) 或 [用白细胞介素-2 和白细胞介素-12 ] 分化为 。分化在补充有 胎牛血清 (FBS; 美国赛默飞世尔科技公司)、1% 青霉素-链霉素 (印度HiMedia实验室) 和 -巯基乙醇 ( -ME) (美国赛默飞世尔科技公司) 的完全RPMI 1640培养基中进行，并在 条件下于 的湿度培养箱中培养3天。在一些实验中，在 分化的第2天，用特异性抑制剂 ( 鱼藤酮和 抗霉素) 处理细胞，并在第3天收获用于下游分析。在其他实验中， 在第3天通过荧光激活细胞分选 (FACS) 分选到CD38 和CD38 群体中，并在白细胞介素-2 (100 U/ml) 中维持直至使用。在某些情况下，通过FACS分选的CD38 iTregs用烟酰胺单核苷酸 (NMN; 500μM)、烟酰胺核糖 (NR; 400μM) 或二甲基α-酮戊二酸 处理过夜，然后用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 彻底洗涤，并用于后续分析。为了评估Foxp3的稳定性， 用烟酰胺单核苷酸 (NMN; 500μM) 或二甲基 -酮戊二酸 处理过夜，然后在白细胞介素-2 (100 U/ml) 存在下再培养2天。
对于乳酸喂养的 研究，细胞在补充有 L-乳酸的CM或无葡萄糖培养基中分化。在第3天，分选的 在含有白细胞介素-2 (100 U/ml) 的各自培养基中培养过夜，有或没有抑制剂 (分别为100μM PCi或100μM PDHi)。在某些情况下，3天激活的iTregs在含有30% TDS的培养基或CM中，与CD38i (5μM)、烟酰胺单核苷酸 (NMN; 500μM) 或载体对照一起，再进一步培养两天。
对于一些研究，将未分化的 细胞在低氧 或常氧 条件下分化为 ，持续3天，随后用于分析。
在其他实验中，在补充有 胎牛血清的完全RPMI 1640培养基中，使用包被在平板上的抗CD3( )和抗CD28( )，并在存在IL-2(100 U/ml)的情况下，激活纯化的未分化CD4 T细胞72小时。激活后，使用包被在平板上的抗CD3 持续刺激TCR长达7天。细胞每48小时传代一次，并在存在IL-2(25 U/ml)的情况下维持培养。长期扩增的T细胞用于后续分析。
对于人类 或 的分化，使用Ficoll-Hypaque梯度离心从健康人类供体的血沉棕黄层中分离外周血单核细胞(PBMCs)。血沉棕黄层在使用前进行匿名处理，所有样本均按照机构审查委员会(IRB)批准(编号IICB/IRB/2020/2P)进行处理。纯化的未分化CD4 T细胞在[存在TGF- 、IL-2(300 U/ml)、抗人IFN- 和抗人IL-4(10μg/ml)的情况下]分化为诱导调节性T细胞(iTregs)，或在[存在IL-2(100 U/ml)的情况下]分化为 。在补充有10%胎牛血清(美国赛默飞世尔科技公司)和1%青霉素-链霉素(印度HiMedia实验室)的完全RPMI 1640培养基中，使用包被在平板上的人抗CD3( )和抗CD28( )，在5% 、 的湿度培养箱中进行分化培养3天。在所有实验中， 在用于共培养之前用PBS彻底洗涤。
T细胞抑制分析
从野生型C57BL/6小鼠脾脏中分离出幼稚T细胞，并按照美国赛默飞世尔科技公司的CellTrace Violet细胞增殖试剂盒的制造商说明，用CTV进行标记。然后将标记有CTV的T细胞以每孔 个细胞的密度接种到96孔板中，同时加入 ，比例各不相同:1:1比例时每孔 个细胞， 比例时每孔 个细胞， 比例时每孔 个细胞，1:0.10比例时每孔 个细胞。除阴性对照组外，细胞在可溶性小鼠抗CD3和抗CD28抗体(各 )存在的情况下共培养3天。设立阳性对照组以评估在无 情况下的T细胞增殖。共培养第3天，通过在 以 离心96孔板收集上清液，并在 保存，直至用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量IFN- 水平。将细胞沉淀溶解于PBS中，随后通过流式细胞术测量CTV稀释度来评估 细胞增殖。对于用人 进行的抑制试验，将新鲜分离的幼稚T细胞用CTV标记，并与乱序或CD38 shRNA转导的 共培养。
siRNA介导的敲低
将新鲜分离的小鼠幼稚 细胞分化为 ，并用荧光激活细胞分选术(FACS)分选 。为了实现PC/PEPCK的敲低，用150 nM靶向PC/PEPCK的小干扰RNA(siRNA)(MISSION esiRNA；西格玛奥德里奇公司)对CD38 iT 进行电穿孔。电穿孔后，细胞培养48小时，然后进行功能研究。在转录水平上PC/PEPCK表达至少降低40%的实验中进行功能差异的统计验证。
T细胞的慢病毒转导
人胚肾(HEK)293T细胞在转染前于T75培养瓶中培养。使用 和HBS方法，将编码CD38 shRNA(Origene)或乱序阴性shRNA(Origene)的慢病毒质粒DNA与结构质粒ps - PAX2和p - MD2G一起转染HEK293T细胞。24小时后，将培养基换成含低血清的培养基。换液4小时后，以 浓度加入丁酸钠，细胞再孵育48至72小时，之后收集含慢病毒的上清液并过滤。按照制造商的方案，使用LentiX Concentrator(Takara Bio，日本新潟)浓缩病毒含量，并在 保存为等分试样直至使用。分化3天后，收集人iT ，洗涤后转移到用RetroNectin( )(Takara Bio)包被过夜的未处理组织培养24孔板(美国纽约康宁公司)上。用浓缩的CD38 shRNA慢病毒/对照shRNA慢病毒颗粒转导细胞，并在 以 离心接种2小时，接种后加入IL - 2，然后在 于 培养箱中培养48小时。
流式细胞术
表面染色通过在冰上用1:200稀释的抗体在FACS缓冲液(PBS中含0.5%牛血清白蛋白和0.1%叠氮化钠)中孵育细胞20分钟进行。对于细胞内细胞因子染色，用佛波醇12 - 肉豆蔻酸酯13 - 乙酸酯 、离子霉素{{F(此处原文似乎有误，推测应为“ionomycin ”)}}刺激T细胞4小时，加入GolgiPlug(BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞)，然后对表面标志物进行染色。然后按照制造商的方案，使用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞)固定并通透细胞。在固定/通透的细胞中进行细胞内细胞因子染色。对于FoxP3染色，细胞先进行表面标志物染色，然后使用FoxP3染色缓冲液套装(赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)固定并通透，随后用于FoxP3染色。为评估BrdU掺入，用FoxP3染色缓冲液套装固定细胞，在脱氧核糖核酸酶处理后进行BrdU染色。
对于所有样品，在表面染色后，在用可固定的活/死细胞染料(赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Live/Dead fixable yellow dead cell stain kit)孵育细胞后，再进行进一步分析。所有染色样品使用BD LSRFortessa(BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞)采集，并使用FlowJo软件(BD Biosciences)进行分析。抗体详情见表S1。
qPCR分析
对于实时定量聚合酶链反应(qPCR)分析，使用TRIzol试剂(赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)裂解细胞，并按照TRIzol提取方案分离RNA。分离的RNA重悬于超纯水(赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)中，并用Biotek Synergy HT酶标仪定量。从1μg RNA中，使用iScript cDNA合成试剂盒(美国伯乐公司)合成cDNA，并在无核酸酶水中稀释1:3用于qPCR反应。使用iTaq Universal SYBR Green Supermix(美国伯乐公司)在CFX96实时系统(美国伯乐公司)上进行qPCR，以标准反应速度共进行40个循环。引物详情见表S2。
乳酸摄取测定和细胞内NAD 测定
使用乳酸 - Glo检测试剂盒(美国普洛麦格公司)按照制造商的方案在每组 细胞中测量乳酸摄取。使用Varioskan LUX多功能读数仪(美国赛默飞世尔科技公司)对发光进行定量。
使用基于细胞的NAD/NADH检测试剂盒(美国开曼化学公司)在每组 细胞中测定细胞内 含量。使用MULTISKAN SkyHigh(美国赛默飞世尔科技公司)在 处测量吸光度。
酶联免疫吸附测定
根据制造商的方案，使用小鼠IFN - 未包被ELISA试剂盒(美国赛默飞世尔科技公司)测量培养上清液中的IFN - 水平。
代谢通量测定
使用Seahorse XFe24分析仪(安捷伦科技公司)进行代谢通量分析。简要地说，将 细胞接种在涂有Cell - Tak(康宁公司)的Seahorse培养板上过夜，并在 下于不含 的培养箱中孵育 以使细胞贴壁。为了评估糖酵解，在基础条件下并响应葡萄糖 (西格玛奥德里奇公司)、寡霉素(1.0 μM；开曼化学公司)和2 - DG(100 mM；西格玛奥德里奇公司)测量细胞外酸化率(ECAR)。为了评估氧化磷酸化，在基础条件下并响应寡霉素 、羰基氰化物 - 三氟甲氧基苯腙(FCCP； )以及鱼藤酮加抗霉素A(分别为2 μM和100 nM)测量氧消耗率(OCR)。一些实验进行了微小修改；在基础条件下或响应烟酰胺单核苷酸/载体对照进行OCR/ECAR分析，随后是寡霉素 、FCCP 以及鱼藤酮和抗霉素A 和 。
代谢组学和稳定同位素示踪
对于代谢组学研究，采集 细胞，在进行统计分析之前，将样品标准化至考马斯亮蓝法测定值。使用冰冷的80%甲醇进行代谢淬灭和代谢物提取，随后在干冰中进行四个冻融循环。在 下以14,000 rpm离心15分钟去除细胞碎片。然后收集上清液并保存在 。所有样品在通风橱内的氮气流中蒸发。蒸发后的样品溶解在质谱(MS)级水中，并放入赛默飞世尔科技公司的Ultimate 3000超高效液相色谱仪的自动进样器中，该仪器与LTQ - Orbitrap XL质谱仪相连，进样量为 。在负离子和正离子模式下进行电喷雾电离(ESI) - MS分析。在质荷比为80至1000的质量范围内以60,000分辨率采集全扫描质谱，源电压为 ，毛细管温度为320，鞘气流量为25。在反相C18柱(超纯金，直径为 × ，粒径为 )中进行液相色谱分离，柱温保持在 。然后使用Qual Browser(赛默飞世尔科技公司Xcalibur 2.1)手动提取积分峰面积。
对于同位素通量分析，生成了i ，并在第3天通过流式细胞术分选到 和 iT 中。细胞用PBS洗涤两次以去除残留培养基，然后在每孔 个细胞)中，用补充了均匀标记的 L-乳酸盐(剑桥同位素实验室)的无葡萄糖RPMI 1640培养基培养18小时。然后在代谢淬灭和使用上述方法提取之前，用冷PBS洗涤细胞。如前所述(44)，通过全面的同位素靶向质谱进行代谢通量分析。样品在与SCIEX ExionLC UHPLC系统联用的三重四极杆混合离子阱质谱仪(QTRAP 6500+，SCIEX)上进行分析。针对质谱仪优化了源和气体参数，数据通过Analyst 1.6.3软件在正负两种模式下采集。将代谢物(10 μl)加载到Acquity UPLC BEH HILIC(1.7 μm， × )柱上进行分离，自动进样器温度设置为 ，柱温箱设置为 。使用溶剂A( 醋酸铵和 氢氧化铵溶于 )和溶剂B( 醋酸铵和 氢氧化铵溶于 ACN，pH 7)作为流动相进行分离，流速为 min。使用的梯度程序如下:初始1分钟用 %缓冲液B，接下来的 分钟内将缓冲液B升至 %，并在接下来的4分钟内保持恒定。在 分钟内将缓冲液B升至初始90%缓冲液B浓度，在下一次进样前，色谱系统在此浓度下重新平衡 分钟。使用MultiQuantTM软件v.3.0(SCIEX)进行峰审查和面积提取。使用来自样品的合并QC分析技术变异性，仅对变异系数<30%的代谢物进行定量。
免疫印迹
为评估线粒体复合物的表达，使用含有蛋白酶抑制剂混合物(赛默飞世尔科技公司)的放射免疫沉淀分析缓冲液裂解 诱导性调节性T细胞(iTregs)和CD38 iTregs。使用考马斯亮蓝法分离并定量总蛋白。等量的蛋白 通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜在 用1:2000稀释的抗氧化磷酸化复合物抗体(Abcam公司)孵育过夜，随后在室温下用二抗(1:2000稀释的辣根过氧化物酶偶联山羊抗小鼠免疫球蛋白G；杰克逊免疫研究实验室)孵育2小时。与预染蛋白标志物(英杰公司)平行电泳以确定蛋白的分子量。为进行化学发光检测，将膜用Clarity Western ECL底物(伯乐公司)处理，并使用伯乐Versa Doc成像系统(伯乐公司)监测信号。然后用剥离缓冲液将同一张膜剥离，并使用热休克蛋白60(HSP 60)特异性抗体(BioBharati生命科学公司)重新检测作为参考对照。
单细胞测序数据分析
在使用Seurat(v4.3.0)进行的单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析中，导入每个样本的基因表达矩阵，并通过基于线粒体基因表达和特征计数过滤细胞进行质量控制。然后使用“LogNormalize”方法对数据进行归一化，该方法通过根据总表达对每个细胞的测量值进行缩放来归一化特征表达，然后进行自然对数转换。接下来，我们使用“vst”方法通过“FindVariableFeatures”识别每个样本中最可变的基因。此外，将基因表达矩阵合并为单个矩阵，并用“ScaleData”函数进行线性变换，随后，使用Seurat中的“RunPCA”函数进行降维，捕获数据集中的主要变异来源。为解决批次效应，对缩放后的主成分分析矩阵使用Seurat中的“RunHarmony”函数(v1.0)进行处理，整合数据以最小化技术变异并实现无监督聚类。 - 对经Harmony校正的嵌入进行的分布式随机邻域嵌入图可视化了细胞簇。聚类分析使用共享最近邻图和Louvain算法根据基因表达模式对细胞进行分组。使用“FindAllMarkers”识别每个簇的标记基因，并使用ggplot2创建的热图和特征图进行可视化，从而深入了解不同细胞类型或状态的基因表达谱。
DNA甲基化检测
对于甲基化研究，每个重复使用 个细胞来检测Foxp3基因的CNS1、CNS2和CNS3区域的特定甲基化。该研究包括基因组DNA的亚硫酸氢盐转化，随后进行PCR扩增。使用甲基化DNA修饰试剂盒，亚硫酸氢盐处理将胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，而5 - 甲基胞嘧啶保持不变。大约60 ng的DNA用于甲基化分析，这通过使用甲基化MS q - PCR快速试剂盒(Epigentec公司)进行qPCR来完成。该研究按照制造商的方案进行。
小鼠肿瘤实验
将B16 - F10黑色素瘤(每只小鼠 个细胞)、YUMM1.7黑色素瘤(每只小鼠 个细胞)或EL4胸腺瘤(每只小鼠 个细胞)皮下注射到6至8周龄C57BL / 6小鼠的侧腹。肿瘤接种后每2天测量一次肿瘤体积。对于CD38i实验，在肿瘤接种后第6天，给携带YUMM1.7黑色素瘤的小鼠腹腔注射CD38i(15 mg / kg)或溶剂对照。然后每周腹腔注射一次CD38i，直到对照小鼠的肿瘤体积达到人道终点。为了评估肿瘤内 增殖，在安乐死1天前，将 的BrdU溶液(BioLegend)腹腔注射到对照和CD38i处理的携带YUMM1.7黑色素瘤的小鼠体内。
统计分析
对于两组之间的统计分析，应用非参数非配对Wilcoxon - Mann - Whitney 检验。涉及两组以上的比较使用单向或双向方差分析(ANOVA)进行。使用GraphPad Prism 9进行数据分析。
补充材料
此PDF文件包括:
图S1至S6
表S1和S2
REFERENCES AND NOTES
1. T. Kamada, Y. Togashi, C. Tay, D. Ha, A. Sasaki, Y. Nakamura, E. Sato, S. Fukuoka, Y. Tada, A. Tanaka, H. Morikawa, A. Kawazoe, T. Kinoshita, K. Shitara, S. Sakaguchi, H. Nishikawa, PD-1 regulatory T cells amplified by PD-1 blockade promote hyperprogression of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 116, 9999-10008 (2019).
2. R. P. M. Sutmuller, L. M. van Duivenvoorde, A. van Elsas, T. N. M. Schumacher, M. E. Wildenberg, J. P. Allison, R. E. M. Toes, R. Offringa, C. J. M. Melief, Synergism of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and depletion of CD25 regulatory T cells in antitumor therapy reveals alternative pathways for suppression of autoreactive cytotoxic T lymphocyte responses. J. Exp. Med. 194, 823-832 (2001).
CD38,NAD⁺,乳酸,丙酮酸,Foxp3
表观信息
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