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mTOR抑制限制脂多糖诱导的急性肾损伤并改善细胞衰老特征

发布时间：

2026-03-10 21:40

mTOR抑制限制脂多糖诱导的急性肾损伤并改善细胞衰老特征

亚历山德拉·斯塔西，罗莎娜·弗兰津，法比奥·萨卢斯蒂奥，亚历山德罗·斯卡廖蒂，保拉·卡佩洛，埃琳娜·斯奎奇马罗，詹维托·卡贾诺，罗莎·洛萨皮奥，莫妮卡·坎皮奥尼，安东尼奥·卡斯特拉内塔，文森佐·坎塔卢皮，克劳迪娅·库尔奇，保拉·庞特雷利，乔瓦尼·斯塔洛内，洛雷托·杰苏阿尔多，维托·法内利 &朱塞佩·卡斯特拉诺

脓毒症诱导的急性肾损伤(AKI)可导致慢性肾功能障碍并加速肾脏衰老。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的激活与肾损伤的发生和发展有关。本研究调查了mTOR抑制剂雷帕霉素在减轻肾损伤方面的有效性，并探讨了其潜在机制。在小鼠模型中，通过腹腔注射含10 mg/kg脂多糖(LPS)的溶液诱导AKI。两组内毒素血症小鼠接受雷帕霉素的预处理和后处理。对肾近端小管上皮细胞(RPTEC)进行全基因组DNA甲基化分析。在LPS诱导的AKI小鼠模型中，雷帕霉素治疗显著降低了肌酐水平，保留了肾实质，并通过抑制ERK途径抵消了内皮-间充质转化(EndMT)。全基因组DNA甲基化分析显示，LPS诱导了异常甲基化，特别是在与早衰相关的基因中，包括外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ENTPD1/CD39)和沃尔弗拉姆内质网跨膜糖蛋白(WFS1)。因此，内毒素血症小鼠表现出CD39表达降低和klotho下调，两者均被雷帕霉素逆转，表明在AKI中有抗衰老作用。mTOR抑制可能是预防LPS诱导的AKI中肾脏加速衰老并潜在减缓慢性肾病进展的一种有前景的策略。

缩写

AKI急性肾损伤

SI-AKI脓毒症诱导的AKI

mTOR雷帕霉素靶蛋白(mTOR)

LPS脂多糖

ENTPD1外核苷三磷酸二磷酸水解酶1

WFS1沃尔弗拉姆内质网跨膜糖蛋白

TLR4Toll样受体4

EC内皮细胞

RPTEC肾近端小管上皮细胞

ALI急性肺损伤

SD标准差

脓毒症诱导的急性肾损伤(SI-AKI)是一种高度复杂且多因素的疾病，其特征是与全身内皮功能障碍相关的过度炎症以及肾固有细胞的改变，这些改变

肾脏病、透析与移植科，DiMePRe-J，巴里大学“阿尔多·莫罗”分校，皮亚扎·G·切萨雷11号，巴里70124，意大利。分子生物技术与健康科学系，分子生物技术中心“圭多·塔罗内”，都灵大学，都灵，意大利。胃肠病学与消化内镜科，巴里大学“阿尔多·莫罗”分校，皮亚扎·G·切萨雷11号，巴里70124，意大利。转化医学系，东皮埃蒙特大学，韦尔切利，意大利。医学与外科学系，福贾大学，福贾，意大利。麻醉与重症监护科，都灵大学城市健康与科学学院，都灵大学，多利奥蒂大街14号，都灵10126，意大利。外科学系，都灵大学，都灵，意大利。肾脏病、透析与肾移植科，圣心天主教大学综合医院基金会马焦雷综合医院，米兰，意大利。临床科学与社区健康系，米兰大学，科门达大街15号，米兰20122，意大利。&邮箱:stasi.alessandra85@gmail.com；giuseppe.castellano@unimi.it

可能促进肾脏疾病进展和衰老。脂多糖(LPS)是大多数革兰氏阴性菌外膜的主要结构成分，因其在脓毒症病理生理学中的作用而闻名。LPS由一种特定的先天免疫受体Toll样受体4(TLR4) 识别，该受体在免疫细胞和肾固有细胞上表达。LPS通过TLR4途径诱导的信号传导引发深刻的炎症反应，导致包括损伤相关分子模式/病原体相关分子模式(DAMPs/PAMPs)在内的多种介质释放，并对肾实质细胞产生多种影响。

在这种情况下，功能失调的内皮细胞(EC)激活生存信号通路并通过一种称为内皮-间充质转化(EndMT) 的过程获得成纤维细胞样表型，导致血管稀疏和肾纤维化。血管功能障碍导致的促炎微环境和局部缺氧通过自噬、自噬和衰老等生存适应机制进一步驱动肾近端小管上皮细胞(RPTEC)的代谢适应，

图4. 内毒素血症动物肾损伤的恢复情况。(A) PAS染色显示，与对照组(假手术组)相比，脂多糖注射后24小时和48小时(脂多糖24小时组和脂多糖48小时组)近端肾小管上皮细胞显著损伤(放大图像)、纤维蛋白沉积明显、肾小管间质间隙增大、众多肾小球毛细血管稀少、鲍曼囊扩张(放大图像)以及间质炎性浸润(放大图像)。脂多糖注射诱导更严重的肾小管和肾小球损伤。接受雷帕霉素预处理(雷帕霉素/脂多糖组)或后处理(脂多糖/雷帕霉素组)的内毒素血症动物的肾活检显示炎性浸润减少，肾小管和肾小球结构保存(放大图像)。雷帕霉素后处理也减轻了肾小球毛细血管丢失、鲍曼囊扩张和肾小管损伤，尽管保护作用不如预处理明显(放大图像)。(B) 按照方法部分所述评估肾小管和肾小球病理评分，每组至少五只小鼠的评分表示为平均值 (假手术组；脂多糖24小时组；脂多糖48小时组；雷帕霉素/脂多糖组；脂多糖/雷帕霉素组 )。(C) 使用单因素方差分析评估统计学意义，采用Tukey方法对成对治疗组差异进行多重比较校正(**** 与假手术组相比；££££ 与脂多糖24小时组相比；####p 与脂多糖相比)。最终导致肾功能显著下降。细胞衰老，一种不可逆的细胞周期停滞状态，已被确定为延长急性肾损伤(AKI)有害影响的关键因素。这种现象在加速适应性不良修复机制中起关键作用，最终将AKI与慢性肾脏病(CKD)的发展联系起来。表观遗传机制，包括DNA甲基化和组蛋白修饰，可能在调节SI-AKI中肾小管上皮细胞衰老中起核心作用。

确定LPS/TLR4信号传导的潜在位点可能是一种有前景的治疗策略，以减少内毒素暴露的有害影响。最近的研究强调了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在炎症性疾病发病机制中的重要性。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在调节蛋白质合成中起关键作用，而蛋白质合成对细胞增殖至关重要。在暴露于脂多糖后，已观察到不同类型免疫细胞中mTORC1的激活，可能通过PI3K-Akt和ERK途径介导。mTORC1的机制靶点已被证明在脂多糖诱导的急性肺损伤(ALI)的发病机制和严重程度中起基本作用。最近的研究还强调了mTORC1通过调节与细胞衰老、纤维化过程以及klotho表达和功能相关的各种代谢途径参与调节肾功能障碍。

然而，mTORC1在SI-AKI中激活的确切机制和意义尚未完全了解。我们的研究结果表明，mTORC1参与肾细胞中LPS/TLR4信号传导的激活，并通过ERK途径促进肾纤维化的早期发展，以及通过DNA甲基化促进细胞衰老。因此，我们假设雷帕霉素或其类似物抑制mTOR可能是一种有前景的SI-AKI治疗方法。

结果

雷帕霉素抑制mTOR可预防脂多糖诱导的AKI

在内毒素血症组(LPS24h和LPS48h组)中均成功诱导出急性肾损伤(AKI)(图1)。在注入LPS后24小时和时，观察到肾实质有明显的形态学变化，包括肾小管空泡化、肾小管扩张、肾小管萎缩、上皮扁平化、坏死、炎性细胞浸润，以及许多肾小球内明显的纤维蛋白沉积和毛细血管数量减少(图1A)。

LPS组肾小管和肾小球损伤的病理评分显著高于假手术组(图1B)。与治疗后组相比，雷帕霉素预处理在限制肾组织损伤方面更有效(图1B)。两种雷帕霉素治疗均显著减轻了肾小管和肾小球损伤，并抑制了炎性浸润的募集(图1A - C)。

此外，与假手术组相比，注射LPS导致血清肌酐随时间增加(图1C)。有趣的是，与LPS组相比，雷帕霉素预处理在时显著改善了血清肌酐水平。雷帕霉素治疗后在恢复基线肌酐水平方面效果较差。

雷帕霉素减少LPS诱导的AKI中的胶原蛋白沉积和肾纤维化

由于肾小球血栓和胶原蛋白沉积被认为是SI - AKI 的标志，我们通过对胶原蛋白III进行免疫组织化学分析，评估了LPS诱导早期纤维化的能力以及雷帕霉素的潜在减轻作用(图2A)。

假手术组肾脏中不存在肾小管间质和肾小球胶原蛋白沉积。相反，注入LPS导致间质和肾小球水平均有广泛的胶原蛋白沉积。值得注意的是，与LPS 24小时组相比，在LPS 48小时组中观察到，长期内毒素血症与肾纤维化增加有关。在内毒素血症动物中，雷帕霉素治疗后导致肾小管间质和肾小球水平的胶原蛋白III表达略有降低。有趣的是，雷帕霉素预处理显著减少了两个区域的胶原蛋白III沉积(图2A，B)。

mTOR抑制可预防内毒素血症性AKI中的内皮细胞功能障碍

由于内皮细胞(EC)在SI - AKI的发病机制中起关键作用，且内皮细胞功能障碍可能与纤维化的发展有关，我们通过对内皮标志物CD31和 - SMA进行双重免疫荧光染色来表征内皮细胞表型变化(图3A，B)。

图2. 雷帕霉素在LPS诱导的AKI中的抗纤维化作用。(A)胶原蛋白III的免疫组织化学显示，内毒素血症小鼠(LPS 24小时和48小时)间质和肾小球水平的胶原蛋白III沉积增加(放大图像)。值得注意的是，内毒素血症的持续时间与更多的胶原蛋白III积累相关，表明间质纤维化。雷帕霉素预处理(RAPA/LPS)显著减少了胶原蛋白沉积(放大图像)。同样，雷帕霉素治疗后(LPS/RAPA)也减少了胶原蛋白积累，尽管仍可检测到胶原蛋白III沉积(放大图像)。(B)如方法部分所述进行定量分析。测量了胶原蛋白III免疫组织化学相对于分析区域的强阳性平均强度(ISP)。(假手术组 LPS 24小时组；LPS 48小时组；RAPA/LPS ；LPS/RAPA )。误差条表示标准差。与假手术组相比，****p < 0.0001；与LPS 24小时组相比，££££p < 0.0001；与LPS 48小时组相比，#####p < 0.0001。

在基础条件下，CD31+内皮细胞(EC)定位于血管内膜以及肾小管周围和肾小球毛细血管中，而细胞则组成性地存在于肾动脉外膜中(图3A)。注入脂多糖(LPS)后，内皮细胞发生表型变化，获得间充质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。在大血管中，正在转变的CD31 -SMA 内皮细胞似乎与下方的基底膜分离，并在血管壁中层被检测到(图3A)。在肾间质中，肾小管周围和肾小球内皮细胞共表达CD31和α-SMA标志物(图3A、B)。

有趣的是，雷帕霉素预处理和后处理通过减少肾血管和毛细血管中正在转变的内皮细胞来预防内皮功能障碍。治疗组和未治疗组之间的差异具有统计学意义(图3B)。

接下来，我们通过流式细胞术分析(图3C、D)来表征雷帕霉素对LPS诱导的内皮-间充质转化(EndMT)的影响。我们的数据显示，雷帕霉素预处理和后处理可抑制内皮功能障碍，并将组成性内皮标志物和功能失调的成纤维细胞标志物恢复到基础水平(图3C、D)。

细胞外信号调节激酶(ERK)通路在内皮功能障碍中的作用

接下来，为了确定参与EndMT并被LPS/TLR4/mTORC-1直接激活的信号传导，我们分析了ERK和AKT的早期磷酸化，这是TLR4和mTORC-1通路共有的两个关键介质。关于mTORC-1通路，我们评估了磷酸化mTORC-1(p-mTORC-1)和磷酸化核糖体蛋白S6激酶(p-P70S6K)的激活水平。如图4A、B所示，LPS刺激后内皮细胞中磷酸化ERK、AKT、mTORC-1和p70S6K的表达显著增加。雷帕霉素刺激前后显著降低了mTORC-1和p70S6K的磷酸化，并且正如预期的那样，并未消除上游调节因子AKT和ERK的磷酸化。

为了选择性地研究AKT和ERK信号传导在LPS诱导的mTORC-1激活中的作用，我们用靶向AKT和ERK的特异性抑制剂预处理内皮细胞(图4A、B)。有趣的是，抑制AKT并没有降低LPS触发的mTORC1和p70S6K的磷酸化。然而，抑制ERK显著降低了mTORC-1和p70S6K的磷酸化至基础水平。接下来，我们用LPS或ERK抑制剂培养内皮细胞。对于预处理，内皮细胞与ERK抑制剂孵育，然后进行LPS刺激，之后我们分析它们的表型。我们发现，即使在LPS刺激后，抑制ERK的内皮细胞也没有发生表型变化，α-SMA表达显著降低，内皮标志物增加(图4C、D)。这些数据支持TLR4-ERK-mTORC1轴在促进EndMT和纤维化中的作用，独立于AKT通路。

LPS诱导肾小管上皮细胞(RPTEC)DNA甲基化变化

为了评估LPS是否调节肾小管细胞中的DNA甲基化，我们用LPS 刺激人肾小管上皮细胞，并进行全基因组DNA甲基化研究。

对预定义基因组区域的单个CpG岛进行甲基化分析，如CpG岛、启动子和平铺区域(5 kb跨度区域)。在未处理的细胞(表示为基础状态)中，在染色体1、8、6、2、7和5中发现甲基化平铺区域的数量最多。它们覆盖了总平铺区域的50%，而染色体9和14包含的甲基化区域最少(图5A)。当我们考虑单个CpG位点时，LPS刺激增加了整个基因组中的DNA甲基化(图5B)。然而，考虑平铺区域时，我们发现一些DNA区域在LPS处理后发生了高甲基化，一些发生了低甲基化，并且位于特定染色体中(图5C)。

然后，我们基于组合排名参数，对LPS刺激的和未刺激的RPTEC进行了差异甲基化分析，重点关注CpG位点和平铺区域(图5D)。然后，我们选择了组合排名最佳的200个平铺区域以及的阈值。分析确定了76个区域，包括18个低甲基化区域和58个高甲基化区域(补充表1)。为了研究这些异常甲基化DNA区域中包含的基因所涉及的生物学过程，我们进行了通路分析。两个高甲基化基因CD39和WFS1被确定为与能量产生和衰老相关的最显著网络(得分53)中的中心节点:(补充图1)。

总体而言，这些数据表明LPS对肾小管细胞表观遗传状态的重编程具有功能性影响，促进了不同染色体上的异常甲基化。

LPS诱导DNA甲基化调节CD39和WFS1基因表达

为了证实DNA甲基化在调节CD39和WFS1中的关键作用，我们评估了LPS刺激的RPTEC与未处理细胞相比的基因表达谱。这两个基因在LPS刺激的RPTEC中差异表达，并且它们的表达与DNA甲基化水平呈负相关(图6A，B)。具体而言，CD39和WFS1基因发生高甲基化，导致其基因表达显著下调(图6B:** ，* )。

这些结果表明，CD39和WFS1的表达直接受DNA甲基化调节，并突出了LPS作为一种表观遗传介质，它至少部分诱导参与抗炎和抗纤维化途径的基因发生高甲基化。

RPTEC中LPS诱导的细胞衰老的特征

在各种急性肾损伤条件下，肾小管上皮细胞会发生衰老，其特征为细胞周期停滞、线粒体功能障碍以及促炎和促纤维化因子的释放。因此，我们通过进行SA- -gal染色、评估klotho和p21表达以及研究与抗炎、抗纤维化和抗衰老途径相关的CD39和WFS1标志物，来评估LPS是否能在体外诱导肾小管细胞衰老。(图7A，B)。

然后，我们用LPS刺激RPTEC (图7A)，并观察到LPS刺激的RPTEC获得了衰老表型，SA-β-GAL阳性显著增加证明了这一点。暴露于LPS的RPTEC

出现增大和多核现象。雷帕霉素处理对LPS诱导的肾小管细胞衰老提供了显著保护。暴露于的RPTEC用作细胞衰老的阳性对照。图7B中衰老细胞的定量显示，LPS诱导的RPTEC衰老具有统计学意义。

为了进一步研究衰老，我们在一组独立的RPTEC中对klotho和p21基因表达进行了实时PCR(图7C-F)。LPS刺激后，klotho表达显著降低(图7C)。雷帕霉素预处理有效地将klotho表达恢复到基线水平。而在LPS刺激后添加雷帕霉素在恢复klotho的基础表达方面效果较差，并且在LPS/RAPA和LPS 48小时之间未发现显著差异。

此外，LPS显著增加了p21表达，表明衰老，但雷帕霉素的预处理和后处理均显著降低了p21水平(图7D)。

图3. 雷帕霉素可预防内皮细胞功能障碍。(A) 经脂多糖(LPS)激活后，肾组织中CD31 (红色)内皮细胞在肾血管、肾小球和间质中获得了肌成纤维细胞标志物 -平滑肌肌动蛋白(绿色)(LPS处理24小时和48小时)。雷帕霉素预处理(RAPA LPS)和后处理(LPS RAPA)可使所有肾组织中的内皮细胞表型恢复正常。(B) 如方法部分所述进行定量分析。放大倍数为630倍。用To-Pro 3对细胞核进行复染(蓝色)。(假手术组；LPS 24小时组；LPS 48小时组；RAPA/LPS ；LPS/RAPA )。#######*dvd*(0, 100) vS-HS 48小时。(C, D) 原代内皮细胞(HUVEC)暴露于LPS(4 μg/ml)48小时。对于雷帕霉素预处理，在LPS暴露前1小时向培养基中加入雷帕霉素(5nM)，然后维持48小时。后处理在LPS刺激6小时后加入雷帕霉素进行孵育。经LPS刺激后，通过流式细胞术分析可知，内皮细胞中特异性内皮细胞标志物显著减少，功能失调的成纤维细胞标志物表达增加。在雷帕霉素存在的情况下，内皮细胞保持了其表型。(C) 结果代表三个独立实验。与基础值相比；££££与LPS相比，p≤0.0001)；(D) 代表性图。

图4. TLR4-mTORC1轴通过ERK信号通路诱导内皮间质转化。(A, B) 用LPS(4μg/ml)刺激培养的内皮细胞30分钟。对于雷帕霉素预处理，在LPS暴露前30分钟向培养基中加入雷帕霉素(5nM)。后处理在LPS刺激30分钟后加入雷帕霉素进行孵育。内皮细胞还用AKT抑制剂或ERK抑制剂预处理30分钟，然后用LPS进行短暂刺激(30分钟)。LPS增加了磷酸化ERK、AKT、mTORC-1和p70S6K的表达。雷帕霉素(RAPA)刺激前后显著降低了p-mTORC1和p-p70S6K，但并未消除AKT和ERK的磷酸化。用ERK抑制剂预处理内皮细胞可降低LPS诱导的mTORC1和p70S6K磷酸化。(A) 流式细胞术分析的代表性图；(B) 结果代表三个独立实验。(C, D) 内皮细胞与LPS或ERK抑制剂一起培养；内皮细胞先用ERK抑制剂预处理，然后用LPS处理。流式细胞术分析表明，即使在LPS刺激下，内皮细胞的表型也没有改变。(C) 流式细胞术分析的代表性图；(D) 结果代表三个独立实验；(****p 与基础值相比；EEEEp 与LPS相比)。

最后，我们探究了CD39和WFS1的表达(图7E、F)，它们可能参与肾小管衰老的调节。在LPS刺激后,这两个基因均显著下调。有趣的是，雷帕霉素预处理显著增加了CD39和WFS1的表达，而后处理在显著增强其表达方面效果不佳，且LPS/RAPA组与LPS 48小时组之间未发现显著差异。

雷帕霉素治疗可预防LPS诱导的体内CD39下调

我们进一步研究了LPS输注是否会促进体内CD39的下调。通过对肾活检组织进行CD39免疫组织化学分析，研究了LPS输注和雷帕霉素治疗对CD39表达的调节作用(图8)。

值得注意的是，CD39的表达通常局限于肾小球部分，在肾小管中不太明显。我们证明了在肾小管部分有显著的CD39表达，甚至在顶端和细胞内，提示近端肾小管细胞的参与(图8A)。假手术小鼠呈现高水平的CD39，而LPS 和 -动物在肾小管中的表达降低。雷帕霉素预处理在内毒素血症性急性肾损伤过程中保护肾实质，恢复肾小管CD39表达。然而，雷帕霉素处理后的小鼠中CD39水平的升高不太明显(图8B)。

-图5. 全基因组亚硫酸氢盐分析显示的RPTEC中LPS相关的DNA甲基化变化。(A)图表显示在基础水平下RPTEC中鉴定出的甲基化区域(平铺区域)的数量和频率。左纵轴表示每条染色体上甲基化区域的数量。右纵轴表示出现总数的累积百分比。红色凹曲线是累积函数，表明RPTEC中总甲基化区域的50%被染色体1、8、6、2、7和5覆盖。(B)基础水平下RPTEC(蓝线)和LPS刺激的RPTEC(橙线)单个CpG位点的DNA甲基化水平。LPS增加了整个基因组的DNA甲基化。(C)图表显示RPTEC(蓝线)和LPS刺激的RPTEC(红线)中染色体共享的平铺区域的平均DNA甲基化水平。中心轴显示平均甲基化值。(D)CpG位点甲基化比较的散点图，根据给定位点的综合排名着色。值表示为每个CpG位点刺激和未刺激的RPTEC之间的平均差异(mean.diff)。(综合排名:刺激和未刺激的RPTEC的平均甲基化水平差异、平均甲基化商和t检验对所有区域进行排名。该值使用最大值即一个位点在这三个测量中的最差排名对它们进行汇总。)

图6. CD39和WFS1基因表达受DNA甲基化调节。(A)与基础条件相比，LPS刺激的RPTEC或用 -氮杂-2’-脱氧胞苷处理的细胞中CD39和WFS1的甲基化水平。如材料和方法中所述计算PMR的百分比。(B)通过qRT-PCR评估的LPS刺激的RPTEC或用 -氮杂处理的细胞中CD39和WFS1的基因表达水平，与未处理的RPTEC相比。与未处理的细胞相比，LPS刺激的RPTEC中的表达水平有显著差异。基因表达水平以管家基因GAPDH进行标准化。结果表示为平均标准偏差(SD)，。

通过蛋白质印迹实验分析组织中的蛋白质裂解物证实了这些结果(图8C、D)。CD39蛋白质分析表明其在LPS处理24小时和48小时的小鼠肾皮质中的表达显著降低，在48小时时降低更明显。雷帕霉素预处理有效地恢复了CD39表达。相反，雷帕霉素处理后CD39的表达水平没有增加，并且在LPS/RAPA和LPS 24小时之间没有观察到显著差异。

mTOR抑制可防止LPS诱导的体内klotho下调

如前所述，klotho最初被鉴定为一种抗衰老蛋白，基因表达缺陷与早衰综合征有关。肾小管上皮细胞被确定为klotho的主要产生者，其减少与肾脏组织学损伤的严重程度相关。

-图7. 永生化近端肾小管上皮细胞(RPTEC)中的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β Gal)染色及靶基因验证。(A)早期传代的RPTEC在暴露于LPS 下后的SA-β-半乳糖苷酶活性。对于预处理组，在LPS暴露前将雷帕霉素添加到培养基中，并维持。在LPS刺激后通过孵育雷帕霉素进行后处理。与后处理相比，预处理组中衰老的抑制更为明显。在LPS暴露后观察到SA-β-gal +细胞，衰老的RTEC出现增大，并且在形态上与同一传代的正常细胞不同，显示出形成更大的多核细胞。未处理的细胞称为基础细胞，而暴露于的细胞用作衰老的阳性对照。使用相差显微镜获取代表性图像。放大倍数40X；比例尺: (B)SA- -Gal +细胞培养物的定量。通过检查每个条件(6孔板)的五个不重叠视野来计算SA- -半乳糖苷酶活性阳性细胞的比例。结果表示为来自三个独立实验的平均值标准差(** )。(C-F)在基础条件下、刺激48小时后、雷帕霉素预处理和后处理以及单独使用雷帕霉素处理后，RPTEC中差异表达的四个基因(KLOTHO、p21、CD39和WFS1)的实时PCR分析。数据表示为平均值标准差(SD)，。(KLOTHO ；p21、CD39和WFS1 ** 和 * )。

通过对肾活检组织进行klotho免疫组织化学分析，研究了LPS输注和雷帕霉素治疗对肾小管klotho表达的影响(图9)。

值得注意的是，klotho表达主要局限于肾小管部分，在肾小球中不太明显，证实其由近端肾小管细胞产生(图9A)。假手术小鼠呈现高水平的klotho，而LPS 和输注显著降低了其在肾小管中的表达。在我们的研究中，雷帕霉素预处理通过恢复肾小管klotho表达并抑制间质纤维化的发展，保护肾脏免受内毒素血症性急性肾损伤(AKI)。与预处理的小鼠相比，雷帕霉素后处理的小鼠中klotho水平的升高不太明显(图9B)。尽管雷帕霉素后处理也提供了显著的保护作用，增加了klotho水平，但其效果与预处理组相比不太明显。

通过蛋白质印迹实验分析组织中的蛋白质裂解物，证实了这一结果(图9C，D)。对klotho蛋白的分析表明，在LPS 和LPS 小鼠的肾皮质中，该蛋白显著减少，并且两种雷帕霉素治疗均可使其恢复。

讨论

本研究为雷帕霉素在预防内皮功能障碍和细胞衰老、对抗脓毒症诱导的急性肾损伤(SI-AKI)过程中的肾损伤方面的短期作用提供了新的见解。

AKI是脓毒症的常见后果，其特征在于与全身内皮损伤和肾固有细胞改变相关的免疫反应加剧。SI-AKI的一个关键介质是内毒素，它加剧宿主炎症反应并对肾实质细胞有直接有害作用。对内毒素刺激的mTORC1激活被认为是LPS-TLR4轴中涉及的主要途径，但其在肾损伤中的分子机制和意义尚未完全明确。

哺乳动物细胞中有两种不同的mTOR复合物:mTORC1和mTORC2。mTORC1参与生物合成和代谢事件的调节，并且对雷帕霉素敏感。有证据表明，雷帕霉素可降低严重脓毒症中发生肺损伤的风险，因为它在中性粒细胞和急性肺损伤中TLR2和TLR4诱导的促炎反应中起核心作用。此外，mTOR正在成为几种慢性肾脏疾病的关键调节因子，通过促进成纤维细胞活化导致肾纤维化。在缺血性急性肾损伤中，mTORC1在肾脏修复和损伤中具有双重作用。虽然其激活对于肾组织再生是必要的，但长期激活会导致持续的细胞功能障碍，导致肾损伤和纤维化的进展。

我们的研究表明，雷帕霉素治疗可通过预防内皮功能障碍、肾小管衰老和间质纤维化来保护内毒素血症期间的肾脏。我们研究了mTORC1在LPS诱导的内皮功能障碍和肾小管衰老中的分子机制。我们的研究结果为LPS暴露后EC中mTORC1 - S6K途径的激活提供了新的见解。与之前的报道相反，我们表明这种激活独立于PI3K - Akt途径。相反，我们的数据表明，MEK - ERK途径是LPS刺激后EC中mTORC1 - S6K激活的替代途径。具体而言，我们提出ERK磷酸化TSC2，导致TSC1/TSC2复合物解离，从而上调mTORC1，类似于在肿瘤样细胞中观察到的机制。此外，我们的研究结果表明，ERK激活在响应LPS的EndMT过程中起关键作用。综上所述，我们的数据指向ERK介导的响应LPS的内皮功能障碍的潜在机制，涉及mTORC1 - S6K激活。这些结果对于理解LPS诱导的内皮功能障碍的分子机制具有重要意义，并可能为开发靶向治疗干预措施提供基础。

内皮功能障碍、RPTEC与细菌成分的直接相互作用、病原体激活的免疫细胞释放促炎细胞因子以及促凝血介质可激活RPTEC中的促衰老途径，加速将急性肾损伤与慢性肾病联系起来的适应性不良修复。表观遗传机制已成为急性肾损伤中的重要调节因子，导致结构和功能变化。几种内源性介质，如补体因子、炎性细胞因子和LPS等细菌成分，可通过组蛋白乙酰化和甲基化直接影响RPTEC染色质状态。

我们的研究提供了证据表明LPS可引发DNA甲基化变化，改变参与炎症和衰老反应的基因表达。我们鉴定并验证了两个主要基因作为衰老网络中的核心节点:CD39和WFS1。这些高甲基化基因在功能上与肾脏衰老相关。CD39在调节对脓毒症性急性肾损伤的反应中的作用仍在研究中。我们假设CD39具有抗炎和肾脏保护作用，CD39也称为外切核苷三磷酸二磷酸酶ENTPD1，是一种由内皮细胞和平滑肌表达的血管外酶，广泛分布于肾脏(例如，较大血管、入球小动脉和肾小球)，最近在RPTEC中也有发现。CD39将细胞外ATP和ADP代谢为AMP，然后由外切5’-核苷酸酶(CD73)将其转化为腺苷(ADO)。ADO具有直接的内皮保护、抗炎和抗血栓作用。

细胞外ATP和ADP从受损组织、受损细胞和血小板脱颗粒中释放出来，所有这些都会导致促炎环境。通过调节细胞外核苷酸水平，CD39控制配体

-图8. 雷帕霉素治疗可恢复LPS诱导的急性肾损伤中的CD39表达。(A) CD39的免疫组织化学显示，LPS小鼠(LPS 24小时)肾小管CD39表达显著降低(放大图像)。在48小时时，与24小时内毒素血症组相比，LPS暴露导致肾小管(放大图像)和肾小球CD39表达更明显降低(放大图像)。雷帕霉素治疗可恢复CD39表达，预处理(RAPA/LPS)在挽救肾小管CD39水平方面比后处理(LPS/RAPA)更有效(放大图像)。(B) 如方法部分所述进行定量分析。对CD39免疫组织化学测量与分析区域相关的强阳性平均强度(ISP)。误差条表示标准差。***p<0.0001 vs. 假手术组；££££p < 0.0001 vs. LPS 24小时组。(假手术组；LPS 24小时组；LPS 48小时组；RAPA/LPS ；LPS/RAPA )(C, D) WB分析显示，与假手术水平相比，LPS输注后CD39表达显著降低。48小时的LPS输注显示CD39蛋白明显减少。雷帕霉素预处理在内毒素血症性急性肾损伤过程中保护肾脏，恢复CD39表达。然而，后处理并未显著重新激活CD39表达。β-肌动蛋白蛋白表达用于标准化。(C) 该凝胶代表具有相似结果的三组动物。(D) 数据表示为平均值标准差(SD)。(假手术组；LPS 组；LPS 组；RAPA/LPS ；LPS/RAPA )。使用Tukey方法对成对治疗组差异进行多重比较校正后，通过单因素方差分析评估统计学显著差异(****p vs. 假手术组；££p < 0.01 vs. LPS 24小时组；### vs. LPS )。可作用于参与急性排斥反应和慢性移植物功能障碍的2型嘌呤能受体(P2)大家族。CD39在各种病理生理条件下，如癌症、自身免疫性疾病、缺血/再灌注损伤和糖尿病肾病中也作为血管保护因子。最近的研究表明，CD39通过减少全身炎症和肾脏损伤来改善心肌梗死并提高SI-AKI小鼠模型的存活率。值得注意的是，最近的一项研究表明，CD39通过减少全身炎症和肾实质损伤有效地提高了SI-AKI小鼠模型的存活率。作者发现，RPTEC中CD39的过表达通过抑制NLRP3相关炎症途径的激活来抵消LPS的有害作用，从而调节细胞凋亡和细胞周期。

在衰老相关疾病中，内质网(ER)应激与p21信号之间存在复杂的交联。在糖尿病RPTECs中，ER应激标志物与增强的SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞和过早衰老相关。WFS1编码一种定位于内质网的跨膜蛋白，调节未折叠蛋白反应。WFS1的突变或表达改变与肾衰竭的快速进展有关。我们的分析表明LPS诱导WFS1的高甲基化，降低其表达并增加细胞周期调节因子p21。考虑到ER应激在急性肾损伤进展中的作用，WFS1信号在脓毒症诱导的急性肾损伤中RTECs的过早衰老中可能至关重要。

多项研究证实雷帕霉素在延长寿命和减轻与年龄相关疾病方面的功效。由于mTOR激活促进p21表达，介导肾细胞的细胞周期停滞和衰老，雷帕霉素可以预防肾脏衰老。我们的研究评估了雷帕霉素是否可以恢复CD39和WFS1表达并预防RPTEC衰老。雷帕霉素预处理通过上调CD39和WFS1、恢复klotho表达以及降低SA-βgal和p21阳性来抵消LPS的影响。体内结果证实LPS加速肾脏衰老，而雷帕霉素消除了这些有害影响。

我们承认我们的研究有一些局限性。首先，甲基化数据仅从三批不同的人RPTEC中获得，我们缺乏关于我们小鼠模型的甲基化状态或雷帕霉素诱导的甲基化的数据。此外，48小时的LPS刺激可能无法完全捕捉LPS对RPTEC细胞中DNA甲基化的动态影响。

尽管如此，我们的研究专注于评估雷帕霉素在脓毒症条件下减轻急性肾损伤的短期影响，强调其中涉及的直接分子和细胞机制。这些发现为急性期提供了有价值的见解，支持雷帕霉素在减少炎症、内皮功能障碍和RPTEC过早衰老方面的作用，从而减轻肾脏损伤。雷帕霉素对肾脏的长期恢复和功能影响值得在未来的研究中进一步调查。

材料和方法

所有方法均按照《科学报告》编辑政策中概述的相关指南和规定进行。

动物模型

所有实验均使用12至16周龄的雄性和雌性C57BL/6 N小鼠(Charles River Laboratories, Inc.)进行，每笼饲养5只动物。小鼠在意大利都灵大学的分子生物技术中心“Guido Tarone”饲养和使用，并按照都灵大学动物伦理委员会和意大利卫生部(742/2018-PR prot. N. CC652.92)批准的机构动物福利指南和法规进行处理。所有报告的方法均符合ARRIVE指南。

简而言之，对小鼠称重(每只22 - 25克)，通过腹腔注射含有的LPS(大肠杆菌脂多糖膜，L2630 - 25MG)(美国密苏里州圣路易斯市Sigma - Aldrich公司)的盐溶液诱导内毒素血症。具体而言，在使用2%异氟醚麻醉下，将LPS腹腔内(ip)注射到右髂窝，剂量为10 mg/kg LPS或等量体积的

生理盐水作为对照。随后，将生理盐水腹腔内注射到左髂窝作为液体补充。

使用区组随机化对小鼠进行随机分组，以确保雄性和雌性小鼠在以下各组中均匀分布:

假手术组:5只小鼠接受 PBS腹腔注射。
LPS组小鼠接受的LPS腹腔注射，并在LPS攻击后处死。
LPS组48小时:5只小鼠接受的LPS腹腔注射，并在LPS攻击后处死。
雷帕霉素(RAPA)组:5只小鼠接受的雷帕霉素(Sigma R0395)腹腔注射。

图9. 肾小管功能障碍及雷帕霉素作用的特征。(A) 对klotho进行免疫组织化学检测发现，LPS小鼠肾小管klotho表达显著降低，而雷帕霉素治疗可使其恢复。LPS注射后48小时，肾小管klotho表达急剧下降。雷帕霉素预处理组(RAPA/LPS)比后处理组(LPS/RAPA)更能恢复肾小管klotho表达。(B) 定量分析如方法部分所述进行。对klotho免疫组织化学检测分析区域内的强阳性平均数(NSP)进行测量。误差线表示标准差。(假手术组 LPS 组 LPS 组 RAPA/LPS LPS/RAPA )。**** 与假手术组相比；££££ 与LPS 组相比；#### 与LPS 组相比。(C, D) 蛋白质印迹分析显示，与假手术组水平相比，LPS注射后klotho表达显著降低。LPS注射后，klotho表达明显降低。雷帕霉素治疗，尤其是预处理组，可保护肾实质，恢复klotho表达。β-肌动蛋白蛋白表达用于标准化。(C) 该凝胶代表结果相似的三组动物。(D) 数据表示为平均值标准差(SD)，采用单因素方差分析评估统计差异，并使用Tukey方法对两两治疗组差异进行多重比较校正。(假手术组 LPS 组 LPS 组 RAPA/LPS LPS/RAPA ) 与假手术组相比；££p < 0.0001与LPS 24小时组相比；####p <0.0001与LPS 48小时组相比。

雷帕霉素/LPS(RAPA/LPS，预处理):8只小鼠接受两次腹腔注射雷帕霉素，间隔，随后腹腔注射 LPS。
LPS/雷帕霉素(LPS/RAPA，后处理):5只小鼠接受一次腹腔注射 LPS，6小时后用雷帕霉素治疗。小鼠在LPS注射后接受第二次雷帕霉素注射。

负责动物处理的两名研究人员中只有一人在实验的不同阶段知晓分组情况。未考虑特定的混杂因素。内毒素血症动物分别在给予脂多糖(LPS)后24小时(LPS 24小时组)和48小时(LPS 48小时组)处牺牲。雷帕霉素预处理的动物(RAPA/LPS组)在注射LPS后 (第一次注射雷帕霉素后48小时)处牺牲。LPS/RAPA组动物在注射LPS后处牺牲。假手术小鼠和RAPA小鼠分别在注射PBS和雷帕霉素后处牺牲。

未设定排除标准。计算得出每组五只小鼠的样本量，以检测肾小管和肾小球病理评分中20%(标准差0.2)的差异，检验效能为80%，α错误为0.05。

样本采集

小鼠在2%异氟烷麻醉下通过心脏穿刺采血，随后颈椎脱臼以确认动物死亡。处牺牲时，采集所有动物的肾脏以评估肾小管和肾小球损伤。每个活检标本的一部分立即在最佳切割温度(OCT，Tissue-Tek)培养基中速冻，并储存在液氮中。另一部分固定在4%的缓冲甲醛中，并按照标准程序包埋在石蜡中。采集小鼠血清和血浆样本，并储存在直至使用。通过血清肌酐评估肾功能。

组织学分析

将福尔马林固定、石蜡包埋的C57BL/6小鼠肾脏切成2μm厚的切片，进行脱蜡和酒精脱水。然后将玻片用蒸馏水冲洗，并进行组织学染色[苏木精和伊红(H&E)、过碘酸希夫(PAS)染色]。然后，通过Aperio ScanScope CS2设备(美国加利福尼亚州维斯塔市Aperio Technologies公司)分析并采集数字玻片，并使用ImageScope V12.1.0.5029(Aperio Technologies公司)分析整个数字玻片。进行H&E和PAS染色以评估组织学损伤。由两名盲法观察者对肾小管和肾小球损伤进行半定量评分，他们检查每个肾脏切片至少20个视野。肾小管损伤的定义为肾小管扩张、肾小管萎缩、肾小管上皮细胞坏死和管型形成的明显迹象。肾小管病变的评分如下:0 = 无肾小管损伤的正常肾脏；的肾小管受损；评分2:10 - 25%的肾小管受损；评分3:25 - 50%的肾小管受损；评分4:50 - 74%的肾小管受损；评分5:>75%的肾小管受损。肾小球病变评分:0 = 正常肾小球；1 = 少数肾小球中有轻度纤维蛋白沉积和毛细血管数量减少；2 = 许多肾小球中有中度纤维蛋白沉积和毛细血管数量减少；3 = 许多肾小球中有明显纤维蛋白沉积和毛细血管数量减少；4 = 许多肾小球中有明显纤维蛋白沉积和毛细血管数量减少以及肾小球硬化；5 = 肾小球硬化。每只动物的评分指数表示为所有获得分数的平均值。每组的肾小管和肾小球病理评分均表示为中位数四分位间距(IQR)(假手术组；LPS 24小时组；LPS 48小时组；RAPA/LPS组；LPS/RAPA组 )。

免疫组织化学

为了对III型胶原蛋白(艾博抗公司，ab7778)、α-klotho蛋白(LS生物公司，b6625)和CD39(胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1，ENTPD1)(艾博抗公司，ab223842)进行免疫组织化学评估，将福尔马林固定石蜡包埋的肾脏组织切成2微米厚的切片，进行脱蜡和热介导抗原修复(柠檬酸缓冲液，用于III型胶原蛋白和α-klotho蛋白切片；Tris/EDTA缓冲液pH 9.0用于CD39切片)。抗原表位暴露后，玻片用 (3%)孵育，α-klotho蛋白切片用吐温-20(0.1%)通透，III型胶原蛋白切片用曲拉通0.25%通透。然后，用蛋白封闭液(美国达科公司)封闭并进行一抗孵育。通过过氧化物酶/DAB达科真实视野检测系统(丹麦格洛斯楚普达科公司)检测阳性染色。过氧化物酶反应显示为棕色沉淀，用苏木精(蓝色)复染。阴性对照通过与无关对照抗体孵育制备。图像由Aperio ScanScope CS2设备(Aperio技术公司)采集，信号使用ImageScope V12.1.0.5029(Aperio技术公司，加利福尼亚州维斯塔)分析。III型胶原蛋白和CD39染色定量为每只动物强阳性总强度(ISP)/总分析面积(ISP/面积)的比值。对于α-klotho蛋白染色，结果表示为强阳性数量(NSP)/总分析面积(NSP/面积)的比值。

共聚焦激光扫描显微镜检查

肾脏切片用 -平滑肌肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术公司，加利福尼亚州圣克鲁斯)和CD31(艾博抗公司，美国剑桥)进行双重染色。所有抗体均与小鼠组织交叉反应。组织切片通过二甲苯和酒精进行脱蜡，并在柠檬酸缓冲液中通过三个5分钟的微波(750瓦)循环进行抗原修复。之后，将其与特异性封闭液、一抗(抗 -平滑肌肌动蛋白1:100，抗CD31 1:30)和相应的二抗(Alexa Fluor 488抗小鼠；Alexa Fluor 555山羊抗兔，分子探针公司，俄勒冈州尤金)孵育。所有切片用TO-PRO-3(分子探针公司)复染，并用荧光封片剂封片。阴性对照通过省略一抗制备。

图像采集由徕卡TCS SP2共聚焦显微镜(德国韦茨拉尔徕卡公司)进行。由两名对玻片来源不知情的独立观察者在至少10个高倍( )视野(HPF)/切片中对数量进行定量。最终计数为两次测量的平均值。观察者间差异在任何情况下均不高于20%。

蛋白质免疫印迹法

蛋白质裂解物用含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液匀浆。蛋白质(20微克)在4 - 15%聚丙烯酰胺凝胶(伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯)中分离，然后通过Trans-Blot Turbo(伯乐公司)转移到PVDF膜(Trans-Blot Turbo Midi PVDF，0.2 mM；伯乐公司)上。在2%牛血清白蛋白封闭后，膜与以下一抗孵育过夜:α-klotho蛋白(LS生物公司，b6625)[1:500]和CD39(艾博抗公司，ab223842)[1:1000]，然后与二抗山羊抗兔IgG HRP偶联物(艾博抗公司，ab6721)[1:2000]孵育。同一膜用小鼠单克隆抗β-肌动蛋白抗体(1:20,000；西格玛公司)检测。使用电化学发光(ECL)系统检测结合抗体(英国阿默沙姆公司)。化学发光信号由Chemidoc采集，并用Image J软件定量。

内皮细胞培养和免疫表型分析

人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)(意大利ATCC-LGC标准公司)在EndGro(默克密理博公司)中于、5%二氧化碳气氛下培养。细胞用脂多糖(LPS) 刺激30分钟。预处理时，在LPS暴露前30分钟向培养基中加入雷帕霉素(5 nM)。后处理时，在LPS刺激30分钟后加入雷帕霉素。

为抑制pERK，细胞在用SC1(Pluripotin，艾博抗公司)预处理30分钟和。为进行pAKT抑制试验，在LPS暴露前，细胞用Akt抑制剂IV(Akt-inh IV，凯美科瑞亚公司)预孵育30分钟。如前所述，通过流式细胞术分析EC表型。

为进行磷酸化蛋白的细胞内染色，细胞用IntraPrep试剂盒(仪器实验室公司)固定并通透处理，然后与未偶联的一抗孵育，抗磷酸化Akt(T308)(美国细胞信号技术公司)、抗磷酸化p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(美国细胞信号技术公司)、抗磷酸化mTOR(Ser2448)(美国细胞信号技术公司)、抗磷酸化p70 S6激酶(Thr389)(美国细胞信号技术公司)，于4°C孵育25分钟。然后洗涤细胞，并用AlexaFluor 488二抗(分子探针公司)和AlexaFluor 555二抗(分子探针公司)在于标记细胞。最后，洗涤细胞两次，并如前所述重悬于流式细胞术缓冲液中进行采集。

为评估与EndMT过程相关的表型变化，将ECs用LPS或ERK抑制剂培养48小时。用ERK抑制剂预处理，然后进行LPS暴露，持续剩余的。

如前所述，通过表面染色分析EC表型，使用异硫氰酸荧光素偶联的抗CD31(德国米尔滕yi生物技术公司)和藻红蛋白偶联的抗血管内皮(VE)钙黏蛋白(德国米尔滕yi生物技术公司)。表面孵育后，用流式细胞术缓冲液洗涤细胞，并进行流式细胞术分析。

使用IntraPrep™试剂盒对细胞进行固定和通透处理后，对未偶联的 -平滑肌肌动蛋白(艾博抗公司)进行细胞内染色，于孵育25分钟。然后洗涤细胞，并用AlexaFluor 488二抗(分子探针公司)在再孵育25分钟。最后，洗涤细胞两次，并进行数据采集。

肾小管上皮细胞培养及DNA/RNA提取

3至5代的RPTEC(人肾近端小管上皮细胞)在RGEM培养基(肾上皮细胞生长培养基，Lonza)中生长至汇合，其中基础培养基RBEM由rhEGF(重组人表皮生长因子)、转铁蛋白、胰岛素、氢化可的松、肾上腺素、三碘甲状腺原氨酸和胎牛血清(FBS)支持，保存在，培养过程中每两天更换一次培养基。将含有培养基的细胞在与5%的一起孵育。一旦汇合，将细胞暴露于或雷帕霉素中。对于预处理组，在暴露于LPS之前，将雷帕霉素添加到培养基中并维持。在LPS刺激后通过孵育雷帕霉素进行后处理。

在LPS刺激后，将细胞在1X PBS中洗涤3次，并更换新鲜培养基。此外，将细胞暴露于作为衰老的阳性对照。对于体外实验，包括全基因组甲基化分析，我们使用了三批独立的RPTEC细胞。使用All Prep DNA/RNA Mini Kit(Qiagen)根据制造商的方案从RPTEC中同时提取DNA和RNA。使用NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies)评估核酸浓度和质量。

实时PCR分析

使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯)按照制造商的说明，将500 ng总RNA用于逆转录反应。使用Klotho(Kl)、CDKN1A p21/Waf1、CD39和WFS1引物(Integrated DNA Technologies，美国爱荷华州珊瑚维尔)(补充表2)与SYBR Green Master Mix(Bio-Rad)和Light Cycler@96(Roche)结合，在iCycler热循环仪(Bio-Rad)上进行实时定量PCR。将mRNA的相对量标准化为 -肌动蛋白mRNA作为管家基因。使用方法分析数据。

DNA甲基化分析

如前所述，利用由HiScanSQ系统和Infinium HumanMethylation450 BeadChips组成的Illumina甲基化分析平台进行DNA甲基化分析。使用EZ-96 DNA甲基化试剂盒(ZymoResearch)对从RTEC提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化，然后在InfiniumHumanMethylation450BeadChips上进行该DNA的杂交。LPS刺激的RTEC和正常培养的RTEC的微阵列数据可在BioStudies数据库中获得，登录号为E-MTAB-13,396，网址为https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress。

所有统计分析均使用R和RnBeads R包进行。考虑到LPS刺激的RTEC和正常培养的RTEC的平均甲基化水平差异、平均甲基化商以及评估两组甲基化值是否来自不同分布的t检验，计算位点和区域水平的差异甲基化分析。此外，根据这三个标准中的每一个为每个位点分配一个秩。计算组合秩作为三个秩中的最大值(即最差秩)。区域水平差异甲基化分析的覆盖范围针对启动子区域、5’-UTR、第一外显子、基因体和3’-UTR中具有位点的基因区域，以便提供尽可能广泛和全面的甲基化状态视图。

定量甲基化特异性PCR测定(qMSP)

使用亚硫酸氢盐转化的DNA，按照制造商说明，采用Methylamp MS-qPCR Fast Kit(Epigentek Group)进行qMSP。每个反应使用的亚硫酸氢盐处理的DNA作为模板。使用MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer/index.html)设计感兴趣基因的引物(补充表2)。ACTB( -肌动蛋白)基因用作参照基因。每次运行均包含无模板对照作为阴性对照。使用EpiTect Control DNA(一种100%甲基化的DNA，Qiagen)作为所有研究基因的阳性对照。PMR(甲基化参照百分比)(即甲基化程度)用于定义特定位点完全甲基化分子的百分比，计算方法如前所述。简而言之，通过将样品中基因/ACTB的比率除以SssI处理的白细胞DNA(Qiagen)中基因/ACTB的比率，再乘以100来计算PMR值。对感兴趣基因和参照基因进行平行PCR。使用比较CT法检测PMR值。甲基化DNA分子百分比与CT之间的关系描述为PMR = 2 - DDCT×100%。

差异甲基化区域中基因网络构建的Ingenuity通路分析(IPA)

使用Ingenuity通路分析(IPA)软件(IPA’，IPA分析匹配50数据集LNUL，QIAGEN Redwood City，http://www.qiagen.com/ingenuity)对差异甲基化区域内的基因网络进行分析。

SA-β-半乳糖苷酶检测

按照制造商方案(Cell Signaling Technology)进行衰老相关的SA - -半乳糖苷染色。用PBS(pH 6.0)洗涤后，将细胞在4%多聚甲醛中固定15分钟，并用新鲜制备的SA - -半乳糖苷溶液( X - 半乳糖苷，柠檬酸/磷酸钠，5 mM亚铁氰化钾，5 mM铁氰化钾，150 mM NaCl和2 mM MgCl)染色。接下来，将细胞在干燥培养箱中过夜孵育。然后，去除染色溶液，将样品浸入70%甘油中，并评估蓝色的显色情况。通过在五个不重叠视野中每个培养皿至少计数500个细胞来确定SA - β - 半乳糖苷阳性细胞的数量。出现尺寸增加的SA - β - 半乳糖苷强阳性细胞数量的百分比计算为考虑每个培养皿中计数的细胞总数的比率。描述为PMR DDCT 。