DEPTOR对人类mTOR复合物的调控
发布时间：
2026-03-12 21:23
DEPTOR对人类mTOR复合物的调控
Matthias Wälchli, Karolin Berneiser, Francesca Mangia, Stefan Imseng, Louise-Marie Craigie, Edward Stuttfeld, Michael N Hall, Timm Maier*
瑞士巴塞尔大学，生物中心
摘要 含DEP结构域的mTOR相互作用蛋白(DEPTOR)是一种脊椎动物特有的蛋白，它既可以作为癌蛋白，也可以作为肿瘤抑制因子，在代谢、免疫和癌症中发挥重要作用。它是唯一一种能够结合并调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)两种复合物的蛋白质，mTOR是细胞生长的核心调节因子。对与人类mTOR复合物1(mTORC1)和mTORC2结合的DEPTOR进行生化分析和冷冻电镜重建显示，DEPTOR的两个结构区域，即PDZ结构域和DEP结构域串联体(DEPt)，都参与了与mTOR的相互作用。PDZ结构域紧密结合并具有轻微的激活作用，但随后作为DEPt结合的锚定物，通过变构抑制mTOR的激活。PDZ结构域和DEPt的结合界面也支持其他信号通路的进一步调控。mTOR复合物对DEPTOR磷酸化的一种单独的、类似底物的相互作用模式，解释了在较高DEPTOR浓度下对未受刺激的mTOR活性的抑制。DEPTOR和mTOR之间的多方面相互作用为理解DEPTOR在生理学中的不同作用提供了基础，并为在疾病中靶向mTOR-DEPTOR相互作用开辟了新途径。
引言
含DEP结构域的mTOR相互作用蛋白(DEPTOR)在脊椎动物中保守存在，它调节丝氨酸/苏氨酸激酶哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性，mTOR是细胞生长的主要调节因子。mTOR在两种功能不同的多蛋白复合物mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2中起作用(Sabatini等人，1994年；Jacinto等人，2004年；Sarbassov等人，2004年；Liu和Sabatini，2020年；Loewith和Hall，2011年；Loewith等人，2002年)，并且DEPTOR是唯一被报道能结合并抑制这两种mTOR复合物的蛋白质(Peterson等人，2009年)。
DEPTOR是一种46 kDa的蛋白质，由一个N端DEP(Dishevelled、Egl-10和Pleckstrin)结构域串联体(本文称为DEPt)和一个C端PDZ(突触后致密物95、盘状大蛋白、紧密连接蛋白-1)结构域组成。有人提出PDZ结构域与mTOR相互作用(Peterson等人，2009年)，并且DEPt介导磷脂酸(PA)结合(Weng等人，2021年)。连接DEPt和PDZ结构域的接头包含一个磷酸化降解基序。mTOR使这个基序磷酸化，导致随后的额外磷酸化、被SCF E3泛素连接酶泛素化以及DEPTOR降解(Gao等人，2011年；Zhao等人，2011年；Duan等人，2011年)。DEPTOR降解反过来通过mTOR负反馈环导致mTORC1激活和mTORC2失活。含OTU结构域的泛素醛结合蛋白1(OTUB1)通过使DEPTOR去泛素化来抵消这一过程(Zhao等人，2018年)。mTOR和DEPTOR与从mTORC1到mTORC2的反馈环以及其他信号通路的相互作用导致了复杂的反应模式，这些模式与取决于细胞类型和状态的DEPTOR丰度变化相关(Caron等人，2018年；Catena和Fanciulli，2017年)。
DEPTOR在癌症、肥胖和免疫缺陷中发挥核心作用(Caron等人，2018年；Laplante等人，2012年；Wedel等人，2019年；Wedel等人，2016年；Caron等人，2016年)。它既可以作为一种癌蛋白，也可以作为一种肿瘤抑制因子(Caron等人，2018年)，并且其在调节PI3K-AKT信号传导中的作用因癌症类型和细胞状态而异。由于活跃的PI3K信号传导，大多数癌症中DEPTOR水平较低(Caron等人，2018年)。在少数癌症中，包括多发性骨髓瘤(Peterson等人，2009年)，DEPTOR过度表达并促进癌细胞存活。肥胖时白色脂肪组织中DEPTOR表达水平升高，并且DEPTOR通过下调mTORC1反馈控制从而激活AKT信号传导来促进脂肪生成(Laplante等人，2012年)。尽管DEPTOR与人类健康相关，但其是mTOR复合物中唯一分子作用机制未知的直接蛋白质调节因子(Yang等人，2017年；Ananda-padamanaban等人，2019年；Rogala等人，2019年)。
视频1. 含DEP结构域的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)相互作用蛋白(DEPTOR)-mTOR复合物2(mTORC2)。冷冻电镜重建和模型概述，突出相关手稿中讨论的功能相关位点和相互作用。
https://elifesciences.org/articles/70871/figures#video1
结果
为了研究DEPTOR和mTOR在两种人类mTOR复合物中的相互作用，我们分别对重组表达和纯化的DEPTOR-mTORC2和DEPTOR-mTORC1复合物进行了分辨率为3.2 Å和3.7 Å的冷冻电镜分析(图1a、b和c；图1补充图1-3、视频1和视频2)，并结合了DEPTOR的DEPt区域的晶体学和溶液结构表征以及生化分析。与DEPTOR结合的两种mTOR复合物的冷冻电镜重建的核心结构在很大程度上类似于它们无DEPTOR状态的结构(图1a、b和c；Yang等人，2017年；Scaiola等人，2020年)。在与DEPTOR结合的mTORC1和mTORC2复合物中，mTOR活性位点呈非激活构象(Yang等人，2017年；Scaiola等人，2020年；图1补充图3g)且未被底物占据。最近发现肌醇六磷酸(IP6)与mTORC1和mTORC2结合，尽管没有明显的激活或抑制作用(Scaiola等人，2020年；Gat，2019年)，并且其结合在与DEPTOR结合的mTORC1和mTORC2复合物中不受干扰。mTORC1底物中短线性TOS和RAIP基序的结合位点在mTORC1-DEPTOR复合物中仍然为空(Tee和Proud，2002年；Nojima，2003年；Schalm等人，2002年)。在mTOR的FAT结构域的两个区域中观察到DEPTOR的一致密度，这与DEPTOR对两种复合物的调节作用一致(Peterson等人，2009年)。
DEPTOR与mTOR的相互作用分两步进行。第一步，DEPTOR的PDZ结构域与mTOR的FAT结构域结合。PDZ结构域核心(氨基酸残基 326 - 409)采用典型的PDZ折叠，并与mTOR FAT结构域的TRD2亚结构域结合(Yang等人，2013年)(图2a和b；图2 - 图补充1a)。相互作用界面由PDZ结构域的保守表面和mTOR的三个螺旋(a )形成(图1、2a和b；图2 - 图补充1a、b、c)。典型的PDZ结构域肽结合凹槽(Lee和Zheng，2010年)存在，但在DEPTOR的PDZ结构域与mTOR的相互作用中未被占据(图2 - 图补充1d)。这就提出了一种可能性，即通过典型的PDZ - 肽相互作用与DEPTOR的PDZ结构域结合其他未知的蛋白质伙伴，可能会进一步增强或抑制mTOR - PDZ的相互作用。据我们所知，其他PDZ结构域尚未观察到DEPTOR的PDZ结构域与mTOR的相互作用模式。mTOR与DEPTOR的PDZ结构域之间的结合界面因来自在分离的mTOR复合物或DEPTOR中已知或预测为无序的区域的贡献而显著扩大。mTOR的Horn(也称为N - HEAT)区域(Yang等人，2017年；Aylett等人，2016年)中的一个环(a ，
视频2. 含DEP结构域的雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)相互作用蛋白(DEPTOR) - mTOR复合物1(mTORC1)。冷冻电镜重建和模型概述，突出了相关手稿中讨论的功能相关位点和相互作用。
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图1. 含DEP结构域的雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)相互作用蛋白(DEPTOR)结合的mTOR复合物1和2(mTORC1和mTORC)的冷冻电镜重建。(a)DEPTOR结合的mTORC2的整体和局部聚焦冷冻电镜重建的复合图。(b)mTORC1、mTORC2和DEPTOR的结构域架构示意图。(c)DEPTOR - mTORC1的整体和局部聚焦冷冻电镜重建的复合图。在(a)和(c)中，蛋白质根据(b)中的方案着色。DEPTOR通过其延伸的PDZ - 连接子和与mTOR的FAT结构域相关的DEP结构域串联(DEPt)区域，以几乎相同的方式与mTORC1和mTORC2结合。
本文的在线版本包括图1的以下图补充:
图1接下页
图1续
图补充1. 含DEP结构域的雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)相互作用蛋白(DEPTOR) - mTOR复合物2(mTORC2)的冷冻电镜数据处理。
图补充2. 含DEP结构域的雷帕霉素相互作用蛋白(DEPTOR) - mTOR复合物1(mTORC1)的冷冻电镜数据处理。
图补充3. 冷冻电镜重建中雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)复合物的局部分辨率和活性位点状态。
DEPTOR结合环(图2c)在之前无DEPTOR时的mTOR复合物重建中是无序的，其功能仍然难以捉摸(Yang等人，2017年；Scaiola等人，2020年)。与DEPTOR结合时，残基a 是有序的，连接到角区(Horn)的残基a 303的主链在较低分辨率下可见(图2 - 图补充1e)。残基a 与DEPTOR的PDZ结构域相互作用，残基 作为界面的一个组成部分插入到DEPTOR的PDZ结构域和mTOR的FAT结构域之间(图2 - 图补充1f)。DEPTOR的PDZ结构域与DEPTOR结合环一起在mTOR的角区(Horn)和FAT结构域之间形成了一个结构连接，其位置可介导mTOR复合物不同亚区域之间的构象串扰。连接DEPt和PDZ结构域的DEPTOR连接子在很大程度上仍未解析(a )，当DEPTOR与mTOR复合物结合时，只有连接子的C末端区域(a 304 - 325)是有序的。残基a 309 - 325为PDZ核心结构域提供了一个N末端延伸，而a 结合由mTOR FAT结构域的α - 螺旋14 - 16形成的一个凹槽(图2d)。连接子 - mTOR相互作用扩大了由PDZ核心结构域形成的界面，表明连接子残基a 对于DEPTOR介导的mTOR调节具有功能相关性。
图2. 含DEP结构域的雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)相互作用蛋白(DEPTOR)的PDZ结构域及其与mTOR的相互作用。(a，b)与mTOR FAT结构域结合的DEPTOR PDZ的前视图(a)和后视图(b)。PDZ结构域(显示为带有红色卡通图的透明表面)与mTOR的FAT结构域中的一个铰链结合。(c)PDZ结构域N末端延伸朝向FAT结构域伸展。相邻的N末端连接子插入到FAT结构域上的一个凹槽中，并对PDZ - mTOR界面有很大贡献。(d)mTOR角区(Horn - region)中的环区域(氨基酸 290 - 350)(带有卡通图的透明部分)在游离的mTOR复合物中是无序的，它对mTOR - PDZ界面有贡献，从而在mTOR的角区(Horn - region)和FAT结构域以及DEPTOR的PDZ结构域之间建立了一个连接。
本文的在线版本包括图2的以下图补充:
图补充1. PDZ结构域与雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)复合物的相互作用。
图3. 含DEP结构域的雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)相互作用蛋白(DEPTOR)的DEP结构域串联(DEPt)区域与mTOR的相互作用。(a)与mTORC复合物2(mTORC2)结合的DEPTOR(红色卡通图表示的透明结构)的表面展示。DEPt区域结合在FAT结构域螺旋重复序列的中央顶部。(b)DEPt的第一个DEP结构域突出的发夹结构插入到mTOR的激酶结构域和FAT结构域之间的缝隙中。DEPTOR置换突变体R2505P(Grabiner等人，2014年)位于附近。(c)分析野生型和突变型DEPTOR对Rheb刺激的mTORC1活性的影响。突变体在图3补充图2中描述。在存在野生型和突变型DEPTOR的情况下，mTORC1与4E-BP1和Rheb一起孵育以进行刺激。反应通过SDS-PAGE分离并通过蛋白质印迹分析。用特异性针对T37/46残基磷酸化的抗体检测4E-BP1磷酸化。4E-BP1-pT37/46信号中蛋白质印迹的定量(平均值±标准差)相对于总4E-BP1信号进行归一化，并且通过单向方差分析确定对照(0μM DEPTOR)和DEPTOR变体之间变化的统计学显著性。 ’p ’p ’p ’s ’n 4.
本文的在线版本包括图3的以下补充图:
源数据1. 激酶测定的源数据。
补充图1. 晶体中的DEP结构域串联(DEPt)以及与mTOR复合物2(mTORC2)相关。
补充图2. PDZ和DEP结构域串联(DEPt)界面中的突变。
DEPTOR与mTOR相互作用的另一步骤由DEPTOR的DEPt区域和mTOR的FAT结构域介导(图1a和c；图3a)。由于局部灵活性和部分占据，在整体高分辨率重建中，与mTOR结合的DEPt区域的分辨率较低。三维变异性分析、聚焦分类和局部精修(图1补充图1-S.1a和2a)使得在约4-6埃的局部分辨率下(图1补充图3e，f)能够清晰地观察到整体折叠和单个二级结构元件(图3补充图1a)。为了获得第二个DEPTOR-mTOR结合界面的伪原子模型，我们确定了重组DEPt区域(氨基酸 1-230)在溶液中小角X射线散射(SAXS)揭示的结构域交换构象下1.93埃分辨率的X射线晶体结构(图3补充图1b，c)。DEPt中的两个结构域均采用特征性的DEP结构域折叠，包括一个α-螺旋核心和一个突出的β-发夹臂。在DEPt中，两个DEP结构域通过它们的N端α-螺旋和第二个DEP结构域的C端延伸相互作用，该C端延伸折叠回到第一个DEP结构域上(图3补充图1b)。DEPt与mTOR的结合保留了DEPt的整体折叠，但与两个DEP结构域之间3.6埃的平移和 旋转相关(图3补充图1d)。
DEP结构域结合在mTOR FAT结构域螺旋重复序列的顶部，位于区域a (图3a)。DEP与mTOR的结合界面小于PDZ-连接子相互作用位点( 与 相比)。N端DEP结构域，包括与第二个DEP结构域的连接子，构成了界面的主要部分( 与 相比)，并且比C端DEP结构域排列更有序(图1-图补充3e、f；图3-图补充1a)。值得注意的是，人类DEPTOR的两种已知异构体之一中不存在N端DEP结构域(Ota等人，2004年)，这可能会消除DEP-mTOR的结合。N端DEP结构域突出的β-发夹插入mTOR的FAT和激酶结构域之间的缝隙中(图3b)，残基 位于此处。在一个癌症相关突变中，该残基变为脯氨酸，这削弱了DEPTOR与mTOR的结合(Grabiner等人，2014年；Sato等人，2010年)，并且不能通过DEPTOR的过表达来补偿，这突出了这种相互作用的功能相关性(图3b；Xu等人，2016年)。DEP与mTOR相互作用的残基高度保守(图3-图补充1e)，界面周围的表面静电势互补(图3-图补充1f)。值得注意的是，发现DEP中参与mTOR相互作用的两个带正电荷的区域与PA结合(Weng等人，2021年)。据报道，PA会将DEPTOR从mTOR复合物中置换出来(Yoon等人，2015年)。
先前描述的mTOR抑制机制包括与mTORC1和mTORC2中激酶活性位点的ATP竞争性结合(例如Torin1)(Thoreen等人，2009年)、FKBP12-雷帕霉素复合物对活性位点的空间位阻(Yang等人，2017年；Choi等人，1996年)，以及FRB结构域结合蛋白抑制剂PRAS-40与mTORC1特异性底物引导相互作用的竞争。在其他底物识别元件处的竞争性结合，例如mTORC1中的TOS和RAIP基序结合位点(Yang等人，2017年；Tee和Proud，2002年；Nojima，2003年；Schalm等人，2002年；Böhm，2021年；Wang等人，2007年)或mTORC2中SIN1的C端部分(Tatebe等人，2017年)，为mTOR抑制提供了替代靶点。最近开发的小分子mTOR抑制剂要么利用上述抑制机制，要么其详细作用模式仍不清楚(Benavides-Serrato等人，2017年；Benjamin等人，2011年；Wang等人，2020年；Guenzle等人，2020年)。
值得注意的是，DEPTOR不仅是mTORC1和mTORC2活性的调节剂，也是mTORC1和mTORC2中mTOR的底物(Peterson等人，2009年；Gao等人，2011年；Zhao等人，2011年；Duan等人，2011年)。事实上，我们在DEPTOR-mTORC1复合物中观察到，在底物螺旋肽段和FRB结构域上的抑制剂PRAS40的结合位点处存在微弱的残余密度，这可能代表DEPTOR的动态相互作用片段或共纯化的相互作用蛋白(图4 - 图补充1a)。基于距离限制，DEPTOR的连接子与PRAS40中延伸螺旋一样与FRB位点结合，这与DEPTOR通过其PDZ和DEPt区域与mTOR的结合不相容；不能排除较小的结合区域，但这需要周围的连接子区域完全伸展。尽管如此，当DEPTOR通过其PDZ和DEPt区域与mTORC1结合时，DEPTOR连接子中mTOR介导的磷酸化所有位点( 、265、286、293、295、296、299；Peterson等人，2009年；Gao等人，2011年；Zhao等人，2011年；Duan等人，2011年)在空间上不可能到达mTOR活性位点。因此，需要一种由连接子介导的DEPTOR的二级低亲和力结合模式(或无招募信号的反式磷酸化)，这为FRB结构域处的残余信号提供了合理的解释。
为了测试DEPTOR相互作用在mTOR活性调节中的相关性，我们分析了Rheb激活的mTORC1对4E - BP1的磷酸化作用。尚未描述用激活的mTORC2进行的等效体外活性测定。昆虫细胞和大肠杆菌表达的DEPTOR分别部分磷酸化或未磷酸化，在 处显示对4E - BP1磷酸化有60 - 70%的抑制作用(图3c，图3 - 源数据1)。这种抑制作用通过单个突变部分消除，通过核心PDZ界面的三重突变完全恢复(图3c，图3 - 图补充2)。值得注意的是，DEPt和mTOR之间界面的突变导致4E - BP1磷酸化的刺激(图3c，图3 - 图补充2)，这表明DEPt介导了DEPTOR对mTOR复合物的抑制作用，而仅通过PDZ结构域的DEPt界面突变体的结合甚至会轻微激活与Rheb结合的mTORC1(图3c)。
讨论
我们的结构和突变分析提出了一个DEPTOR对mTOR复合物作用的模型，其中DEPTOR通过其PDZ结构域锚定以高亲和力结合，可能受其他PDZ结合蛋白调节，随后基于亲和力以较低亲和力结合DEPt。DEPTOR通过DEPt结合的显性负效应部分抑制mTOR活性，或者如果PA结合阻止DEPt与mTOR结合，则通过PDZ结构域的影响适度刺激mTOR活性(图4b)。仅在高浓度的DEPTOR(图4b)下才会观察到对未刺激的基础mTORC1或mTORC2的抑制，这会导致DEPTOR与mTORCs发生额外的类似底物的结合。
据报道，DEPTOR的孤立DEPt区域与mTORC1缺乏显著结合，且对mTORC1活性没有影响，由此产生了一种假设，即在全长DEPTOR的情况下，DEPt不参与控制mTOR活性(Peterson等人，2009年；Heimhalt等人，2021年)。然而，我们的数据表明，当通过PDZ结构域锚定时，DEPt与mTOR FAT结构域的一个区域结合，并抑制mTOR的变构激活。早期观察结果支持了强PDZ和弱DEPt相互作用结合的亲和力，即全长DEPTOR在比孤立PDZ结构域结合所需浓度更低的情况下就能抑制mTORC1激活:孤立的PDZ结构域以 的 与模拟Rheb激活的mTORC1变体 结合，但在同一系统中DEPTOR的 值为 (Heimhalt等人，2021年)。最近，4E-BP1中两个mTORC1结合基序，即高亲和力TOS基序和极低亲和力RAIP基序，也证明了类似的强关联和极弱关联相互作用的功能相关性(Böhm，2021年)。
我们在DEPt界面的突变体中观察到Rheb刺激的mTORC1活性出现了意外的微弱激活，我们将其归因于PDZ结构域结合的影响。这种效应与在等摩尔孤立PDZ结构域存在下(总体为纳摩尔浓度，Heimhalt等人，2021年的图2—图补充1/图6—图补充1)mTORC1对4E-BP1磷酸化增加的观察结果一致。也有报道称，PDZ结构域对结合激活的mTORC1与未激活的mTORC1的亲和力大约高10倍( 对 )(Heimhalt等人，2021年)，尽管激活的和未激活的mTOR复合物的静态结构中的界面没有差异(Yang等人，2017年)。总之，这些数据表明，PDZ结构域的结合与mTOR上其结合位点的动力学变化有关，这些变化与mTOR激活变构偶联。基于通过空的PDZ-肽结合槽的典型肽-PDZ结构域相互作用，其他蛋白质与DEPTOR的结合可能会调节PDZ对mTOR的亲和力，甚至其与mTOR结合时对活性的影响。
为什么低浓度的DEPTOR能抑制Rheb刺激的mTORC1，但对于已报道的对未刺激的mTORCs的抑制(Peterson等人，2009年；Gao等人，2011年；Laplante等人，2012年；Yoon等人，2015年)却需要高得多的DEPTOR浓度(Heimhalt等人，2021年)？
在PDZ与mTOR结合的促进下，DEPt与未激活的mTOR复合物结合，而不会在FAT区域诱导结构变化，如这里针对mTORC1和mTORC2所显示的那样。我们认为，DEPt与FAT结构域的一个区域结合，该区域转导Rheb的变构激活，特别抑制了Rheb结合位点与激酶位点之间的构象偶联，因此仅降低了mTORC1活性的刺激。这可能是通过增加FAT区域中对传递变构激活能力较差的状态的比例来实现的，要么直接是在未激活的mTOR中观察到的状态，要么是其他中间状态。这种作用模式表明在低浓度的DEPTOR下不存在对未刺激的基础mTORC活性的抑制。对于低DEPTOR浓度下缺乏抑制作用的另一种解释(Heimhalt等人，2021年)可能是由于PDZ结构域与受刺激的mTORC1和未受刺激的mTORC1之间的差异相互作用，分别为 的 与7 μM(Heimhalt等人，2021年)，导致无法与mTORC结合。然而，基于我们对DEPt结合的另一个界面的证明，DEPt和PDZ结合的亲和力表明全长DEPTOR的结合仍然发生在低于有效抑制未刺激的mTORC1所需的约15 - 50 μM的浓度下(Heimhalt等人，2021年)。
图4. 含DEP结构域的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)相互作用蛋白(DEPTOR)介导的mTOR活性调节模型。(a)基于结构的表示:(1)未激活的mTOR复合物1(mTORC1)的基础状态(基于PDB:6BCX)，(2)Rheb结合对mTORC1的变构激活(基于PDB:6BCU)，以及(3)DEPTOR通过PDZ结构域和DEP结构域串联(DEPt)与mTORC1的结合对其构象状态和活性的影响。构象状态亚群中的可能转变用阴影表示。(b)DEPTOR与mTOR复合物之间建议的调节相互作用示意图。(a)中所示的结构特征状态用数字表示。DEPTOR通过PDZ结构域和DEPt结合可防止变构激活。在高浓度下，DEPTOR以二级结合模式作为底物与mTORC1结合，并在空间上影响其他底物进入活性位点。磷脂酸(PA)可能干扰DEPt - mTOR结合，解除对mTORC的变构抑制。剩余结合的PDZ结构域在激活和未激活的mTOR复合物中轻度刺激激酶活性。
本文的在线版本包括图4的以下图补充:
图补充1. 含DEP结构域的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)相互作用蛋白(DEPTOR)结合的mTOR复合物1(mTORC1)在FRB结构域底物招募位点的残余密度。
对于在较高浓度下抑制mTORC1和mTORC2的一个合理的解释可能是在DEPTOR浓度超过mTOR的过量情况下的二级、低亲和力结合模式，这种模式不涉及PDZ和DEPt与mTOR的相互作用。实际上，DEPTOR是mTORC1和mTORC2的底物(Peterson等人，2009年；Gao等人，2011年；Zhao等人，2011年；Duan等人，2011年)。TOR复合物的底物招募涉及通过许多底物在激酶结构域之外的中亲和力和低亲和力相互作用进行特定底物招募(Yang等人，2017年；Tee和Proud，2002年；Nojima，2003年；Schalm等人，2002年；Böhm，2021年；Tatebe等人，2017年)，但通过PDZ结构域和DEPt的主要DEPTOR结合不适合招募，这表明存在与mTORC1和mTORC2的低亲和力二级结合模式。实际上，这里在mTORC1的已知底物招募位点观察到的残余密度表明了这种替代的、类似底物的弱相互作用。我们之前已经表明mTORC2中的核心底物识别区域是灵活排列的，这解释了为什么在当前类型的冷冻电镜分析中底物相互作用没有显现出来(Scaiola等人，2020年)。
通过FRB结构域或mTORC2中的其他区域，DEPTOR与底物样结合，并同时募集其他具有各自结合基序的底物，例如，具有TOS和RAIP基序的4E - BP1，这将导致对mTOR活性位点的相互限制，这种限制可能部分与溶液浓度解偶联，并由局部蛋白质动力学主导。同时，我们认为DEPTOR抑制活化的mTOR复合物的高亲和力模式的核心机制不太可能基于类似PRAS40的FRB相互作用，因为(1)mTORC2中FRB结构域上的结合位点不可接近(图4 - 图补充1b)，(2)这将使保守的特征性DEPt及其涉及 的mTOR相互作用没有指定功能，并且(3)它没有为对刺激和未刺激的mTORC1的差异效应提供额外解释，因为FRB结构域上的结合位点与变构激活不相关联。
值得注意的是，这里提出的介导mTOR抑制的DEPt和mTOR的界面涉及DEPt中最近与PA相互作用有关的区域(Weng等人，2021年)。我们假设DEPt与PA的相互作用可能控制DEPt与mTOR的结合，导致基于PDZ的活化或基于DEPt的活化mTOR复合物的下调。这将在PA信号传导和膜上的mTOR活化之间建立一个机制联系(图4b；Taka - hara等人，2020年)。
DEPTOR已被表征为mTOR活性的调节剂，对代谢和癌症有深远影响(Liu和Sabatini，2020年)。然而，它对细胞生理学的不同和正交效应，包括其作为癌蛋白和肿瘤抑制因子的明显拮抗作用，仍然是个谜。在这里，我们提供了一个DEPTOR与mTORC1和mTORC2复杂相互作用的结构导向模型，该模型确定了DEPTOR不同相互作用区域的正交贡献，以及来自其他信号通路的串扰进一步调节的潜力。这里提供的分子见解将是有针对性地剖析DEPTOR对mTOR信号传导的影响以进一步了解DEPTOR在生理学和疾病中的不同作用的关键组成部分。
材料和方法
蛋白质表达和纯化
Sf21昆虫细胞(表达系统)在HyClone昆虫细胞培养基(GE生命科学)中培养，并根据Fitzgerald等人，2006年的方法产生杆状病毒。mTORC2如先前所述进行表达和纯化，在D258之后插入内部FLAG标签(Scaiola等人，2020年)。纯化的mTORC2在凝胶过滤缓冲液中浓缩，补充5% w/v甘油，并在 下储存直至进一步使用。
为了表达人源mTORC1，如前所述(Aylett等人，2016年)，用杆状病毒感染Sf21昆虫细胞。感染后 ，通过在 下离心15分钟收获细胞，并在 保存直至进一步使用。使用玻璃匀浆器将细胞沉淀在 二乙醇胺(pH 8)、 和 中裂解，裂解物通过超速离心澄清。将可溶性蛋白与 抗DYKDDDDK琼脂糖珠(Genscript，皮斯卡塔韦，新泽西州)在 下孵育 。将珠子转移到 重力流柱(Bio-Rad)中，并用含有 二乙醇胺(pH 8)、 和 的 洗涤缓冲液洗涤四次。通过将珠子与补充有合成DYKDDDDK肽(0.6 mg/ml)(Genscript，皮斯卡塔韦，新泽西州)的 洗涤缓冲液孵育 来洗脱蛋白质。使用合成DYKDDDDK肽(0.1 mg/ml)和5分钟孵育时间进行另外三个洗脱步骤，将洗脱液合并。使用具有再生纤维素膜的100,000 Da分子量截留离心浓缩器(Amicon)浓缩洗脱的蛋白质，并在定制的Superose 6 Increase 10/600 GL凝胶过滤柱上通过尺寸排阻色谱法纯化，该柱用 二乙醇胺(pH 8.0)、200 mM NaCl、 甘油和 三(2-羧乙基)膦(TCEP)平衡。将纯化的mTORC1浓缩在凝胶过滤缓冲液中，并在 保存直至进一步使用。
全长人野生型(WT)DEPTOR编码序列从pRK5 FLAG人DEPTOR中扩增得到，该质粒由David Sabatini馈赠(Addgene质粒编号21334)(Peterson等人，2009年)，并通过Gateway克隆技术克隆到带有N端His10-Myc-FLAG标签的pAceBAC2表达载体(Geneva Biotech，瑞士日内瓦)中。为了表达人WT DEPTOR，用杆状病毒感染Sf21细胞，感染后在 以 离心收获 ，并在 保存直至进一步使用。细胞沉淀用裂解缓冲液( PIPES [pH 6.8]，500 mM NaCl，50 mM咪唑，2 mM MgCl ，和2 mM TCEP)超声裂解，裂解物通过超速离心澄清。澄清的裂解物加载到 Ni柱(金斯瑞高亲和力镍填充树脂)上，用含1 mM ATP的裂解缓冲液以10柱体积(CV)洗涤，并用线性梯度(5CV)洗脱到含 咪唑的裂解缓冲液中。使用TEV蛋白酶过夜切割标签，然后通过正交Ni柱(25 ml，金斯瑞高亲和力镍填充树脂)从样品中去除标签和带标签的TEV蛋白酶。蛋白质在 PIPES(pH 6.8)、 NaCl、5%甘油和1 mM TCEP中进行最后的凝胶过滤层析步骤。含有DEPTOR的级分浓缩至10 mg/ml并在 保存直至进一步使用。
DEPt(一种 )被克隆到载体pETG-10A中并在大肠杆菌BL21DE3细胞中表达。细胞在 YT培养基中于 培养。在 为0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为 ；细胞进一步培养 ，然后通过离心收获。细胞在 HEPES(pH 8)、 咪唑、1 mM TCEP中超声裂解，裂解物通过超速离心澄清。澄清的裂解物加载到5 ml Ni柱(金斯瑞高亲和力镍填充树脂)上，用13CV裂解缓冲液洗涤，并用线性梯度在5CV内洗脱到 HEPES(pH 8)、 咪唑和1 mM TCEP中。使用TEV蛋白酶过夜切割标签，然后通过正交Ni柱(5 ml，金斯瑞高亲和力镍填充树脂)从样品中去除标签和带标签的TEV蛋白酶。蛋白质在 HEPES(pH 8)、150 mM NaCl、5%甘油和1 mM TCEP中进行最后的凝胶过滤层析步骤。含有DEPt的级分浓缩至 并在 保存直至进一步使用。
由金斯瑞合成编码人野生型Rheb(氨基酸 1 - 171)(GenBank:D78132)的DNA，并克隆到编码His - GST标签用于表达的载体pETG30A中。大肠杆菌SoluBL21细胞在ZY培养基中于 培养。在 为0.65时，加入IPTG至终浓度为 。细胞进一步培养 ，然后通过离心收获。使用法国压榨机在 二乙醇胺(pH 8)、 和 β - 巯基乙醇(bME)中裂解细胞，裂解物通过超速离心澄清。澄清的裂解物加载到 His - Trap HP(通用电气医疗集团)上，用补充有20 mM咪唑的裂解缓冲液洗涤20CV，并用线性梯度(5CV)洗脱至 二乙醇胺(pH 8)、 咪唑、 和 bME。使用TEV蛋白酶过夜切割标签，然后通过正交镍柱镍柱(5 ml His - Trap HP [通用电气医疗集团])从样品中去除标签和标记的TEV蛋白酶。蛋白质在10 mM二乙醇胺(pH 8)、150 mM NaCl和1 mM TCEP中进行最终的凝胶过滤色谱步骤(HiLoad 16/600 Superdex 75 pg，赛多利斯)。收集含Rheb的级分，用3000 Da分子量截留离心浓缩器(密理博)浓缩，并补充 甘油，储存在 直至进一步使用。
体外mTORC1活性测定
在含有终浓度为50 mM HEPES(pH 7.5)、75 mM NaCl、2.4%甘油、6 mM MgCl和1 mM TCEP的体系中进行mTORC1激酶活性测定。4E - BP1的表达和纯化如前所述(Böhm，2021年)。对于Rheb激活的mTORC1，将Rheb与2 mM GTPγS(耶拿生物科学公司)和5 mM EDTA在室温下孵育1小时，然后通过加入 至 终浓度进行锁定。对于活性测定，将2 nM纯化的mTORC1与15 µM DEPTOR(野生型或突变体)、5 µM Rheb和320 nM 4E - BP1作为底物混合。通过加入 ATP启动反应，在室温下孵育 ，然后用 SDS样品缓冲液终止反应。样品通过SDS - PAGE分离，并通过Trans - Blot Turbo转移系统(伯乐公司)转移到孔径为0.2 µM的硝酸纤维素膜上。使用以下抗体通过LI - COR Fc系统(LI - COR生物科学公司)检测信号:mTOR(1:1000，RRID:AB_2105622)、4E - BP1 - p(T37/46)(1:1000，RRID: AB_560835)、4E - BP1(1:1000，RRID: AB_331692)和IRDye 800CW山羊抗兔IgG(1:17500，RRID: AB_621843)。所有抗体均稀释到TBST和LI - COR拦截(TBS)封闭缓冲液的等量混合物中。使用GraphPad Prism(RRID:SCR_002798)进行统计分析，采用单向方差分析。
结晶、X射线数据收集及结构测定
DEPt区域(一个 )采用坐滴气相扩散法在 进行结晶，蛋白质浓度为14.9 mg/ml，储液(12% w/v PEG 3350，0.2 M NaCl)与蛋白质的比例为1:1，总液滴体积为 。晶体转移至含有添加到 的乙二醇的冷冻保护剂中，并在液氮中玻璃化。在瑞士光源(保罗·谢尔研究所)的X06SA光束线于100 K下使用Eiger16M探测器(Dectris)收集晶体学数据。数据在波长1.0 Å下收集，曝光时间为 ，旋转角度为 ，扫描 ，探测器距离为 。
数据用DIALS处理，并用aimless(RRID:SCR_015747)进行缩放(Evans和Murshudov，2013年)。使用程序PHASER(RRID:SCR_014219)(McCoy等人，2007年)，以4F7Z.pdb(White等人，2012年)的晶体结构作为搜索模型通过分子置换法解析结构。使用COOT(RRID:SCR_014222)(Emsley和Cowtan，2004年)进行模型构建，并用PHENIX(RRID:SCR_014224)(Adams，2002年)对结构进行精修。使用MolProbity(RRID:SCR_014226)(Williams等人，2018年)验证模型。数据和精修统计总结在补充文件3中。最终模型包含两条链，其中DEPTOR的残基为20 - 230，N端的19个残基未解析，可能是由于其灵活性。
小角X射线散射(SAXS)数据收集与分析
在英国钻石光源(DLS)的B21光束线上，以批处理模式收集了浓度为2 - 14 mg/ml的凝胶过滤缓冲液中纯化的DEPt的小角X射线散射(SAXS)数据。使用PRIMUS和CRYSOL(Svergun等人，1995年；Manalastas - Cantos等人，2021年)评估了二聚体晶体结构、晶体结构的一个单体以及基于冷冻电镜重建的DEPt模型的溶液散射，并将其拟合到实验散射曲线中。使用GraphPad Prism 9.1.0版本绘制了由CRYSOL生成的拟合图。
冷冻电镜样品制备和数据收集
将新鲜解冻的mTORC2等分试样与新鲜解冻的DEPTOR等分试样按1:8摩尔比混合，并在制备网格之前在 二羟乙基甘氨酸(pH 7.5)、 三(2 - 羧乙基)膦和 甘油中进行透析。对于每个网格，将 的样品在 涂覆到Quantifoil R2/2多孔碳铜网格(Quantifoil Micro Tools)上，该网格安装在腔室设置为 和 湿度的Vitrobot(赛默飞世尔科技)中。立即以2.5 - 4秒的印迹时间进行印迹，并在液体乙烷中快速冷冻。使用配备K2 Summit直接电子探测器(Gatan)的Titan Krios(赛默飞世尔科技FEI)透射电子显微镜，在计数模式下使用SerialEM(RRID:SCR_017293)(Evans和Murshudov，2013年；补充文件1)收集数据。在数据收集期间，散焦在 - 1至 - 3 之间变化，每个孔收集五次曝光。以1.058 Å/像素的像素大小和约50电子/Å 的总剂量收集帧堆栈。
将新鲜解冻的mTORC1等分试样与新鲜解冻的DEPTOR等分试样按1:12摩尔比混合，并在制备网格之前在 二羟乙基甘氨酸(pH 7.5)、 三(2 - 羧乙基)膦和0.25%甘油中进行透析。对于每个网格，将4 μl浓度为1.4 mg/ml的样品涂覆到Quantifoil R2/2多孔碳铜网格(Quantifoil Micro Tools)上，该网格安装在腔室设置为 和 湿度的Vitrobot(赛默飞世尔科技)中。在孵育10秒后，以2.5 - 4秒的印迹时间进行印迹，并在液体乙烷中快速冷冻。
使用配备K3直接电子探测器(Gatan)的Glacios(赛默飞世尔科技FEI)透射电子显微镜，在相关双采样模式下使用SerialEM(Mastronarde，2005年；补充文件2)收集了两个数据集。在数据收集期间，散焦在 - 1至 - 2.5 µm之间变化。以0.556 Å/像素的超分辨率像素大小和约50电子/Å 的总剂量收集帧堆栈。
冷冻电镜数据处理
由7371张显微照片组成的DEPTOR-mTORC2数据集，使用Patch Motion对电子束诱导漂移进行了校正，并使用cryoSPARC中的Patch CTF(RRID:SCR_016501)(Punjani等人，2017年)确定了每张显微照片的对比度传递函数(CTF)参数。在对显微照片进行筛选后，我们选择了6924张显微照片进行进一步处理。使用cryoSPARC中的斑点拾取器功能拾取颗粒，并进行无参考二维分类。显示结构特征的二维类别用作使用cryoSPARC中的模板拾取器进行颗粒拾取的模板。使用迭代二维分类对颗粒进行排序。将颗粒坐标转移到Relion(RRID:SCR_016274)，并从显微照片中提取颗粒，这些显微照片先前已使用Relion(Zivanov等人，2018年)自己实现的MotionCor2(RRID:SCR_016499)(Zheng等人，2017年)进行了运动校正，并使用CTFFIND4.1(RRID:SCR_016732)(Rohou和Grigorieff，2015年)估计了CTF。初始三维自动细化得到了4.03 Å的重建结果。对颗粒进行迭代CTF细化和贝叶斯颗粒抛光(Zivanov等人，2020年)。将抛光后的颗粒导入cryo-SPARC，然后进行均匀细化。为了精简数据集，通过非均匀细化将颗粒分为三类。选择数量最多的类别，并将颗粒用于非均匀均匀细化，然后使用全局掩码进行局部细化，得到3.41 Å的重建结果(图1；图1-图补充1a；Punjani等人，2020年)。通过随后分别针对一个原体的局部细化，我们获得了3.27 Å和3.32 Å的重建结果。基于mTORC2的C2对称性对全局细化的颗粒进行对称扩展。针对一个原体的局部非均匀细化产生了 处的图谱。为了减少异质性，在Relion中不对颗粒进行对齐分类为五类。在cryoSPARC中对这些类别进行单独的局部细化后，选择了四类。在这些颗粒上，对一个原体进行信号减法，然后针对剩余的原体进行局部非均匀细化。获得了分辨率为3.2 Å的最终原体图谱(图2；图1-图补充1a)。由于部分占据和高灵活性，DEPt区域在这些重建中仍然解析不佳。对该区域的分类是通过在Relion中使用对称扩展的颗粒堆栈和DEPt区域的掩码进行无对齐三维分类为五类来完成的。只有一类显示出结构特征。对一个原体进行部分信号减法，然后进行聚焦局部非均匀细化，得到3.7 Å的重建结果(图3；图1-图补充1a)。处理方案见图1-图补充1a。
对于DEPTOR-mTORC1数据集，来自两个数据收集的显微照片分别使用补丁运动校正束流诱导漂移，并使用cryoSPARC中的Patch CTF确定每张显微照片的CTF参数(Punjani等人，2017年)。经过人工筛选后，我们总共选择了8604部影片进行进一步处理。使用cryoSPARC中的斑点挑选器功能挑选颗粒，并进行无参考二维分类。显示结构特征的二维类别用作使用cryoSPARC中的模板挑选器进行颗粒挑选的模板。通过迭代二维分类清理颗粒堆栈。来自两个数据集的提取颗粒以从头重建作为起始模型进行初始非均匀细化。为了分类异质性，使用异质细化将颗粒分为三类。代表“宽型”和“紧密型”mTORC1构象的两个数量最多的类别的颗粒用于非均匀均匀细化，然后使用全局掩码进行局部细化(Punjani等人，2020年)。这产生了4.07 Å分辨率的DEPTOR-mTORC1重建(图谱4；图1—图补充2a)。随后针对单个原体进行的非均匀局部细化产生了3.97 Å和3.99 Å分辨率的重建。利用复合物的C2对称性对整体细化的颗粒进行对称扩展。使用针对一个原体的对称扩展颗粒的非均匀局部细化，获得了3.67 Å分辨率的最终图谱(图谱5；图1—图补充2a)。通过使用五个主模式的三维变异性分析实现对DEPt区域占有率的分类(Punjani和Fleet，2021年)。根据主模式将颗粒分为五个簇。对DEPt占有率最高的簇进行非均匀局部细化，得到4.24 Å分辨率的重建(图谱6；图1—图补充2a)。处理方案见图1—图补充2a。
冷冻电镜模型构建与细化
mTORC2冷冻电镜结构(PDB:6ZWM Scaiola等人，2020年)的一个原体用作初始模型，并刚体拟合到图谱2中(图1—图补充1a)。使用COOT(Emsley和Cowtan，2004年)对手动拟合密度进行了微调。mTOR的连接子在DEPTOR结合时形成结构，基于在过滤到较低分辨率的图谱中连接到mTOR建模部分的连续密度进行识别，但仅使用COOT将更好排序的残基a 从头构建到全分辨率图谱中。使用trRosetta和Robetta(Yang等人，2020年)(RRID:SCR_021181，RRID:SCR_018805)生成PDZ结构域的初始模型和二级结构定义(图2—图补充1a)。这些初始模型刚体拟合到图谱中，并在COOT中进行调整以拟合密度。N端PDZ延伸和随后结合mTOR的连接子(a )使用COOT从头构建，以在软化或低通滤波图谱中可视化的该区域的连续密度为指导，这些图谱具有更高的无序度，降低了侧链可见性。最终使用phenix.real_space_refine(Afonine，2018年)对结构进行实空间细化。得到的结构刚体拟合到图谱3中(图1—图补充1a)。将DEPt晶体结构的一个单体拟合到额外密度中。使用冷冻电镜重建和晶体结构的第二个单体作为模板，在计算机上对结构域交换的晶体结构进行解交换，以获得生理相关的DEPt单体模型。将各个结构域拟合到图谱中，并在COOT中手动进行微调。最终模型使用phenix.real_space_refine进行实空间细化。
对于DEPTOR-mTORC1的模型构建，使用了pdb:6BCX(Yang等人，2017年)的一个原体作为初始模型。将各个蛋白质进行刚体拟合到图谱5中(图1-图补充2a)，保持与高分辨率6BCX中未分配身份的残基一致。从DEPTOR-mTORC2重建中获得的PDZ结构域模型，进行刚体拟合到密度图中。最终模型使用phenix.real_space_refine进行实空间精炼。将获得的模型刚体拟合到图谱6中(图1-图补充2a)。此外，从各自的DEPTOR-mTORC2重建中获得的DEPt模型，刚体拟合到图谱6中(图1-图补充2a)，以产生一个带有PDZ结构域和DEPt结合的mTORC1原体。最终模型使用phenix.real_space_refine进行实空间精炼。为了获得一个带有结合PDZ结构域的mTORC1二聚体模型，将两个PDZ结合原体的副本刚体拟合到图谱4中(图1—图补充2a)，随后使用phenix.real_space_refine进行实空间精炼。所有模型使用phenix和MolProbity(Williams等人，2018年)进行验证。
结构分析与图形生成
使用PISA(RRID:SCR_015749)(Krissinel和Henrick，2007年)分析DEPTOR和mTOR之间各个蛋白质界面的性质。为了分析DEPTOR的序列保守性，我们使用Clustal Omega(RRID:SCR_001591)(Madeira，2019年)对136条全长DEPTOR序列进行比对。最终比对结果用作AL2CO(Pei和Grishin，2001年)的输入，以使用ChimeraX(RRID:SCR_015872)(Pettersen等人，2021年)将保守性映射到DEPTOR结构上。为了分析DEPt的DEP2与mTOR结合诱导的运动，将DEPt晶体和冷冻电镜结构叠加到DEP1上。使用Pymol的PSICO扩展(RRID:SCR_000305)(Schrodinger，LLC，2015年)分析DEP2的旋转和平移。所有密度和结构表示以及动画均使用UCSF ChimeraX(Pettersen等人，2021年)生成。使用cryoSPARCv3(Structura Biotechnology Inc)估计局部分辨率。
冷冻电镜,DEPTOR,mTORC1/2,mTOR磷酸化
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