聚合性 GBP1 与 LPS 的直接结合破坏细菌细胞壁功能
发布时间：
2026-03-13 21:15
聚合性 GBP1 与 LPS 的直接结合破坏细菌细胞壁功能
米里亚姆·库奇 D、琳达·西斯泰米奇 、卡米·F·莱瑟 、玛西亚·B·戈德堡 、克里斯蒂安·赫尔曼 和约恩·科斯 (D)
摘要
在革兰氏阴性菌的外膜中，脂多糖(LPS)的 O 抗原片段形成化学机械屏障，而脂质 A 部分则锚定 LPS 分子。感染时，人类鸟苷酸结合蛋白 1(hGBP1)与细胞内革兰氏阴性菌病原体共定位，促进细菌杀伤，促进脂质 A 传感器半胱天冬酶 -4 的激活，并阻止肌动蛋白驱动的肠道病原体志贺氏菌的传播。hGBP1 多种抗菌功能的潜在分子机制尚不清楚。在这里，我们证明 hGBP1 直接与 LPS 结合，并通过蛋白质聚合诱导 “洗涤剂样” 的 LPS 聚集。聚合的 hGBP1 与细菌表面的结合破坏了 O 抗原屏障，从而暴露脂质 A，引发半胱天冬酶 -4 的募集，增强多粘菌素 B 的抗菌活性，并阻断志贺氏菌外膜肌动蛋白运动因子 IcsA 的功能。这些发现将 hGBP1 表征为一种 LPS 结合表面活性剂，它破坏外膜的刚性，对革兰氏阴性菌细胞壁的功能产生多效性影响。
关键词 基于肌动蛋白的运动；革兰氏阴性；鸟苷酸结合蛋白；脂多糖；O 抗原
主题分类 微生物学、病毒学与宿主病原体相互作用 DOI 10.15252/embj.2020104926 | 2020 年 3 月 6 日收到 | 2020 年 4 月 27 日修订 | 2020 年 4 月 29 日接受 | 2020 年 6 月 8 日在线发表
《欧洲分子生物学组织杂志》(2020)39:e104926
引言
细胞自主免疫描述了多细胞生物体内单个细胞激活针对细胞内病原体的多种细胞内在宿主防御程序的能力。这些古老的、固有的防御程序通常受到时空控制，并且常常需要诱导信号来启动(霍华德，2007；兰多夫等人，2013)。微生物相关分子模式，如革兰氏阴性菌外膜分子脂多糖(LPS)，可以通过激活包括胞质 LPS 传感器半胱天冬酶 -4 在内的专门模式识别受体，在受感染细胞中充当此类诱导信号(哈加尔等人，2013；加贺木等人，2013；施等人，2014)。或者，前哨细胞和免疫效应细胞释放的促炎细胞因子指导宿主细胞转变为增强的抗菌抗性状态。也许针对细菌病原体的细胞自主免疫的最有效诱导剂是淋巴细胞衍生的细胞因子γ干扰素(IFN )，它控制由 IFN 刺激基因(ISGs)编码的数百种抗菌蛋白的表达。这些 ISG 中许多的具体功能要么未知，要么仅得到很差的表征(麦克米金，2012)。
在表达最高的 ISG 中，鸟苷酸结合蛋白(GBPs)在抗菌宿主防御中起重要作用(科斯，2017；曼等人，2017；普拉夫克，2018；桑托斯和布罗兹，2018；黄等人，2019)。GBPs 促进感染的巨噬细胞内革兰氏阴性菌的裂解(曼等人，2015；梅尼尔等人，2015；李等人，2017；刘等人，2018)，并在响应感染、细菌外膜囊泡或胞质 LPS 时帮助激活 LPS 传感器半胱天冬酶 -4(梅尼尔等人，2014；皮拉等人，2014；芬西等人，2017；拉格朗日等人，2018；桑托斯等人，2018)。人类 GBP1 还干扰胞质入侵细菌病原体福氏志贺氏菌利用宿主肌动蛋白聚合机制进行细胞内细菌运动和细胞传播的能力(皮罗等人，2017；万德尔等人，2017)。GBPs 发挥这些看似不同的细胞功能的分子机制尚未确定；然而，它们似乎与 GBPs 特异性结合细胞内细菌病原体的能力有关。
人源鸟苷结合蛋白1(hGBP1)与胞质内革兰氏阴性菌病原体泰国伯克霍尔德菌和福氏志贺菌共定位，但不与革兰氏阳性菌单核细胞增生李斯特菌共定位(皮罗等人，2017年)。另外六个hGBP旁系同源物中的四个也与胞质内的福氏志贺菌相关联，但严格依赖于hGBP1(李等人，2017年；皮罗等人，2017年；万德尔等人，2017年)。总之，这些已报道的观察结果暗示了一个有趣但未经测试的模型，即hGBP1在作为革兰氏阴性菌的真正胞质受体方面，在hGBP中是独特存在的。在此，我们证明聚合的hGBP1通过脂多糖(LPS)结合直接附着于革兰氏阴性菌。在初始附着后，hGBP1转变为一个稳定的蛋白外壳，专门包裹“光滑”细菌菌株，即表达LPS最外层O抗原多糖片段的细菌。我们发现细菌的hGBP1包裹破坏了对抗亚致死浓度抗菌肽多粘菌素B的O抗原屏障，使半胱天冬酶-4能够识别细菌表面的脂质A，并且还干扰了对细胞内细菌运动至关重要的志贺氏菌外膜蛋白IcsA的功能。总之，我们的观察结果表明hGBP1是一种LPS结合和LPS聚集表面活性剂，它破坏革兰氏阴性菌外膜的关键功能，从而促进多种抗菌宿主防御途径。
1美国北卡罗来纳州达勒姆市杜克大学医学中心分子遗传学与微生物学系
2德国波鸿市鲁尔大学物理化学I系
3美国马萨诸塞州波士顿市麻省总医院细菌致病中心传染病科
4美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院布莱根妇女医院微生物学系
5美国北卡罗来纳州达勒姆市杜克大学医学中心免疫学系
*通讯作者。电话:+1 919 684 7109；电子邮件:jorn.coers@duke.edu
结果
法尼基化的hGBP1以GTP酶依赖的方式直接结合福氏志贺菌
作为发动蛋白超家族蛋白的典型特征(Daumke和Praefcke，2016年；Ramachandran和Schmid，2018年)，hGBP1由一个大的N端球状G结构域(LG结构域)和一个螺旋状C端组成，该C端可分为中间结构域(MD)和GTPase效应结构域(GED)(图1A)。在其底物GTP存在的情况下，hGBP1会二聚化(Ince等人，2017年)，并通过其C端法尼基部分介导的疏水相互作用与膜结合，当hGBP1无核苷酸时，该部分则埋在一个疏水口袋中(Fres等人，2010年；Shydlovskyi等人，2017年；Ji等人，2019年)。因此，为了测试hGBP1是否能够结合到胞质革兰氏阴性菌弗氏志贺氏菌的外膜上，我们在鸟嘌呤核苷酸存在的情况下，将荧光标记的法尼基化hGBP1(hGBP1 )与甲醛固定或活细菌混合，并在不同孵育时间后拍摄共聚焦图像(图1B)。我们观察到在GTP存在但GDP不存在的情况下， 与固定和活的弗氏志贺氏菌都有直接结合(图1C和附录图S1A)，跨越了hGBP1蛋白浓度的生理范围(Naschberger等人，2006年)(附录图S1B)。与在组织培养中进行的共定位研究一致(Li等人，2017年；Piro等人，2017年；Wandel等人，2017年)，我们发现破坏核苷酸结合的突变(hGBP1 )、GTP水解(hGBP1 )或GDP水解(hGBP1 (Praefcke等人，2004年)，或缺乏蛋白质法尼基化会阻止hGBP1在体外与弗氏志贺氏菌结合(图1C)。这些数据表明hGBP1F通过一个依赖GTP水解的过程直接与弗氏志贺氏菌结合。
hGBP1聚合是细菌结合所必需的
当在细胞中表达时，hGBP1形成离散的颗粒状结构(Britzen-Laurent等人，2010年)。在使用缺乏细菌hGBP1拮抗剂IpaH9.8的弗氏志贺氏菌突变株进行的延时显微镜实验中，已证明该拮抗剂可显著减少hGBP1向胞质细菌的募集(Li等人，2017年；Piro等人，2017年；Wandel等人，2017年)，我们观察到这些hGBP1颗粒状结构出现在靠近胞质细菌的位置，并且进一步记录了这些颗粒转变为包裹整个细菌的hGBP1蛋白外壳的过程(图2A和视频EV1)。与hGBP1靶向弗氏志贺氏菌的细胞内动态相似，我们发现补充GTP后，hGBP1 颗粒状结构在体外迅速形成并与细菌表面结合。与我们的活细胞成像数据非常对称的是，这些与细菌相关的hGBP1颗粒随后在体外转变为包裹单个细菌的蛋白外壳(图2B和EV1A以及视频EV2)。
尽管最初将在细胞内检测到的hGBP1 颗粒解释为膜相关的囊泡样结构(Britzen-Laurent等人，2010年)，但我们最近的体外研究表明，hGBP1F不仅与膜结合，还能独立于外源性脂质自组装成大聚合物(Shydlovskyi等人，2017年；Sistemich等人，2020年)。因此，我们推测在体外有和没有外源添加细菌的情况下形成的hGBP1 颗粒(图2B)构成了hGBP1F聚合物。为支持这一观点并证实先前的工作(Shydlovskyi等人，2017年)，我们发现通过光谱法测量的超分子 颗粒的积累仅在可水解GTP存在时发生(图EV1B)。我们进一步观察到，水解性差的类似物GTPγS——虽然足以指导 附着于人工囊泡(图EV1C)，如先前报道(Shydlovskyi等人，2017年)——但未能在体外促使hGBP1F附着于细菌(图2C和EV1C，以及视频EV3和EV4)。同样，通过混合GDP-氟化铝(GDP-AlFx)模拟hGBP1 GTP水解过渡态会引发 与囊泡结合，但不与细菌结合(图2C和EV1C，以及视频EV5)。因为hGBP1 在GDP- 存在下形成不可逆的短聚合物(Shydlovskyi等人，2017年；Sistemich等人, 2020年)，这些结果表明 与 . flexneri的直接结合需要可逆的 聚合(图2D和EV1D)。
C端hGBP1多碱性基序是与福氏志贺氏菌持续结合所必需的
人GBP1聚合物具有环状结构，单个hGBP1分子围绕由其法尼基部分形成的疏水核心组装(Shydlovskyi等人，2017年)。紧邻C端法尼基基团存在一个短的多碱性基序，包含一段三个精氨酸(3R)(图1A)。我们先前证明，包含3R片段的C端多碱性基序在人GBP家族中是hGBP1特有的，并且是hGBP1与胞内福氏志贺氏菌有效共定位所必需的(Piro等人，2017年)。为确定3R驱动hGBP1转运至福氏志贺氏菌的机制，我们评估了重组hGBP1 (一种缺乏3R片段的突变体)在体外形成聚合物和结合细菌的能力。首先，我们通过吸收光谱监测蛋白质聚合，发现hGBP1 仍能形成大颗粒，尽管动力学延迟(图3A和EV2A)。因为hGBP1经历聚合加速的协同水解(Praefcke等人，2004年；Shydlovskyi等人，2017年)，聚合动力学的明显减慢可能解释了我们在与hGBP1 突变体反应中观察到的GTP水解速率适度降低(图3A和C，以及EV2B)。我们观察到R584 - 586A突变对非法尼基化因而不聚合的hGBP1的GTP水解速率没有影响，这一观察结果支持了这一结论(图EV2C)。
图1. 法尼基化的hGBP1以GTP酶依赖性方式直接结合福氏志贺氏菌。
全长、无核苷酸、法尼基化的hGBP1(PDB条目6k1z)与结合GDP - AIFx的LG结构域二聚体(PDB条目2B92)的结构。插图(i)显示了法尼基部分和三个精氨酸延伸(3R = R584 - 586)。插图(ii)突出了核苷酸结合和水解所需的残基。
B实验设计:将荧光标记的重组hGBP1变体和核苷酸与肉汤培养的活细菌或固定细菌混合；通过共聚焦显微镜监测细菌结合情况。
C用2 mM GTP和10 µM Alexa - Fluor647标记的蛋白质孵育20分钟后，甲醛固定的GFP 福氏志贺氏菌的共聚焦图像。对20分钟后与hGBP突变体相关的细菌进行定量。显示了来自两个独立实验的合并数据的平均频率 SEM。通过带有Tukey多重比较检验的单因素方差分析确定显著性。***P≤0.001。比例尺等于 。流程图描绘了K51A、R48A和H74A hGBP1突变对核苷酸结合和水解的影响。
该图的源数据可在线获取。
为了进一步探究C末端多碱性基序的功能，我们使用扫描电子显微镜观察 聚合物的形成。与GTP孵育 后，我们在 或hGBP1 存在的情况下观察到聚合物结构，但在非聚合突变体 存在的情况下未观察到(图3B)。值得注意的是，由 形成的聚合物在形态上与 聚合物不同。此外， 聚合物而非 聚合物似乎与福氏志贺氏菌的外表面形成连续连接(图3B)，这表明 聚合物在功能上可能与hGBP1 聚合物不同。因此，我们测试了R584 - 586A突变是否会影响细菌结合或细菌hGBP1包被。我们注意到，在补充hGBP1 和GTP后 ， 聚合物与细菌直接接触，尽管与 相比，hGBP1结合细菌的总数减少了两倍(图3C)。尽管初始细菌结合似乎相对完整，但在 孵育期间的任何时间点， 都未能形成包围单个细菌的蛋白包被(图3C)。总体而言，这些观察结果表明C末端多碱性基序改变了 聚合的动力学，并且是 与细菌表面紧密结合所必需的。
图2. hGBP1聚合是细菌结合所必需的。
在HeLa hGBP1基因敲除细胞中，通过延时显微镜监测异位表达的mCherry - hGBP1向胞质GFP* 福氏志贺菌 ipaH9.8的易位。显示了感染后55分钟(mpi)开始的电影EV1的各个时间帧。
B 共聚焦延时显微镜用于对在有或没有甲醛固定的GFP 福氏志贺菌存在下补充2 mM GTP的10 μM Alexa - Fluor647 - hGBP1 进行成像。电影EV2的各个时间帧描绘了hGBP1 的荧光强度。显示了60分钟时间点的hGBP1 和福氏志贺菌荧光的合并图像。
C 在向甲醛固定的GFP 福氏志贺菌中加入10 μM Alexa - Fluor647 - hGBP1 后45分钟，在存在指示核苷酸(GTP，天然底物；GppNHp，不可水解的GTP类似物；GTPyS，缓慢水解的GTP类似物；GDP - AIFx，GTP过渡态类似物)的情况下拍摄图像。对45分钟后与hGBP1相关的细菌进行定量。来自两个独立实验的合并数据显示为平均值±标准误。通过单因素方差分析和Tukey多重比较检验确定显著性。*** 。
D 模型:hGBP1聚合物直接结合到福氏志贺菌上并转变为包裹细菌的蛋白外壳。
数据信息:所有标尺均等于 。
该图的源数据可在线获取。
图3. hGBP1的C末端多碱性基序是与福氏志贺菌持续结合所必需的。
A 在 GTP存在下，通过在 处的吸收光谱随时间监测 和 的聚合。吸光度信号与在定义时间点分析的相同溶液的核苷酸组成叠加，揭示了缓慢聚合物成核的特征第一阶段和快速聚合物生长及协同水解的第二阶段。
B 活的福氏志贺菌在不存在蛋白质或在2 mM GTP存在下与5 μM的mGBP1、hGBP1、 或hGBP1、 (非聚合突变体)孵育4分钟后的扫描电子显微镜照片。箭头指向未附着的hGBP1聚合物，箭头指向附着在细菌上的hGBP1聚合物，星号标记似乎与细菌表面融合的聚合物结构。
C 甲醛固定的GFP* 福氏志贺菌在混合10 μM Alexa - Fluor647标记的hGBP1 - 用于hGBP1 - 和2 mM GTP后的共聚焦延时显微镜图像。对5分钟时hGBP1 聚合物与细菌的结合以及60分钟后细菌被hGBP1 蛋白外壳包裹的情况进行定量。显示了来自至少三个独立实验的合并数据的平均频率 标准误。通过不成对 检验确定显著性，双侧。***P≤0.001；****P≤0.0001。
数据信息:所有标尺均等于 。
该图的源数据可在线获取。
hGBP1 与LPS的直接结合介导其与革兰氏阴性菌的关联
我们发现 聚合物直接附着于 .flexneri，这使我们推测 结合细菌外膜上暴露的非自身底物。为验证这一假设，我们首先监测了 与多种致病细菌物种的结合情况。我们发现 聚合物不仅与福氏志贺菌结合，还与我们测试的其他革兰氏阴性人类细菌病原体结合，即肠炎沙门氏菌鼠伤寒血清型(ST)、嗜肺军团菌(Lp)和尿路致病性大肠杆菌(UPEC)。然而，我们未观察到 与革兰氏阳性细菌单核细胞增生李斯特菌(Lm)和金黄色葡萄球菌(Sa)有任何结合(图 4A)。这些结果表明，hGBP1 聚合物识别革兰氏阴性细菌细胞包膜中存在但革兰氏阳性细菌中不存在的分子。由于表面暴露的脂化糖脂多糖(LPS)是革兰氏阴性外膜高度表达的成分，但革兰氏阳性菌中不存在(Simpson & Trent，2019)，我们询问 hGBP1 是否能直接结合 LPS。为验证这一假设，我们在 GTP 存在的情况下，将荧光标记的光滑型(O - 抗原 )大肠杆菌 LPS(O55:B55)或粗糙型(O - 抗原 )明尼苏达沙门氏菌 LPS(SM)与 混合，并监测 与 LPS 随时间的共定位情况。如预期，GTP 诱导了 聚合物的形成，表现为颗粒状结构(图 4B)。值得注意的是，这些 hGBP1F 颗粒与 LPS 簇共定位，LPS 簇与 颗粒同时形成，并且也依赖于法尼基化以及 聚合，因为聚合缺陷的 突变体 和未法尼基化的 hGBP1 不会诱导 LPS 簇形成(图 4B 和 EV3A，以及视频 EV6)。值得注意的是，hGBP1 聚合促进了光滑型 LPS O55:B55 和粗糙型 LPS SM 的聚集(图 4B 和 EV3A)，表明 O - 抗原对于聚合的 hGBP1 结合 LPS 并非必需。接下来，我们在斑点印迹试验中证实了 hGBP1 与 LPS 的结合(图 EV3B)。具有聚合能力但 3R 缺陷的突变体 能够在悬浮液中结合并聚集 LPS(图 4B)，但在斑点印迹试验中未能与硝酸纤维素膜结合的 LPS 结合(图 EV3B)，这进一步强调了 3R 区段在使 持续结合 LPS 修饰表面方面的重要性。为进一步表征 hGBP1 - LPS 相互作用的动态变化，我们在有和无 LPS 055:B5 的情况下测量了 hGBP1 的聚合和 GTP 水解情况。我们观察到在 LPS 存在的情况下， 聚合起始更快，GTP 水解动力学加速(图 4C)，揭示了 LPS 作为 hGBP1 聚合潜在成核促进因子的作用。LPS 是一种两亲性分子，在水溶液中形成胶束(Santos 等人，2003)，因此我们可以从综合数据得出结论， 直接结合 LPS 胶束，这导致 聚合加速，并以聚合依赖的方式组装大型 LPS 聚集体。
由于 hGBP1 直接与脂多糖(LPS)结合，我们检测了 LPS 是否可作为 附着于细菌的竞争性抑制剂。我们发现，浓度为 或更高的大肠杆菌 LPS O55:B5 会减少 与弗氏志贺氏菌的初始结合(图 EV3C)，并在加入 hGBP1 和 GTP 后 时，几乎完全阻断了在 弗氏志贺氏菌及其他细菌表面检测到 hGBP1 (图 4D 和 E，以及视频 EV7)。另一种 LPS 类型(O111:B4)也能抑制 hGBP1 锚定到 弗氏志贺氏菌上，尽管效果不如 O55:B5(图 EV3D)。由于 O55:B5 在水溶液中形成的聚集体比 O111:B4 小，因此单位质量的有效表面积更大(Risco 等人，1993；Bergstrand 等人，2006；Stenutz 等人，2006)，预计 O55:B5 比 O111:B4 更能有效地隔离 hGBP1，这就解释了它作为竞争性抑制剂的卓越性能。与这两种 LPS 类型不同，从酵母细胞壁纯化的全葡聚糖颗粒(WGP)或单体葡萄糖对 与 弗氏志贺氏菌的结合没有影响(图 EV3D)。综上所述，这些数据表明 hGBP1 是一种 LPS 结合蛋白，外源性 LPS 会破坏 聚合物在革兰氏阴性细菌表面的募集。
细菌O抗原驱动从细菌结合的 聚合物向包裹细菌的 蛋白外壳的转变
O抗原构成膜嵌入LPS向外的碳水化合物部分(卡利尼奇等人，2014年)。我们之前观察到人源鸟苷结合蛋白1(hGBP1)对福氏志贺菌粗糙突变株(如rfaL)的胞内靶向作用减弱(皮罗等人，2017年)，该突变株缺乏LPS的O抗原部分，但保留了与脂多糖A相连的内、外碳水化合物核心(图5A)。为了研究O抗原影响hGBP1募集到福氏志贺菌的机制，我们监测了体外 与福氏志贺菌rfaL的结合。我们发现，在结合反应开始5分钟后， 与rfaL突变体的对接效率与野生型福氏志贺菌 一样高(图5B)。然而， 未能转变为包裹福氏志贺菌rfaL的均匀蛋白外壳；相反，在早期(图5B和C)和晚期(图5B和附录图S2A)孵育时，rfaL突变体表面均可检测到颗粒状结构。同样，我们观察到光滑但非粗糙的 . 大肠杆菌菌株表面形成了 蛋白包膜(附录图S2B)。因此，尽管 与LPS的结合和聚集不依赖于O抗原(图4B)，但O抗原促进了表面对接的 聚合物向包裹细菌的hGBP1 蛋白片层的转变(图5D)。
O抗原重复单元在不同细菌物种之间高度可变(Kalynych等人，2014年)。为了确定O重复序列的特定糖组成是否会影响 聚合物向包膜的转变，我们测试了 蛋白在 表面形成包膜的情况。携带大肠杆菌血清型O8或O25 rfb区域的福氏志贺氏菌2a菌株，该区域决定了O重复糖构型(Sandlin等人，1996年)。尽管O重复生化组成存在很大差异(图5A)，但福氏志贺氏菌同基因rfb突变菌株之间用 进行细菌包裹的情况相当(图5E)。这些数据表明，O重复侧链的存在而非特定的O重复组成是使 与细菌外膜稳定结合的关键决定因素。
hGBP1 与细菌的结合破坏O抗原屏障功能
O抗原为包括抗生素多粘菌素B(PMB)在内的各种物质提供了非特异性物理屏障。PMB是一种阳离子抗菌肽，它以高亲和力与脂多糖A带负电荷的磷酸基团结合，并通过其疏水尾部破坏细菌膜的完整性(Moffatt等人，2019年)。与之前在其他革兰氏阴性菌中观察到的结果一致(Berry等人，2009年；Holzer等人，2009年)，我们发现缺乏O抗原的福氏志贺氏菌rfaL突变体对PMB高度敏感(图EV4A)。由于hGBP1F具有LPS聚集特性(图4)，我们推测结合到细菌表面的{{F}}可以起到表面活性剂的作用，溶解O抗原屏障。为支持这一假设，我们发现，在存在亚致死剂量PMB的情况下， 与野生型福氏志贺氏菌的体外结合导致细菌集落形成单位(CFU)计数降低了一个对数级(图6A和EV4A)。hGBP1F对UPEC的多碱性基序依赖性包裹(图6B和EV4B)同样降低了细菌活力(图6A)，而hGBP1 结合未能促进细菌杀伤。
图4. 与LPS的直接结合介导其与革兰氏阴性菌的关联。
A. 在将 GTP与 Alexa - Fluor647 - 或Alexa - Fluor488 - hGBP1 混合60分钟后，对甲醛固定的表达GFP(鼠伤寒沙门氏菌[ST]、单核细胞增生李斯特菌[Lm])、RFP(福氏志贺氏菌[Sf]、致病性大肠杆菌[UPEC])或dsRed(嗜肺军团菌[Lp]、金黄色葡萄球菌[Sa])的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌拍摄的代表性共聚焦图像。
B(上图)添加5 μM Alexa-Fluor647-hGBP1 并补充2 mM GTP后，5 μM Alexa-Fluor488-LPS-055:B5的共聚焦延时显微镜图像。(下图)添加5 μM Alexa-Fluor647-hGBP1 或补充2 mM GTP的Alexa-Fluor647-hGBP1 20分钟后，5 μM Alexa-Fluor488-LPS-055:B5的共聚焦图像。图表描绘了补充2 mM GTP和5 μM所示hGBP1变体的Alexa-Fluor488-LPS-055:B5的平均聚集体面积。来自三个独立实验的合并数据的平均面积 标准误。显著性通过单向方差分析和Tukey多重比较检验确定。n.s.，不显著；*** ；**** 。
C在存在和不存在 LPS-055:B5的情况下，通过在350 nm处的吸收光谱监测添加 GTP诱导的 的聚合。吸光度信号与在定义时间点分析的相同溶液的核苷酸组成叠加。测定了hGBP1、存在和不存在5 μM LPS-055:B5的变体的最大水解速率(周转数)。图表显示了来自至少三个独立实验的合并数据的平均周转数 标准误。显著性通过双向方差分析和Tukey多重比较检验确定。n.s.，不显著；***P ；*****P 。
D将补充有不同浓度LPS-055:B5的甲醛固定的GFP 福氏志贺氏菌与 hGBP1 和 GTP混合。在 后，对包封的福氏志贺氏菌进行定量。来自三个独立实验的合并数据显示为平均 标准误。显著性通过单向方差分析和Tukey多重比较检验确定。 。
E在存在和不存在100 μM LPS-055:B5的情况下，添加5 μM Alexa-Fluor647-或Alexa-Fluor488-hGBP1 和2 mM GTP 60分钟后，甲醛固定的表达GFP、RFP或dSRed的革兰氏阴性细菌的共聚焦图像。60分钟后，对hGBP1 包封的革兰氏阴性细菌进行定量。来自三个独立实验的合并数据显示为平均 标准误。显著性通过双向方差分析和Tukey多重比较检验确定。****p 。
数据信息:所有比例尺均等于 。
该图的源数据可在线获取。由溶菌酶(图6A)提供，溶菌酶是一种可降解周质肽聚糖的酶。这些数据表明， 与革兰氏阴性菌的细菌表面结合可能会破坏O抗原屏障，从而使多粘菌素B能够穿透并与脂质A结合。为了进一步验证这一假设，我们用一种与大肠杆菌LPS的内核和脂质A结合的抗体对UPEC细菌进行染色。用hGBP1 而非 突变体 孵育后，可在细菌表面的不同位点观察到抗LPS染色(图6C)。这些数据表明， 对细菌的稳定、3R依赖性吞噬导致O抗原屏障的局部破坏，从而使抗体能够与LPS内核和脂质A结合。最后，与在人类单核细胞中观察到的相关结果一致(Fisch等人，2019年)，我们发现hGBP1促进脂质A传感器caspase-4向侵入受感染HeLa细胞胞质溶胶的革兰氏阴性菌进行细胞内募集(图6D和EV4C)。综上所述，这些观察结果表明，革兰氏阴性菌周围 蛋白外壳的形成破坏了O抗原屏障功能，使脂质A能够被抗菌分子和免疫传感器识别。
hGBP1破坏志贺氏菌IcsA的极性定位并阻止宿主肌动蛋白聚合机制的募集
除了提供物理屏障外，O抗原还控制细菌致病的其他方面，包括基于肌动蛋白的胞内运动的调节:先前的报告表明，缺乏O抗原的弗氏志贺氏菌突变体在宿主肌动蛋白组装方面存在缺陷，因此在细胞间的传播效率低下(Sandlin等人，1995年、1996年；Hong和Payne，1997年；Van den Bosch等人，1997年)。志贺氏菌自转运蛋白IcsA的极性表面表达促进了基于细菌肌动蛋白的有效运动(Agaisse，2016年)(图7A)。我们证实了先前的发现(Sandlin等人，1996年)，即rfaL突变体单极IcsA定位减少，并且经常无法在宿主细胞胞质溶胶中形成肌动蛋白尾(图7B)。尽管O抗原调节极性IcsA定位和相关肌动蛋白组装的机制尚未完全明确，但一个有说服力的模型表明，在细菌极分泌IcsA后(Steinhauer等人，1999年；Charles等人，2001年)，O抗原缺陷细菌中增强的膜流动性导致IcsA从细菌极扩散增加(Robbins等人，2001年)。基于这个模型以及我们支持hGBP1作为LPS结合表面活性剂作用的数据(图4)，我们假设hGBP1与细菌的结合可能同样增加膜流动性，导致IcsA的周向定位增加。为支持这一假设，我们注意到在hGBP1靶向的弗氏志贺氏菌中，几乎完全缺乏单极IcsA定位，并且IcsA相互作用伙伴N-WASP和肌动蛋白成核因子Arp2/3复合物的极性募集显著减少，同时形成了肌动蛋白尾(图7C和D)。IcsA的定位错误、N-WASP和Arp2/3募集的缺乏以及肌动蛋白尾的形成依赖于IFN 诱导的hGBP1表达，这在hGBP1缺陷宿主细胞中这些表型的逆转中很明显(图7E)。综上所述，这些发现不仅为先前报道的hGBP1介导的肌动蛋白尾形成抑制提供了细胞机制(Piro等人，2017年；Wandel等人，2017年)，还意味着hGBP1通过作为细菌LPS表面层的“洗涤剂样”破坏者的单一分子活性，发挥其多种抗菌功能，如溶菌、促进宿主细胞死亡和抗菌运动因子(图EV5)。
讨论
细胞内防御程序对于有效的宿主免疫至关重要。hGBP1是识别、捕获和清除细胞内革兰氏阴性菌的关键催化剂，已证明其有助于细菌杀伤(Tietzel等人，2009年；Al-Zeer等人，2013年；Li等人，2017年；Liu等人，2018年)，促进LPS传感器caspase-4的激活(Lagrange等人，2018年；Fisch等人，2019年)，并阻止基于肌动蛋白的细菌运动(Piro等人，2017年；Wandel等人，2017年)。hGBP1或其小鼠同源物执行这些不同细胞功能的分子机制仍然是个谜。在这里，我们提供证据表明，hGBP1作为一种LPS结合和LPS聚集表面活性剂，破坏了向外的LPS层的物理化学性质，从而促进脂质A传感器caspase-4向细菌表面的募集，并增强了靶向脂质A的抗菌剂PMB的功效。为进一步支持“表面活性剂模型”，我们证明hGBP1与福氏志贺氏菌的结合导致
图5.细菌O抗原驱动从细菌结合的hGBP1 聚合物向包裹细菌的hGBP1 蛋白外壳的转变。
福氏志贺氏菌细菌外膜组成和LPS结构的图形描绘。箭头指示缺陷型rfaL突变体中的LPS截断位点。显示了福氏志贺氏菌2a血清型以及大肠杆菌O8和O25血清型的O抗原寡糖亚基组成。
B添加 Alexa-Fluor-647-hGBP1 和 GTP后，固定的GFP*同基因福氏志贺氏菌野生型和rfaL突变体的延时显微镜观察。对 时被hGBP1 结合的细菌以及60分钟后被hGBP1 包裹的细菌进行定量。来自三个独立实验的合并数据显示为平均值 SEM。通过不成对 检验进行双尾显著性测定。n.s.，无显著性差异；**** .
C在2 mM GTP存在下，未添加蛋白质或添加 hGBP1 孵育4分钟的活野生型和rfaL突变体菌株的扫描电子显微镜照片。箭头指向未附着的hGBP1聚合物，箭头指向附着在细菌上的hGBP1聚合物，星号标记似乎与细菌表面融合的聚合物结构。
D模型:O抗原驱动表面对接的hGBP1 聚合物向包裹细菌的hGBP1 蛋白片层的转变。
E在存在 Alexa-Fluor-647-hGBP 和 GTP的情况下孵育60分钟后，甲醛固定的、携带大肠杆菌O8和O25血清型rfb区域的同基因GFP 野生型和突变型福氏志贺氏菌菌株的共聚焦图像。
数据信息:所有比例尺均等于 。
本图的源数据可在线获取。
图6. 与细菌的结合破坏了O抗原屏障功能。
A 在不存在或存在10 μM hGBP1和5 mM GTP的情况下，用缓冲液孵育1.5小时后，将活细菌用抗生素(2.5 μg/ml多粘菌素B或5 mg/ml溶菌酶)处理30分钟或不进行处理。随后通过菌落形成单位(CFU)计数确定存活细菌的数量。图表显示了来自至少三个独立实验的合并数据的平均CFU ± SEM。通过双向方差分析和Tukey多重比较检验确定显著性。n.s.，无显著性；****P 。
B 将甲醛固定的RFP 尿道致病性大肠杆菌与 Alexa-Fluor488-hGBP 或补充有 GTP的 混合。孵育60分钟后，对含有hGBP1的尿道致病性大肠杆菌进行定量。图表描述了来自三个独立实验的合并数据的平均 SEM。通过不成对的 -检验(双侧)确定显著性。 。
C 将甲醛固定的RFP*尿道致病性大肠杆菌与10 μM Alexa-Fluor488-hGBP1- of-hGBP1、 和2 mM GTP混合。孵育60分钟后固定样品，并用抗大肠杆菌LPS内核/脂质A片段的抗体(抗LPS)染色。对抗LPS染色的尿道致病性大肠杆菌的频率进行定量。图表显示了来自三个独立实验的合并数据的平均 SEM。通过双向方差分析和Tukey多重比较检验确定显著性。n.s.，无显著性；**** 。
D 用细胞溶质进入型鼠伤寒沙门氏菌突变体ΔsifA(感染复数=25)或弗氏志贺氏菌CospC3ΔipaH9.8(感染复数=6)感染经IFNγ预处理的稳定表达无活性突变体YFP-半胱天冬酶- 的野生型和hGBP1基因敲除HeLa细胞，弗氏志贺氏菌CospC3ΔipaH9.8是一种缺乏半胱天冬酶-4拮抗剂OsFC3以及hGBP1拮抗剂lpaH9.8的突变菌株。在感染后4小时(鼠伤寒沙门氏菌Δsif/A)或2小时(弗氏志贺氏菌ΔospC3ΔipaH9.8)固定细胞，并对内源性hGBP1进行染色。对与YFP-半胱天冬酶-4C 相关的细菌进行定量，并显示来自三个独立实验的合并数据的平均 SEM。通过双向方差分析和Tukey多重比较检验确定显著性。****
数据信息:所有比例尺均等于 。
本图的源数据可在线获取。
图7。
图7。hGBP1破坏弗氏志贺氏菌IcsA的极性定位并阻断宿主肌动蛋白聚合机制的募集。
A 示意图描述了弗氏志贺氏菌利用宿主肌动蛋白聚合机制的分子机制:细菌自转运蛋白lcsA定位于细菌的一个极点，在那里它募集并激活宿主肌动蛋白成核促进因子N-WASP。然后N-WASP募集并激活宿主肌动蛋白成核因子Arp2/3复合物以启动肌动蛋白聚合。
将B-E细胞以感染复数(MOI)为6用经聚-L-赖氨酸处理的绿色荧光蛋白*福氏志贺氏菌菌株进行感染。对细胞进行指定蛋白染色，并使用共聚焦荧光显微镜记录Z轴堆叠图像。当 m时，肌动蛋白尾被归类为尾。所有图表显示来自三个独立实验的合并数据的平均值 标准误。所有标尺均为 。箭头指向与指定蛋白相关的细菌，箭头指向缺乏指定蛋白的细菌，星号标记缺乏单极lcsA定位的细菌。(B) 未预处理的HeLa细胞用野生型或rfal福氏志贺氏菌进行感染。在感染后1小时(hpi)对IcsA的总定位和单极定位以及肌动蛋白尾的形成进行定量。显著性通过不成对双尾t检验确定。n.s.，无显著性差异；* ；** 。(C, D) 在感染福氏志贺氏菌AipaH9.8的HeLa hGBP1基因敲除细胞中表达mCherry-hGBP1，并在感染后2.5小时(hpi)对IcsA、N-WASP、Arp2和F-肌动蛋白进行染色。对hGBP1与细菌上指定蛋白的共定位进行定量。显著性通过不成对 检验，双尾确定。n.s.，无显著性差异， 。(E) 用干扰素 预处理和未预处理的野生型和hGBP1基因敲除的HeLa细胞用福氏志贺氏菌 ipaH9.8进行感染，并在感染后2.5小时(hpi)评估和定量IcsA、N-WASP、Arp2和F-肌动蛋白的亚细胞定位。显著性通过双向方差分析和Tukey多重比较检验确定。* 。
该图的源数据可在线获取。外膜蛋白IcsA的周向定位增加而非单极定位增加，这可能是由于在存在“去污剂样”hGBP1的情况下外膜流动性增加(Herrmann等人，2015年)。因此，我们的研究提供了一个新的概念框架，以定义hGBP1以及其他宿主物种中可能相关的GBP家族成员抗菌活性的分子机制。
hGBP1如何作为表面活性剂发挥作用？hGBP1聚合物的核心由从带正电荷的蛋白质C末端延伸的疏水法尼基基团组成(Shydlovskyi等人，2017年)。因此，hGBP1聚合物核心预计具有表面活性剂典型的两亲性质。尽管我们之前已经表征了hGBP1聚合的分子机制(Shydlovskyi等人，2017年；Sistemich等人，2020年)，但在这项当前工作之前我们尚未报道其生物学功能。本研究通过证明该过程对于hGBP1与脂多糖(LPS)结合以及附着于革兰氏阴性菌表面至关重要，赋予了hGBP1聚合这样的生物学功能。我们进一步表明，在LPS存在下hGBP1聚合动力学和GTP水解速率会加速，因此已将LPS确定为其生理脂质模板。虽然LPS结合的hGBP1聚合物的确切结构需要进一步研究，但我们已经可以得出结论，hGBP1聚合物核心的生化特征以及我们的体外结合研究都与所提出的“表面活性剂模型”一致。
在聚合态的人源鸟苷结合蛋白1(hGBP1)结构最初附着于细菌表面之后，这些聚合物似乎会解体，并转变为完全包裹革兰氏阴性菌的均匀hGBP1蛋白外壳。此时，我们只能推测单个hGBP1分子在这个hGBP1蛋白外壳中是如何排列的:我们预测法尼基尾从hGBP1聚合物的核心释放出来，并插入细菌外膜的外小叶(图EV5)。我们进一步预测hGBP1的C端多碱性基序与附着在脂质A和脂多糖内核上的磷酸基团发生有吸引力的静电相互作用(Simpson & Trent，2019)，从而至少部分解释了多碱性基序在细菌表面形成稳定hGBP1外壳的必要性。最后，我们推测hGBP1分子保持其聚合态的伸展构象(Shydlovskyi等人，2017；Sistemich等人，2020)，并与脂多糖的O抗原片段交错排列，从而破坏O抗原介导的脂多糖-脂多糖相互作用，这种相互作用有助于外膜硬度(Rojas等人，2018)并削弱O抗原的屏障功能。
作为许多革兰氏阴性菌包膜的暴露表面结构，O抗原是宿主免疫反应的直接且常见的靶点。由于脂多糖的O抗原片段在细菌血清型和物种之间高度可变，适应性免疫系统通过高度特异性的抗体检测广泛的O抗原库，而先天性免疫系统只能通过基因组编码的凝集素检测O抗原的子集(Mey等人，1996；Kawabata & Iwanaga，1999；Lerouge & Vanderleyden，2002；Wesener等人，2015，2017)。出乎意料的是，我们的数据表明先天性免疫蛋白hGBP1检测细菌表面O抗原的存在，而不是O抗原的特定生化构型。对潜在分子机制的深入了解可以从我们的发现中得出，即hGBP1聚合物以O抗原非依赖的方式结合到细菌表面，但需要O抗原的存在才能有效地从细菌结合的聚合态转变为包裹细菌的蛋白外壳。我们提出hGBP1聚合物在其与细菌附着端解聚，以将单个hGBP1分子插入细菌膜(图EV5)，并且进一步提出O抗原片段与单个hGBP1分子之间的相互作用支持这一过程，例如通过将单个hGBP1蛋白维持在其伸展构象。
我们的研究还揭示了hGBP1的C端多碱性基序在促进解聚过程中的关键作用，这一过程显然是从聚合物转变为非聚合蛋白外壳所必需的。虽然需要更多的工作来详细表征这一转变过程，但此处呈现的数据表明hGBP1进化出了一种复杂的多步骤机制，以在革兰氏阴性菌表面形成紧密结合的蛋白外壳。这一过程的特异性基于hGBP1识别表面暴露的光滑脂多糖作为一种独特分子模式的能力，这种分子模式由附着在带负电荷的脂质膜上的多糖组成。虽然我们的研究确定脂多糖是促进hGBP1与革兰氏阴性菌表面稳定结合的主要细菌模式，但我们不能排除hGBP1也识别其他微生物分子，这些分子可能有助于其募集到革兰氏阴性菌或促进其靶向其他类别的细胞内微生物病原体。此外，hGBP1也可能识别宿主损伤相关分子模式。支持这一假设的是，我们之前证明hGBP1会转运到无菌损伤的内体(Feeley等人，2017；Piro等人，2017)。对通常局限于完整囊泡腔侧的胞质暴露宿主糖的识别也可能参与hGBP1募集到含细菌液泡的过程(Feeley等人，2017)。同样，虽然目前只是推测，但hGBP1聚合物与构成革兰氏阴性菌外膜的高度可变糖的低亲和力但广泛特异性的相互作用可能介导聚合物与细菌表面的初始对接反应。
我们提出，人源鸟苷结合蛋白1(hGBP1)作为一种结合脂多糖(LPS)的表面活性剂发挥作用。该模型引发了几个可验证的假说。例如，鸟苷结合蛋白(GBPs)促进巨噬细胞而非上皮细胞中胞质细菌的溶解破坏(Man等人，2015年；Meunier等人，2015年；Li等人，2017年；Piro等人，2017年；Wandel等人，2017年；Liu等人，2018年)。我们在此证明，仅hGBP1与革兰氏阴性菌的结合既无杀菌作用也无抑菌作用，反而使细菌更容易受到抗菌肽PMB的影响。因此，我们提出巨噬细胞中依赖GBP的细菌溶解是由巨噬细胞而非上皮细胞胞质中大量表达的溶菌蛋白的协同活性介导的。GBPs还被证明可加速宿主细胞胞质中光滑型以及粗糙型LPS诱导的半胱天冬酶-4(caspase-4)激活(Pilla等人，2014年；Finethy等人，2015年；Lagrange等人，2018年；Santos等人，2018年)。我们目前的研究表明，hGBP1在体外可聚集光滑型和粗糙型LPS。因此，我们提出hGBP1以及可能的其他GBPs在宿主细胞胞质中与LPS相互作用形成高分子量LPS聚集体，这是半胱天冬酶-4(caspase-4)的预测生理结合底物(Wacker等人，2017年；An等人，2019年)。最后，这项工作表明hGBP1破坏了志贺氏菌外膜蛋白IcsA的功能，首次为先前报道的hGBP1介导的基于肌动蛋白的运动抑制提供了分子模型(Piro等人，2017年；Wandel等人，2017年)。我们预测，将hGBP1整合到细菌外膜中可能会影响其他细菌外膜蛋白的功能，这些蛋白与IcsA类似，对膜流动性的变化敏感。
先前的研究已经暗示GBPs在直接感知LPS方面可能发挥作用。我们表明，小鼠GBPs可加速小鼠骨髓来源巨噬细胞LPS转染后半胱天冬酶-4(caspase-4)激活的动力学(Pilla等人，2014年)，随后的一项研究将这些观察结果扩展到了人源GBPs(Lagrange等人，2018年)。在后续工作中，我们证明小鼠GBPs可促进细菌外膜囊泡(OMVs)——细菌释放的镶嵌有LPS的囊泡——诱导的半胱天冬酶-4(caspase-4)激活。我们发现，hGBP1最接近的小鼠同源物小鼠Gbp2在OMV处理的巨噬细胞内与LPS共定位(Finethy等人，2017年)，这支持了小鼠Gbp2与LPS之间的直接相互作用。另一项研究表明，小鼠Gbp5在巨噬细胞内与转染的LPS共定位(Santos等人，2018年)。总体而言，这些研究提出了一个假说，即一种或多种GBPs可能直接感知LPS。为支持这一假说，我们的研究将hGBP1鉴定为一种真正的LPS受体。
因此，哺乳动物宿主细胞胞质溶胶受到至少两类不同的LPS传感器的监测:hGBP1和半胱天冬酶-4/-5。这两种传感器协同运作:虽然半胱天冬酶-4与LPS聚集体结合(Shi等人，2014年；Wacker等人，2017年；An等人，2019年)，但我们的研究表明，hGBP1最初与LPS胶束相互作用，然后产生比在水溶液中自组装的聚集体大得多的LPS聚集体。未来的研究需要确定hGBP1-LPS复合物的结构构型，但有趣的是推测hGBP1会破坏LPS胶束的完整性，就像它对细菌外膜所做的那样，并因此在形成LPS-hGBP1复合物时与单体LPS分子结合。LPS胶束和含LPS的细菌膜的这种破坏可能在非经典炎性小体的激活中起重要作用。事实上，证实了先前的观察结果(Fisch等人，2019年)，我们表明hGBP1促进半胱天冬酶-4向细菌表面的募集；我们认为这个过程是由hGBP1驱动的LPS层部分溶解介导的。通过相同的主要机制，我们预计hGBP1会使革兰氏阴性菌更容易受到一系列抗菌剂的影响，就像这里已经显示的抗生素PMB的情况一样。因此，促进hGBP1与细菌外膜结合的干预措施，例如在志贺氏菌感染的情况下通过抑制细菌hGBP1拮抗剂IpaH9.8(Li等人，2017年；Piro等人，2017年；Wandel等人，2017年)，可能会带来包括提高某些抗生素疗效在内的治疗益处。
材料与方法
试剂与工具表
| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
| 抗体 | ||
| 小鼠抗大肠杆菌J5脂多糖单克隆抗体 | RayBiotech公司 | DS-MB-01267 |
| 兔抗人鸟苷酸结合蛋白1单克隆抗体 | 艾博抗(上海)贸易有限公司 | ab131255 |
| 兔抗IcsA多克隆抗体 | 戈德堡等人(1993年) | 无 |
| 兔抗N-WASP单克隆抗体 | 细胞信号技术公司 | 4848 |
| 小鼠抗Arp2单克隆抗体 | 艾博抗(上海)贸易有限公司 | ab49674 |
| Alexa-Fluor 568标记的山羊抗小鼠IgG | 赛默飞世尔科技公司 | A11004 |
试剂和工具表(续)
| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
| Alexa荧光660标记的山羊抗小鼠IgG | 赛默飞世尔科技 | A21054 |
| Alexa荧光568标记的驴抗兔IgG | 赛默飞世尔科技 | A10042 |
| Alexa荧光660标记的山羊抗兔IgG | 赛默飞世尔科技 | A21073 |
| 细菌和病毒菌株 | ||
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL | Stratagene | 无 |
| Rosetta(DE3)pLysS | Stratagene | 无 |
| Veggie NovaBlue Singles(Novagen) | 默克密理博 | 71251 |
| pInducer-mCherry-hGBP1 | 皮罗等人(2017年) | 无 |
| pMX-CMV-YFP-CASP4 | 菲施等人(2019年) | 无 |
| 福氏志贺菌2457T pEGFPmut2 | 桑德林等人(1995年) | 无 |
| 福氏志贺菌2457T pEGFPmut2 | 皮罗等人(2017年) | 无 |
| 福氏志贺菌2457T rfaL突变体 | 科勒等人(2002年) | BS520 |
| 福氏志贺菌2457T rfaL突变体pEGFPmut2 | 皮罗等人(2017年) | 无 |
| 福氏志贺菌2457T rfb08突变体 | 桑德林等人(1996年) | BS515 |
| 福氏志贺菌2457T rfb08突变体pEGFPmut2 | 本研究 | 无 |
| 福氏志贺菌2457T rfb025突变体 | 桑德林等人(1996年) | BS525 |
| 福氏志贺菌2457T rfb025突变体pEGFPmut2 | 本研究 | 无 |
| 福氏志贺菌2457T ΔipaH9.8 | 皮罗等人(2017年) | 无 |
| 福氏志贺菌2457T ΔipaH9.8 pEGFPmut2 | 皮罗等人(2017年) | 无 |
| 福氏志贺菌2457T ΔospC3ΔipaH9.8 | 本研究 | 无 |
| 鼠伤寒沙门氏菌SL1344 pGFP | 瓦尔迪维亚和法尔科夫(1997年) | 无 |
| 鼠伤寒沙门氏菌14028s StrR phoN::Tn10dCm ΔsifA | 弗里曼等人(2003年) | 无 |
| 尿路致病性大肠杆菌CFT073 pLRFP-C1 | 韦尔奇等人(2002年) | 无 |
| 尿路致病性大肠杆菌CI5 pLRFP-C1 | 亚伯拉罕等人(1985年);宋等人(2009年) | 无 |
| 嗜肺军团菌血清群1菌株LP01 rpsL pMMB207-dsRed | 费利等人(2017年) | 无 |
| 单核细胞增生李斯特菌10403S DH-L1039 | 沈和希金斯(2005年) | 无 |
| 金黄色葡萄球菌RN4220 pSRFPS1 | 罗德里格斯等人(2017年) | 无 |
| 大肠杆菌DH10B pEGFPmut2 | 本研究 | 无 |
| 大肠杆菌DH5α pEGFPmut2 | 本研究 | 无 |
| 化学物质、肽和重组蛋白 | ||
| Alexa荧光660鬼笔环肽 | 赛默飞世尔科技 | A22285 |
| 法尼基焦磷酸(FPP) | 开曼化学公司 | 63250 |
| 异丙基 - -1-硫代半乳糖苷(IPTG) | 卡尔·罗斯 | CN08.4 |
| 苯甲基磺酰氟(PMSF) | 卡尔·罗斯 | 6367.2 |
| 三磷酸鸟苷(GTP)溶液 | 赛默飞世尔科技和耶拿生物科学公司 | R0461和NU-1012 |
| 二磷酸鸟苷(GDP) | 艾博抗公司和耶拿生物科学公司 | ab146529和NU-1172 |
| 鸟苷5’-O-[γ-硫代]三磷酸(GTPγS) | 艾博抗公司和耶拿生物科学公司 | ab146662和NU-412 |
| 5’-鸟苷酰亚胺二磷酸(GppNHp) | 艾博抗公司和耶拿生物科学公司 | ab146659和NU-401 |
| Alexa-Fluor 488 C5马来酰亚胺(Alexa-Fluor488) | 赛默飞世尔科技 | A10254 |
| Alexa-Fluor 647 C2马来酰亚胺(Alexa-Fluor647) | 赛默飞世尔科技 | A20347 |
| 来自大肠杆菌血清型055:B5的脂多糖(LPS-O55:B5)，Alexa-Fluor 488缀合物 | 赛默飞世尔科技 | L23351 |
| 赛默飞世尔科技 | L23356 | |
| 新试剂与根源表(续 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
| 来自明尼苏达沙门氏菌的脂多糖(LPS - SM)，Alexa - Fluor 488共轭物 | ||
| 多粘菌素B(PMB)溶液 | 默克密理博 | 81271 |
| 溶菌酶 | 赛默飞世尔科技 | 89833 |
| 来自大肠杆菌O55:B5的脂多糖(LPS - O55:B5) | Invivogen | tlrl - pb5lps |
| 来自大肠杆菌O111:B4的脂多糖(LPS - O111:B4) | Invivogen | tlrl - eblps |
| 来自酿酒酵母的全葡聚糖颗粒(WGP) | Invivogen | tlrl - wgps |
| 脑极性脂质(BPL)提取物(猪源) | 艾凡提极性脂质公司 | 141101 |
| 杜氏改良 Eagle 培养基(Gibco) | 赛默飞世尔科技 | 11995040 |
| 胎牛血清(FBS) | 康宁和欧米茄 | 35 - 010 - CV和FB - 01 |
| 非必需氨基酸(NEAA，Gibco) | 赛默飞世尔科技 | 11140050 |
| β - 巯基乙醇(β - ME，Gibco) | 赛默飞世尔科技 | 21985023 |
| HisPur钴树脂 | 赛默飞世尔科技 | 89965 |
| 16:0 Liss Rhod PE(Rho - PE) | 艾凡提极性脂质公司 | 810158 |
| KOD热启动DNA聚合酶 | 默克密理博 | 71086 |
| 二硫苏糖醇(DTT) | 卡尔·罗斯 | 6908.2 |
| 硝酸纤维素膜， | 伯乐 | 1620112 |
| 三(2 - 羧乙基)膦盐酸盐(TCEP - HCl) | 赛默飞世尔科技 | 20490 |
| QIAprep Spin Miniprep试剂盒 | Qiagen | 27104 |
| 1×HBSS | 赛默飞世尔科技 | 14025092 |
| 1×PBS | 赛默飞世尔科技 | 10010023 |
| 聚 - o - 赖氨酸氢溴酸盐 | 默克密理博 | P6407 |
| 干扰素 | 默克密理博 | IF002 |
| 脱水四环素(aTc) | Takara | 631310 |
| Mowiol 4 - 88 | 默克密理博 | 81381 |
| 对苯二胺(PPD) | 默克密理博 | P1519 |
| 实验模型:细胞系 | ||
| 插入Cas9基因的HeLa细胞(HeLa野生型细胞) | 皮罗等人(2017年) | 无 |
| hGBP1缺陷型HeLa细胞(HeLa hGBP1 - KO细胞) | 皮罗等人(2017年) | 无 |
| hGBP1缺陷型HeLa细胞pInducer - mCherry - hGBP1 | 皮罗等人(2017年) | 无 |
| 寡核苷酸 | ||
| K51A - F:GGC CTC TAC CGC ACA GGC GCA TCC TAC CTG ATG AAC AAG C | 本研究 | 无 |
| K51A - R:GCT TGT TCA TCA GGT AGG ATG CGC CTG TGC GGT AGA GGC C | 本研究 | 无 |
| Q577A - F:GC AGA ATA ATG AAA AAT GAG ATA TGC GAT CTC CAG ACG AAA ATG AGA C | 本研究 | 无 |
| Q577A - R:C GTC TCA TTT TCG TCT GGA GAT CGC ATA TCT CAT TTT TCA TTA TTC TG | 本研究 | 无 |
| R584 - 586A - F:C CAG ACG AAA ATG GCA GCG GCC AAG GCA TGT ACC ATA AGC | 本研究 | 无 |
| R584 - 586A - R:GCT TAT GGT ACA TGC CTT GGC CGC TGC CAT TTT CGT CTG G | 本研究 | 无 |
| 重组DNA | ||
| pRSF - Duet1 - His6 - FTase | 弗雷等人(2010年) | 无 |
| pQE - 80L - His6 - hGBP1 | 英斯等人(2017年) | 无 |
| pOE - 80L - His6 - hGBP1 - R48A - Q577C | 本研究 | 无 |
| DOE - 80L - His6 - hGBP1 - K51A | 本研究 | 无 |
| DOE - 80L - His6 - hGBP1 - H74A - O577C | 本研究 | 无 |
试剂和工具表(续)
| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
| pQE - 80L - His6 - hGBP1 - R584 - 586A | 本研究 | 无 |
| pEGFPmut2 | 科马克等人(1996年) | 无 |
| 软件和算法 | ||
| ChromPass HPLC软件1.8.6.1 | 佳速科 | |
| 斐济(软件名) | 辛德林等人(2012年) | https://imagej.net/Fiji |
| 棱镜7(软件名) | GraphPad(公司名) | https://www.graphpad.com/scientific - sof tware/prism/ |
| PyMOL 1.7.2.1 | 薛定谔(公司名) | https://pymol.org |
| 其他 | ||
| HiLoad 26/60 Superdex 200预装级 | 通用电气医疗生命科学公司 | 28989336 |
| HiPrep Butyl FF 16/10 | 通用电气医疗生命科学公司 | 28-9365-47 |
| 超滤柱Vivaspin 20，10,000 MWCO，PES材质 | 赛多利斯(公司名) | VS2002 |
| 超滤柱Vivaspin Turbo 4，10,000 MWCO，PES材质 | 赛多利斯(公司名) | VS04T01 |
| 玻璃底微孔板 | MatTek(公司名) | P35G - 1.5 - 10 - C |
方法与协议
材料可用性
本研究中提及的材料和试剂不存在可用性限制。
实验模型与受试者详情
细胞系
亲本(野生型)和先前描述的hGBP1缺陷型(hGBP1-KO)HeLa细胞(Piro等人，2017年)在补充有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和 -巯基乙醇的杜氏改良 Eagle 培养基中于 和 条件下培养。HeLa hGBP1-KO细胞用脱水四环素(aTc)诱导型基因表达系统进行稳定转导，以驱动mCherry-hGBP1的表达。野生型和hGBP1-KO HeLa细胞用pMX-CMV-YFP-CASP4 (Fisch等人，2019年)进行稳定转导，以驱动YFP-半胱天冬酶-4-C258S的表达。所有细胞系均定期进行支原体污染筛查。
细菌菌株与细菌培养条件
细菌菌株在补充有刚果红的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)琼脂(弗氏志贺氏菌菌株)、TSB琼脂(金黄色葡萄球菌)、Luria肉汤(LB)-Miller琼脂(大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌菌株)或脑心浸液(BHI)琼脂(单核细胞增生李斯特菌)上生长，并根据需要补充抗生素 羧苄青霉素、 卡那霉素、 氯霉素、 链霉素、 甲氧苄啶)，在 于 培养。嗜肺军团菌在补充有 乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)-缓冲的活性炭酵母提取物琼脂上生长，该琼脂补充有 、 半胱氨酸、 氯霉素和 链霉素，培养2-3天。对于体外结合试验、电子显微镜检查、活力测定和感染，细菌在各自的肉汤培养物中于 和250 rpm过夜培养。弗氏志贺氏菌菌株、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌(补充有 )和 单核细胞增生李斯特菌的过夜培养物在新鲜肉汤中按1:30稀释，并在 上生长至 处的光密度为0.3-0.7。光密度为2-3的嗜肺军团菌过夜培养物无需进一步稀释即可使用。对于感染研究，弗氏志贺氏菌和鼠伤寒沙门氏菌ΔsifA的过夜培养物在新鲜肉汤中按1:30稀释，并生长 至 为 (弗氏志贺氏菌菌株)或生长 至 为 (鼠伤寒沙门氏菌 sif )。细菌在 收获用于 ，用 PBS洗涤一次，并用 PBS中的 聚-D-赖氨酸处理 (弗氏志贺氏菌野生型、rfaL突变体和ΔipaH9.8)或不处理直接用于感染(弗氏志贺氏菌ΔospC3ΔipaH9.8、鼠伤寒沙门氏菌ΔsifA)。
方法细节
弗氏志贺氏菌菌株构建
为了用质粒转化福氏志贺菌，按照所述方法(Warren，2011年)制备用于电穿孔的细菌菌株。简要地说，将过夜培养的细菌培养物以1:100的比例稀释于200毫升改良SOB培养基(2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、 、 ，pH 7.0)中，并生长至 为 。将细菌培养物在 下以 离心 。细菌重悬于 冰冷的4%甘油/1.5%甘露醇中，进行密度梯度离心，然后重悬于 冰冷的4%甘油/1.5%甘露醇中。用pEGFPmut2(Cormack等人，1996年)转化细菌。菌株ΔipaH9.8先前已有报道(Piro等人，2017年)。为了产生ΔospC3ΔipaH9.8，通过用质粒pCP20进行细胞转染表达Flp重组酶，从ΔipaH9.8::FRT-KANR-FRT(Piro等人，2017年)中去除KANR盒(Cherepanov & Wackernagel，1995年)。接下来，从ΔospC3::FRT-KANR-FRT(Mou等人，2018年)中PCR扩增FRT::KANR::FRT，并使用λ-red重组系统(Datsenko & Wanner，2000年)引入到ΔipaH9.8中。
用于克隆、诱变和重组蛋白表达的细菌菌株
大肠杆菌菌株Veggie NovaBlue Singles、BL21 CodonPlus (DE3) RIL和Rosetta (DE3) pLysS在补充有 氨苄青霉素的LB-Miller琼脂上于 过夜培养。为了进行质粒纯化，大肠杆菌菌株在LB-Miller肉汤中于 在摇床上以 过夜培养。
定点诱变
使用QuikChange定点诱变技术，用KOD Hot Start高保真DNA聚合酶和引入所需突变的寡核苷酸，将点突变引入pQE-80L-His -hGBP1中。诱变后，将质粒转化到化学感受态大肠杆菌Veggie NovaBlue Singles中，并用Qiaprep spin miniprep柱进行纯化。用 测序仪(Applied Biosys-tems)通过DNA Sanger测序验证突变。
蛋白质表达、纯化和法尼基化
重组人鸟苷酸结合蛋白1(hGBP1)野生型和变体的表达、纯化及法尼基化基本上如先前所述(Ince等人，2017年；Sistemich等人，2020年)。N端带有His 标签的hGBP1野生型蛋白和点突变体由细菌载体pQE - 80L在大肠杆菌菌株BL21 CodonPlus(DE3) RIL中表达。N端 标签的法尼基转移酶(FTase)由pRSF - Duet1载体在大肠杆菌菌株Rosetta(DE3) pLysS中表达。细菌在 terrific肉汤培养基(用于FTase表达时补充 )中培养，并在 和 下生长至 为0.4 - 0.6。温度降至 (hGBP1构建体)或 (FTase)，并用 IPTG诱导蛋白表达。对于FTase表达，向培养物中加入 。细菌在 后于 在 下收获15分钟(Sorvall LYNX 6000离心机，F9 - 6x1000 LEX转子，赛默飞世尔科技)。
用于纯化重组hGBP1和FTase的缓冲液组合物仅在使用 HEPES，pH 7.8(用于FTase)而非 Tris-HCl，pH 7.9(用于hGBP1)方面有所不同。收获的细菌重悬于缓冲液A(50 mM Tris- ，pH 和 )中，补充有 苯甲基磺酰氟(PMSF)，并通过超声处理(超声均质器Sonoplus HD 2200，Bandelin)裂解。通过在 和 下离心45 - 60分钟(Sorvall LYNX 6000离心机，F21 - 8x50y转子，赛默飞世尔科技)去除细胞碎片。含有hGBP1构建体或FTase可溶性部分的上清液通过利用蛋白质的N端His 标签的固定金属亲和色谱(IMAC)进行纯化，随后进行尺寸排阻色谱(SEC)以去除非特异性蛋白质聚集体。IMAC和SEC柱连接到ÄKTA Purifier或ÄKTA Prime系统(通用电气医疗生命科学)。加载可溶性蛋白质后，IMAC柱(填充有 HisPur Cobalt Resin)依次用5 - 10柱体积(CV)的缓冲液A和3 - 4 CV的缓冲液B10(50 mM Tris-HCl，pH值7.9，150 mM NaCl，5 mM 和 咪唑)洗涤。蛋白质用 缓冲液B150(50 mM Tris-HCl，pH值7.9，150 mM NaCl，5 mM 和 咪唑)洗脱。来自IMAC的含有hGBP1的级分合并并通过加入 沉淀。 蛋白质沉淀溶解在缓冲液 中，并加载到用缓冲液C平衡的SEC柱(Superdex 200 26/60，320 ml)上以从纯化的蛋白质中去除 。来自IMAC的含有FTase的级分合并，使用Vivaspin 20离心柱通过超滤浓缩，并加载到SEC柱上以分离单体蛋白质。
将单体hGBP1构建体在玻璃小瓶中与法尼基焦磷酸(FPP)和FTase于缓冲液D(50 mM Tris-HCl，pH 7.9，5 mM MgCl2，150 mM NaCl，10 μM )中在 下于 孵育。hGBP1:FPP:FTase的比例为1:2.5:0.02。向反应混合物中加入 至最终浓度为1.25 M，并加载到疏水相互作用色谱(HIC)柱(Butyl FF 16/10，20 ml)上，该柱先前已用缓冲液E(50 mM Tris-HCl，pH 7.9，5 mM )平衡。上样后，HIC柱依次用2倍柱体积的缓冲液E和2倍柱体积的缓冲液E洗涤，其初始 浓度降至 。通过在 上从 到 连续梯度进一步降低 浓度(法尼基化hGBP1的洗脱)，然后在3.75倍柱体积上从45%到25% 连续梯度(未法尼基化hGBP1的洗脱)，将法尼基化蛋白与未法尼基化蛋白分离。收集含有法尼基化hGBP1的馏分，使用Vivaspin 20离心柱通过超滤浓缩，并通过SEC进一步纯化以分离单体蛋白。在对单体靶蛋白(FTase、法尼基化和未法尼基化hGBP1)进行SEC纯化后，使用Vivaspin 20柱通过超滤浓缩蛋白制剂，在液氮中冷冻，并在 下储存。根据朗伯-比尔定律计算蛋白质浓度，使用缓冲液C中 处的吸光度和各自的摩尔吸收系数(FTase ，hGBP1 )。
用荧光染料标记蛋白质
将缓冲液C换成缓冲液G( Tris-HCl，pH 7.4， ，以及 )后，将蛋白质与Alexa-Fluor马来酰亚胺染料在冰上孵育 。蛋白质与染料的摩尔比为1:1。通过使用Vivaspin Turbo 4离心柱进行超滤，将缓冲液G换成补充有2 mM DTT的缓冲液C，从而终止标记反应。根据朗伯-比尔定律，使用在缓冲液C中 和 处的吸光度、各自的摩尔吸收系数(hGBP1为45,840 ，Alexa-Fluor488为71,000 ，Alexa-Fluor647为268,000 )以及荧光染料的校正因子(Alexa-Fluor488为0.11，Alexa-Fluor647为0.03)，计算蛋白质浓度和标记效率。将半胱氨酸Q577C引入pQE-80L-His -hGBP1-R48A和-H74A中，以有效标记 和 。Alexa-Fluor488标记的蛋白质的标记效率在46%至63%之间。Alexa-Fluor647标记的蛋白质的标记效率在10%至41%之间。
##基于吸光度的聚合测定和核苷酸组成分析
如前所述(Shydlovskyi等人，2017年)，使用Specord200紫外/可见分光光度计(Analytik Jena)进行基于吸光度的测量。将蛋白质在补充有 BSA的缓冲液C中稀释，并在温度控制的比色皿中于 下孵育 。将核苷酸以 (GTP、GppNHp、GTPγS)或 (GDP-Al )的终浓度注入比色皿中。随着时间的推移，跟踪hGBP1的聚合过程，以 处的吸光度信号作为指标。在使用GTP的实验中，在规定的时间点分析样品的核苷酸组成。为此，从比色皿中取出 等份样品，通过加入 的 立即停止GTPase水解，然后用 的 进行中和。通过使用连接到BT4100 HPLC泵(Shimadzu)的Chromolith Performance RP-倒置端盖柱(Merck)，通过反相高效液相色谱(HPLC)分离GTP、GDP和GMP来分析核苷酸组成。通过使用MD-2多波长检测器(Jasco)监测 处的吸收来检测核苷酸的保留时间。为了量化GMP(鸟苷酸)、GDP(二磷酸鸟苷)和GTP(三磷酸鸟苷)的浓度，使用ChromPass软件(Jasco)对各自核苷酸对应的峰面积进行积分。
##脂质囊泡制备
若丹明标记的脂质体通过在振荡电场中使干燥的脂质膜水化来生成。脑极性脂质(BPL)和若丹明 - 磷脂酰乙醇胺(Rhod - PE)分别在氯仿中稀释至最终浓度为 和 ，并在 真空下于铂电极上干燥 。然后用特氟龙帽密封电极，并填充与测量缓冲液C渗透压相同的蔗糖溶液。通过施加 和 的正弦电压 来形成脂质体。之后，通过施加 和 的正弦电压30分钟使脂质体与电极分离。
体外结合测定
在 收获细菌 ，用 PBS洗涤一次，然后(i)在pH 7.4的 PBS中用 甲醛固定 ，接着用 PBS洗涤两次，并重悬于补充有 的 PBS中(甲醛固定的细菌)，或者(ii)用 PBS洗涤一次，并重悬于缓冲液C中(活细菌)。表达荧光蛋白或Alexa - Fluor488偶联脂多糖(LPS)的活细菌或甲醛固定细菌在补充有 牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液C中稀释，然后将稀释液加到玻璃底 微孔板的盖玻片上。在 以 离心后，细菌或LPS在温度控制的显微镜载物台上于 孵育 。在脂质体实验中，将脂质体轻轻加入细菌中，并将混合物在 再孵育 。Alexa - Fluor标记的人鸟苷结合蛋白1(hGBP1)野生型或突变体蛋白在补充有 BSA的缓冲液C中稀释。在加入核苷酸后，在 将hGBP1直接加入细菌或LPS中。除非图注另有说明，所有体外结合实验中细菌的最终浓度为 /ml、LPS为 、蛋白为 ，核苷酸为 (GTP、GppNHp、GTP )或 (GDP - AlFX)。接下来，轻轻混合样品并进行延时成像。每隔1分钟或1.5分钟采集图像。在对细菌实验记录60分钟(或对LPS实验记录20分钟)的延时图像后，对不同视野进行成像以进行定量分析。使用蔡司Plan - Apochromat 63×/1.4油浸物镜在蔡司780倒置共聚焦显微镜或蔡司880 Airyscan快速倒置共聚焦显微镜(Axio Observer Z1)上进行成像。使用Fiji处理图像。
扫描电子显微镜
将浓度为 个细菌/毫升的缓冲液 中的活细菌以 滴的量滴加到用异丙醇清洗过的硅片上。在室温(RT)下孵育 后，将细菌与 缓冲液 或添加了 、 或hGBP1 以及 GTP的 缓冲液 轻轻混合。在 和 的孵育时间后，用 浓度的 浓缩固定剂(8%甲醛，4%戊二醛溶于 PBS)固定样品20分钟。样品用 PBS洗涤一次，用纯净水洗涤两次，然后风干。干燥后的样品使用Desk V溅射镀膜机(Denton)镀200秒金。使用工作在 的Apreo S扫描电子显微镜(FEI，赛默飞世尔科技)获取扫描电子显微镜图像。
斑点印迹法
将浓度范围为 至 的LPS - O55:B5和LPS - O111:B4的 等份两倍系列稀释液点在硝酸纤维素膜上，然后风干。膜先用封闭缓冲液 (Tris - HCl，pH ，BSA， TCEP - HCl)孵育 ，然后用在缓冲液 中稀释的 Alexa - Fluor647 - hGBP1 或 - hGBP1 以及 GTP在室温下孵育10分钟。在用添加了 GTP的缓冲液H短暂洗涤后，使用ChemiDoc MP成像系统(Bio - Rad)检测膜上蛋白质的荧光。由于hGBP1 显示出较慢的聚合和GTP水解动力学，hGBP1 在添加到负载LPS的膜之前先与GTP孵育 。
细菌菌落形成单位测定
将活细菌洗涤并重悬于补充有 牛血清白蛋白(BSA)和 鸟苷三磷酸(GTP)的缓冲液C中，使其浓度达到 个细菌/毫升。然后，将细菌在有或无 的情况下于 孵育 。接下来，在指定的情况下，加入终浓度为 (多粘菌素B，PMB)或 (溶菌酶)的抗菌剂，并将细菌在 再孵育 。将细菌的系列稀释液接种在LB - 米勒琼脂平板上，并在 过夜孵育后确定菌落形成单位(CFU)计数。使用 进行活力测定。福氏志贺氏菌野生型和rfaL突变体的测定以类似方式进行，但在多粘菌素B处理前的孵育时间缩短至45分钟。
细菌细胞培养感染
细胞系在24孔板中的玻璃盖玻片上培养，并用 干扰素 处理，或用 异丙基 - β - D - 硫代半乳糖苷(aTc)处理，或不处理 。然后，以感染复数(MOI)为6(福氏志贺氏菌菌株)或MOI为25(鼠伤寒沙门氏菌ΔsifA)感染细胞。用聚 - D - 赖氨酸处理或未处理的细菌重悬于预热的细胞培养基中，并在 以 离心于细胞上。感染的细胞在 和 孵育 (大多数福氏志贺氏菌菌株)或30分钟(福氏志贺氏菌ΔospC3ΔipaH9.8、鼠伤寒沙门氏菌 sifA)。用 汉克平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次后，将细胞与含有 庆大霉素的细胞培养基一起孵育。细胞在 和 孵育直至感染后1小时(福氏志贺氏菌野生型和rfaL突变体)、2小时(福氏志贺氏菌ΔospC3ΔipaH9.8)、2.5小时(福氏志贺氏菌ΔipaH9.8)或4小时(鼠伤寒沙门氏菌ΔsifA)。在室温下用 甲醛固定细胞，并用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次以进行免疫荧光染色。
免疫荧光显微镜检查
用抗体对内源性hGBP1、Arp2、N-WASP、F-肌动蛋白、细菌LPS和IcsA进行染色。细胞首先在室温下用 Triton X-100在 PBS中通透处理10分钟，然后用 PBS洗涤三次。通透处理后的细胞用缓冲液J( PBS、 BSA、 甘氨酸)封闭 。细胞用在缓冲液G中稀释的一抗处理，在室温下处理 或在 过夜。特异性抗体稀释度/浓度和孵育条件如下:抗hGBP1，1:150，室温1小时；抗Arp2， ，过夜 ；抗N-WASP，1:50，室温1小时；抗IcsA，1:25，4°C过夜。接下来，细胞用0.05% Triton X-100在 PBS中洗涤三次，每次 ，然后用在缓冲液G中1:1000稀释的与Alexa-Fluor568或Alexa-Fluor660偶联的抗小鼠或抗兔IgG在室温下处理 。F-肌动蛋白用Alexa-Fluor660-鬼笔环肽(在缓冲液G中1:40)在室温下染色 。用 Triton X-100洗涤三次，每次 后，细胞用与 PPD按9:1稀释的封片剂(100 mM Tris-HCl，pH 8.5，25%甘油， Mowiol)固定在显微镜载玻片上。在没有封片的玻璃底微孔板中，用抗LPS(1:50，室温1小时)对UPEC进行染色。处理后的载玻片用蔡司780倒置共聚焦显微镜或蔡司880 Airyscan快速倒置共聚焦显微镜在Axio Observer Z1显微镜上成像，使用蔡司Plan-Apochromat 油镜，或用徕卡STED和共聚焦显微镜在徕卡DMi8电动倒置显微镜上成像，使用蔡司Plan-Apochromat 油镜。以 的间隔采集Z轴堆叠图像。图像用Fiji处理。
感染细胞的延时显微镜观察
将HeLa hGBP1-KO pInducer-mCherry-hGBP1细胞接种在玻璃底 微孔板上，并用 aTc处理 以刺激mCherry-hGBP1表达。如上所述，用聚-D-赖氨酸处理过的表达GFP的福氏志贺氏菌ΔipaH9.8感染细胞。使用Axio Observer Z1显微镜上的蔡司780倒置共聚焦显微镜，每隔1分钟采集感染细胞的延时图像，将载物台培养箱设置为 并进行 缓冲，使用蔡司Plan-Apochromat 油镜。图像用Fiji处理。
数据可用性
本研究未将数据存入外部存储库。本文的扩展视图可在线获取。
致谢
我们感谢克莱尔·史密斯博士和大卫·托宾博士以及科尔斯实验室的成员对手稿的严格审阅。我们感谢安东尼·毛雷利博士与我们分享福氏志贺氏菌菌株；索曼·亚伯拉罕博士、梅塔·库恩博士和爱德华·苗博士与我们分享尿路致病性大肠杆菌、葡萄球菌和沙门氏菌菌株；阿维纳什·谢诺伊博士和伊娃·弗里克尔博士与我们分享pMX-CMV-YFP-CASP4 质粒；以及杰里特·普拉埃夫克博士与我们分享pRSF-Duet1-FTase质粒。这项工作得到了美国国立卫生研究院的资助，编号分别为AI139425(授予J.C.)、AI28360(C.F.L.)和AI081724(授予M.B.G.)；德国研究基金会(DFG)的研究奖学金427472513(授予M.K.)和研究资助HE2679/6 - 1(授予C.H.)；以及哈佛医学院院长创新奖(授予M.B.G.)。J.C.获得了博勒斯·韦尔科姆基金会颁发的传染病发病机制研究奖。这项工作部分是在杜克大学光学显微镜核心设施(LMCF)以及杜克大学共享材料仪器设施(SMIF)进行的，SMIF是北卡罗来纳州研究三角纳米技术网络(RTNN)的成员，该网络由美国国家科学基金会(资助编号ECCS - 1542015)作为国家纳米技术协调基础设施(NNCI)的一部分提供支持。我们感谢LMCF的成员本杰明·卡尔森博士、高亚生博士、丽莎·卡梅伦博士以及SMIF的成员米歇尔·普卢提供的培训。
作者贡献
MK和JC构思了该项目。MK和LS进行了实验。MK和JC撰写了手稿。所有作者都对手稿的审阅和编辑做出了贡献。CFL和MBG提供了试剂。JC和CH监督了该项目。JC、CH、CFL和MBG获得了与该项目相关的资金。
利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
参考文献
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