ObgE介导的持续性的生化决定因素
发布时间：
2026-03-14 17:45
ObgE介导的持续性的生化决定因素
娜塔莉·韦斯特拉滕，D. 1,2，† 索蒂里奥斯·格凯卡斯，
西里埃尔·伊内斯·金特， 芭贝特·德克斯，
布拉姆·范登伯格， 宝琳·赫佩尔斯，
埃伦·洛瓦吉， 沃特·克纳彭，
多里安·威尔马埃茨， 利塞洛特·德瓦赫特，
马尔滕·福瓦特， 兰詹·库马尔·辛格， 扬·米歇尔斯 和维姆·韦尔塞斯
比利时鲁汶大学微生物与植物遗传学中心，卡斯特尔帕克阿伦贝格20号，邮编2460，3001鲁汶。
比利时鲁汶，卡斯特尔帕克阿伦贝格20号，邮编3001，鲁汶大学微生物学中心，信箱2460。
比利时布鲁塞尔自由大学结构生物学系，普勒因laan 2号，邮编1050，布鲁塞尔。
比利时布鲁塞尔普莱因laan 2号1050 VIB - VUB结构生物学中心。
生命科学技术系，智能系统与新兴技术部门，比利时鲁汶市卡佩勒德雷夫 75 号，邮编 3001，imec 公司。
总结
Obg是一种多功能GTP酶，在细菌的持续存活中起关键作用。我们之前表明，大肠杆菌同源物ObgE通过激活毒素-抗毒素模块的转录并随后使膜去极化来发挥这种活性。在这里，我们评估了G结构域功能在ObgE介导的持续存活中的作用。通过筛选突变体文库，我们鉴定出五个obgE等位基因(具有G166V、D246G、S270I、N283I和I313N替换)，它们失去了持续存活功能，不再激活hokB表达。这些等位基因支持否则缺乏ObgE的菌株的生存能力，表明ObgE的持续存活功能可以与其基本作用脱钩。基于ObgE晶体结构，我们设计了另外两种突变蛋白(T193A和D286Y)，其中一种(D286Y)不再影响持续存活。使用等温滴定量热法
量热法、停流实验和动力学，我们随后评估了所有突变体中的核苷酸结合和GTPase活性。除了可能在蛋白质-蛋白质相互作用中受到影响的S270I突变体之外，所有失去其持续存在功能的突变体与GDP或警报素ppGpp的结合都严重减少。然而，我们没有发现持续存在与GTP或pppGpp结合之间，以及与GTP水解之间的明确关系。综合来看，我们的结果标志着在理解持续存在背后的生化决定因素方面迈出了重要一步。
引言
GTP酶是细胞生理学的核心调节因子。它们广泛存在于生命的三个领域，在所有主要细胞过程中发挥关键作用，包括蛋白质合成、DNA复制和细胞分裂(卡尔登和马奇，2003年)。当与GTP结合时，GTP酶通常被认为处于“开启”状态，使其能够与下游效应器相互作用。GTP水解是由一个亲核水分子攻击GTP -磷酸来实现的，这会使蛋白质处于结合GDP的“关闭”状态。随后GDP可以被释放，从而允许新一轮的GTP结合和水解继续进行(韦斯特拉滕等人，2011年；维廷霍费尔和维特，2011年)。
细菌GTP酶Obg，也被称为CgtA或YhbZ，先前已被证明是核糖体组装、DNA复制、孢子形成、形态分化和细胞周期调控中的关键因子(金特等人，2014年；德瓦赫特等人，2017a)。我们最近报道了大肠杆菌同源物ObgE的晶体结构，它包含一个N端结构域和一个中央G结构域，这两个结构域是所有Obg蛋白共有的，以及一个内在无序的C端结构域(凯卡斯等人，2017年)。此外，我们揭示了ObgE在抗生素治疗后细菌存活中的核心作用(韦斯特拉滕等人，2015年)。当受到抗生素挑战时，细菌群体的存活部分依赖于一小部分短暂表现出多药耐受性的细胞。这些所谓的持留菌在其群体中与正常细胞基因相同，但它们能够耐受极高水平的杀伤剂处理。去除这些药剂后，持留菌可以产生新的群体，从而影响细菌感染的成功清除(刘易斯，2010年；米歇尔斯等人，2016年；范登伯格等人，2017年)。
2019年9月1日接受。*通讯作者。电子邮件:jan.michiels@kuleuven.vib.be；电话:(+32) 16 32 96 84；传真:+32 16 32 19 63(J.M.)；wim.versees@vub.be；电话:(+32) 2629 18 49；传真(+32) 2 629 19 63(W.V.)。
共同第一作者。
共同最后作者。
我们之前的工作已经在大肠杆菌中建立了持留菌水平与细胞ObgE浓度之间的明确关联。高水平的ObgE被证明会诱导形成孔毒素HokB的表达，这会导致ATP泄漏、膜去极化并最终导致持留状态。这个过程被证明依赖于严格反应的警报素(p)ppGpp。此外，我们证明通过在ObgE的中央G结构域引入单点突变(G166V)，可以完全消除ObgE过表达时持留菌比例的增加(韦斯特拉滕等人，2015年；威尔马尔茨等人，2018年)。鉴定影响持留状态的其他氨基酸残基并表征其生化特性，可以为ObgE的活性提供新的见解。这些信息反过来可以提供有关负责ObgE介导的持留状态的细胞机制的线索。
在这里，对ObgE关于持留表型进行了结构-功能分析。通过随机诱变构建的突变ObgE过表达文库的筛选导致鉴定出五个氨基酸取代(G166V、D246G、S270I、N283I和I313N)，这些取代消除了ObgE的持留功能，而不干扰其对生长的基本功能。基于ObgE的晶体结构，合理设计了额外的突变等位基因(T193A和D286Y)，并评估了它们对持留状态和活力的影响。对突变的Obg蛋白关于其核苷酸结合和水解特性进行了详细的生化和生物物理分析，结果表明GTP水解速率与持留表型之间没有联系，而持留状态与核苷酸结合之间的关系似乎更复杂。
结果
鉴定ObgE中影响持留状态的氨基酸残基
我们之前已经证明，大肠杆菌中持留菌水平与ObgE的细胞浓度相关(Verstraeten等人，2015年)。为了确定介导持留性至关重要的氨基酸残基，通过易错PCR对obgE基因进行随机诱变，首先聚焦于G结构域。突变的obgE等位基因从 启动子过表达，并导入野生型大肠杆菌细胞中，构建了一个包含600个随机突变体的文库，随后对其进行持留性筛选。第一轮筛选后，71个突变体表现出与阴性对照无显著差异的持留菌表型，这表明编码的ObgE蛋白无法介导持留性。对这些突变体进行了更定量的持留性测定，之后保留了30个等位基因用于进一步研究(图1)。序列分析显示，每个选定的突变等位基因中有1至7个氨基酸替换(不考虑沉默突变)(表1)。氨基酸替换遍布目标obg 区域。在总共88个已鉴定的突变位置中，17个位置至少被替换了两次。有趣的是，在选定的一个突变体(RM13)中发现了G166V替换，我们之前已经证明它消除了ObgE的持留功能(Verstraeten等人，2015年)。
接下来，确定了在obgE过表达时导致持留功能丧失的单个氨基酸替换。因此，将来自30个选定突变等位基因(最多包含三个替换)的所有替换独立引入obgE中。如果在不同突变体中特定位置被替换为不同氨基酸，则仅选择一个替换来构建单个突变体。携带超过三个替换的随机突变等位基因未被考虑，因为相应的突变蛋白可能由于蛋白质错误折叠而失去了功能。在25个测试替换(G166V、V179L、I218V、L241P、D246G、P255Q、S270I、N283I、I313N、S314P和C325Y)中，有11个替换在突变等位基因过表达时导致持留功能显著丧失(图2)。
图1. 筛选失去持留功能的随机突变等位基因。易错PCR产生的obgE等位基因表达后，用氧氟沙星处理的大肠杆菌在稳定期的平均相对持留菌比例。条形表示数据系列的 和 百分位数。携带pBAD/His A-venus(阴性对照)或过表达野生型obgE-venus(阳性对照)的菌株也包括在内(以正方形表示)。相对持留菌比例低于2(虚线)的突变体筛选情况以灰色表示。这些突变体命名为RM1至RM30
表1. 30个选定的随机突变等位基因的鉴定替换概述，其表达的突变ObgE蛋白表现出持留功能丧失。
| 随机突变体 | 突变 | MRPFa |
| RM1 | K185E、L235M、P249Q、Y311N | 0.196 |
| RM2 | L154P、C238Y、H243R、D248N、A259S | 0.226 |
| RM3* | L154P、D254E、E302V | 0.301 |
| RM4* | 1313N | 0.346 |
| RM5 | F175l、G220C、S270R、L273P、K284M、E307V、E366K | 0.356 |
| RM6 | G163S、K290M、W306C、L324F | 0.393 |
| RM7 | D148V、A160T、K296I、C325S、D368V | 0.443 |
| RM8* | N283I、P346S | 0.448 |
| RM9 | K276Q、C325Y、E334G、E363A | 0.462 |
| RM10* | S314P | 0.505 |
| RM11 | R202Q、C238R、S264G、N335H | 0.513 |
| RM12* | S314P | 0.559 |
| RM13* | G166V、P336L | 0.574 |
| RM14 | D188G、C238R、I261N、D308Y | 0.574 |
| RM15 | M167V、F231L、G320S、V328E | 0.614 |
| RM16 | P146S、S173T、N283S、D286Y(D286Y)、A293P | 0.631 |
| RM17* | V162D、T275A | 0.649 |
| RM18 | L244H、N283S、D289E、K298E | 0.668 |
| RM19 | G147S、S270C、I332T、M352V | 0.735 |
| RM20* | D246G、L273P、K296N | 0.888 |
| RM21* | D213E、L241P、E334G | 0.911 |
| RM22* | 1247N、P255Q | 0.936 |
| RM23 | D161G、L287P、A303V、Y310C、D355V | 0.964 |
| RM24 | R177H、D308V、D327V、1333N | 0.971 |
| RM25* | L242M、D246T、Q360E | 1.060 |
| RM26* | V179L、I218V、S270I | 1.244 |
| RM27 | S197N、V256D、I300N、D323G、V384I | 1.536 |
| RM28 | L159Q、Y189H、L266Q、K309I | 1.802 |
| RM29 | F191S、D248Y、V328E、E382G | 1.922 |
| RM30 | M167S、V211D、D213S、G228C、H243R、T275A | 1.996 |
已对其鉴定出的氨基酸取代单独评估了它们对ObgE持续存在功能的影响的随机突变体用星号标记。斜体的残基在多个突变体中发生了突变。加粗的取代消除了ObgE的持续存在功能(图2)。下划线的取代消除了ObgE的持续存在功能，同时支持生长(图3)。
MRPF:如图1所示的平均相对持续菌分数。
表达温度敏感型obgE等位基因的菌株的互补分析
所选单突变体持续存在功能的丧失可能是由特异性影响ObgE自身持续存在功能的突变引起的，也可能是由影响ObgE结构从而影响蛋白质稳定性和整体功能的突变引起的。为了验证这些情况中的哪一种适用于所选的单突变体，我们利用了ObgE对生长至关重要这一事实(Kobayashi等人，200(此处原文有误，应为2001))。因此，我们检查了突变的ObgE蛋白是否能够在大肠杆菌GN5003中提供生长所需的基本功能。该菌株缺乏功能性的染色体obgE拷贝，但转提供了一个质粒携带的温度敏感型obg 等位基因以支持在允许条件下的生长(Kobayashi等人，2001)。
在非允许温度下，只有表达野生型ObgE以及具有G166V、D246G、S270I、N283I或I313N取代的突变体的菌株能够完全互补生长所需的基本功能(图3A)。这表明这些突变蛋白在体内至少部分正确折叠且具有功能。具有L241P、S314P和C325Y取代的突变ObgE蛋白只能部分互补生长所需的基本功能(图3A)。可能这些突变产生了温度敏感型ObgE蛋白，如之前对 所显示的那样(Sato等人，2005)。或者，这些位置的取代导致了显著的结构改变，严重影响了ObgE的稳定性和功能。
在最初选择的12个含有三个或更少氨基酸取代的随机突变体中，其中9个持续存在功能的丧失可归因于单个突变的影响(表1)。然而，有三个突变体并非如此。当评估这些突变体互补生长所需基本功能的能力时，突变体RM3(具有L154P、D254E和E302V突变)携带的等位基因无法支持生长，这表明该突变体是基于整体功能降低而被选择的。然而，突变体RM17(具有V162D和T275A突变)和RM22(具有I247N和P255Q突变)表达的突变等位基因完全互补了ObgE的基本功能(图3B)。因此，似乎这些突变体中特定的点突变组合导致了观察到的持续存在功能丧失。
图2. 具有持续存在功能丧失的位点特异性突变等位基因的选择。在 轴上所示的各自氨基酸取代的obgE等位基因表达后，用氧氟沙星处理的大肠杆菌在稳定期的存活百分比。包括空载体对照和过表达野生型obgE的菌株。给出了平均值±SEM(n≥3)。与对照相比存活分数的显著差异用星号 表示。
预测影响核苷酸结合的活性位点突变体的合理设计
上述随机诱变方法在obgE中鉴定出五个点突变(G166V、D246G、S270I、N283I和I313N)，与野生型相比，这些突变消除了过表达对持久性的影响(图4)。此外，由于已获得与GDP结合的ObgE的高分辨率结构(Gkekas等人，2017年)，我们还合理设计了另外两个可能影响ObgE功能某些方面(如核苷酸结合和GTP水解)的活性位点突变:T193A和D286Y。T193是来自开关I的主要开关残基，因此预测T193A突变体主要影响GTP结合(Vetter和Wittinghofer，2001年；Wittinghofer和Vetter，2011年)，新月柄杆菌Obg同源物CgtA也证明了这一点(Lin等人，2001年)。在D286Y突变体中，靠近核苷酸鸟嘌呤部分的天冬氨酸被一个大的酪氨酸残基取代，因此预测该突变会严重影响GDP和GTP结合(图4)。应该注意的是，随机突变体RM16中也存在这种突变，由于它组合了五个不同的点突变，因此没有保留用于进一步分析(表1)。对于 和 ，其体内功能已得到证实，并且它们支持生存能力(图3A)。有趣的是，过表达ObgE 不会增加持久性，而过表达 确实会将持久性提高到与野生型ObgE几乎相似的水平(补充图S1)。
所选obgE等位基因的体内功能
为了排除温度敏感型 等位基因在大肠杆菌GN5003中的潜在影响，我们在缺乏其染色体obg 基因的干净敲除菌株中表达了六个所选等位基因(G166V、D246G、S270I、N283I、I313N和D286Y)。还包括T193A等位基因作为对照。所有等位基因的表达水平相似(图5A)，表达突变等位基因的菌株显示正常生长(补充图S2)，CFU/ml范围为 至 (图5B)。然而，与表达野生型obgE基因或来自质粒的obg 的ΔobgE菌株相比，表达六个所选突变等位基因中任何一个的菌株的持留菌分数均显著降低(图5C)。与在存在obgE内源性野生型拷贝的情况下过表达突变等位基因的大影响相比(图2和S1)，这种差异相对较小，但仍然显著。此外，所选突变等位基因在过表达时均未诱导hokB转录(图5D)。综合起来，这些结果表明G166V、D246G、S270I、N283I、I313N和D286Y取代特异性地靶向ObgE的持久性功能。
突变型ObgE蛋白的体外折叠和稳定性
为了将突变体对持久性的体内影响与其体外生化特性联系起来，首先小规模表达和纯化了ObgE野生型和突变型蛋白。在七个测试突变体(G166V、D246G、S270I、N283I、I313N、T193A和D286Y)中，ObgE 在表达和/或纯化过程中显示出显著降解，蛋白质印迹也证实了这一点(图6A和B)。其他突变体没有显示出如此严重的降解，并进行了大规模表达和纯化。对纯化的蛋白质进行了详细的生化和生物物理分析，以确定受影响氨基酸在ObgE分子机制中的作用。
为了测试这些突变对ObgE功能的影响，我们确定了这些突变体在体外是否正确折叠并稳定。首先，我们通过将它们的圆二色性(CD)光谱与野生型的光谱进行比较，来确定它们的折叠情况(二级结构含量)(图6C)。CD谱表明，在 时，所有突变蛋白似乎都正确折叠，并且与野生型蛋白ObgE具有大致相同的二级结构含量(补充表S1)。
图3. 评估选定的突变obgE等位基因的基本功能。将表达指定ObgE蛋白的大肠杆菌GN5003进行10倍系列稀释，点样在补充有适当抗生素和0.2%阿拉伯糖的LB平板上，并在允许的 和非允许的 温度下平行评估生长情况。对照:携带空载体pBAD/His A的大肠杆菌GN5003；ObgE:携带pBAD/His A-obgE的GN5003。
A. 携带单个氨基酸取代的ObgE突变体。
B. 携带多个氨基酸取代的ObgE突变体(RM3:L154P、D254E、E302V；RM17:V162D、T275A；RM22:I247N、P255Q)。表达的ObgE蛋白完全补充生长必需功能的菌株用星号标记。
接下来，我们通过进行热迁移分析(TSA)来确定野生型和突变型ObgE的热稳定性(图6D)。野生型ObgE具有中等热稳定性， 值为 。D246G、S270I、T193A和D2286Y突变体的 值(分别为 和 )与野生型ObgE相当，表明这些突变不影响蛋白质的整体折叠或稳定性。然而，N283I突变体的 值显著更低( )，表明该突变对稳定性有影响，但正如通过CD光谱观察到的，证实该蛋白质在 时预计主要已折叠。最后，G166V突变体表现出异常行为，因为在热迁移分析中未观察到随着温度升高的协同解折叠。相反，在5到 之间观察到荧光逐渐降低。尽管这种行为的根本原因尚不完全清楚，但这可能表明该蛋白质在低温下已经呈现出大的疏水表面(尽管如在CD中所见形成了二级结构)，并且随着温度升高蛋白质沉淀。总之，从这些实验中，我们可以说D246G、S270I、T193A和D286Y突变体在折叠和稳定性方面不受影响，而N283I突变对稳定性有轻微影响，G166V和I313N突变体在折叠和稳定性方面受到更严重的影响。
图4. ObgE的G结构域上突变的定位。
A. ObgE的G结构域与结合GDP的ObgE ISTORD晶体结构(PDB-ID 5M04)(Gkekas等人，2017年)的两种取向的卡通表示。GDP显示为棍状， 显示为球体。在随机筛选中发现的失去持久性表型的ObgE变体中发生突变的残基(G166、D246、S270、N283、I313)显示为品红色棍状。另外两个突变的残基(T193、D286)显示为绿色。
B. ObgE结构域组织的示意图，显示了G结构域中的五个保守序列基序(G1 - G5)。在放大的G结构域上指出了突变的位置。
突变对核苷酸结合的影响
为了研究突变氨基酸在ObgE的核苷酸结合和水解中的作用，我们首先使用等温滴定量热法(ITC)实验(表2，补充图S3和S4)确定了它们对GDP和核苷酸三磷酸类似物鸟苷 -[ -硫代]三磷酸(GTPγS)的核苷酸结合亲和力的贡献。此外，使用ITC，我们还确定了它们对鸟苷3’-二磷酸5’-二磷酸(ppGpp)和鸟苷3’-二磷酸5’-三磷酸(pppGpp)结合的影响(表2，补充图S5和S6)。ppGpp和pppGpp是所谓的警报素，在营养应激期间产生并触发严谨反应(Braeken等人，2006年)，我们之前的结果表明，ppGpp和/或pppGpp的存在是Obg介导的持续性的先决条件(Verstraeten等人，2015年)。
野生型ObgE对GDP 、GTP S 和ppGpp 显示出相对较低的亲和力(Gkekas等人,2017)。值得注意的是，但与其他近期报道一致(Zhang等人，2018年)，我们在此发现，与其他三种核苷酸 相比，野生型ObgE对pppGpp的亲和力要低得多。在随机诱变筛选中发现的两个失去持续性表型的突变体G166V和N283I，没有显示出任何可观察到的核苷酸结合。此外，正如所设想的，另外经过合理设计的突变体D286Y也完全失去了结合核苷酸的能力。N283和D286都位于G蛋白保守的所谓G4基序中，分别与鸟嘌呤的N7/O6和N1/N6相互作用。因此，用非极性大体积氨基酸取代这些残基确实预计会严重影响核苷酸结合。G166位于与核苷酸的 离子和磷酸基团相互作用的P环中，对应于G-xxxx-GK-[TS]共有序列(Ras中的G10)中的第一个甘氨酸(Clanton等人，1987年)。用大体积缬氨酸残基取代可能直接干扰核苷酸结合，或者更普遍地影响蛋白质的折叠，如我们的TSA分析中所观察到的。
图5. obg 突变等位基因在 obg 敲除菌株中的表达。
A. 使用抗His抗体的蛋白质免疫印迹显示，在携带pBAD/His A-obgE的野生型大肠杆菌BW25113(对照)以及从pBAD/His A表达所示obgE等位基因的BW25113 ΔobgE中obgE的表达。培养物在0.2%阿拉伯糖存在下过夜培养。B. 用各自在 轴上所示氨基酸取代表示的obgE等位基因表达后，处于稳定期的大肠杆菌BW25113 ΔobgE在用水处理(灰色)或氧氟沙星处理(白色)后的菌落形成单位数。给出了平均值 标准误 。C. 在用氧氟沙星处理后，处于稳定期的大肠杆菌BW25113 ΔobgE在用各自在 轴上所示氨基酸取代表示的obgE等位基因表达后的存活率。包括过表达野生型obgE的对照菌株。从B图所示数据计算存活分数。给出了平均值 标准误 。与对照相比存活分数的显著差异用星号 表示。
D. 在obgE过表达后hokB的表达。携带在 启动子控制下hokB与RFP转录融合的菌株(pACYC184- -hokB-RFP)以及pBAD/His A(对照)或pBAD/His A-obgE( 轴上所示等位基因)在0.2%阿拉伯糖存在下过夜培养。使用基于Synergy Mx单色仪的多模式微孔板读数器(BioTek)测量红色荧光。给出了平均值 标准误 。与空载体对照相比的显著差异用星号表示( )。a.u.，任意单位。
D246G取代对GDP、GTPγS和ppGpp的结合亲和力也有显著影响，与野生型ObgE相比，对GDP的亲和力降低了近10倍( )，对GTP的亲和力降低了11倍( )，对ppGpp的亲和力降低了12倍( )。相比之下，该突变对pppGpp的结合亲和力的影响不到2倍( )。核苷酸结合的这种全局性但较温和的影响可以从晶体结构中得到解释。D246不直接与核苷酸相互作用，而是与284位的赖氨酸残基相互作用，而该赖氨酸残基又直接与核苷酸相互作用。
S270I 替换对 GDP 和 pppGpp 的结合影响可忽略不计，而对 GTPγS 和 ppGpp 的亲和力分别降低约四倍和两倍。S270 残基距离核苷酸结合口袋较远，因此预计对 GTPγS 的亲和力不会有影响。由于在 ObgE 晶体结构中 S270 靠近 Switch II(Gkekas 等人，2017 年)，S270 中的突变可能会通过影响 Switch II 的构象而潜在地导致对 GTP 结合的影响。最后，位于 Switch I 区域的合理设计的 T193A 突变体对 GDP 的亲和力几乎未改变，对 GTPγS 的亲和力几乎降低了四倍，正如预期的那样。相比之下，该突变对 ppGpp 或 pppGpp 的亲和力没有影响。总之，虽然 GDP 和 ppGpp 结合在某些突变体(G166V、D246G、N283I 和 D286Y)中受到严重影响，而在其他突变体(S270I、T193A)中几乎不受影响，但对 GTP(GTPγS)亲和力的影响是所有已表征突变体的共同特性。与其他核苷酸相比，pppGpp 的整体亲和力较低，并且仅在 G166V、N283I 和 D286Y 突变体中结合受到显著影响。
图 6. 野生型和突变型 ObgE 蛋白的折叠与稳定性。
A. (小规模)纯化野生型 ObgE 和本研究中描述的突变体后的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。
B. 使用抗 抗体的蛋白质免疫印迹。
C. 远紫外圆二色性(CD)光谱，代表 ObgE 野生型和突变体的二级结构。蛋白质浓度为 ，实验在 下于 光程比色皿中以 的扫描速度进行。光谱代表每个样品 15 次扫描的平均值。
D. 热位移分析显示野生型 ObgE(WT)和突变体的热解折叠情况，如图所示。实验在 蛋白浓度下进行，温度从 以 的步长升至 (绘制三个独立测量值的平均值 标准偏差)。解链温度 通过使用 GraphPad Prism 用玻尔兹曼 S 型方程拟合数据的一阶导数来确定。
表 2. 通过等温滴定量热法(ITC)测定的 ObgE 野生型和突变体在 中对 GDP、GTPγS、ppGpp 和 pppGpp 的结合亲和力 。
| 蛋白质 | 鸟苷二磷酸 | 鸟苷-5’-O-(3-硫代三磷酸) | 鸟苷四磷酸 | 鸟苷五磷酸 |
| 野生型 | 0.44 ± 0.03 | 1.3 ± 0.1 | 9.8±1.1 | |
| 甘氨酸166缬氨酸 | 纳米比亚元° | 纳米比亚元 | 纳米比亚元 | 纳米比亚元 |
| 天冬氨酸246甘氨酸 | 4.1±0.4 | 14.8 ± 0.9 | 7.8±1.2 | 16.9 ± 3.6 |
| 丝氨酸270异亮氨酸 | 0.45 ± 0.05 | 4.9 ± 0.5 | 1.14±0.09 | 11.5 ± 1.0 |
| 天冬酰胺283异亮氨酸 | 纳米比亚元 | 纳米比亚元 | 纳米比亚元 | 纳米比亚元 |
| 苏氨酸193丙氨酸 | 0.53 ± 0.03 | 4.7 ± 0.4 | 0.8 ± 0.1 | 8.8 ± 2.1 |
| 天冬氨酸286酪氨酸 | 纳米比亚元 | 纳米比亚元 | 纳米比亚元 | 纳米比亚元 |
原始等温滴定量热法数据见补充图S3 - S6。
数据取自Gkekas等人(2017年)。
NMB:无可测量的结合。
为了进一步确定D246G、S270I和T193A替换对核苷酸结合动力学的影响，我们使用了停流荧光实验(使用市售的荧光标记核苷酸mant - GDP/GTP)。已表明野生型ObgE由于核苷酸快速结合和解离，对GDP和GTP显示出低亲和力 (GDP) (Gkekas等人，2017年)。D246G突变体对GDP和GTP的亲和力较低，是由于GDP和GTP的结合速率降低了三倍，同时GDP和GTP的解离速率分别增加了5倍和12倍(图7)。S270I替换对GTP亲和力的具体影响是，GDP和GTP的结合速率几乎未改变，GDP解离速率未改变，但GTP解离速率增加了12倍。最后，T193A对GTP亲和力的影响也是由于GDP和GTP的结合速率未改变，同时GDP解离速率增加了三倍，GTP解离速率增加了19倍(所有数据见图7)。
突变对GTP水解及核糖体激活的影响
除了对核苷酸结合的影响外，我们还测量了突变对GTP水解的稳态米氏动力学性质的影响(表3和补充图S7)。野生型ObgE蛋白显示出非常低的内在GTP酶活性，具有 和 (Gkekas等人，2017年)。对于G166V、N283I和D286Y突变体，在GTP浓度达到 之前未观察到GTP水解，这与观察到的GTPγS缺乏结合一致。同样，对于T193A突变体，在1 mM GTP之前未观察到GTP水解，尽管该突变体确实结合GTPγS(尽管亲和力降低)。T193残基对应于G蛋白达到催化活性“弹簧加载”ON构象所需的主要开关I残基，因此突变该残基可能以这种方式影响GTP水解(Vetter和Wittinghofer，2001年；Wittinghofer和Vetter，2011年)。最后，D246G和S270I突变体显示出GTP酶活性，尽管效率低于野生型ObgE蛋白。两个突变体的 值与野生型ObgE相当(表明 )，但D246G和S270I的 值分别降低了7倍和4.5倍。因此，这表明所有测试的ObgE突变体在水解GTP的能力上都受到影响，尽管程度不同。
虽然ObgE具有非常低的内在GTPase活性，但先前已有描述称，这种活性在与核糖体结合后会增强(Feng等人，2014年；Chatterjee和Datta，2015年；Gkekas等人，2017年)。为了研究那些仍具有内在GTPase活性的突变体的核糖体激活是否受到突变的影响，我们在不存在和存在不同浓度核糖体的情况下测量了它们的活性(补充图S8)。需要注意的是，在使用的最高浓度核糖体下，在核糖体制备物中遇到了污染性的GTPase活性，这可能是由于共纯化的GTPases所致。在减去该背景活性后，发现 和 的GTPase活性随着核糖体(催化)量的增加而逐渐增加，这与我们之前在野生型ObgE中发现的激活情况相当(补充图S7)。添加最高测试浓度的核糖体(0.1 μM的70S核糖体至0.5 μM ObgE)可使野生型ObgE的水解速率(Gkekas等人，2017年)提高约10倍。相比之下，添加相同量的核糖体可使 的GTP水解活性提高9倍， 提高 - 倍。这表明核糖体的激活以及因此可能的核糖体结合不受突变的影响。图7. 通过停流荧光分析测定的ObgE突变体的GDP和GTP结合及解离动力学。
A. 通过在与不同浓度的 和 快速混合后追踪 mant - GDP(混合前/后浓度为 0.2/0.1 µM)荧光获得的瞬态。图中给出的浓度值代表混合前后 ObgE 突变体的浓度。下图展示了观测速率常数 的浓度依赖性。线性拟合的斜率得出 GDP 结合速率 。B. 通过在将 未标记的 GDP 与 ObgE 突变体和 mant - GDP 的混合物混合后追踪 mant - GDP 从 和 中的释放，直接测定 GDP 解离速率 。
C. 通过在与不同浓度的 、ObgE 和ObgE 快速混合后跟踪mant - GTP(0.2/0.1 μM，混合前/后)荧光获得的瞬态。使用与(A)中相同浓度。下面的面板显示了观察到的速率常数 的浓度依赖性。线性拟合的斜率和截距分别得出GTP结合 和解离 速率。D. ObgE突变体的核苷酸结合/解离动力学总结以及推导的 值。对于ObgE野生型，数据取自Gkekas等人(2017年)。
表3. ObgE野生型和突变体的GTP水解稳态动力学参数。
| 蛋白质 | |||
| WTa | 0.064 ± 0.001 | 10.4 ± 0.7 | |
| G166V | NMA | NMA | |
| D246G | 0.009 ± 0.002 | ||
| S270I | 0.014 ± 0.007 | ||
| N283I | NMA | NMA | |
| T193A | NMA | NMA | |
| D286Y | NMA | NMA |
数据取自Gkekas等人(2017年)。
NMA:无可测量活性。
讨论
Obg是一种广泛保守的GTP酶，在所有测试生物体中对细菌生存能力至关重要(Verstraeten等人，2011年)。此前，我们已证明大肠杆菌Obg(ObgE)在细菌持久性调控中起核心作用，群体中持留菌细胞的比例与ObgE的细胞浓度成比例(Verstraeten等人，2015年)。ObgE介导的持久性通过hokB基因的转录激活发生，hokB基因编码I型毒素-抗毒素模块的毒素部分。因此，它与II型毒素-抗毒素不同，后者在持久性中的作用此前一直存在一些争议(Ramisetty等人，2016年；Harms等人，2017年；Goormaghtigh等人，2018年；Ronneau和Helaine，2019年)。HokB的同源抗毒素sokB是一种RNA分子，它结合hokB mRNA的前导区域，将其靶向降解(Gerdes等人，1986年)。小肽HokB通过形成允许ATP分子通过的孔来诱导持久性，导致膜去极化(Wilmaerts等人，2018年)。ObgE介导的持久性取决于警报素(p)ppGpp的存在，并且由于后者在某些情况下与Obg共纯化，并且以与GDP和GTP相似的亲和力与Obg结合(Buglino等人，2002年；Persky等人，2009年；Gkekas等人，2017年)，我们此前曾提出(p)ppGpp参与持久性可能通过直接与Obg结合发生(Verstraeten等人，2015年)。
为了进一步深入了解ObgE介导的持久性机制以及与ObgE生化特性的联系，我们首先采用随机诱变来鉴定调节持久性表型的ObgE残基。通过这种方式，我们鉴定出五个单个点突变，这些突变在过表达时消除了ObgE的持久性表型(G166V、D246G、S270I、N283I和I313N)。此外，还鉴定出两个随机突变等位基因，它们需要组合两个单个点突变才能影响持久性表型(V162D/T275A和I247N/P255Q)。从随机诱变筛选中可以明显看出，一些obgE突变等位基因相对于野生型基因对持久性有更强的影响(图1)。目前，我们对此观察结果没有解释:编码的蛋白质可能以更高的量存在，或者它们的生化特性或与其他蛋白质的相互作用可能存在改变。
除了通过随机诱变鉴定出的突变外，我们还测试了位于ObgE的G结构域的G2(开关I)和G4基序中的两个合理设计的突变体(分别为T193A和D286Y)。D286Y突变完全破坏了ObgE的持久性表型。相反，T193A突变体在过表达时将持久性增加到几乎与野生型蛋白相等的水平。结合我们的筛选结果现在我们有六个不再影响持久性的突变ObgE蛋白可供使用。六个选定的等位基因中没有一个能够诱导hokB表达。由于许多G蛋白作为分子开关在结合GTP的“开启状态”和结合GDP的“关闭状态”之间循环(Vetter和Wittinghofer，2001年)，接下来我们研究了对持久性表型的影响是否以及如何与ObgE突变体的核苷酸结合和水解特性相关联。
测试了野生型和突变型ObgE与GDP、GTP类似物GTPγS以及警报素ppGpp和pppGpp的结合情况。与之前的报道一致，我们发现野生型ObgE对GDP的亲和力比对GTP S高约三倍，而对ppGpp的亲和力与GDP相当，考虑到相似的5’-二磷酸基团，这是预期的结果(Wout等人，2004年；Gkekas等人，2017年)。然而，我们测量到与ppGpp和GTPγS相比，ObgE对pppGpp的亲和力低约10倍。考虑到pppGpp在5’OH处结合一个三磷酸基团，类似于GTPγS，在3’OH处结合一个二磷酸基团，类似于ppGpp，这种低亲和力令人惊讶。尽管如此，最近一篇论文报道，与ppGpp相比，pppGpp对ObgE以及参与翻译的其他GTP酶的亲和力也较低(Zhang等人，2018年)。在等待ObgE与pppGpp结合的结构信息时，这似乎表明pppGpp与其他三种核苷酸不同，以不同方式结合到ObgE活性位点口袋中。ObgE对pppGpp的较低亲和力，与报道的在应激大肠杆菌细胞中pppGpp与ppGpp相比积累较低相结合，表明ppGpp是ObgE介导的持久性中最相关的警报素(Potrykus和Cashel，2008年)。
ObgE突变体的核苷酸结合特性与其对持久性的影响之间似乎不存在简单直接的关系。所有测试的突变体对GTP(或GTPγS)的亲和力都降低了，尽管程度不同。然而，GTP结合与持久性表型的诱导之间没有明显的联系。事实上，T193A突变体对GTP的亲和力降低了四倍，而对持久性没有(或非常小的)影响。丧失诱导持久性能力的G166V、D246G、N283I和D286Y突变体，其对GDP和ppGpp的结合亲和力也受到严重影响。相比之下，不影响持久性表型的T193A替代不影响GDP也不影响ppGpp结合。这可能表明ObgE需要结合GDP或ppGpp来诱导持久性。首先，S270I突变体似乎是个例外，因为这个突变体完全丧失了诱导持久性的能力，而对GDP和ppGpp的亲和力分别不受影响或仅降低两倍。然而，S270残基位于离GTP/GDP结合位点相当远的位置，在G结构域的背面。因此，其他影响，如与(迄今未鉴定的)效应蛋白的相互作用受到干扰，可能在S270I突变体持久性表型的丧失中起额外作用。事实上，在晶体结构中，S270非常靠近K268(Gkekas等人，2017年)。已发现将后者残基突变为异亮氨酸(K268I)会激活大肠杆菌中的程序性细胞死亡途径，可能是通过影响与效应分子的相互作用(Dewachter等人，2015年；2016年；2017b年)。总之，我们的结合研究使我们能够谨慎推测，ObgE结合GDP或ppGpp的能力与其持久性表型相关，但其他因素肯定也起作用，如S270I突变体所示。尽管我们发现随机筛选中鉴定的所有突变体的GTP水解速率都受到影响，但GTP酶活性与持久性诱导之间似乎也没有明显的联系，因为合理设计的T193A突变体诱导持久性的能力仅受到非常轻微的影响，而其GTP酶活性降低到检测不到的水平。
有趣的是，我们在本研究中鉴定出的六个在其持续存在表型上受到影响的点突变体仍具有完全的活力，这表明ObgE在持续存在中的作用可以与其基本功能分离。这因此证实了ObgE可能在细菌生理学中发挥几种不同的功能。此外，我们发现其中三个突变体(G166V、N283I和D286Y)在ITC中测试的最高浓度(约150 μM)下对任何核苷酸的结合都完全受损，而在高达 的GTP浓度下未观察到GTP水解。这一观察结果可以有不同的解释。第一个非常有趣的可能性是，ObgE以不依赖核苷酸的方式发挥其基本功能，或者使用与无核苷酸蛋白相似的构象。或者，在细胞中的高GTP浓度(约1 - 1.5 mM)下，一小部分结合GTP的突变型ObgE可能仍然存在，这足以维持活力(Buckstein等人，2008年；Varik等人，2017年)。
总之，本研究为ObgE诱导持续存在的机制提供了新的见解。我们发现ObgE的持续存在表型可以与其基本细胞功能分离。在诱导持续存在的能力与GTP水解或与核糖体的刺激/结合之间未观察到明确的联系。然而，我们的数据表明，GDP或ppGpp结合是ObgE激活hokB表达所必需的，但并不足以最终导致持续存在。
实验步骤
细菌菌株和生长条件
在大多数实验中，大肠杆菌TOP10(Invitrogen)用作亲本菌株。为了评估不同obgE等位基因表达后的活力，使用了大肠杆菌GN5003(Kobayashi等人，2001年)和大肠杆菌BW25113(Baba等人，2006年)。大肠杆菌Rosetta (DE3) pLysS用于纯化过表达的ObgE蛋白。细胞在溶原肉汤(LB)培养基或固化培养基(1.5%琼脂)中于 (TOP10、BW25113)、 (GN5003)或 (Rosetta)下培养。培养基添加剂按以下浓度添加:氨苄青霉素为 ，氯霉素为 ，卡那霉素为 以及四环素为 。obgE基因敲除菌株总是在0.2%阿拉伯糖存在下生长。
obgE基因敲除菌株的构建
如所述(Datsenko和Wanner)，通过 Red介导的基因替换，在携带pBAD/His A - obgE的 大肠杆菌BW25113中删除了obgE的内源拷贝。
2019年约翰威立父子有限公司版权所有，《分子微生物学》，0, 1 - 16(2000年)，使用补充表S2中列出的引物。通过PCR验证了卡那霉素抗性盒 成功取代了obgE。使用P1噬菌体转导将obgE::Km 的基因组区域转移到从pBAD/His A表达突变obgE等位基因的BW25113受体菌株中。简而言之，通过将BW25113 obgE::Km pBAD/His A - obgE的过夜培养物在补充有0.2%葡萄糖和5 mM CaCl 的 LB培养基中100倍稀释来制备裂解物。该样品在 下孵育 。随后，加入不同量的P1裂解物 ，样品孵育2 - 3小时直至发生裂解。选择含有最少量 的样品，加入 氯仿并涡旋。收集上清液并在 下以 离心。上清液再次暴露于 氯仿并涡旋。最后，裂解物储存在 。对于转导，受体菌株的过夜培养物以12000 rpm离心1分钟。沉淀溶解在补充有0.2%阿拉伯糖、5 mM CaCl2和1 mM MgSO 的 LB中。加入不同体积的供体裂解物 ，样品在 下(不振荡)孵育 。接下来，加入 LB培养基和 的 - 柠檬酸盐，样品(振荡)孵育 。最后，将样品接种在补充有0.2%阿拉伯糖和5 - 20 mM Na + - 柠檬酸盐的选择性培养基上。
通过易错PCR构建突变文库
使用GeneMorph II随机诱变试剂盒(Stratagene)进行易错PCR，引物列于补充表S2中，以pBAD/His A - obgE - venus(Verstraeten等人，2015年)作为模板DNA。诱变靶向ObgE的248个C末端密码子，覆盖完整的GTP结合和C末端结构域。实际考虑使我们排除了N末端结构域。使用100 ng起始DNA材料并完成30个扩增循环，实现了每kb 4.5至9个核苷酸替换的所需中间突变频率。文库中的菌株数量是根据ObgE的GTP结合和C末端结构域内每个氨基酸至少突变一次 的概率计算的。这个数字是从每个位置氨基酸替换的机会推导出来的，假设在整个突变区域这个机会是相等的。使用估计易错PCR文库中氨基酸多样性的PEDEL - AA算法(Patrick等人，2003年)，根据突变区域的核苷酸序列、所有可能的转换和颠换率以及产生终止密码子、插入或缺失的机会来计算这种突变机会。这些特征是试剂盒中提供的易错聚合酶混合物所固有的。
将突变的PCR产物用SacII和Xbal进行酶切，并克隆到pBAD/His A-obgE-venus载体中。单独表达Venus或与ObgE偶联表达对预期的持续存在表型均无影响(数据未显示)。构建体被导入大肠杆菌TOP10，并在氨苄青霉素和氨苄青霉素+阿拉伯糖上进行平行筛选。通过监测ObgE-Venus融合蛋白的荧光来排除文库中发生插入、缺失或引入终止密码子的突变体。最终文库由600个突变菌株组成。突变体保存在50%甘油中于 。
持续存在测定
为了进行筛选，将菌株在补充有氨苄青霉素的 LB培养基中于96孔板中培养。过夜培养后，将培养物在补充有氨苄青霉素和0.2%阿拉伯糖的新鲜LB培养基中稀释100倍。培养物再次在200 rpm振荡下过夜培养。将每种培养物的两倍 转移到一个新的96孔板中。在第一个板中，向每个孔中加入 无菌水以进行对照处理。在第二个板中，加入 终浓度为 的氧氟沙星溶液。然后将两个96孔板在 下培养，以200 rpm振荡 。接下来，将每种培养物进行10倍系列稀释并点样到LB平板上。每个实验中都包括持续存在表型的阳性和阴性对照。在 下培养 后，测定CFU的数量。
对于选定的突变体，按照先前描述的方法(De Groote等人，2009年)进行了更定量的持续存在测定。简要地说，过夜培养物在含有补充有氨苄青霉素和0.2%阿拉伯糖的 LB培养基的 烧瓶中稀释100倍，并在 下振荡培养 。将约 的培养物用 的氧氟沙星(终浓度为 )处理。用无菌水进行对照处理。处理在200 rpm振荡下进行5小时，之后通过平板计数测定CFU的数量。将处理后的样品和对照样品的CFU测量值进行比较以确定存活率。对持续存在菌比例的潜在差异进行了统计学验证。每个比较研究使用经典的Fisher F检验检查对数持续存在菌比例的方差是否存在显著差异。如果检测到这种差异，则应用Welch均值检验，否则，使用合并方差估计的t检验。此外，还验证了对数持续存在菌比例的正态性。图1中绘制的数据表示平均相对持续存在菌比例，其定义为感兴趣菌株的持续存在菌比例与携带空载体的阴性对照菌株的持续存在菌比例之比。
位点特异性单氨基酸突变体的构建
为了进行持续存在测定，使用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene)并以pBAD/His A-obgE为模板引入位点特异性突变(Verstraeten等人，2015年)。用于创建位点特异性突变的引物列于补充表S2中。分别通过将随机产生的突变体RM8、RM4和RM10的Xhol-BgIII片段克隆到pBAD/His A-obgE中，构建了含有N283I、I313N或S314P取代的单个大肠杆菌突变体。分别通过用Xhol和Alel消化RM3和RM17构建体并将片段克隆到pBAD/His A-obgE中，引入了L154P和V162D取代。使用Sanger测序验证单个突变的存在，并通过使用抗His 抗体的western印迹法评估在0.2%阿拉伯糖过夜诱导后突变蛋白的表达。
测量hokB表达
在 启动子控制下，将hokB与RFP(mCherry)进行转录融合，以此作为hokB表达的一种衡量方式。pACYC184 - - hokB - RFP质粒的构建方法先前已有描述(Verstraeten等人，2015年)。将从 启动子表达obgE(野生型和选定突变等位基因)的pBAD/His A质粒导入该菌株。培养物在含有 阿拉伯糖的 LB培养基中于 过夜培养。使用基于Synergy Mx单色仪的多模式微孔板读数器(BioTek)评估红色荧光。
蛋白质表达与纯化
为进行过表达，如先前所述(Verstraeten等人，2015年)，使用Ndel和HindlII位点将obgE开放阅读框克隆到pET - 28(+)载体(Novagen)中。使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene)，利用补充表S2中列出的引物引入ObgE点突变。ObgE蛋白在 大肠杆菌菌株Rosetta (DE3) pLysS细胞中作为N端带有His标签的蛋白表达，通过 - NTA亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化，并如先前所述(Gkekas等人，2017年)使其不含核苷酸。含有纯化ObgE的组分进行浓缩，在液氮中快速冷冻并储存在 。所有后续实验均从这些不含核苷酸的ObgE批次开始。
70S核糖体的纯化
70S核糖体的纯化如前所述(Gkekas等人，2017年)进行。将纯化的核糖体重悬于含有 Tris 7.5、10 mM 和 - 巯基乙醇的 缓冲液中。核糖体浓度根据以下公式计算: 。核糖体在液氮中快速冷冻并储存在 ，直至进一步实验。
TSA分析
通过热迁移分析获得不同ObgE突变体的热稳定性(解链温度: )。基于SYPRO橙色荧光，使用CFX connect实时PCR系统(Bio - Rad)检测热解折叠。将约0.5 mg 的蛋白质与5x SYPRO橙色蛋白质凝胶染色剂(赛默飞世尔科技)混合，温度以 步长从 升至 。所有测量均重复三次。使用GraphPad Prism通过Boltzmann S形方程拟合数据的一阶导数来确定解链温度。
圆二色光谱法
使用配备 PTC 423S 珀尔帖元件的 Jasco J-715 圆二色光谱仪记录 ObgE 的远紫外圆二色(CD)光谱。蛋白质浓度为 ，缓冲液为 Tris pH 7.5、 NaCl、5 mM MgCl 和 1 mM TCEP。蛋白质的远紫外 CD 光谱在 1 mm 光程的石英比色皿中记录，波长范围为 260 nm 至 200 nm，扫描速度为 ，响应时间为 1 秒，光谱带宽为 。最终的 CD 光谱是在 下累积扫描 15 次的结果。根据 Bertoldo 等人(2011 年)的方法计算摩尔椭圆率 。基于 CD 光谱的二级结构含量使用 BeStSel 网络服务器(Micsonai 等人，2015 年)得出。
等温滴定量热法
使用 MicroCal iTC200(GE Healthcare)或 Nano ITC(TA Instruments)系统在 下进行等温滴定量热法(ITC)实验，缓冲液由 20 mM Hepes pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM MgCl 和 1 mM β-巯基乙醇组成。对于 ObgE 与 GDP(Sigma)、GTPγS(Jena Bioscience)、ppGpp(TriLink Biotechnologies)和 pppGpp(Jena Bioscience)的结合亲和力测量，根据亲和力不同，细胞中蛋白质浓度在 和 之间，注射器中配体浓度在 和 之间。为了获得平衡结合解离常数 和结合化学计量数 ，使用 ITC 仪器附带的 Origin 软件提供的标准 Marquardt 非线性回归方法将所得数据拟合到单结合位点模型。
荧光停流动力学
使用停流装置(SX18.MV；Applied Photophysics)，将浓度范围为 2 - 16 μM 的 ObgE 与 的 - O -(N - 甲基蒽基)- 标记核苷酸(mant - GDP/mant - GTP；Jena Bioscience)快速混合，提供伪一级结合动力学条件。mant 核苷酸在 处激发，通过 截止滤光片监测荧光变化。对于每个蛋白质浓度，将所得数据拟合到单指数函数，得到观察速率常数 。结合速率常数 从绘制 与蛋白质浓度的线性拟合斜率获得，解离速率常数 从截距获得。解离速率常数还通过将 的蛋白质与 的 mant 核苷酸和 的未标记核苷酸混合并拟合到单指数函数获得。 值根据 与 的比值计算。实验在 下于 Hepes pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM MgCl 和 2 mM DTT 中进行。
GTP 水解测定
使用连接到高效液相色谱系统(沃特世)的C18反相柱，随时间监测由ObgE催化的GTP水解，随后分离核苷酸(GDP和GTP)。在 条件下，于由 Hepes(pH 7.5)、150 mM NaCl、5 mM 和 DTT组成的缓冲液中进行测量。将约 的ObgE与2.5至 的不同GTP浓度一起孵育。在几个时间点取样，并通过在 加热5分钟来终止反应。离心后，将上清液加载到C18反相柱(朱庇特， )上，使用含有 、10 mM四丁基溴化铵和7.5%乙腈的缓冲液洗脱核苷酸。使用254 nm处的吸光度检测核苷酸。根据已知GDP浓度得出的标准曲线，从峰面积计算样品中的GDP浓度。初始速率作为[GDP]对时间图的斜率获得，并拟合到米氏方程。如前所述(Gkekas等人，2017年)，通过在 将增加量的70S核糖体与ObgE预孵育，确定70S核糖体对ObgE GTP酶活性的影响。
致谢
我们要感谢Cedric Govaerts和Maud Sigoillot允许使用纳米等温滴定量热仪并提供帮助。这项工作得到了弗拉芒研究基金会(FWO)的资助(J. Michiels和W. Versées获得资助G047112N；J. Michiels获得资助G0B2515N和G055517N)；布鲁塞尔自由大学的一项战略研究计划(W. Versées获得资助SRP34)；比利时科学政策办公室发起的大学间吸引力极点计划(J. Michiels获得资助P7/28)；鲁汶大学授予J. Michiels的C1资助(C16/17/006)；大力神基金会以及欧洲共同体第七框架计划的BioStruct-X。Sotirios Gkekas、Cyrielle I. Kint和Wouter Knapen获得了弗拉芒科学技术创新促进研究所(IWT)的奖学金。Babette Deckers、Bram Van den Bergh、Pauline Herpels、Elen Louwagie和Liselot Dewachter获得了弗拉芒研究基金会(FWO)的奖学金。资助者在研究设计、数据收集和解释或提交发表的决定中没有任何作用。我们声明没有利益冲突。
作者贡献
NV构思了这项研究，分析了数据并撰写了手稿。SG和CIK设计并进行了实验，分析了数据并撰写了手稿。BD、BVdB、PH、EL、WK、DW和LD进行了实验并分析了数据。MF和JM构思了这项研究，设计了实验，讨论了结果并编辑了手稿。RKS进行了实验，分析了数据，讨论了结果并编辑了手稿。WV构思了这项研究，设计了实验，讨论了结果并撰写了手稿。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可在合理请求时从相应作者处获得。
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