细菌翻译中从起始到延伸的定向转变
发布时间：
2026-03-15 20:43
细菌翻译中从起始到延伸的定向转变
阿坎莎·戈亚尔、里卡多·贝拉尔迪内利、克里斯蒂娜·马拉奇、波尔·米隆和玛丽娜·V·罗德尼娜
德国哥廷根马克斯·普朗克生物物理化学研究所物理生物化学系，邮编37077
2015年7月10日收到；2015年8月14日修订；2015年8月18日接受
摘要
50S亚基加入后，30S起始复合物(IC)向正在翻译的70S核糖体的转变为细菌翻译过程中的mRNA选择提供了一个重要的检查点。在这里，我们使用荧光标记的翻译组件工具箱，通过快速动力学技术研究了70S IC形成过程中发生的反应的时间和控制。我们提出了一个动力学模型，该模型基于在增加50S亚基浓度的情况下，用八种不同报告分子获得的数据进行全局拟合。IF1和IF3共同影响亚基结合的动力学，但不改变70S IC成熟后续步骤的基本速率。50S亚基加入后，依赖IF2的反应独立于IF1或IF3的存在而发生。GTP水解触发fMet-tRNA 从IF2上有效解离，并促进IF2和IF1从70S IC上解离，但不影响IF3。不可水解的GTP类似物使平衡向稳定的70S-mRNA-IF1-IF2-fMet-tRNAfMet复合物移动。我们的动力学分析揭示了翻译起始后期的分子编排。
引言
蛋白质合成的起始通过将起始tRNA(fMet-tRNA )定位在核糖体P位点的起始密码子上，确立了mRNA的阅读框。在细菌中，起始由三种起始因子(IF1、IF2和IF3)促进，包括三个主要阶段(1 - 7)。首先，起始因子、fMet-tRNA 和mRNA被招募到小核糖体亚基(30S)上，形成30S预起始复合物(30S PIC)。在下一阶段，fMet-tRNAfMet的反密码子识别 亚基 位点的mRNA起始密码子，导致30S起始复合物(30S IC)的形成。最后，大核糖体亚基(�0S)与30S IC结合，IF2将GTP水解为GDP和无机磷酸(Pi)，起始因子被释放，fMet-tRNAfMet容纳在肽基转移酶中心的P位点，准备参与第一个肽键的形成。30S IC的形成及其向70S延伸复合物(70SEC)的成熟为mRNA和tRNA选择提供了多个动力学检查点，这些检查点决定了细胞中mRNA翻译的频率(6)。
这些因子以协同方式结合到30S亚基上，即它们影响彼此在复合物中的结合亲和力。IF1增加IF2和IF3对30S亚基的亲和力，反过来，IF1通过它们的存在而稳定在30S上(8 - 13)。IF3变构控制IF2与30S IC的相互作用(14,15)，并与IF1一起使IF2稳定在复合物上。反之，IF2的存在也使IF3与30S亚基的结合稳定(13)。fMet-tRNA 与30S亚基的对接通过与IF2的C2结构域的特异性相互作用发生(16 - 18)，随后是起始密码子识别。这导致30S IC的形成，其中mRNA、fMet-tRNA 、IF1和IF2与30S亚基的结合进一步加强，而IF3的结合不稳定(13)。
30S起始复合物转化为70S起始复合物是一个多步骤过程(图1)(参考文献19 - 23)。IF2和fMet - tRNAfMet对30S起始复合物的协同定位作用驱动亚基快速结合(参考文献14,24 - 26)。IF1和IF3影响50S亚基对接动力学的一种方式是调节IF2 - GTP - fMet - tRNAfMet复合物在30S起始复合物上的方向和动力学(参考文献15,26,27)。此外，IF3在空间上阻碍亚基间桥的形成(参考文献27,28)，从而减缓50S亚基的对接。IF1和IF3共同作用，通过诱导30S起始复合物形成一种阻碍50S亚基结合的构象，帮助区分错误形成的30S起始复合物，例如那些由含有非最佳翻译起始区域(TIR)的mRNA编程或缺乏IF2或fMet - tRNA 的复合物(参考文献21,24,29 - 31)。
基于生化、快速动力学和单分子荧光共振能量转移(FRET)研究的当前70S起始复合物形成模型表明，50S亚基的结合触发IF2快速水解GTP，导致一系列核糖体和IF2构象变化以及fMet - tRNA 移动(参考文献19,20,23,32 - 34)。fMet - tRNA 从IF2的C2结构域释放到经典的 位点 ，亚基相互旋转进入经典状态，使核糖体进入具备延伸能力的构象(参考文献,22)。最后，IF2可能从70S复合物解离(参考文献33 - 37)，使得与EF - Tu和GTP形成三元复合物(TC)的氨酰 - tRNA能够结合到A位点并形成第一个肽键。如快速动力学(参考文献21)、化学探针(参考文献38)和单分子FRET(参考文献15,39)所示，IF3从核糖体的解离也发生在亚基结合之后。
*通信作者联系方式:电话:+49 551 201 2900；传真:+49 551 2905；邮箱:rodnina@mpibpc.mpg.de
现地址:Pohl Milón，医学院，健康科学学院，秘鲁应用科学大学 - UPC，利马，L - 33，秘鲁。
图1. 细菌翻译起始后期事件示意图。IF1、IF·2 - GTP、IF3、mRNA和fMet - tRNAfMet结合到30S亚基上形成30S起始复合物。阶段1:50S亚基与30S起始复合物结合触发IF2快速水解GTP并形成70S起始前复合物(70S PIC)。阶段2:IF1、IF2和IF3从核糖体解离，形成准备进行延伸的70S起始复合物。阶段3:EF - Tu - GTP - 氨酰 - tRNA(三元复合物，TC)与70S起始复合物结合，随后形成肽键，产生70S延伸复合物(70S EC)。
在从30S起始复合物(IC)转变为70S起始复合物的过程中，IF1、IF2和IF3之间的相互作用还知之甚少。诸如IF1从70S复合物上解离、甲酰甲硫氨酰 - tRNAfMet与IF2的C2结构域之间直接相互作用的丧失以及GDP从IF2上解离等反应，尚未被直接监测到。先前的研究表明，IF1和IF2在30S起始复合物上相互作用(13,27,40,41)，并且可能会影响彼此从核糖体上的释放。已经使用位于tRNA 肘部区域的荧光报告分子(Prf20)研究了甲酰甲硫氨酰 - tRNA 的运动(20,23)，但尚不确定Prf20的荧光变化是否代表tRNA{{F}}从IF2上解离、3′ CCA末端在50S P位点的容纳，或者是其他一些重排。最后，使用不同的不可水解GTP类似物研究IF2在起始过程中GTP水解的作用存在争议，因为实验结果似乎取决于所使用的类似物以及起始组分的来源——大肠杆菌或嗜热栖热放线菌(20,23,33,34,36)。在这里，我们使用来自大肠杆菌的翻译起始组分同源系统(42)和一套新型荧光报告分子工具盒来研究翻译起始的后期事件。结果提供了一个70S起始复合物成熟为延伸的70S复合物的全面动力学方案，包括IF1和IF2解离的时间和控制。我们的结果深入了解了起始因子之间的相互作用，并强调了IF2和GTP水解在翻译起始过程中的作用。
材料与方法
组分的制备
核糖体亚基通过区带离心法从大肠杆菌MRE600纯化的70S核糖体中制备(42,43)。30S亚基在缓冲液A(50 mM Tris-HCl [pH 7.5]，70 mM )中，添加额外的 ，在 下反应 后重新激活。EF-Tu、IF1和IF3按照所述方法制备(42,44)。IF2及其截短突变体(ΔN(缺少1 - 294位残基)和 (缺少792 - 890位残基))通过镍-氮三乙酸亲和层析法制备。甲酰甲硫氨酰 - tRNA 通过高效液相色谱法纯化(42)，其氨酰化和甲酰化率为95%。022 mRNA(42)通过T7 RNA聚合酶转录制备。鸟苷三磷酸(GTP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷 - 5’-O-(3-硫代三磷酸)-γ-硫代鸟苷(GTPγS)、鸟苷 - 5’-O-(3-硫代三磷酸)-亚氨基鸟苷(GDPNP)、mant - GTP ( -甲基-邻氨基苯甲酰基)-鸟苷 - 三磷酸，三乙铵盐)和mant - GTPγS(2 - -( -甲基-邻氨基苯甲酰基)-鸟苷 - -( -硫代)-三磷酸，三乙铵盐)购自耶拿生物科学公司；Bpy - GTP(鸟苷 -三磷酸，BODIPY FL -(或 - )- -( -(2 - 氨基乙基)氨基甲酸酯)，三钠盐)和Bpy - GDP(鸟苷-5’-二磷酸，BODIPY FL -(或 - )- -( -(2 - 氨基乙基)氨基甲酸酯)，双(三乙铵)盐)购自赛默飞世尔科技公司。
按照已发表的方案(13,21,42)，用硫醇反应性染料(Alexa(Alx)555和Atto540Q马来酰亚胺)对单半胱氨酸突变体IF1进行荧光标记。按照所述方法(45,46)，通过用荧光标记的S13112(Alx488)重构30SΔS13来制备 (Alx488)亚基。按照所述方法对 . 大肠杆菌磷酸结合蛋白(PBP；(47))和甲硫氨酰 - tRNAfMet(48,49)进行荧光标记。通过SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳和分光光度分析评估的标记效率为 。
生化方法
30S起始复合物(0.1 - 0.3μM)通过在缓冲液A中孵育30S亚基与3倍过量的IF2、IF3和IF1(或2倍过量的标记IF1)，以及5倍过量的mRNA和f (或3倍过量的Bpy - Met - tRNA )形成，缓冲液A中含有0.25 mM GTP(或 Bpy - GTP / 10 mant - GTP)，在 下孵育 。三元复合物EF - Tu - GTP - Phe - tRNA 通过在磷酸烯醇丙酮酸 和丙酮酸激酶 存在下，将EF - Tu(1.6 )与Phe - tRNA 和GTP(0.25 mM)孵育 ，在 下制备。
纯化的带有Bpy - Met - tRNA 的70S起始复合物通过在起始因子 、Bpy - - tRNA 和GTP 存在下，在 孵育70S核糖体 制备。将反应混合物的 铺在缓冲液A中1.1 M蔗糖的 上。复合物在贝克曼库尔特超速离心机的转子TLS - 55中以55000 rpm离心4小时。沉淀溶解在缓冲液A中。通过测量 处的吸光度和Bpy - Met - tRNA 的放射性来检查核糖体的浓度和70S起始复合物形成的效率。
动力学实验
所有测量均在缓冲液A中于 进行。使用SX - 20MV停流装置(英国莱瑟黑德应用光物理公司)进行停流测量，通过快速混合等体积(60 每管)的30S IC(最终浓度0.05 - 0.15 M)和以递增浓度(0 - 2 )添加的50S亚基。所有实验均在准一级条件下进行，即50S亚基相对于30S IC至少过量3倍。增加50S浓度时未观察到明显的幅度依赖性，因此对时间进程进行幅度变化归一化，以便于时间进程的视觉比较(图2)。在不存在IF1和IF3的实验中，在增加的50S浓度(0.15 - 0.5 μM)下测量光散射(LS)(见下文)，但所有其他实验均在固定浓度的50S亚基 下进行。使用GTP 的实验在 亚基下进行。
LS和IF3解离如前所述(21)进行测量。为测量LS，激发波长设置为434 ，且在不使用滤光片的情况下以与入射光束成 角度测量散射光。Alx555的直接激发波长为 ，输出在通过截止滤光片KV590(肖特)后进行监测。Bpy和Alx488的直接激发波长为 ，输出在通过KV500截止滤光片后进行监测。在存在GTP 的情况下，使用荧光MDCC - PBP蛋白(2 μM)和Pi - MOP混合物(0.1 U/ml PNPase和200 µM 7 - 甲基鸟苷)(47)监测Pi释放。MDCC的直接激发波长为 ，输出在通过KV450截止滤光片后进行监测。IF2的内在Trp残基与mant - GTP之间的FRET通过在 激发时mant发射通过KV408截止滤光片进行监测。在淬灭流动装置(KinTek)中测量二肽形成，并通过HPLC和液体闪烁计数确定 Met - Phe二肽形成的程度。通过在停流装置中快速混合Bpy - GTP或Bpy - GDP 与游离IF2 或与在不存在任何核苷酸的情况下形成的与 IC 结合的IF2，监测Bpy - GTP和Bpy - GDP与IF2的结合。
通过将在Bpy-Met-tRNA 和GTP(12.5μM)存在下形成的30S IC(0.05 )与50S亚基(0.25μM)、IF2(4 )和GTP 快速混合，来测量IF2从70S IC的释放以及随后与70S IC的重新结合。通过将在不存在IF3但存在IF1 和GTP 的情况下形成的 与 亚基 和GTP 快速混合，来测量IF1从70S IC的释放以及与70S IC的重新结合。
通过将纯化的70S IC(含有Bpy-Met-tRNAfMet)(10 nM)与结合到不同GTP类似物 上的IF2 快速混合，来测量IF2与70S IC的结合。为了测量 与 的结合，从 亚基和GTP(12.5 )制备复合物。未纯化的 IC在停流装置中与 和 快速混合。
图2. 70S IC成熟过程中的反应时间进程。在存在指示的荧光标记起始成分的情况下形成的30S IC，在停流(A - G)或淬灭流(H)仪器中与浓度不断增加的50S亚基快速混合。(A)50S亚基加入的时间进程。(B)GTP酶激活和IF2释放的时间进程。(C)GDP解离的时间进程。(D)Pi从IF2释放的时间进程。(E)tRNAfMet从IF2释放到核糖体P位点的时间进程。(F)70S IC上IF1环境变化的时间进程。(G)IF1解离的时间进程。(H)第一个fMet - Phe肽键形成的时间进程。显示了可观察类型和50S亚基浓度 的变化。这些曲线根据幅度变化进行了归一化。平滑线显示了通过对所有时间进程进行数值积分的全局评估获得的拟合。
动力学建模
使用指数拟合评估了Bpy-GTP和Bpy-GDP与IF2的结合时间进程、Bpy-Met-tRNA 与30S PIC的结合、IF2与含有Bpy-Met-tRNA 的70S IC的结合、IF14(Atto540Q)与 (Alx488)的结合、IF1从30S IC的解离以及IF3从70S IC的解离。使用9步模型通过数值积分对 上的反应时间进程进行了综合评估(见结果)。对于Pi释放以及mant-GTP与IF2之间的FRET，从存在50S亚基时获得的各自时间进程中减去缓冲液对照迹线(在不存在50S亚基的情况下获得)的拟合。对在存在GTP S时显示信号变化的可观测物的时间进程用4步模型进行拟合(A B (LS); B C (mant-GTP S); C D (IF1 (Alx555))以及D E (亚基缓慢结合))。所有计算均使用Prism(Graphpad软件)和KinTek Explorer(KinTek公司，美国)进行。标准误差由每个反应7 - 10次技术重复得到的平均时间进程的拟合计算得出。全局拟合的统计数据见补充材料。
结果
可观测物与步骤分配
使用从大肠杆菌中纯化的起始组分制备30S IC。作为模型mRNA，我们选择了m022，因为用这种mRNA形成的30S IC允许快速亚基结合(20,21)，这对于解析后续反应的各个速率至关重要。为了监测从30S IC到70S IC的转变，我们通过将预先形成的30S IC与50S亚基快速混合来启动反应。在50S亚基结合后发生的几个过程的时间安排是使用荧光标记的组分，根据荧光强度或Förster共振能量转移(FRET)随时间的变化来确定的(图2)。我们利用新的可观测物来追踪IF1从70S复合物的解离动力学，以及IF2依赖性反应，如fMet-tRNAfMet CCA末端的解离和IF2的GDP释放。我们还监测了先前报道的反应，如亚基结合、IF2的Pi释放和肽键形成(19 - 21,50)，以构建一个包括所有反应的综合动力学模型。
通过测量亚基结合、监测光散射(LS)来评估每个荧光组分在促进IC形成中的活性。在每种情况下，亚基缔合的动力学均未受影响(补充图S1A)，表明标记并未明显改变30S IC 的功能特性。为了确定各个步骤的顺序和时间，最初通过指数拟合对时间进程进行评估。在可能的情况下，根据表观速率常数(表1)确定事件顺序。作为第二个标准，根据各个反应之前延迟阶段的长度来评估顺序(补充图S2)。随后，使用所有报告分子的组合数据集通过数值积分获得基本反应的速率常数(表2)。
50S亚基与30S IC的缔合(图2A)(21)导致LS的双相变化，其中主要的(>总振幅变化的65%)快速相表明 与以“有活性”构象存在的大多数 IC结合，而次要相可能代表一小部分活性较低(51)或组成异质的复合物。通过指数拟合对LS动力学进行了初步评估，结果表明主要步骤的表观速率常数 随 亚基浓度 线性增加；表1)(补充图S1B)，表明是双分子缔合步骤，与先前报道一致(20,21)。
图3. GTP水解对70S起始复合物成熟动力学的影响。在停流(A - E)或淬灭流(F)装置中，将30S起始复合物与50S亚基 快速混合，并在存在GTP(黑色)或GTP S(绿色)的情况下监测所示反应的时间进程。 中的插图显示了肽键形成的延长时间窗口。平滑线(A - E)显示了通过使用数值积分对所有时间进程进行全局评估获得的拟合结果。
接下来，我们试图研究与IF2相关的反应。使用荧光GTP类似物mant - GTP和Bodipy(Bpy) - GTP监测GTP与IF2的G结构域之间的相互作用。我们跟踪了mant - GTP与该因子的内在色氨酸残基(52,53)之间的荧光共振能量转移。先前报道的mant - GTP与IF2结合和解离的动力学表明，IF2对mant - GTP的亲和力与对非荧光GTP的亲和力在相同范围内(52,54)。当50S与用mant - GTP形成的30S起始复合物结合时，观察到双相荧光共振能量转移变化(图2B)。两个阶段的表观速率常数均显示出对50S浓度增加的双曲线依赖性(补充图S1C)，并在 和2.5 时达到饱和(表1)，这表明这两个反应代表了IF2的重排，其跟随双分子亚基结合步骤。当mant - GTP被不可水解的类似物mant - GTPγS取代时，第一步不受影响(图3B)，这表明IF2 G结构域的相应重排在该因子的预水解状态下发生。然而，第二步对GTP水解有很强的依赖性，并且在存在GTPγS的情况下被消除。与用EF - Tu获得的类似结果一致(55 - 57)，我们将第一个向上阶段归因于GTPase激活，第二个向下阶段归因于IF2从70S复合物解离，尽管我们不能排除第二个阶段可能代表核苷酸从IF2释放或该因子从核糖体解离时的构象重排。
表1. 70S起始复合物成熟过程中反应的表观速率常数总结
| 动力学步骤 | 可观测的 | 所有起始因子结合GTP | -起始因子1结合GTP | -起始因子3结合GTP | 所有起始因子结合GTP |
| 亚基结合， | 长片段(>65%) | 未检测到 | |||
| GTP酶激活 | Mant-GTP | 7.4 ± 0.5 | |||
| 起始因子1环境变化 | 起始因子1(4(A1x555) (>80%) | 无 | 3.7 ± 0.5 | ||
| 起始因子1解离 | 起始因子1(4(Atto540Q) - 30S核糖体小亚基13(Alx4x88) (>60%) | 无 | 无 | ||
| 起始因子2解离 | Mant-GTP | 2.8 ± 0.1 | 无 | ||
| 起始因子3解离 | 起始因子3 甲酰甲硫氨酰 - tRNAfMet(荧光素) | 无 |
所有速率均来自时间进程的指数拟合。在双指数拟合的情况下，相关阶段的幅度贡献以括号形式表示为总幅度变化的百分比。对于mant-GTP，荧光变化有一个上升阶段(GTP酶激活)和一个下降阶段(IF2解离)，因此未标明幅度贡献。数值表示为平均值 标准误；n.d. - 未确定；n.o. - 未观察到。另见补充图S1。
对于由所有IF和GTP形成的30S IC，针对每个可观测值，在五到六个不同的50S亚基浓度下测量时间进程。
对于-IF1和-IF3，在不同的50S浓度下监测LS。对于其余每个可观测值，在1 μM 50S亚基浓度下获得单个时间进程。
对于GTP ，在 亚基浓度下针对每个可观测值获得单个时间进程。
单指数拟合。
表2. 70S IC成熟过程中反应的基本速率常数总结
| 动力学步骤 | 可观测的 | 所有起始因子结合鸟苷三磷酸 | -起始因子1结合鸟苷二磷酸 | -起始因子3结合鸟苷二磷酸 | 所有起始因子结合鸟苷 |
| 结合， | 大亚基 | ||||
| 50S亚基解离， | 大亚基 | ||||
| 鸟苷三磷酸酶激活， | Mant-鸟苷三磷酸 | ||||
| 起始因子1环境变化， | 起始因子14(Alx555) | 无 | |||
| 无机磷酸释放， | 无机磷酸-磷结合蛋白(MDCC) | 无 | |||
| 甲酰甲硫氨酰-tRNA 从起始因子2释放， | Bpy-甲硫氨酰-tRNAfMet | 无 | |||
| 起始因子2和鸟苷二磷酸释放， | Mant-鸟苷三磷酸和Bpy-鸟苷三磷酸 | 作为 和 | 作为 和 | 无 | |
| 起始因子1解离， | 起始因子1(Atto540Q)- 30S1S1(Alx488) | 无 | 7±1 | 无 | |
| 肽键形成， | 甲酰甲硫氨酰-苯丙氨酸 | 2.3 ± 0.8 | 无 |
所有速率均通过数值积分对集体时间进程进行全局拟合得出。通过全局拟合得出的值表示为平均值±标准误；未观察到(n.o.)。
对于由所有起始因子(IFs)和GTP形成的30S起始复合物(ICs)而言，针对每个可观测值，在五到六个不同的50S亚基浓度下测量时间进程。
对于-IF1和-IF3，将与核糖体小亚基(LS)结合的浓度依赖性与针对其余每个可观测值的单个时间进程(在1μM 50S亚基浓度下获得)相结合。
由于用GTP或GTPγS获得的核糖体小亚基(LS)速率之间没有差异(图3A)，因此将与GTP结合的核糖体小亚基(LS)的浓度依赖性与针对mant-GTP 和起始因子(IF) 的单个时间进程(在 亚基浓度下获得)相结合。
GTP酶激活的动力学与50S亚基的加入无法区分。
当使用Bpy-GTP形成30S起始复合物(IC)时，在50S亚基加入后的 延迟期后，Bpy荧光下降(图2C)。为了确定荧光变化的原因，我们监测了Bpy-GTP和Bpy-GDP与游离或与30S结合的起始因子2(IF2)的相互作用(补充图S3)。Bpy-GTP或Bpy-GDP与IF2结合时荧光增加(补充图S3A - C)，以及用非荧光GTP追踪时荧光下降(补充图S3D)，其幅度与在70S起始复合物(IC)形成过程中观察到的荧光变化相当。基于这些结果，我们得出结论，在70S起始复合物(IC)形成时观察到的Bpy - 核苷酸荧光下降反映了Bpy - GTP水解后Bpy - GDP从IF2的释放。因为在Bpy - GTP水解后反应中Bpy - GDP的最终浓度由 起始复合物(IC) 的浓度决定，该浓度比GDP与游离IF2结合的 至少低10倍( 1 - 2μM(58))，预计Bpy - GDP会自发地从IF2上解离。
为了监测GTP水解后起始因子2(IF2)释放无机磷酸(Pi)的情况，我们使用了一种指示反应，其中磷酸结合蛋白的荧光衍生物MDCC - PBP会迅速结合从IF2释放的Pi。在 延迟后，我们观察到荧光呈双相增加(图2D)(19,47)。导致主要荧光变化的单轮Pi释放之后是一个缓慢步骤，代表随后的GTP水解多轮事件。在没有 亚基的情况下，由于IF2的内在GTP酶活性水平较低(32,59)，未观察到荧光变化。
使用连接到甲硫氨酸氨基的Bodipy-FL标签(Bpy-Met-tRNA )监测了tRNA 末端的动力学(48)。荧光团的位置使我们能够监测Bpy-Met-tRNA 的 CCA末端与IF2的C2结构域之间的相互作用。当Bpy-Met-tRNA 通过IF2被募集到30S PIC时，其荧光增加(补充图S4)。在没有IF2、30S的情况下，或者当使用缺乏C2结构域的IF2截短突变体(IF2ΔC2)时，未观察到荧光变化。当50S对接至30S IC时， 延迟期后荧光下降，我们将其归因于在70S IC形成过程中tRNAfMet从IF2释放(图2E)(33,34)。
尚不清楚依赖IF1的重排时机。为了监测50S亚基结合后IF1的动态变化，我们使用了一种IF1变体，该变体在第4位设计了一个半胱氨酸残基，并用荧光染料Alexa555(IF1 (Alx555))(13,42)或猝灭剂Atto540Q(IF1,4(Atto540Q))进行标记。借助两个报告分子研究了IF1与核糖体的相互作用，监测(i)IF1(Alx555)的荧光变化，以及(ii)附着在30S亚基上核糖体蛋白S13第112位残基上的Alx488(30S1(3lx488))与IF1(4(kto540Q)之间的FRET变化(45,46)。当IF1 (Alx555)与30S IC结合后，用过量的非荧光因子进行追踪时，荧光发生了约15%的下降，下降速率为 (补充图S5A)。从 (Alx488)中追踪 导致荧光增加 ，这是由于IF1解离时两种染料在空间上分离，并且分两步进行——第一步FRET变化较小(约占总幅度变化的20%)，发生速率为 (与IF1(Alx555)的荧光变化速率相似)，第二步 较慢，占FRET信号变化的大部分(补充图S5B)。当将50S亚基与由 IC与 (Alx555)形成的复合物(图2F)或与FRET对IF1 (Atto540Q)和 (Alx488)混合时(图2G)，每种情况下的幅度变化与从30S复合物中追踪该因子时观察到的相应幅度相似(补充图S5A - B)，表明50S亚基的加入促进了该因子从70S复合物中完全解离。通过对两个反应的时间进程进行指数拟合得到的 显示出对50S亚基浓度的双曲线依赖性(补充图S1D)，分别在4.7和1.9 时达到饱和(表1)。这些结果表明，IF1从30S复合物和70S复合物中的解离可能通过两步机制进行，第一步由 的荧光变化报告，第二步由 与IF1(4(Atto540Q)之间的FRET变化报告。
通过监测在存在GTP S的情况下70S IC形成的实验，进一步支持了这两种可观测现象之间的区别(图3D - E):IF1 (Alx555)的荧光变化未受影响，而 (Alx488)与IF1 (Atto540Q)之间的FRET受到很大抑制(见下文)，这表明这两种可观测现象反映了两个不同的反应。由于IF1是一种相对较小、紧密折叠的蛋白质， (Alx555)的荧光强度变化不太可能反映该因子自身的结构重排。相反，荧光变化可能反映了由于复合物的构象重排或建立替代的IF1接触(30)(在下文，我们将此步骤称为“IF1环境变化”)导致报告基团环境的改变。另一方面，IF1 (Atto540Q)与 (Alx488)之间FRET的丧失导致供体荧光增加，这可归因于IF1随后从70S复合物中解离。
最后，为了监测30S IC向具有延伸能力的70S IC的转变，通过淬灭流动法测量二肽形成。将30S IC与50S亚基以及EF - Tu - GTP - Phe - tRNA 快速混合，并随时间监测fMet - Phe的形成(图2H)。
用GTP S替代GTP
通过用不可水解的GTP类似物GTPγS替代GTP，研究了IF2促进不同反应时对GTP水解的需求。最近对IF2的真核同源物eIF5B的研究认为GTP S是一种合适的GTP类似物，因为它能够在活性位点正确配位一价阳离子(60)。对于SelB也得出了类似结论(61)，其中GTPγS被证明是一种真正的GTP类似物。与先前报道一致，在30S复合物上用GTP S替代GTP不影响亚基结合(图3A和表1)(23、36、62、63)。当mant - GTP被mant - GTP S替代时，仅观察到报告GTP酶激活的荧光增加的第一阶段(图3B和表1)。指示IF2解离的第二阶段被阻断，这与先前报道一致，即GTP水解是IF2从70S IC释放所必需的(20、33 - 36)。GTP水解对于tRNAfMet从IF2的C2结构域释放也是必不可少的，因为用GTPγS替代GTP完全消除了该反应(图3C)。
如上所述，用于监测70S IC上IF1动态的两种可观测现象对缺乏GTP水解的反应不同，这表明报告基团反映了两个独立的重排。如IF1 4(Alx555)所报告的，缺乏GTP水解对IF1环境变化没有显著影响(图3D和表1)，但通过IF1 - 30S FRET监测到的IF1从70S复合物的解离在很大程度上被阻止(图3E)。我们通过监测IF3 (Alx555)与荧光素标记的fMet - tRNAfMet之间的FRET来检查IF3解离是否有类似效果(21)，发现IF3的解离完全独立于GTP水解(补充图S6)。
当GTP水解被阻止时，肽键形成受到抑制(图3F)，这表明IF2介导的GTP水解是70S起始复合物向具备延伸能力状态有效转变所必需的。假设70S成熟为具备延伸能力状态受GTPγS水解及随后的IF2解离限制，二肽形成可作为一种指标，用于估算IF2对GTP S的水解速率(0.0015 )(图3F(插图))。
晚期起始事件的时间安排
为了解决动力学机制，在50S亚基浓度增加的情况下监测了每个反应(图2)。我们通过对所有可观测物的时间进程进行全局拟合，确定了基本反应的速率常数，以便为70S IC形成过程提供全面的解决方案。通过比较表观速率常数(表1)、时间进程的延迟阶段(补充图S2A)以及不同反应对GTP水解的依赖性(图3)，我们制定了以下9步模型来评估反应的时间进程:
其中A和R分别指30S起始复合物(IC)和50S亚基，B到J是从30S IC到70S延伸复合物(EC)形成途径中的中间体。亚基结合的动力学由 和 描述。mant-GTP与IF2中的色氨酸残基之间FRET变化的第一阶段(GTPase激活)对应于 转变(速率常数 )，因为——基于指数拟合——它是最快的重排步骤，且与GTP水解无关。 转变归因于IF1环境的变化，该变化与GTP水解无关，主要由IF1 (Alx555)的荧光变化显示(反应幅度的主要部分)。这一步骤在较小程度上(30%)也由IF1 和 之间的FRET描绘，这解释了为什么用GTP S替代GTP仅部分阻碍反应(图3E)。
当GTP水解被阻止时，反应途径的所有后续步骤均受到抑制。后续步骤的顺序是根据其动力学确定的，特别是根据延迟阶段的特征持续时间(补充图S2)。单轮Pi释放对应于步骤 。随后与起始解偶联的多轮GTP水解和Pi释放由一个较晚且非常缓慢的步骤 描述，其速率被赋予固定值 。Bpy-Met-tRNA 从IF2的释放由 给出。IF1和IF2从70S IC解离，以及IF2中GDP的释放 - 分别由IF1 (Atto540Q)和 (Alx488)之间FRET的主要阶段、mant-GTP与IF2之间FRET的第二阶段以及Bpy-GTP的荧光变化报告 - 大约同时发生，并由一个单一步骤 描述。fMet-Phe形成 的最后一步对应于 。
由 描述的一个额外步骤被纳入模型，以解释在反应后期观察到的次要阶段。这一步骤可以用50S缓慢加入错误形成或“无活性”(51)的30S ICs来解释，并且主要在IF3存在的情况下观察到，IF3赋予这些复合物一种抗结合构象。亚基结合后发生的所有反应都被假定为准不可逆反应，这对于(Pi、IF1、IF2、GDP的)释放反应很可能是成立的，并且代表了模型的一种简化，这是合理的，因为70S复合物在正向成熟途径中的不可逆性以及没有任何证据表明存在显著的可逆步骤。用替代模型拟合数据，即具有更多步骤或不同事件顺序的模型，没有得到令人满意的解决方案。元素速率常数总结在表2中，拟合的总体统计数据以及每个步骤对每个可观测值的总荧光/FRET变化的贡献在补充图S7中给出。
图4. 70S IC上起始因子之间的相互作用。含有所有起始因子(黑色)、不含IF1(蓝色)或不含IF3(红色)的30S IC，在停流(A - G)或淬灭流 仪器中与 亚基 快速混合，并监测所示反应。平滑线显示通过使用数值积分对所有时间进程进行全局评估获得的拟合结果。
50S亚基结合后IF1和IF3的作用
为了研究IF1和IF3在促进70S IC成熟的每个步骤中的各自作用，在固定浓度 的 亚基存在和不存在任一因子的情况下监测反应(图4)。在50S亚基浓度增加时监测LS(补充图S1B)，以获得亚基结合第一步的元素速率常数。使用上述模型对时间进程进行拟合，但当不存在IF1时，IF1依赖的步骤从反应方案中去除。数值积分分析表明，GTPase激活步骤(通过mant - GTP和IF2之间FRET变化的第一阶段监测)，在完整系统中是一个动力学上离散的反应，在不存在IF3时变得与50S亚基对接难以区分；因此，这两个步骤被归为一组。当在不存在IF1或IF3的情况下制备复合物时，IF2从70S复合物解离(如mant - GTP和IF2之间FRET的第二阶段所报告)与tRNAfMet从IF2释放大约同时发生(表2)。
在不存在IF1或IF3的情况下，50S结合的缔合速率常数为 (图4A，表2)，并且反应几乎是不可逆的(表2)。更快的亚基结合(图4A，补充图S1B，表1)也导致GTPase激活的表观速率增加(图4B，表1)。然而，在不存在IF1时反应的元素速率常数没有变化，而在不存在IF3时速率比前一步更快(表2)。从30S IC中省略IF1或IF3不会影响IFl依赖反应的效率，如GDP和Pi的释放(分别为图4C和D)。在不存在IF3的情况下，观察到Bpy - Met - tRNAfMet荧光变化(图4E)和肽键形成(图4H)的程度适度降低(20 - 40%)。当不存在IF1或IF3时，Pi释放的速率不受影响，而tRNAfMet从IF2的释放略慢，同时发生IF2解离。随后，在这些条件下，GDP释放和肽键形成变得略快(表2)。总体而言，无论是否存在IF1或IF3，IF2途径遵循相同的事件顺序(补充图S2B - C)。
当复合物中省略IF3时，由于亚基结合更快，IF1环境变化的表观速率(由IF1(Alx555)荧光描绘)快了2倍(图4F，表1)。在这些条件下， 和 之间FRET幅度的很大一部分(约50%)归因于IF1环境的变化，而其余一半归因于IF1解离(图4G)。此外，IF1信号变化的总体幅度更大，可能是因为即使是不正确形成的30S复合物也会发生快速且不可逆的亚基结合，而在完整系统中，IF3会强烈区分这些复合物。我们通过监测IF3 (Alx555)和荧光素标记的fMet-tRNAfMet之间的FRET来检查IF1的缺失是否影响IF3动力学(21)，并观察到IF3从此类复合物中解离的表观速率快了3倍(表1，补充图S6)，这同样可归因于更快的亚基结合。总之，尽管观察到不同反应的时间进程存在差异，但唯一受IF1或IF3缺失显著影响的步骤是50S亚基结合。
起始途径的可逆性
为了进一步研究GTP水解的作用，我们研究了用GTP S替代GTP时，成熟的70S IC是否能招募IF1和IF2。如上所述，当用GTP和Bpy-Met-tRNA 形成的30S IC与 亚基快速混合时，由于GTP水解后Bpy-Met-tRNAfMet从IF2释放，观察到Bpy荧光降低(图2E和5A)。当在存在20倍过量GTP 的情况下进行相同实验时，与50S亚基一起加入，观察到双相荧光变化(图5A)。信号的初始降低之后是荧光增加，这是由于GDP与GTPγS交换后，IF2重新结合到成熟的70S IC上，并随后被IF2-GTPγS捕获Bpy-Met-tRNAfMet的 CCA末端所致。因此，在没有GTP水解的情况下，结合平衡向Bpy-Met-tRNA -IF2-70S复合物的形成方向移动，并且IF2的解离不受欢迎，从而阻止了能够进入延伸阶段的成熟70S IC的形成。
图5. GTP水解对IF1和IF2与成熟70S起始复合物结合的影响。(A) 在Bpy-Met-tRNAfMet和GTP(12.5 )存在下形成的30S起始复合物在存在或不存在GTP S(0.25 mM)的情况下与 亚基快速混合。监测Bpy-Met-tRNA 荧光变化的时间进程。(B) 通过将纯化的70S起始复合物(含有Bpy-Met-tRNAfMet)与结合GTPγS、GDPNP、GTP或GDP的IF2混合，跟踪因子与70S起始复合物结合时Bpy-Met-tRNA 与IF2的相互作用。在存在GTP 的情况下，使用缺乏C2结构域( )的IF2变体进行了类似的实验。(C) 由IF1 (Atto540Q)和GTP(12.5 )形成的 (Alx488)起始复合物在存在或不存在GTP 的情况下与 亚基混合。(D) 通过在存在GTP或GTPγS的情况下将未纯化的70S起始复合物(在不存在IF1的情况下由 (Alx488)形成)与IF1 (Atto540Q)混合，跟踪IF1与成熟70S起始复合物的结合。
为了进一步证实这些发现，我们将含有Bpy-Met-tRNA 的纯化70S起始复合物与结合GTPγS或GDPNP的IF2混合(图5B)。观察到的荧光增加描述了IF2与核糖体上的Bpy-Met-tRNAfMet的结合。当使用缺乏C2结构域(64)的IF2截短版本与GTPγS一起使用时，未观察到荧光变化，证实了tRNA 与IF2之间直接相互作用的丧失。此外，由于快速的GTP水解和IF2解离，在存在GTP的情况下，全长IF2与70S起始复合物-Bpy-Met-tRNA 结合时没有荧光增加。在存在GDP的情况下进行的对照实验也没有显示荧光变化(图5B)。
同样地，当由GTP和 形成的 (Alx488)起始复合物与 亚基快速混合时，在IF1 (Atto540Q)从70S复合物释放时观察到荧光增加(图2G和5C)。在与50S亚基一起添加20倍过量的GTPγS的情况下，观察到双相荧光变化(图5C)，代表IF1的初始释放，随后该因子重新结合到70S复合物上。我们通过在存在GTP或GTPγS的情况下将未纯化的 (Alx488)起始复合物(其在溶液中含有IF2)与IF1(Atto540Q)混合，检查IF1是否可以结合到预先形成的70S起始复合物上(图5D)。在存在GTP的情况下未观察到结合，而在存在GTPγS的情况下IF1可以结合到成熟的70S复合物上。
由于IF2是结合鸟嘌呤核苷酸的效应分子，因此看来处于预水解状态的IF2与70S复合物的相互作用促进了IF1与70S起始复合物(IC)的结合。在30S起始复合物上，IF1可能与 形式(即包含全长N端结构域)的 大肠杆菌IF2的N端结构域(NTD)接触(27)。为了测试IF1和IF2之间的相互作用是否特定于IF2的这种特定同工型，我们通过使用缺少整个N端结构域的IF2截短版本(IF2ΔN(41))(补充图S8)来检查IF1的释放是否可以与GTP水解以及随后的IF2解离解偶联。在IF2ΔN不进行GTP水解的情况下，IF1 (Atto540Q)未从 (Alx488)复合物中释放，这表明IF1从70S复合物中的释放不是由与IF2的N端结构域相互作用的丧失介导的。因此，有可能(i)IF1在70S起始复合物上与IF2的不同结构域相互作用，或者(ii)在不可水解的GTP类似物存在下，IF2与70S起始复合物的结合赋予了70S复合物一种预水解构象，从而揭示了一个IF1结合位点。因此，GTP水解可能通过使IF2和IF1从核糖体上的解离不可逆，从而引导70S起始复合物转变为具有延伸能力的状态。
讨论
目前的动力学分析提供了一个从典型的30S起始复合物成熟为70S延伸复合物(EC)的详细机制图(图6)。50S亚基的结合是形成70S复合物的第一步。当所有因子、fMet-tRNAfMet和GTP都结合到携带022 mRNA的30S亚基上时，亚基结合以 的表观速率常数发生(21)。然而，考虑到50S亚基结合后步骤的详细动力学分析表明，最初的50S亚基对接是可逆的，其基本速率常数约为 和 ，这与先前发表的结果一致(20)。50S亚基结合后立即形成的70S起始前复合物(PIC)中间体(图六)可能对应于通过单分子荧光共振能量转移(FRET)观察到的70S复合物的短暂状态(十五)。复合物需要进一步重排以稳定两个亚基之间的相互作用，从而导致70S起始复合物的形成(15,20)。当使用含有非最佳翻译起始区域(TIR)的mRNA时，最初的50S亚基对接不受抑制，而向稳定的70S起始复合物形成的转变非常缓慢，这是由于复合物的高解离速率和向70S延伸复合物的缓慢转变(21,29)。
亚基结合之后，IF2(36 )迅速激活GTP酶并发生GTP水解(19,20)，随后发生构象重排，导致IF1环境 发生变化。GTP水解后发生Pi释放 ，随后fMet - tRNAfMet从IF2迅速释放(18 s )，导致tRNA进入P位点(33,34,65)。先前的报道表明，tRNA 构象变化(通过连接在fMet - tRNA D环上的原黄素荧光变化监测)先于Pi释放(20)。我们无法用Bpy - Met - tRNA 对我们的数据集进行建模以适应这一系列事件，这表明这两个标签可能报告了两种不同的tRNA 依赖性反应。此后，IF2和IF1从 复合物 上解离，并且IF2将其结合的GDP换成GTP以参与进一步的起始事件。由于在生理条件下GDP和GTP对游离IF(2)的亲和力相似(58)，核苷酸交换由于GDP的高解离速率和细胞中GTP的高细胞浓度而自发发生(53)。最后，肽键形成在 滞后阶段之后发生，其基本速率常数为 (21)。延迟代表形成70S IC所需的时间。当使用预先形成的70S IC而不是(30S IC和50S亚基)时，未观察到延迟阶段，并且肽键形成的时间进程是单指数的，速率常数为2 。IF3解离 与70S复合物的成熟同时发生(21)，并且与GTP水解无关。
在没有IF1或IF3的情况下，亚基结合比在两种因子存在时略快(基本速率常数为 )，但这些复合物的解离非常缓慢(表2)，导致反应的整体表观速率常数更高( )。亚基解离的低速率表明形成了寿命更长的复合物，这解释了IF1和IF3如何在50S亚基结合步骤中有助于mRNA选择(15,21)。更快的亚基结合导致更高的GTP酶激活速率、IF1环境变化和IF3解离速率，而不影响反应的基本速率常数。值得注意的是，50S亚基结合是后期起始途径中唯一受IF1或IF3缺失影响的步骤，而后续步骤均未受到显著影响。
亚基结合的时间和程度完全独立于IF2介导的GTP水解反应(参考文献23、36、63)。然而，缺乏GTP水解会阻碍IF2依赖的反应，如tRNA 从IF2的C2结构域解离以及肽键形成(参考文献20、29、36、65)。与之前报道的在存在不同的不可水解GTP类似物GDPCP(参考文献20、29)或GDP/无核苷酸(参考文献19)的情况下相比，使用GTP S产生了更高程度的抑制作用。在前一种情况下，作者(参考文献20、29)观察到tRNA 构象变化幅度和二肽形成减少了2-3倍，而在我们的系统中这些事件几乎完全被抑制。我们在存在相同类似物GDPCP的情况下检查了亚基结合和tRNA 从IF2的释放，与GTPγS相比发现差异很小(数据未显示)。我们还观察到，在存在GDP或不存在任何核苷酸 的情况下，亚基结合速率比存在GTP时慢 倍(数据未显示)，这与早期报道一致(参考文献62)。这些结果表明，差异很可能源于大肠杆菌(我们的系统)或 嗜热栖热菌(在 中使用)的IF2对不同鸟嘌呤核苷酸的敏感性差异。在存在GTP S的情况下，IF2可以结合到成熟70S起始复合物上fMet-tRNA 的 末端，并且反应平衡向复合物形成的预水解状态移动，这表明GTP水解在促进翻译起始后期的方向性方面起着重要作用。
图6. 细菌翻译起始后期事件的详细动力学方案。IF1、IF2-GTP、IF3、mRNA和fMet-tRNA 结合到30S亚基上形成30S起始复合物。步骤1:50S亚基与30S起始复合物结合形成70S起始复合物。步骤2:GTP酶激活和快速GTP水解(参考文献19、20、23、32)。步骤3:IFI环境变化。步骤4:Pi从IF2释放。步骤5:Met-tRNA’Met的3’末端从IF2 C2结构域释放。步骤6:IF2从70S复合物释放以及GDP从IF2释放；IF1从70S复合物释放，产生一个具有延伸能力的70S起始复合物。步骤7:EF-Tu-GTP-氨酰-tRNA(TC)与70S起始复合物结合，随后形成肽键形成70S延伸复合物。据报道，IF3从70S复合物解离的表观速率为 (参考文献21)；由于在复合物成熟时IF3可能会发生构象变化和移动，IF3的位置用较浅的阴影表示，应视为暂定。如虚线箭头所示，在没有GTP水解的情况下，IF1和IF2与70S起始复合物的解离以及步骤5会变成可逆的。用于监测每个步骤的可观测指标总结在表2中。
尚不清楚Pi的释放对于从IF2释放fMet - tRNAfMet是否是一个必要步骤。对于EF - G而言，Pi的释放和tRNA - mRNA的易位可以相互独立发生(67)；类似的机制可能适用于从IF2释放Pi和fMet - tRNAfMet。如果这两个因子采用类似的偶联机制，那么在Pi释放以及tRNA从IF2解离之前的一个步骤可能是IF2途径其余部分的限速步骤。另一方面，如果Pi的释放对于fMet - tRNAfMet从IF2解离是必要的，这将意味着G结构域可以将构象变化传递给C2结构域。目前尚不清楚GTP水解或Pi从G结构域的释放如何传递到IF2的C2结构域。虽然对真核生物/古细菌IF2同源物e/aIF5B的结构研究表明，分子的核苷酸结合状态可能通过结构域间界面进行传递(60,68)，但由于其结构域的不同排列(69,70)，IF2可能不使用相同的机制。从IF2释放Pi和tRNAfMet通过以下方式促进该因子从核糖体解离:(i)IF2从其在70S复合物上的高亲和力状态构象重排为其低亲和力、准备离开的GDP构象(33,34)，以及(ii)与fMet - tRNA 的 端直接相互作用的丧失，这是IF2在核糖体上的一个重要锚定点(26,33)。事实上，已经观察到IF2对fMet - tRNA 的亲和力降低(Goyal等人，未发表数据)或对核糖体的亲和力降低(52,71)有助于在促进IF2从70S复合物释放时绕过对GTP水解的需求。
缺乏IF1不会显著影响70S复合物上IF2依赖性反应的程度或时间。另一方面，IF2缺乏GTP水解会消除IF1从核糖体的解离。使用来自酿酒酵母的重组系统也获得了类似的结果，其中在缺乏eIF5B的GTP水解时，eIF1A(IF1的真核同源物)从80S IC的解离显示慢10倍(⑦②)。一旦释放，IF1只能重新结合到核糖体的预水解状态(例如由IF2 - GTP S诱导)。尚不清楚几个IF2依赖性事件中的哪一个，如GTP水解、Pi释放、fMet - tRNAfMet释放、亚基间旋转或IF2从核糖体的解离，直接负责促进IF1从70S IC的释放。因为使用缺乏NTD的IF2变体并不能消除70S复合物上IF1释放对GTP水解的依赖性，所以即使在那些IF2不保留其全长NTD的生物体中，IF1的释放可能也依赖于GTP水解。IF1从70S复合物的解离可能通过与IF2直接相互作用的丧失或GTP水解后核糖体的构象重排来促进，这解释了与30S IC相比，IF1从70S IC释放的速度更快(表观速率分别为 与0.01 ，(补充图S5B))。
与IF1相反，当GTP水解被阻止时，IF3从70S IC的解离不受影响。这些发现与认为70S复合物释放IF3可能需要GTP水解的观点(33)不一致。然而，有可能我们指定为IF3解离的步骤(21)，可能代表IF3的一个主要移动，例如从亚基界面移向核糖体的外表面，这将与其他亚基间桥(38)一起释放桥B2b(27,28,73,74)，并允许稳定的亚基结合发生。
给定mRNA进入翻译的频率取决于具有有利构象的30S起始复合物(IC)的组装，这种构象有利于50S亚基的轻松结合(13,21)。在起始的早期阶段，IF1和IF3充当守门人，通过防止亚基与无生产性的30S IC对接，并促进起始过程中50S亚基对接可逆的阶段(15,21,29)。在亚基稳定结合后，越过这个检查点，mRNA就不能再从复合物中自由解离。在正确形成的30S IC上，IF1和IF3主要通过调节50S亚基对接和解离的速率来控制70S IC的成熟。然而，不排除IF1和IF3在含有非经典起始密码子区域(TIR)的mRNA翻译起始过程中，在70S IC水平上可能执行额外的保真功能。因此，从30S IC到延伸核糖体的进程通过一系列步骤进行，这些步骤将IF3/IF1的质量控制和IF2依赖的GTP水解与起始因子的逐步释放以及亚基之间结合的加强相耦合。
补充数据
补充数据可在NAR在线获取。
致谢
我们感谢Wolfgang Wintermeyer对稿件的严格审阅；感谢Liudmila Filonava进行初步实验；感谢Dmitry Burakovsky和Irena Andreeva分别提供核糖体亚基和Bpy-Met-tRNA 的额外制剂；感谢Olaf Geintzer、Sandra Kappler、Christina Kothe、Anna Pfeifer、Theresia Uh-lendorf、Tanja Wiles和Michael Zimmermann提供专业技术协助。
资金支持
勃林格殷格翰基金会和哥廷根神经科学、生物物理学和分子生物科学研究生院(授予A.G.)；马克斯·普朗克学会和德国研究基金会的资助(授予M.V.R.)；秘鲁国家创新促进竞争力和生产力计划[382-PNICP-PIBA-2014(授予P.M.)]。开放获取费用的资金:马克斯·普朗克学会。利益冲突声明:无。
REFERENCES
1. Gualerzi, C.O., Brandi, L., Caserta, E., Garofalo, C., Lammi, M., La Teana, A., Petrelli, D., Spurio, R., Tomsic, J. and Pon, C.L. (2001) Initiation factors in the early events of mRNA translation in bacteria. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 66, 363-376.
2. Boelens, R. and Gualerzi, C.O. (2002) Structure and function of bacterial initiation factors. Curr. Protein Pept. Sci., 3, 107-119.
3. Myasnikov, A.G., Simonetti, A., Marzi, S. and Klaholz, B.P. (2009) Structure-function insights into prokaryotic and eukaryotic translation initiation. Curr. Opin. Struct. Biol., 19, 300-309.
4. Simonetti, A., Marzi, S., Jenner, L., Myasnikov, A., Romby, P., Yusupova, G., Klaholz, B.P. and Yusupov, M. (2009) A structural view of translation initiation in bacteria. Cell. Mol. Life Sci., 66, 423-436.
5. Laursen, B.S., Sorensen, H.P., Mortensen, K.K. and Sperling-Petersen, H.U. (2005) Initiation of protein synthesis in bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 69, 101-123.
6. Milon, P. and Rodnina, M.V. (2012) Kinetic control of translation initiation in bacteria. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 47, 334-348.
7. Allen, G.S. and Frank, J. (2007) Structural insights on the translation initiation complex: ghosts of a universal initiation complex. Mol. Microbiol., 63, 941-950.
8. Zucker, F.H. and Hershey, J.W. (1986) Binding of Escherichia coli protein synthesis initiation factor IF1 to 30S ribosomal subunits measured by fluorescence polarization. Biochemistry, 25, 3682-3690.
9. Weiel, J. and Hershey, J.W. (1982) The binding of fluorescein-labeled protein synthesis initiation factor 2 to Escherichia coli 30 S ribosomal subunits determined by fluorescence polarization. J. Biol. Chem., 257, 1215-1220.
10. Stringer, E.A., Sarkar, P. and Maitra, U. (1977) Function of initiation factor 1 in the binding and release of initiation factor 2 from ribosomal initiation complexes in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 252, 1739-1744.
11. Celano, B., Pawlik, R.T. and Gualerzi, C.O. (1988) Interaction of Escherichia coli translation-initiation factor IF-1 with ribosomes. Eur. J. Biochem., 178, 351-355.
12. Caserta, E., Tomsic, J., Spurio, R., La Teana, A., Pon, C.L. and Gualerzi, C.O. (2006) Translation initiation factor IF2 interacts with the 30 S ribosomal subunit via two separate binding sites. J. Mol. Biol., 362, 787-799.
13. Milon, P., Maracci, C., Filonava, L., Gualerzi, C.O. and Rodnina, M.V. (2012) Real-time assembly landscape of bacterial 30S translation initiation complex. Nat. Struct. Mol. Biol., 19, 609-615.
14. Wang, J., Caban, K. and Gonzalez, R.L. Jr (2015) Ribosomal initiation complex-driven changes in the stability and dynamics of initiation factor 2 regulate the fidelity of translation initiation. J. Mol. Biol., 427, 1819-1834.
15. MacDougall, D.D. and Gonzalez, R.L. Jr (2015) Translation initiation factor 3 regulates switching between different modes of ribosomal subunit joining. J. Mol. Biol., 427, 1801-1818.
16. Guenneugues, M., Caserta, E., Brandi, L., Spurio, R., Meunier, S., Pon, C.L., Boelens, R. and Gualerzi, C.O. (2000) Mapping the fMet-tRNA(f)(Met) binding site of initiation factor IF2. EMBO J., 19, 5233-5240.
17. Milon, P., Carotti, M., Konevega, A.L., Wintermeyer, W., Rodnina, M.V. and Gualerzi, C.O. (2010) The ribosome-bound initiation factor 2 recruits initiator tRNA to the 30S initiation complex. EMBO Rep., 11, 312-316.
18. Spurio, R., Brandi, L., Caserta, E., Pon, C.L., Gualerzi, C.O., Misselwitz, R., Krafft, C., Welfle, K. and Welfle, H. (2000) The C-terminal subdomain (IF2 C-2) contains the entire fMet-tRNA binding site of initiation factor IF2. J. Biol. Chem., 275, 2447-2454.
19. Tomsic, J., Vitali, L.A., Daviter, T., Savelsbergh, A., Spurio, R., Striebeck, P., Wintermeyer, W., Rodnina, M.V. and Gualerzi, C.O. (2000) Late events of translation initiation in bacteria: a kinetic analysis. EMBO J., 19, 2127-2136.
20. Grigoriadou, C., Marzi, S., Kirillov, S., Gualerzi, C.O. and Cooperman, B.S. (2007) A quantitative kinetic scheme for translation initiation complex formation. J. Mol. Biol., 373, 562-572.
21. Milon, P., Konevega, A.L., Gualerzi, C.O. and Rodnina, M.V. (2008) Kinetic checkpoint at a late step in translation initiation. Mol. Cell, 30, 712-720.
22. Marshall, R.A., Aitken, C.E. and Puglisi, J.D. (2009) GTP hydrolysis by IF2 guides progression of the ribosome into elongation. Mol. Cell, 35, 37-47.
23. Qin, H., Grigoriadou, C. and Cooperman, B.S. (2009) Interaction of IF2 with the ribosomal GTPase-associated center during 70S initiation complex formation. Biochemistry, 48, 4699-4706.
24. Antoun, A., Pavlov, M.Y., Lovmar, M. and Ehrenberg, M. (2006) How initiation factors tune the rate of initiation of protein synthesis in bacteria. EMBO J., 25, 2539-2550.
25. Grunberg-Manago, M., Dessen, P., Pantaloni, D., Godefroy-Colburn, T., Wolfe, A.D. and Dondon, J. (1975) Light-scattering studies showing the effect of initiation factors on the reversible dissociation of Escherichia coli ribosomes. J. Mol. Biol., 94, 461-478.
26. Simonetti, A., Marzi, S., Myasnikov, A.G., Fabbretti, A., Yusupov, M., Gualerzi, C.O. and Klaholz, B.P. (2008) Structure of the 30S translation initiation complex. Nature, 455, 416-420.
27. Julian, P., Milon, P., Agirrezabala, X., Lasso, G., Gil, D., Rodnina, M.V. and Valle, M. (2011) The Cryo-EM structure of a complete 30S translation initiation complex from Escherichia coli. PLoS Biol., 9, e1001095.
28. Dallas, A. and Noller, H.F. (2001) Interaction of translation initiation factor 3 with the 30S ribosomal subunit. Mol. Cell, 8, 855-864.
29. Grigoriadou, C., Marzi, S., Pan, D., Gualerzi, C.O. and Cooperman, B.S. (2007) The translational fidelity function of IF3 during transition from the initiation complex to the initiation complex. J. Mol. Biol., 373, 551-561.
30. Qin, D. and Fredrick, K. (2009) Control of translation initiation involves a factor-induced rearrangement of helix 44 of 16S ribosomal RNA. Mol. Microbiol., 71, 1239-1249.
细菌,GTP,IF2,tRNA,IF1,IF3
表观信息
5’-三磷酸鸟苷RNA招募GTP结合蛋白以抑制RIG-I/Ⅰ型干扰素信号传导
2026-09-14
一种用于蛋白质靶向和结合测定的定量、无标记视觉干涉比色测定平台
2026-09-14
TUSC3的表观遗传激活使胶质母细胞瘤对替莫唑胺敏感，与MGMT启动子甲基化状态无关
2026-09-11
2026-09-08
艾维缔官网
艾德官网
B站IVDSHOW
抖音军哥聊表观
视频号艾维缔
小红书艾维缔
快手表观盒子
表观遗传学
联系我们
