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5’-三磷酸鸟苷RNA招募GTP结合蛋白以抑制RIG-I/Ⅰ型干扰素信号传导

发布时间：

2026-09-14 21:56

5’-三磷酸鸟苷RNA招募GTP结合蛋白以抑制RIG-I/Ⅰ型干扰素信号传导

图形摘要

要点

• 5’-pppA RNA比 -pppG引发更强的RIG-I依赖性干扰素反应
• 差异免疫原性不能仅通过RIG-I结合或激活来解释

5’-pppG RNA优先募集大量GTP结合蛋白

• 升高的GTP水平减少了5’-pppA和5’-pppG之间的免疫原性差异

作者

玛格达莱娜·沃尔奇克、雅采克·希曼斯基、伊万·特鲁斯、……、冈瑟·哈特曼、尤里·拉普西尔伯、格拉齐安·米赫莱夫斯基

通信

gmichlewski@iimcb.gov.pl

简而言之

Wolczyk等人表明，核苷酸可调节先天免疫信号，5’-三磷酸腺苷引发的干扰素反应比鸟苷更强。他们鉴定出与鸟苷起始的RNA相互作用的蛋白质，揭示了一个对抗病毒防御、自身免疫和RNA治疗具有潜在影响的调节层。

5’-三磷酸鸟苷RNA招募GTP结合蛋白以抑制RIG-I/Ⅰ型干扰素信号传导

玛格达莱娜·沃尔奇克，亚采克·希曼斯基，伊万·特鲁斯，扎拉·纳兹，娜塔莉·伊德林，米哈尔·莱乔夫斯基，埃米莉亚·巴拉诺夫斯卡，1 阿利西亚·比斯，2 雅库布·斯坦尼斯瓦夫·诺瓦克，2 托拉·塔梅，1 贾斯蒂娜·亚基维茨，1 埃尔日别塔·诺瓦克，1 克里斯汀·维本，冈瑟·哈特曼，尤里·拉普西尔伯，以及格拉齐安·米奇莱夫斯基

位于华沙的国际分子与细胞生物学研究所，华沙，波兰

小波兰生物技术中心，雅盖隆大学，克拉科夫，波兰

波恩大学医院临床化学与临床药理学研究所 - 转化免疫学，波恩，德国爱丁堡大学惠康细胞生物学中心，爱丁堡，英国

生物技术系，柏林工业大学，柏林，德国

Si-M/"模拟人"，柏林工业大学和柏林夏里特大学医学中心的科学框架，柏林，德国

这些作者贡献相同

主要联系人

*通讯作者:gmichlewski@imcb.gov.pl

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2026.04.014

总结

干扰素(IFN)反应对于抗病毒活性至关重要，但过度激活会导致组织损伤和自身免疫性疾病。细胞质受体视黄酸诱导基因I(RIG-I)检测病毒双链RNA(dsRNA)和携带5’-三磷酸(5’-ppp)部分的内源性RNA聚合酶III(RNA Pol III)转录本，触发IRF3磷酸化和IFN反应。许多病毒RNA以5’-三磷酸腺苷(5’-pppA)起始，而高等真核生物中大多数内源性RNA Pol III转录本以5’-三磷酸鸟苷(5’-pppG)起始，但这种偏向的原因尚不清楚。在这里，我们表明，尽管在体外对RIG-I的刺激相当，但5’-pppA dsRNA比5’-pppG dsRNA触发更强的RIG-I/IFN反应。使用RNA下拉和质谱分析，我们鉴定出优先与5’-pppG dsRNA相互作用的GTP结合蛋白。补充鸟苷可增加细胞内GTP水平，减少5’-pppG和5’-pppA dsRNA之间的免疫原性差异。我们的研究结果为RIG-I/IFN途径的序列依赖性激活提供了见解，对RNA序列的进化压力、RNA驱动的自身免疫、病毒免疫原性以及RNA治疗的合理设计具有重要意义。

引言

在高等真核生物中，先天免疫系统是抵御病毒感染的快速且重要的防御机制。当被称为模式识别受体(PRR)的细胞传感器检测到通常与病原体相关的分子特征(即病原体相关分子模式)时，这种反应就会启动。其中一种特征是病毒、RNA聚合酶III(RNA Pol III)或通过体外转录(IVT)产生的无帽RNA上的 -三磷酸( -ppp)基团。视黄酸诱导基因I(RIG-I)是具有5’-ppp基序的病毒RNA的关键PRR。这种RNA的结合会诱导RIG-I发生结构重排，随后由E3连接酶Riplet进行K63连接的泛素化，激活线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)，以及磷酸化干扰素调节因子3(IRF3)、7(IRF7)和核因子这些因子诱导I型干扰素干扰素(IFNs)以及随后的干扰素刺激基因(ISGs)。虽然对于抗病毒防御至关重要，但过度激活会导致慢性炎症或自身免疫。 RIG-I通过其结构和化学特征选择性地识别RNA配体。它被短的、平头的双链RNA(dsRNAs)或携带 -ppp或 -二磷酸基团的茎环RNA激活(图1A)。至关重要的是，RIG-I通过感知2’-O-甲基化的缺失将它们与宿主RNA区分开来，2’-O-甲基化通常存在于加帽的真核mRNA末端。即使是最小的合成RNA，包括10bp双链体或茎环，也能强烈激活RIG-I。在甲型流感病毒(IAV)感染期间，短的病毒RNA片段( )作为有效的RIG-I激动剂，突出了RNA结构和组成的重要性。

许多RNA病毒基因组以 -三磷酸腺苷(5’-pppA)开头，而高等真核生物中的RNA Pol III转录本以及一些高致病性RNA病毒的基因组则以 -三磷酸鸟苷( -pppG)开头。为了重新审视这一概念，我们整理了人类RNA Pol III转录本和具有 -ppp末端的代表性RNA病毒的 -末端核苷酸(图1B和1C)。一些病毒，如IAV，主要以 -pppA开头，而其他病毒，包括埃博拉病毒、拉沙病毒和丙型肝炎病毒(HCV)，则可以以 -pppG或其他核苷开头。值得注意的是，已经对第一个核苷酸突变进行了研究:IAV在该核苷酸发生突变或缺失后会恢复为野生型，而在HCV中将 -末端核苷酸修饰为另一种嘌呤核苷酸是不可行的。此外，以 -pppA开头的HCV基因型大多被黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)加帽，这可能会阻止RIG-I的诱导，而5’-pppG基因型则保持未加帽状态。另一方面，高等真核生物中的大多数RNA Pol III转录本，包括tRNA、Y RNA、穹窿体RNA和5S RNA，都从5’-pppG开始(图1B)。尽管它们富含尿苷的末端尾巴使它们成为不太理想的RIG-I激动剂，但它们可以作为RIG-I/IFN途径的内源性触发因素。值得注意的是，在四种人类Y RNA中，只有Y5 RNA以 -pppA开头；其他三种以 -pppG开头。Y5 RNA主要位于细胞核中，我们的定量逆转录PCR(RT-qPCR)数据表明，它是HEK293细胞中含量最少的Y RNA(图S1)。病毒基因组和RNA Pol III转录本为何显示出这些序列偏好仍然未知。

图1. 病毒和RNA聚合酶III转录本中5’-ppp末端核苷酸的保守性

(A) 显示最佳RIG-I激动剂的示意图。

(B) RNA聚合酶III转录本和选定的具有无帽RNA基因组的人类病毒中5’-ppp末端核苷酸的保守性。

因此，我们询问第一个核苷酸如何影响RIG-I途径的激活。由于病毒RNA基因组在末端不易发生突变，我们使用了合成RNA。我们之前表明，与以 -pppG起始的IVT反应相比，以 -pppA起始的IVT反应产生的免疫刺激性双链RNA副产物要多得多。这使得IVT衍生的单链RNA(ssRNA)不适用于比较 -pppA和 -pppG转录本的免疫原性。为了解决这个问题，我们使用了各种长度的完美双链RNA。短于40 nt的RNA通过化学固相合成产生，作为带有5’-ppp的“有义”链和带有的“反义”链。较长的RNA通过IVT产生，有义链和反义链分别制备，每条都带有 -ppp。我们的方法有两个主要优点:双链体是有效的RIG-I激动剂，并且以1:1的比例混合IVT衍生链可将富含 -pppA RNA中的微量双链RNA杂质的影响降至最低。

在这里，我们表明，以 -pppA开头的双链RNA比以 -pppG开头的双链RNA引发更强的RIG-I/IFN反应。值得注意的是，在分离系统中，两种双链RNA都表现出相当的结合亲和力和相似的RIG-I激活，这表明差异不太可能是由直接受体相互作用导致的。标记的5’-pppA和5’-pppG双链RNA也积累到相似的水平，在细胞核中5’-pppG比5’-pppA有明显的优势。RNA下拉结合质谱(MS)显示，几种GTP酶和GTP结合蛋白优先结合5’-pppG RNA。此外，通过核苷补救途径迅速提高细胞内GTP水平的鸟苷补充，减少了 -pppG和 -pppA RNA之间免疫原性的差异。我们假设，丰富的GTP酶和GTP结合蛋白在空间上或功能上阻碍了 -pppG RNA，从而减少了RIG-I介导的IFN激活。我们的研究结果表明，5’-pppG RNA可能使某些RNA病毒和RNA聚合酶III转录本逃避细胞免疫感知，揭示了一种控制序列依赖性RIG-I/IFN途径激活的机制。

《分子细胞》

文章

结果

在人类和小鼠细胞中，5’-三磷酸腺苷双链RNA(5’-pppA dsRNAs)比5’-三磷酸鸟苷双链RNA(5’-pppG dsRNAs)更能强烈激活维甲酸诱导基因I(RIG-I)/I型干扰素(IFN)信号通路

为了评估RIG-I激动剂端核苷酸身份的生物学意义，我们假设端pppG RNA可能使某些RNA病毒和RNA Pol III转录本逃避RIG-I/IFN通路的检测。如上所述，直接对病毒诱变或使用IVT反应产生不含免疫原性dsRNA的RNA Pol III转录本并不可行。因此，我们使用了两种源自IAV的dsRNA，其中正义链对应IAV PR8株节段8正链的起始部分——一种76 bp的IVT合成dsRNA(图2A)和一种较短的24 bp化学合成类似物(图2B)。使用24 bp dsRNA的理由在于它完全避免了IVT产物中典型的dsRNA污染。我们在IVT合成和化学合成的dsRNA中均将初始的端pppA替换为端pppG，同时通过Watson-Crick碱基配对(A:U和G:C)保持碱基配对(图2A和图2B)。使用变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(尿素-PAGE)分析各RNA链的完整性(图S2A和S2C)，并通过天然PAGE验证双链形成(图S2B和S2D)。将携带5’-pppA或5’-pppG的76 bp IVT或24 bp合成dsRNA转染人胚肾HEK293细胞。在用IVT 76 bp dsRNA处理的细胞中，5’-pppA组比端pppG dsRNA转染细胞中观察到更高水平的磷酸化IRF3(pIRF3)和RIG-I蛋白，尤其在0.1和 mL浓度下(图2C和图2D)。pIRF3和RIG-I的差异在4至的所有时间点均可观察到(图S3A)。在转染24 bp合成dsRNA的细胞中也观察到类似趋势，尽管在更高浓度(10和25 ng/mL)下才明显(图2E和图2F；图S3B)。IVT来源的dsRNA表现出更强的RIG-I/IFN通路刺激作用，可能由于其长度更长且RNA双链两端均存在端ppp基团，而合成dsRNA仅一条链有修饰。在更高dsRNA浓度(IVT dsRNA为10 ng/mL，合成dsRNA为50 ng/mL)下，反应达到饱和，5’-pppA与5’-pppG之间无差异(图2C-2F)。

使用IFN- 报告基因HEK293细胞和HEK-blue I型干扰素检测方法，我们评估了受试RNA诱导的IFN- 活性。携带5’-pppA的体外转录双链RNA(IVT dsRNAs)引发的IFN反应比5’-pppG显著更强(图2G)。对于合成双链RNA，在100 - 1000 ng/mL浓度下观察到 -pppA变体增强了IFN产生(图2H)。用缺乏5’-ppp的76 bp体外转录双链RNA或24 bp合成双链RNA转染的HEK293细胞，其IFN- 产生减少(图2G和2H)。从76 bp双链RNA的反义链上去除 -ppp，会降低 -pppA和 -pppG变体在各种细胞系中的IRF3磷酸化和RIG-I表达(图S3C)，尽管变体之间的差异仍然存在。双链RNA中两条RNA链的完全去磷酸化完全抑制了RIG-I/IFN信号通路(图S3C和S3D)。

为尽量减少体外转录(IVT)污染物导致的假阳性结果，我们采用半合成方法生成了76 bp的双链RNA(dsRNA) (图S3E)。将IVT产生的55 nt RNA通过夹板连接与化学合成的21 nt RNA连接，以产生三磷酸化的正义链。在HEK-blue I型干扰素检测中，76 bp的半合成 -pppA和 -pppG正义链RNA(0%反义链)未显示出免疫刺激活性(图S3F)。然而，添加微量(0.05%-1%)互补的、IVT产生的、去磷酸化的76 bp反义RNA链以形成dsRNA足以激活RIG-I/干扰素途径。重要的是， -pppA和 -pppG RNA之间的明显差异仍然可以观察到(图S3F)。

接下来，我们使用从纯合 Kate2报告基因小鼠中分离的报告基因骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)进行转染实验，该实验允许通过 Kate2荧光实时观察干扰素。在用IVT来源的76 bp dsRNA或完全合成的24 bp dsRNA转染的细胞中，观察到带有5’-pppA的dsRNA对干扰素启动子的激活更强(图2I和2J)。对于76 bp的IVT dsRNA，在转染后，5’-pppA和 -pppG之间出现了统计学上的显著差异。对于合成的24 bp dsRNA，这种差异在转染后变得显著。在整个时间过程中，对于76 bp和24 bp的dsRNA，5’-pppA dsRNA的免疫原性比5’-pppG构建体高6倍(图S3G和S3H)。值得注意的是，在用缺乏 -ppp的dsRNA转染的BMDM中未检测到RIG-I/干扰素信号通路的激活，这证实了这种结构特征对免疫激活的必要性(图2I和2J)。

5’-三磷酸腺苷双链RNA比5’-三磷酸鸟苷双链RNA更能诱导干扰素刺激基因(ISG)的强烈表达

为了更全面地了解细胞效应，我们对用5’-三磷酸腺苷或5’-三磷酸鸟苷76碱基对双链RNA转染的人胚肾293(HEK293)细胞进行了RNA测序(RNA-seq)分析(图3A - 3D)。结果表明，大多数知名的干扰素刺激基因由5’-三磷酸腺苷诱导的强度比5’-三磷酸鸟苷76碱基对双链RNA更强。在通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测量的干扰素1 和干扰素刺激基因15(ISG15)信使核糖核酸(mRNA)水平中也观察到了不同RIG-I信号强度的影响(图3E)。该分析表明， -三磷酸腺苷双链RNA比 -三磷酸鸟苷双链RNA更具免疫原性，能刺激包括干扰素诱导蛋白2(IFIT2)、干扰素诱导蛋白3(IFIT3)、2’,5’-寡腺苷酸合成酶2(OAS2)和Mx蛋白3(MX3)在内的多种转录本的表达，突出了我们研究结果的生物学相关性。

观察到的这些效应并不局限于这些双链RNA。体外转录(IVT)衍生的双链RNA也呈现类似模式，其正义链序列取自前体微小RNA-7a(图S4)和Y5 RNA(图S5和S6)。值得注意的是，Y5 RNA衍生的双链RNA的免疫原性强烈依赖于浓度。在0.1纳克/毫升时，5′-三磷酸腺苷Y5双链RNA的免疫原性比 -三磷酸鸟苷高40倍，而在 / 时，其免疫原性仅约为 -三磷酸鸟苷的两倍(图S5F和S5G)。此外，对用Y5双链RNA转染的细胞的总RNA进行的RNA-seq分析显示，与 -三磷酸鸟苷相比， -三磷酸腺苷对干扰素刺激基因转录本的上调更高(图S6)。干扰素刺激基因上调的模式与76碱基对双链RNA观察到的模式高度相似(图3A)，表明激活了共同的信号通路。然而，用Y5双链RNA 5’-三磷酸鸟苷转染导致了一组不同转录本的上调

图2. 5’-三磷酸腺苷双链RNA比5’-三磷酸鸟苷双链RNA更能促进强大的维甲酸诱导基因I/干扰素信号传导

(A和B) 通过体外转录和化学合成产生的5’-末端核苷酸双链RNA变体(5’-三磷酸腺苷或5’-三磷酸鸟苷)示意图。

(C和E) 人胚肾293细胞经不同浓度体外转录76 bp(C)或合成24 bp(E)双链RNA处理后，IRF3磷酸化及RIG-I水平的Western blot分析。

(D和F) 人胚肾293细胞经脂质体转染(C–)、3p-发夹RNA(C+)或不同浓度体外转录76碱基对(D)/合成24碱基对(F)双链RNA转染后，干扰素调节因子3磷酸化及维甲酸诱导基因I蛋白水平的光密度分析( ，Šidák校正双向方差分析)。

(G和H) 用双链RNA转染后人胚肾293细胞中I型干扰素产生情况，通过人胚肾蓝I型干扰素检测法评估(G:n = 4，H:n = 5)。

(I和J) 用测试的双链RNA转染后小鼠骨髓来源巨噬细胞中维甲酸诱导基因I/干扰素激活情况，以0 - 24小时内的mKate2+细胞计数表示。灰色区域代表标准差(I: ，J: ，对转换后的值进行重复测量方差分析[rANOVA]，采用Geisser - Greenhouse校正和Tukey检验，* ，以及 )。

《分子细胞》

图3. 5’-三磷酸腺苷76碱基对双链RNA比5’-三磷酸鸟苷76碱基对双链RNA引发更强的干扰素刺激基因反应

(A) 热图显示用5’-三磷酸腺苷或5’-三磷酸鸟苷76碱基对双链RNA刺激后，以模拟物为对照(n = 3)，干扰素刺激基因的标准化表达(行Z分数)。颜色标度表示相对表达(蓝色，低；红色，高)。

(B - D) 火山图总结了所示比较中的全基因组差异表达。每个点代表一个单一基因；显著差异表达的基因用颜色突出显示，非显著基因显示为灰色，差异表达的干扰素刺激基因用其名称标记。水平虚线表示统计显著性阈值；垂直虚线表示对数倍变化截止值。(B) 5’-三磷酸腺苷与5’-三磷酸鸟苷76碱基对双链RNA诱导的转录反应的直接比较。(C) 模拟处理与5’-三磷酸腺苷76碱基对双链RNA刺激的细胞。(D) 模拟处理与5’-三磷酸鸟苷76碱基对双链RNA刺激的细胞。

(E) RNA-seq结果的RT-qPCR验证及对dsRNA变体评估(双链5’-ppp-5’；单链5’-ppp-5’-OH；双链5’-OH-5’-OH)。HEK293细胞经1 ng/mL 76 bp dsRNA刺激12 h后，定量IFN-β/ISG15 mRNA水平。显著性:*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001；ns无显著性。

不属于核心干扰素刺激基因反应，且不被 -三磷酸鸟苷76碱基对双链RNA诱导。这表明即使序列嵌入短双链RNA片段中，也存在其他序列特异性传感途径。

为了评估具有更高鸟嘌呤-胞嘧啶含量的双链RNA序列是否也表现出可变的免疫原性，我们在Y5衍生的双链RNA两端引入了夹子。尽管含有鸟嘌呤-胞嘧啶夹子尾巴的双链RNA比其野生型对应物表现出更低的免疫原性潜力，但它们对 -三磷酸腺苷仍比对 -三磷酸鸟苷构建体表现出更高的免疫原性(图S5E - S5G)。此外，一种短的、合成的、具有平端的部分双链RIG - I激动剂(见专利#WO/2025/088117A1)也证明， -三磷酸腺苷RNA作为RIG - I刺激剂的效力比5’-三磷酸鸟苷RNA高20倍(图S7)。这些结果表明， -三磷酸腺苷与 -三磷酸鸟苷双链RNA相比更高的免疫原性在多种RIG - I激动剂中都存在。

接下来，我们在HEK293、A549和THP-1 RIG-I基因敲除(KO)细胞中进行了额外实验，这些细胞与本研究中使用的野生型细胞同基因，使用所有测试的双链RNA构建体以及3p-hpRNA和聚肌胞苷酸(poly(I:C))作为对照(图S8)。这些结果表明，在RIG-I KO细胞中只有聚肌胞苷酸(poly(I:C))仍具有免疫原性，而所有其他双链RNA，包括3p-hpRNA，均丧失免疫原活性。同时，我们在THP-1 MAVS KO细胞中进行了类似试验，观察到所有测试试剂均未诱导IRF3磷酸化，而在A549 MAVS KO细胞中，只有聚肌胞苷酸(poly(I:C))显示出非常微弱的免疫原效应。最后，为排除MDA-5的作用，我们在A549和THP-1 MDA-5 KO细胞中进行了实验，所有测试RNA均保留免疫原活性，如IRF3磷酸化和RIG-I水平升高所示。这些结果表明，双链RNA转染后观察到的效应是由RIG-I介导的。

综上所述，这些发现揭示了一种一致的模式，即携带5’-pppA末端的双链RNA在人类和小鼠细胞中比携带 -pppG的等效序列更具免疫原性，突出了在这种情况下RNA浓度的重要性。尽管这种差异在人类永生化细胞系中很明显，但一项使用原代细胞的小鼠实验(带有mKate2报告基因的骨髓来源巨噬细胞，可实时监测IFN- 启动子活性)显示，基于 -末端核苷酸的身份，双链RNA免疫原性存在更显著的差异。此外，这种效应与RIG-I/IFN信号通路相关，因为刺激完全依赖于 -ppp基团的存在。

-pppA和 -pppG双链RNA具有相当的稳定性，但亚细胞定位不同

为了确定 -pppA和 -pppG双链RNA之间免疫原性的差异是否源于RNA水平或细胞内分布的改变，我们首先在转染后评估双链RNA的丰度。对用76 bp双链RNA转染的HEK293细胞进行RT-qPCR分析，结果显示在转染后4小时和24小时， -pppA和 -pppG的水平相当，表明细胞内稳定性相似(图4A)，尽管在时变异性增加。在一项独立实验中，在细胞质和细胞核组分中均观察到相对于 -pppA， -pppG有适度但显著的富集(图4B)。接下来，我们研究了 Alexa Fluor 647标记的双链RNA与J2抗体染色相结合的亚细胞分布，J2抗体可选择性识别双链RNA(图4C)。两种RNA变体都很容易被检测到，总体信号强度相当，5’-pppG信号略有增加(图4D)。值得注意的是，与5’-pppA相比，5’-pppG 76 bp双链RNA在细胞内的离散斑点数量更多。与分级分离和RT-qPCR数据一致，相对于 -pppA，5’-pppG双链RNA在细胞核中的检测增加(图4C和4D)。此外， -pppG 76 bp双链RNA与J2抗体的共定位比 -pppA 76 bp双链RNA更强(图4E)。这种差异可能反映了RIG-I对 -pppA的结合更有效，导致下游免疫信号增强，并且由于蛋白质-RNA复合物的形成，J2抗体的可及性降低。使用Alexa Fluor 647标记的Y5双链RNA也获得了类似的结果(图S9)。总之，这些数据表明5’-pppA和5’-pppG双链RNA在细胞内具有相当的稳定性，但亚细胞分布明显不同， -pppG在细胞核中的检测增强。

-三磷酸腺苷和 -三磷酸鸟苷双链RNA在与重组维甲酸诱导基因I的生化分析中显示出不同的结合亲和力，但激活作用相似

为了进一步研究 -三磷酸腺苷和 -三磷酸鸟苷RNA在维甲酸诱导基因I/干扰素途径激活中观察到的显著差异是否可能是由于维甲酸诱导基因I与这些RNA的差异结合，我们用纯化的重组维甲酸诱导基因I蛋白进行了电泳迁移率变动分析(EMSA)(图5A和5B；图S10A)。由于RNA分子中存在荧光团的方法要求，对76 bp双链RNA的正义链进行了末端修饰，对合成的24 bp双链RNA的反义链用荧光素亚磷酰胺(6-羧基荧光素[6-FAM])进行了末端修饰。结合亲和力测量显示，与 -三磷酸鸟苷双链RNA 相比，维甲酸诱导基因I与 -三磷酸腺苷体外转录76 bp双链RNA的结合亲和力显著更高 (图5E；表S1)。值得注意的是， -三磷酸腺苷双链RNA的去磷酸化导致维甲酸诱导基因I结合亲和力降低了倍，而相应的 -羟基鸟苷双链RNA相对于其三磷酸化对应物仅表现出适度的、不显著的结合亲和力下降。在重组维甲酸诱导基因I与合成的24 bp双链RNA之间的直接相互作用中也观察到了类似的趋势(图5B)， -三磷酸腺苷的结合亲和力明显高于 -三磷酸鸟苷。与之前的观察结果一致，维甲酸诱导基因I与5’-羟基腺苷双链RNA的相互作用比其三磷酸化形式弱约8倍，的结合亲和力下降相对于 -三磷酸鸟苷仅减少了倍，但在这种情况下，差异是显著的(图5E；表S1)。使用NanoTemper光谱位移溶液亲和力测量的正交方法证实了EMSA数据，76 bp双链RNA -三磷酸腺苷和 -三磷酸鸟苷的亲和力分别为3.2和 (图S10B和S10C)。

为了更深入地了解在分离条件下维甲酸诱导基因I与双链RNA之间相对于5’-末端核苷酸的相互作用，我们进行了维甲酸诱导基因I激活测量。基于之前的研究表明...

《分子细胞》

图4. -pppA和 -pppG 76碱基对双链小RNA水平与离散亚细胞检测结果相当

(A) 通过RT-qPCR测量的5’-pppA和5’-pppG 76碱基对双链小RNA水平，以GAPDH mRNA为对照进行标准化，并表示为相对于用5′-pppA 76碱基对双链RNA转染4小时的细胞的倍数变化。将HEK293细胞用0.1 ng/mL的5′-pppA或5′-pppG 76碱基对双链RNA转染，并孵育4或24小时。

(B) 通过RT-qPCR测量的5′-pppA和5′-pppG 76碱基对双链RNA的亚细胞分布。将HEK293细胞用0.1 ng/mL的5′-pppA或5′-pppG 76碱基对双链RNA转染，并孵育4或24小时。细胞质和细胞核部分之间的相对水平表示为相对于用5′-pppA 76碱基对双链RNA转染4小时的细胞的倍数变化。

(C) 仅用脂质体转染(C–)、3p-hpRNA(C+)或Alexa Fluor 647标记的76碱基对双链RNA(5′-pppA或5′-pppG；红色)转染的A549细胞的代表性荧光显微镜图像。细胞用识别双链RNA的J2抗体染色(绿色)，并用Hoechst 33342作为细胞核复染剂(蓝色，白色条， )。

(D) 总双链RNA信号强度和细胞内斑点的定量。数据表示为每个细胞或每个细胞核中Alexa Fluor 647标记的双链RNA斑点的数量、每个细胞或每个细胞核中J2抗体阳性双链RNA斑点的数量，以及Alexa Fluor 647标记的双链RNA或J2识别的双链RNA的平均斑点强度。

(E) Alexa Fluor 647标记的双链RNA与J2抗体染色之间信号共定位的定量，以曼德斯重叠系数表示。

(D和E) 数据是在每个转染条件下从三个独立的载玻片(n = 3)收集的，每个载玻片成像三个视野。使用带有Tukey检验的单因素方差分析或未配对的Welch’s 检验进行统计分析。统计学显著性:“ ”，“ ”，“* ”和“**** ”；ns表示无统计学显著性。

为了研究5’-三磷酸核糖核酸激活RIG-I的作用与其将ATP水解为ADP的能力之间的相关性，我们进行了ATP酶活性检测，以评估重组RIG-I与双链RNA结合后的活性。用于比较RIG-I与不同RNA结合活性的一个参数是所测试双链RNA的半数最大效应浓度 (图5C和5D)。体外转录76bp双链RNA的检测结果表明，三磷酸化双链RNA是最强的RIG-I激活剂，且5’-pppA之间存在差异和 -pppG 最小且无统计学意义。三磷酸缺失的双链RNA是效果较差的ATP酶激活剂，与电泳迁移率变动分析(EMSA)结果一致，刺激RIG-I的能力远低于。同样，合成的 -ppp双链RNA能强烈激活RIG-I， -pppA 和 -pppG 之间差异可忽略不计，而缺乏三磷酸基团的双链RNA -

《分子细胞》

图5. 双链RNA刺激下重组RIG-I结合亲和力和ATP酶活性的生化分析

(A和B) 使用电泳迁移率变动分析(EMSA)评估重组RIG-I与具有不同末端核苷酸( -pppA、 -pppG、 -OH-A和 -OH-G)的双链RNA的结合亲和力。图表表示在蛋白质浓度增加时与RIG-I结合的RNA比例。

(C和D) 在ATP酶分析中测量ATP向ADP的转化，以评估76 bp或24 bp双链RNA对重组RIG-I蛋白的激活。将四参数逻辑曲线(4PL)模型拟合到EMSA和ATP酶分析得出的数据，以获得结合的解离常数 (A和B)，以及ATP酶活性的双链RNA 的半数最大效应浓度(C和D)。

(E) 生化参数汇总表，包括和值及其相应的95%置信区间(Cls)，用于比较不同双链RNA变体的RIG-I结合亲和力和激活情况。误差条表示平均的标准误差。统计学显著性: ，表示无统计学显著性(表S1)。与效力显著降低(图5E；表S1)。

将这些结果与在人类和小鼠细胞上进行的实验相比较，我们推测双链RNA的免疫原性潜力可能仅部分由RIG-I蛋白与 -pppA和 -pppG双链RNA的直接结合亲和力差异来解释。然而，双链RNA的免疫原性潜力与激活RIG-I的能力并不严格相关，因为我们在ATP酶测定中未观察到差异。这表明在重组RIG-I蛋白的分离条件下，无法完全重现观察到的 -pppA与 -pppG双链RNA免疫原性潜力差异的机制。因此， -pppA和 -pppG双链RNA在RIG-I途径激活上的差异可能是由于生化测定中不存在的序列特异性细胞因子。

-三磷酸腺苷和 -三磷酸鸟苷双链RNA结合不同组的RNA结合蛋白(RBP)

为阐明 -三磷酸腺苷与 -三磷酸鸟苷双链RNA免疫原性差异背后的细胞机制，我们采用了

RNA下拉结合无标记定量质谱分析(RP-MS)，鉴定出对测试双链RNA表现出不同结合亲和力的蛋白质(图6A；图S11)。尽管大多数蛋白质在两种双链RNA之间表现出相似的结合，但有一部分蛋白质成为异常值(图6B)。5’-三磷酸腺苷体外转录76碱基对双链RNA下拉富集了大量参与核酸代谢、RNA稳定性或降解的蛋白质。值得注意的是，5’-三磷酸鸟苷体外转录的76bp双链RNA下拉了与翻译和RNA转运相关的蛋白质。在5’-三磷酸鸟苷体外转录的76bp双链RNA下拉实验中富集的相当一部分蛋白质具有GTP结合、小GTP酶结合或GTP酶活性，并参与翻译过程(图6C)。相反， -三磷酸腺苷体外转录的76bp双链RNA的结合蛋白很少被归类为单链RNA结合蛋白，考虑到在下拉实验中使用双链RNA分子作为诱饵，这有点出乎意料(图6D)。

为了进一步验证这些发现，我们使用HEK293细胞裂解物以及体外转录76碱基对或合成24碱基对双链RNA进行了RNA下拉蛋白质印迹分析(图6E和6F)。这些结果证实了nudix水解酶16(NUDT16)、RAN、RAS癌基因家族成员(RAN)和RAN结合蛋白1(RANBP1)与5’-三磷酸鸟苷体外转录76碱基对双链RNA及其较短类似物合成5’-三磷酸鸟苷24碱基对双链RNA的结合增加。同时，双链RNA结合蛋白、蛋白激酶R(PKR)和DExH盒解旋酶9(DHX9)以类似方式被 -三磷酸腺苷和 -三磷酸鸟苷双链RNA捕获，证实了双链RNA质量和上样量相同(图6E和6F)。

《分子细胞》

(下一页的图例)

令人惊讶的是，在 -pppA和 -pppG双链RNA之间未观察到RIG-I结合的明显差异。这可能表明RNA下拉法不够灵敏，无法检测到蛋白质亲和力的细微差异，或者在细胞内和体外条件下，影响 -pppA和 -pppG对RIG-I不同刺激的因素有所不同。最后，为了检查已鉴定蛋白质与测试双链RNA的结合对RNA 末端三磷酸基团存在的依赖性，我们还测试了去磷酸化的RNA。有趣的是，我们观察到从双链RNA上去除 -ppp基团不会影响RIG-I蛋白的结合，但会导致富含 -pppG的蛋白质与以鸟苷起始的去磷酸化RNA的结合完全受到抑制(图6E和6F)。

接下来，为了研究GTP结合蛋白对RIG-I-RNA相互作用的影响，我们在RNA下拉过程中向蛋白质提取物中引入了不可水解的GTP类似物。这种方法旨在占据GTP结合口袋，从而阻碍GTP结合蛋白与5’-pppG RNA的相互作用。事实上，添加GTP类似物导致NUDT16、RAN和RANBP1与双链RNA的结合完全被阻断(图6E和6F)。相比之下，参考蛋白DHX9和PKR与双链RNA的结合不受影响。综上所述，这些发现确定了与含有5’-pppG和 -pppA的双链RNA有不同结合的蛋白质，并表明GTP结合蛋白使用一个共享口袋来结合GTP和 -pppG RNA。

根据人类蛋白质图谱中每百万标准化转录本(nTPM)估计，5’-pppG双链RNA下拉质谱数据集(图S11)中几个最显著富集的候选蛋白的表达水平表明，许多蛋白的表达水平与常用管家基因相当或超过常用管家基因。例如，真核翻译延伸因子1α1(EEF1A1)、RAN和RANBP1在HEK293细胞中的表达水平分别为6661、1716和1005 nTPM，而GAPDH和ACTB的表达水平分别为3029和1565 nTPM。此外，如CRISPR功能丧失依赖性数据所示，几个候选蛋白对细胞活力至关重要。总之，这些特征使得对所有富集因子进行系统的功能丧失和组合基因剖析在技术上具有挑战性，并且对于一些蛋白质来说，与维持活细胞不兼容。尽管如此，我们生成了两个独立的缺乏NUDT16的基因敲除细胞系(图S12)，NUDT16是在我们所有的5’-pppG双链RNA下拉实验中一直强烈富集的一个因子(图S11)。我们选择NUDT16有两个原因。第一，在 -pppG双链RNA条件下，它在最富集的候选蛋白中反复出现。第二，在我们的质谱数据集中，在相应的5’-pppA双链RNA下拉实验中未检测到NUDT16(图S11)，使其成为一个可进行特异性测试且易于实验操作的候选对象。在NUDT16基因敲除细胞中，我们未观察到相对免疫原性的逆转，并且5’-pppA双链RNA仍比5’-pppG双链RNA具有更强的免疫原性。这表明在我们的系统中，仅NUDT16并非对这两种配体产生差异反应的主要决定因素。值得注意的是，相对于野生型细胞，我们确实观察到基因敲除细胞对对照3p-hpRNA的反应有增强的趋势。这与NUDT16可能依赖RNA背景发挥调节作用相一致。3p-hpRNA是一种体外转录(IVT)衍生的茎环结构，起始于5’-pppG，并且是比完全碱基配对的双链RNA更弱的RIG-I激动剂；因此，包括NUDT16在内的与5’-ppp RNA结合或加工的蛋白质丰度的适度变化，可能对这种次优配体产生比对更强的5’-pppA双链RNA反应更明显的影响。总体而言，这些结果鉴定出了此前未知的5’-序列特异性双链RNA相互作用因子，并反对单一主导因素决定 -pppA和 -pppG双链RNA免疫原性差异的观点。相反，它们支持一种模型，即 -pppG双链RNA受到大量且部分冗余的细胞蛋白质网络的调节，各个组分以RNA背景依赖的方式适度发挥作用。

核苷补救途径驱动的GTP增加使 -pppG和 -pppA双链RNA的免疫原性相等

为了评估GTP结合蛋白是否对细胞内RIG-I/IFN途径的激活有任何影响，我们旨在用升高水平的GTP使其饱和。为了实现这一点，我们通过用鸟苷补充生长培养基来刺激核苷补救途径(图7A)，从而提高细胞内GTP水平。作为对照，我们使用腺苷补充，这会导致ATP水平升高。将HEK293细胞在补充有鸟苷、腺苷或二甲基亚砜(用作载体对照)的培养基中培养。使用反相超高效液相色谱(UHPLC)，我们在细胞暴露于腺苷或鸟苷后测量细胞内ATP、GTP和对照代谢物的水平，包括二磷酸腺苷(ADP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和次黄嘌呤(HX)(图7B；图S13A)。鸟苷处理导致GTP浓度增加约4倍，达到每毫克总蛋白30 nmol，而腺苷不影响GTP水平，仅使ATP从每总蛋白30增加到，增加幅度不大且无统计学意义。NAD和NADP水平保持不变，而鸟苷处理后ADP和ATP均显著降低

图6. RNA下拉分析揭示RBP选择性结合 -pppA或 -pppG双链RNA

(A) RNA下拉测定的示意图。

(B) IVT 76 bp双链RNA变体的RNA下拉后无标记液相色谱 - 串联质谱(LC-MS/MS)结果。火山图表示富含带有5′-pppA或5′-pppG的双链RNA的蛋白质的差异分析结果。显著性阈值设定为10log 和。富含5′-pppA的蛋白质以绿色突出显示，而富含5′-pppG的蛋白质以蓝色显示。

(C和D) GO分析显示与差异富集蛋白质相关的主要生物学过程和分子功能。

(E和F) 通过RNA下拉和蛋白质印迹分析验证了在5′-pppG IVT 76 bp双链RNA上富集的与GTP结合活性相关的前三种候选蛋白质的结合。PKR和DHX9是双链RNA结合的阳性对照。在两种条件下评估蛋白质富集: -ppp的耗尽，以及用作为GTP结合蛋白抑制剂的不可水解GTP类似物处理。

《分子细胞》

图7. 通过核苷补救途径提高细胞内鸟苷三磷酸水平可最小化对5’-三磷酸腺苷和5’-三磷酸鸟苷双链RNA免疫反应的差异

(A) 鸟苷三磷酸补救途径示意图。

(B) 人胚肾293细胞经二甲基亚砜(溶剂)、腺苷(对照)或鸟苷处理48小时后的核苷酸谱(三磷酸腺苷、鸟苷三磷酸、二磷酸腺苷、NAD、NADP及次黄嘌呤) 。

(C和F) 人胚肾293细胞经二甲基亚砜(溶剂)、腺苷(对照)或鸟苷处理后，分别转染脂质体(C-)、体外转录的76碱基对dsRNA(5’-三磷酸腺苷或5’-三磷酸鸟苷来源，C)及合成的11碱基对维甲酸诱导基因I配体(F)，检测IRF3磷酸化及RIG-I蛋白水平的Western blot分析。

(D、E、G和H) 用二甲基亚砜(溶媒)、腺苷(对照)或鸟苷处理HEK293细胞，然后仅用脂质体转染(C–)、5’-pppA或5’-pppG体外转录76 bp双链RNA，或11 bp RIG-I配体后，对IRF3磷酸化(D和G)和RIG-I蛋白水平(E和H)进行光密度分析(n = 4，采用Sidak校正的双向方差分析)。统计学显著性:’ ，** ，*** ；ns表示无统计学显著性

处理。在此预处理之后，用带有5’-pppA或5’-pppG末端的76 bp双链RNA或11 bp合成RIG-I配体转染细胞，以评估嘌呤核苷酸库变化对双链RNA传感和信号传导的影响。补充鸟苷后，与用二甲基亚砜或腺苷处理的对照相比，用5’-pppA和5’-pppG双链RNA转染均导致IFN产生增加(图7C - 7H)。重要的是，在富含鸟苷的条件下，通过测量IRF3磷酸化和RIG-I水平评估的 -pppA和 -pppG双链RNA之间的IFN反应差异显著减小(图7C - 7H)。在预先暴露于腺苷或鸟苷的细胞中使用低分子量聚(I:C)的对照实验表明，与二甲基亚砜对照相比，聚(I:C)处理后，两种核苷均未改变IRF3磷酸化或RIG-I水平(图S13B和S13C)。这与对3p - hpRNA的反应形成对比(图S13B和S13C)，其中鸟苷而非腺苷增强了IRF3磷酸化和RIG-I水平。因为3p - hpRNA也以5’-pppG起始，这些结果提供了强有力的证据，即过量的GTP和GTP结合蛋白的隔离可增加RNA的免疫原性潜力，特别是那些带有5’-pppG的RNA。这些发现表明，细胞内GTP水平升高增强了RIG-I/IFN反应，并使通常结合5’-pppG双链RNA并通过空间位阻干扰阻断RIG-I识别的GTP结合蛋白饱和。

总之，我们的研究表明，与以 -pppG起始的相应RNA相比，以 -pppA起始的双链RNA引发更强有力的RIG-I/IFN反应。观察到的现象在各种测试的RNA和细胞系中以及在小鼠和人类细胞中均成立。我们的工作假设提出，在细胞环境中，GTP酶和GTP结合蛋白阻碍 -pppG RNA对RIG-I的激活，从而降低其免疫原性。

讨论

病毒具有一些保守特征，如无帽的5’-三磷酸末端、未甲基化的富含C-磷酸-G(CpG)的基序和双链RNA。这些特征在真核宿主RNA中通常不存在或被掩盖，但能被包括RIG-I在内的先天免疫蛋白识别。在病理条件下，宿主RNA也能激活RIG-I。为避免错误激活，宿主RNA进化出了限制先天免疫识别的特征。这些特征包括RNA聚合酶II转录的mRNA上的帽结构和核苷酸修饰， RNA聚合酶I转录的rRNA上的特定切割模式和化学修饰，以及通过双特异性磷酸酶11(DUSP11)等磷酸酶从RNA聚合酶III转录本中去除 -三磷酸末端。此外，亚细胞区室化，包括受限的线粒体双链RNA，进一步减少了不必要的免疫检测。{{F�}}总体而言，这些适应性变化确保了在生理条件下，宿主RNA在很大程度上不会被先天免疫系统检测到。

在此，我们提出了一个关于RIG-I对序列特异性RNA的识别以及由此引发的I型干扰素反应激活的概念模型。在这个模型中，内源性RNA，代表- 在此，我们提出了一个关于RIG-I对序列特异性RNA的识别以及由此引发的I型干扰素反应激活的概念模型。在这个模型中，代表高等真核生物中大多数RNA聚合酶III转录本的内源性RNA，以及某些高致病性病毒，起始于 -三磷酸鸟苷。由于GTP结合蛋白和GTP酶的干扰，这些RNA可能作为相对较弱的RIG-I激动剂。GTP酶以纳摩尔亲和力结合GTP，而ATP酶通常在高微摩尔范围内结合ATP。最近的一项研究表明，GTP结合亲和力比ATP酶高约3000倍。这可能解释了为什么具有 -三磷酸鸟苷的RNA比具有 -三磷酸腺苷末端的RNA受到的影响更大。与其他机制，如DUSP11介导的去磷酸化一起，这可能有助于此类RNA尽量减少被RIG-I途径检测到。相反，以 -三磷酸腺苷起始的RNA，如IAV或HCV等病毒的典型特征，具有更大的激活RIG-I/干扰素途径的潜力，这促使它们进化出免疫逃避策略。在IAV中，NS1蛋白破坏了几种宿主免疫功能，而在HCV中，携带 -三磷酸腺苷但不携带 -三磷酸鸟苷的亚型被FAD加帽。尽管一些报告表明FAD可能不会阻碍RIG-I。 IAV还利用 -帽抢夺来隐藏其转录本，使其不被先天传感器检测到，并支持帽依赖性翻译。我们的结果表明，体外转录产生的或化学合成的具有 -三磷酸腺苷的双链RNA比具有 -三磷酸鸟苷的双链RNA更具免疫原性。之前已经观察到短双链RNA有类似差异，但尚未深入研究。支持这一点的是，带有5’-三磷酸腺苷的RNA聚合酶III转录本Y5 RNA的表达水平明显低于其他带有5’-三磷酸鸟苷的Y RNA(图S1)，并且保留在细胞核中。总之，这些发现表明，病毒中更具免疫原性的 -三磷酸腺苷末端的保留可能反映了启动子和聚合酶功能的限制。相反，升高的干扰素信号可能有助于维持病毒复制的平衡，使其能够在不杀死宿主的情况下传播。

用 -pppA或 -pppG双链RNA转染时，I型干扰素诱导的最大差异出现在非常低的浓度下。这可能代表病毒感染的早期阶段，这对于产生有效的细胞反应至关重要。同样，西尼罗河病毒复制过程中产生的低水平免疫原性病毒RNA可以激活RIG-I。在测试的最高双链RNA浓度下( 针对IVT 76 bp双链RNA和针对合成24 bp双链RNA)， -pppA和 -pppG变体之间未观察到显著差异。这意味着参与反应的内源性因素在高RNA浓度下可能会饱和。有趣的是，Ren等人报道，以 -pppA或 -pppG开头的双链RNA在干扰素诱导方面没有差异。这种差异可能是由于RNA浓度和底物设计的不同。他们的研究使用了完全互补的双链RNA，两端暴露，浓度为，相当于约。相比之下，我们IVT产生的76-bp双链RNA在浓度为 (相当于 )时表现出最佳结果，在浓度为 (相当于 )及更高时，干扰素诱导没有明显差异。此外，尽管迄今为止报道的最短的RIG-I激动剂是和，但总体配体长度对于RIG-I识别至关重要。支持这一点的是，Te Velthuis等人证明，56-125 nt的IAV衍生的微型病毒RNA触发了最高的干扰素启动子活性。

为了研究为什么 -pppA和 -pppG双链RNA对RIG-I/I型干扰素信号的激活存在差异，我们使用了互补的

《分子细胞》

文章生化和细胞方法。生化分析具有条件明确的优点，通过直接结合测量可以精确表征分子相互作用。使用这种方法，我们观察到RIG-I与 -pppA双链RNA的结合亲和力略高于与 -pppG双链RNA的结合亲和力。先前的研究表明，RNA与RIG-I的更强结合与RIG-I/干扰素途径的更大激活相关。这些发现表明核苷酸的身份可以影响双链RNA的免疫原性。相比之下，通过ATP消耗评估的RIG-I活性在与 -pppA或 -pppG双链RNA结合时没有显著差异(图5)。其他研究表明，ATPase活性不能完全反映RIG-I的激活，RIG-I的激活主要取决于ATP结合和构象变化，而不是ATP水解本身。因此，生化分析没有完全解释观察到的5’-pppA和5’-pppG双链RNA免疫原性之间的差异。

为解决这一问题，我们研究了是否有其他细胞因子导致这些双链RNA对RIG-I/IFN途径的差异激活。细胞分析显示，两种双链RNA变体的水平相似，但与 -pppA相比， -pppG的核定位更高。这表明，与 -pppA相比， -pppG双链RNA从细胞质RIG-I中的部分隔离可能会降低其免疫原性，这表明存在区分这些双链RNA的蛋白质因子。一致地，RNA下拉结合质谱分析表明，即使是单个核苷酸差异也会改变蛋白质结合谱并富集不同的蛋白质组。有趣的是，当使用5’-pppA双链RNA作为诱饵时，尽管双链RNA固定在树脂上，但通常与单链RNA相关的蛋白质被富集。这表明A-U碱基对较低的稳定性可能允许解旋酶或裂解物中的其他RNA结合蛋白使双链部分或完全解旋，将瞬时单链RNA区域暴露给单链RNA结合蛋白。相比之下，对 -pppG双链RNA下拉产物的基因本体分析揭示了九种被归类为GTP酶或GTP结合蛋白的蛋白质。其中，NUDT16是一个特别值得注意的发现。NUDT16是一种已知的去帽酶，可催化小核仁RNA(snoRNA)和mRNA中帽结构的切割。在这里，我们发现它与未加帽的双链RNA结合，这是以前未报道过的相互作用。我们的结果进一步表明，它与短双链RNA的结合严格取决于 -pppG部分的存在，并且通过用不可水解的GTP类似物阻断NUDT16的GTP结合口袋而被破坏。虽然我们没有发现NUDT16与RIG-I/IFN途径的激活或抑制直接相关，但新出现的证据表明它通过调节炎症mRNA周转和维持免疫细胞中的基因组完整性来促进先天免疫。它的表达在脓毒症等炎症条件下上调，表明在控制先天免疫反应中具有潜在的调节作用。重要的是，我们的蛋白质组学结果表明，RIG-I/IFN途径的差异激活可能由与5’-pppG双链RNA优先结合的多种蛋白质的冗余性和高细胞丰度决定(图S11)，但不排除其中存在关键因子。少数5’-pppG双链RNA结合蛋白，包括EEF1A1、RAN和RANBP1，其水平超过或与常用的看家基因相当。此外，CRISPR功能丧失数据表明，许多候选基因对细胞活力至关重要。这使得对所有富集因子进行系统的功能丧失和功能获得实验在技术上具有挑战性，并且对于几种蛋白质来说，与维持活细胞不相容。保留基因。此外，CRISPR功能丧失数据表明，许多候选基因对细胞活力至关重要。这使得对所有富集因子进行系统的功能丧失和功能获得实验在技术上具有挑战性，并且对于几种蛋白质来说，与维持活细胞不兼容。

特别重要的是，在鸟苷补救途径受到刺激时， -pppG双链RNA对RIG-I/IFN途径的激活作用增强。结合当GTPase的GTP结合口袋被占据时其与双链RNA的相互作用被破坏这一发现，这表明鸟苷三磷酸(GTP)水平升高可能会减轻GTPase和 -pppG双链RNA的抑制作用。许多病毒感染会引发宿主信使核糖核酸(mRNA)降解，通过补救途径增加核苷酸前体，病毒利用这些前体来支持复制。我们的研究结果表明，包括GTP在内的核苷酸水平的这种增加，也可能通过增强RIG-I/IFN途径的激活而使宿主受益。带有5’-pppG末端的内源性RNA聚合酶III转录本，如Y RNA，可能作为化学计量的免疫刺激配体，并在感染期间促进先天免疫反应。除了RNA病毒，DNA病毒也可以产生被RIG-I识别的RNA，并且可能含有抑制RIG-I活性的因子。一些DNA病毒，包括爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，产生具有5’-pppA末端的RNA，这可能具有高度免疫原性。 EBV感染还与自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、多发性硬化症、和类风湿性关节炎有关。因此，EBV可能促成自身免疫性疾病的发作或加重。然而，这种RNA在自身免疫性疾病中的确切作用仍不清楚，需要进一步研究病毒与宿主的相互作用。

总之，我们的结果表明，细胞中RIG-I对无帽双链RNA的准确识别可能依赖于特定末端 -ppp核苷酸的存在以及周围的细胞蛋白环境，含有5’-pppA的RNA比含有5’-pppG的RNA更具免疫原性。RIG-I/IFN途径中这种以前未知的序列特异性信号传导方面，对于推进相关知识以及设计针对致病性病毒和参与自身免疫的宿主RNA的策略将具有重要意义。

研究的局限性

尽管我们证明了含有5’-pppA的双链RNA比含有5’-pppG的双链RNA具有更强的免疫原性，但我们无法直接证明体外转录的RNA Pol III转录本或RNA病毒也是如此。这主要反映了转录从 -pppA开始时IVT倾向于产生更多具有免疫原性的双链RNA副产物，以及病毒启动子序列的进化和机制限制。未来的研究应该检查内源性修饰的RNA Pol III转录本或更广泛的病毒诱变。然而，任何改善先天免疫逃逸的病毒修饰都应谨慎考虑。此外，除了GTP结合蛋白对5’-pppG的封闭作用外，其他机制也可能导致5’-pppA和5’-pppG RNA之间免疫原性的差异。例如，一些蛋白质可能通过额外的解旋酶活性或蛋白质-蛋白质相互作用增强RIG-I对 -pppA RNA的反应。此外，RNA结合蛋白是使用全细胞提取物而不是细胞质部分鉴定的，而细胞质部分可能与RIG-I的定位和功能更相关。尽管如此，我们的结果具有重要意义，并为未来研究RNA驱动的自身免疫性疾病、RNA病毒免疫原性以及根据对先天免疫途径的预期影响合理设计RNA治疗药物提供了有力依据。

资源可用性

主要联系人

如需进一步信息以及资源和试剂相关请求，请联系主要联系人Gracjan Michlewski(gmichlewski@iimcb.gov.pl)。

材料可用性

本研究中产生的所有质粒和细胞系可应要求提供。

数据和代码可用性

• RNA测序数据已存入序列读取存档库(生物项目编号#PRJNA1418010)。蛋白质组学数据可通过蛋白质组交换/PRIDE (#PXD065769)获取。原始图像和凝胶已存入Mendeley数据(DOI:https://doi.org/10.17632/hx3s69gc4y.1)。截至发表日期，所有数据均公开可用，补充信息可在线获取。
• 本文未报告原始代码。
如需重新分析本文数据所需的其他信息，可向主要联系人索取。

致谢

该项目由马克斯·普朗克学会发起的DIOSCURI计划资助，与波兰国家科学中心联合管理，并由波兰科学和高等教育部以及德国联邦研究、技术和太空部共同资助(G.M.获得#2019/ 02/H/NZ1/00002)；波兰国家学术交流机构在波兰归国计划内提供资助；以及国家科学中心(G.M.获得#2021/01/1/NZ1/00001)。这项工作还得到了华沙国际分子和细胞生物学研究所的法定资金支持。本研究得益于IIMCB IN-MOL-CELL基础设施(RRID: SCR_021630)，该设施由欧盟 - 下一代欧盟根据国家复苏和韧性计划资助。IN-MOL-CELL基础设施还得到了欧盟在“地平线欧洲”框架下资助的RACE项目(#101059801)以及波兰科学基金会IRAP计划下开展的RACE-PRIME项目的支持，该项目由欧盟在2021 - 2027年欧洲智能经济基金(FENG)下共同资助。J.S.N.由“地平线2020”(#101001394，SG)资助。资金来自德国研究基金会(DFG)根据德国卓越战略(#EXC2008 - 390540038 - UniSysCat以及J.R.获得#449713269和G.H.获得#EXC2151 - 390873048)。G.H.获得了DFG #TRR237、DFG #TRR259以及DZIF #TTU07.834的资助。惠康细胞生物学中心由惠康信托基金的核心资金支持(#203149)。开放获取费用的资金来源:DIOSCURI中心。

细胞内核苷酸测量由Barbara Ku-tryb-Zajac博士、Alicja Braczko博士和Krzysztof Urbanowicz(格但斯克医科大学实验心脏肿瘤学中心)进行。图1A、2A、2B、6A、7A、S3E、S4A和S5A以及图形摘要由BioRender.com创建。

作者贡献

G.M.构思研究；M.W.、J.S.和G.M.设计实验；M.W.、J.S.、I.T.、Z.N.、N.I.、E.N.、M.L.、E.B.、A.B.、J.S.N.、T.T.和C.W.执行实验；M.W.、J.S.、I.T.、Z.N.、N.I.、M.L.、E.B.、A.B.、J.S.N.、G.H.、J.R.

G.M.分析了数据；M.W.、J.S.和G.M.在所有作者的参与下撰写了手稿。所有作者均批准了最终手稿。

利益声明

作者声明不存在利益冲突。

《明星方法》

本文在线版本提供了详细方法，包括以下内容:

• 关键资源表
• 实验模型和研究参与者详情 - 细胞培养
• KO细胞的生成和来源
• 方法详情
• 体外转录反应
• 化学RNA合成
• 夹板连接
• 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 在细胞培养物中转染RNA
• HEK - 蓝色I型干扰素检测
• 蛋白质免疫印迹分析
• 蛋白质免疫印迹的光密度分析
• RNA提取和逆转录定量聚合酶链反应
• RNA测序分析
• 总细胞和亚细胞组分中双链RNA的定量分析
• 荧光RNA制备
• 双链RNA的免疫荧光染色
• 电泳迁移率变动分析(EMSA)
• 结合亲和力的光谱位移分析
• RIG-I ATP酶活性测定
• RNA下拉实验
• 质谱分析
• 基于小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的mKate2/IFN- 活性测定
• 重组RIG-I蛋白的制备
• 核苷酸补救途径的诱导
• 细胞内核苷酸浓度的测定
• 序列标识和5’核苷酸变异性分析
• 定量与统计分析

补充信息

补充信息可在https://doi.org/10.1016/j.molcel.2026.04.014在线获取。

收到日期:2025年7月25日

修订日期:2026年2月25日

接受日期:2026年4月15日

参考文献

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5'-pppA,5'-pppG,RIG-I,GTP,病毒RNA,RNA药物

无

一种用于蛋白质靶向和结合测定的定量、无标记视觉干涉比色测定平台

无

一种用于蛋白质靶向和结合测定的定量、无标记视觉干涉比色测定平台

表观信息

5’-三磷酸鸟苷RNA招募GTP结合蛋白以抑制RIG-I/Ⅰ型干扰素信号传导

2026-09-14

一种用于蛋白质靶向和结合测定的定量、无标记视觉干涉比色测定平台

2026-09-14

未折叠蛋白反应通过提高BMI1水平使KAT2B泛素化，从而抑制KAT2B/MLKL介导的肝细胞坏死性凋亡