RAB样蛋白2在男性生育、精子鞭毛内运输及尾部组装中起关键作用
发布时间：
2026-03-16 21:55
RAB样蛋白2在男性生育、精子鞭毛内运输及尾部组装中起关键作用
詹妮弗·C·Y·罗 ，杜昂蓬·占赛 ，安妮·E·奥康纳 ，克莱尔·博格 ，布雷特·J·克拉克 ，詹姆斯·C·惠斯托克 ，马克·C·菲尔德 ，维基·亚当斯 ，石川智本 ，R·约翰·艾特肯 ，贝琳达·惠特尔，克里斯托弗·C·古德诺4，克里斯托弗·J·奥曼迪 ，莫伊拉·K·奥布赖恩 *
1 解剖学与发育生物学系，莫纳什大学，墨尔本，维多利亚州，澳大利亚；2 生物化学与分子生物学系，莫纳什大学，墨尔本，维多利亚州，澳大利亚；3 病理学系，剑桥大学，剑桥，英国；4 澳大利亚表型组学设施，约翰·柯廷医学研究学院，澳大利亚国立大学，堪培拉，澳大利亚首都直辖区；5 环境与生命科学学院，纽卡斯尔大学，卡拉汉，新南威尔士州，澳大利亚；6 加文医学研究所，达令赫斯特，新南威尔士州，澳大利亚
摘要
相当比例的年轻男性不育，而对于大多数人来说，潜在原因仍不明。然而，男性不育常与精子运动能力缺陷有关，其中精子尾部是一种特化的鞭毛/纤毛。相反，对尾部形成所涉及的关键机制有更深入的了解，可能会带来避孕机会，或者更广泛地说，为全球纤毛缺陷提供治疗策略。在此，我们确定了RAB样蛋白2(RABL2)是精子尾部组装和功能的必要条件。RABL2是RAS GTP酶超家族中一个特征不明的分支成员。RABL2在发育中的雄性生殖细胞中高度富集，定位于精子尾部的中段。在其他含有活动纤毛的组织中观察到较少的Rabl2 mRNA。使用免疫共沉淀方法和RABL2亲和柱，随后进行免疫化学分析，我们证明在发育中的单倍体生殖细胞内，RABL2与鞭毛内运输(IFT)蛋白相互作用，并将一组特定的效应(货物)蛋白，包括糖酵解途径的关键成员，递送至精子尾部。RABL2与效应蛋白的结合受GTP调节。RABL2功能紊乱，如Mot小鼠品系，其关键蛋白-蛋白相互作用结构域发生突变，导致雄性不育，表现为精子产量减少、精子运动异常和尾部短小。我们的数据证明了RABL蛋白家族的新功能、RABL2在男性生育中的关键作用以及一种以前未被描述的蛋白递送至鞭毛的机制。
引用:罗JCY，占赛D，奥康纳AE，博格C，克拉克BJ等。(2012年)RAB样蛋白2在男性生育、精子鞭毛内运输及尾部组装中起关键作用。《公共科学图书馆·遗传学》8(10):e1002969。doi:10.1371/journal.pgen.1002969
编辑:苏珊·K·达彻，美国华盛顿大学医学院
2012年3月17日收到；2012年8月8日接受；2012年10月4日发表
版权:© 2012年罗等人。这是一篇开放获取文章，根据知识共享署名许可协议分发，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
资助:本研究得到了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会(NHMRC)授予莫伊拉·K·奥布赖恩(#606445)和克里斯托弗·J·奥曼迪的资助、澳大利亚研究理事会(莫伊拉·K·奥布赖恩、R·约翰·艾特肯和克里斯托弗·J·奥曼迪)、新南威尔士州癌症理事会(克里斯托弗·J·奥曼迪)、新南威尔士州癌症研究所(克里斯托弗·J·奥曼迪)、法国巴黎银行澳大利亚和新西兰分行(克里斯托弗·J·奥曼迪)、RT霍尔信托基金(克里斯托弗·J·奥曼迪)以及国家乳腺癌基金会(克里斯托弗·J·奥曼迪)的资助。詹妮弗·C·Y·罗获得了NHMRC博士奖学金。莫伊拉·K·奥布赖恩和克里斯托弗·J·奥曼迪获得了NHMRC高级研究奖学金(#545805和#481310)。克里斯托弗·C·古德诺获得了NHMRC澳大利亚奖学金。詹姆斯·C·惠斯托克获得了澳大利亚研究理事会联合会奖学金。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决策或稿件准备过程中没有参与。
利益冲突:作者声明不存在利益冲突。
* 电子邮件:moira.obryan@monash.edu
引言
不育症影响着至少二十分之一的育龄男性[1]，而对于大多数患者来说，潜在的致病机制仍然未知。这一点，以及缺乏有效的男性避孕药，根源在于对形成功能性精子所需的基因和途径的基本认识不足。
精子在睾丸的生精上皮内通过一系列过程产生，包括干细胞更新、减数分裂和一个称为精子形成的彻底分化过程，其中单倍体生殖细胞被转化为具有运动和受精潜力的高度极化细胞。哺乳动物的精子尾部，与所有物种的活动纤毛和鞭毛一样，其核心包含一个由9+2微管排列组成的轴丝。轴丝从精子头部底部的中心粒/基体发育而来，其功能是代谢ATP并产生微管滑动和运动[2]。然而，与大多数其他纤毛不同的是，精子尾部具有周边排列的附属结构，包括纤维鞘和外致密纤维，它们赋予尾部摆动方向性、防止剪切力，并且就纤维鞘而言，是参与糖酵解和产生至少一部分作为轴丝运动燃料所需ATP的酶的支架[3]。精子尾部组装的机制几乎完全未知。精子轴丝功能缺陷会导致弱精子症(异常精子运动)[4]。活动轴丝功能的整体缺陷会导致原发性纤毛运动障碍(PCD)，这是一种以反复呼吸道感染、男性不育、右位心(卡塔格内综合征)和脑积水等多种表现为特征的综合征[5]。
通过随机诱变方法，我们确定RABL2对精子尾部功能和男性生育能力至关重要。RABL蛋白是Ras GTPase超家族中一个特征不明确的亚家族，最初在锥虫和衣藻中被发现是初级纤毛功能所需的鞭毛内运输(IFT)颗粒的重要组成部分[6,7]。在这里，我们证明了RABL2对精子
作者总结
为了满足二十分之一不育育龄男性的医疗需求，更深入地了解男性生育机制至关重要。相反，仍然迫切需要更多的避孕选择，包括那些针对雄性配子的选择。为了填补这些知识空白，我们使用随机诱变方法培育了Mot小鼠品系，并确定RABL2是男性生育能力的重要调节因子。携带突变Rabl2基因的小鼠由于精子运动能力严重受损而不育。通过生化方法，我们发现RABL2与鞭毛内运输机制的成分结合，并鉴定了一些RABL2结合(效应)蛋白。RABL2中Mot突变的存在导致将结合蛋白输送到精子尾部的能力显著受损。RABL2主要在雄性生殖细胞中产生；然而，在含有活动纤毛(参与液体/细胞运动的毛发状结构)的器官中也有较低水平的产生，因此增加了RABL2可能参与统称为原发性纤毛运动障碍的更广泛人类疾病的可能性。鞭毛，一种活动纤毛组装。从生化角度来看，RABL2的功能受GTP调节，它与IFT复合体B机制的成分结合，并参与将一组货物蛋白输送到发育中的鞭毛或鞭毛内。
结果/讨论
RABL2是男性生育所必需的
为了鉴定与雄性生育力密切相关的基因，我们使用N-乙基亚硝基脲(ENU)对小鼠基因组进行随机诱变。小鼠在C57BL6背景上发生突变，然后与CBA品系杂交两代以促进突变定位，之后通过杂交将小鼠维持在混合背景上。通过育种试验鉴定携带导致雄性不育突变的小鼠品系[8,9]。Mot品系呈现出雄性不育，频率为四分之一，因此强烈提示为隐性突变。定位将因果突变缩小到15号染色体上的一个区域(碱基对64,938,858和93,141,531)，该区域包含49个基因。在这些基因中，如EST表达数据库所示，32个在睾丸中表达，因此可能与Mot表型有关。对所有32个基因的蛋白质编码区和内含子-外显子边界进行扩增和测序，在所有受影响的雄性(Rabl2Mot/Mot)的Rabl2基因外显子5中鉴定出一个纯合的A到G突变(图1A)。在连锁区域内未发现其他突变。未受影响(可育)的雄性具有纯合野生型等位基因(Rabl2WT/WT)或野生型和Mot等位基因的杂合子(Rabl2WT/Mot)。Mot突变导致预测的RABL2同工型1(ENSMUST00000058058)和2(ENSMUST00000023294)的第73位氨基酸处的天冬氨酸(D，带负电荷)被甘氨酸(G，非极性)取代，而预测的同工型3(ENSMUST00000094056)由于外显子3-5通过剪接被去除而不会改变(图1A-1B)。因此， 雄性由于RABL2同工型1和2中的单个氨基酸取代而不育。
值得注意的是，在回交到纯C57BL6背景7代后，D73G突变与雄性不育之间的频率和100%关联未改变，这进一步证明Rabl2突变是该表型的病因(数据未显示)。如本文所示，结果是使用混合背景小鼠产生的。
Mot雄性不育是由于单倍体生殖细胞发育异常和精子运动性丧失
对出生后发育和精子发生建立过程中不同年龄睾丸的定量PCR分析显示，同工型2的mRNA表达水平高，同工型1的mRNA表达水平低(图2A)。同工型1和2在出生后第18天表达最高，此时单倍体生殖细胞首次出现在生精上皮中(图2B-2C)。使用针对RABL2同工型2产生的单克隆抗体进行免疫荧光标记，证实RABL2主要定位于睾丸的单倍体区室(图2D)。在附睾精子中，RABL2定位于尾部的中段(图2D)。在免疫荧光标记之前用免疫肽预吸收抗体导致染色消除(图2D插图)，从而支持免疫标记的特异性。来自Rabl2 动物的睾丸切片的免疫荧光标记导致RABL2的定位与野生型样品中观察到的相似(图2D)。
所有接受检测的Rabl2 雄性小鼠与野生型雌性小鼠配对时均不育(在长达6个月的时间内，每组n≥20只)。除了普遍的雄性不育外， 雄性小鼠外表健康，体重正常(图S1)，并且至少在10周龄时组织被采集用于分析之前，表现出正常的交配行为。为了确定雄性不育的细胞原因，使用Borg等人 [10] 概述的策略对小鼠进行表型分析。Rabl2 雄性小鼠的睾丸包含所有生殖细胞类型(图3A - 3B)，然而，与野生型同窝小鼠相比，睾丸重量减少了15%(91.8毫克对78.3毫克，p = 0.0094，每组n = 6)(图3C)。对每日精子产生量的分析，通过Triton X - 100抗性细胞核的数量来表示，发现Rabl2 雄性小鼠的精子产量减少了49%(1.82 对0.93 ，n = 6)(图3D)。总体而言，这些数据表明生殖细胞在精子发生后期丢失，在此期间它们对睾丸总重量的贡献相对较小。
大量精子确实到达了 雄性小鼠的附睾，因此可用于射精和受精(图S1B - S1C)。精子结构表面上看起来正常(图3E与图3F)。同样，电子显微镜显示轴丝和附属结构(外致密纤维、纤维鞘和线粒体鞘)均无明显结构异常(图3I - 图3J，n = 2种不同基因型动物，每种动物10个精子)。然而，对Rabl2Mot/Mot雄性小鼠精子的计算机辅助精子分析显示，总活力较低(70.3%对51.8%，每种基因型 )，渐进性活力极小(44.1%对7.4%，每种基因型 )(图3G)。这些数据强烈表明， 雄性小鼠不育是由于交配后精子无法进入雌性生殖道所致。
RABL2在进化上是保守的
序列分析确定Rabl2是Ras GTPase超家族中特征描述较少的Rab样进化枝的一个未表征成员 [11]。如图S2所示，RABL2与RAB家族成员具有显著的序列相似性和可能的进化起源，然而，它在超家族中形成了一个独特的分支——因此得名“Rab样”。RABL蛋白的定义是与Rab进化枝密切相关，但由于缺乏一个或多个亚家族特异性因子而被排除在Rab进化枝之外 [12 - 14]。特别是，来自多种生物体的预测RABL2蛋白缺乏典型的C末端异戊二烯化信号，未被Rabifier [14] 鉴定为Rab蛋白，并且在使用包含真核生物中Rab蛋白多样性的选定Rab序列训练集进行系统发育分析时被排除在Rab进化枝之外 [15]。
图1. Mot小鼠品系在Rab/2基因中存在一个点突变。(A) Mot品系在第5外显子的第一个密码子中存在一个A到G的替换，这将影响RABL2亚型(转录本)1和2，但不影响假定的亚型3。方框表示外显子(白色是非编码序列[1]，黑色是蛋白质编码序列)，线条表示内含子。箭头表示启动子的位置和转录方向。ATG表示翻译起始位点。(B) Rab12 突变导致一个进化上保守的天冬氨酸(D)转变为甘氨酸(G)(箭头)。(C) RABL2包含RAB蛋白中参与GTP结合的所有五个共有基序。每个阴影框下方显示共有基序序列，框内显示实际的RABL2序列。星号表示Mot突变的位置。
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尽管确切的生物化学机制仍有待确定，但最近的数据表明两种RABL蛋白在纤毛/鞭毛发育中发挥作用。特别是，布氏锥虫中Rabl5的失活导致鞭毛发育不良和无法运动[6]，而IFT27(RABL4)是IFT(鞭毛内运输)复合体B机制的核心成分，在衣藻中从生长的鞭毛尖端进行蛋白质的顺向运输中发挥作用，并且在哺乳动物中也发现了RABL4[16 - 18]。与复合体B的其他成员一样，Ift27 RNA干扰会导致纤毛发育不良[7]。
在人类基因组的22q13.33染色体上可见一个RABL2基因(称为RABL2B)[19](蛋白质同一性为88.7%)，许多物种中都存在直系同源物，包括有鞭毛的绿藻衣藻(同一性为49%)和锥虫物种(同一性为51%)(图1B)。在智人中，我们注意到RABL2有一个旁系同源物扩展(RABL2A)。由于旁系同源物之间只有四个氨基酸变化，其功能意义尚不清楚。在含有纤毛的物种中存在RABL2直系同源物的一个显著例外是在果蝇中，未鉴定到直系同源物。通过反向BLAST搜索确定，在缺乏纤毛/鞭毛的生物体中不存在Rabl2直系同源物，这表明RABL2在纤毛/鞭毛功能中具有进化上保守的作用，并且与真正的IFT因子IFT22/RABL5的系统发育分布高度相似[6]。
使用全人类睾丸mRNA对RABL2A和RABL2B进行RT - PCR表明，这两个旁系同源物在睾丸中均有表达(数据未显示，MKOB)。EST表达数据表明，RABL2A在包括脑、子宫、睾丸、肺、眼和前列腺以及一系列癌组织在内的广泛组织中表达(Unigene条目Hs.446425)。EST表达数据表明，RABL2B主要在脑、睾丸和子宫中表达，在一系列其他组织中的表达量较少(Unigene条目Hs.584862)。
值得注意的是，在所有检测物种中所有可能的直系同源物中，天冬氨酸73都是保守的，因此表明它在RABL2功能中起关键作用(图1B)。对等量的Rabl2WT/WT与Rabl2 雄性小鼠精子提取物进行蛋白质印迹分析，结果显示蛋白质水平相当，这表明该表型不太可能是由于mRNA或蛋白质不稳定造成的，而是由于特定的氨基酸变化(图3H)。这些数据还表明，D73突变并不妨碍RABL2进入鞭毛/纤毛区室。野生型与突变型睾丸组织切片中RABL2的免疫荧光定位也支持了这一结论(应考虑突变动物中伸长的精子细胞数量减少)(图2D)。
图2. Rabl2的表达与定位。(A)成年小鼠睾丸表达Rabl2同工型1和同工型2的mRNA，其中同工型2表达量更高。每种基因型N = 3只小鼠(*** p<0.001)。出生后发育中的睾丸中Rabl2同工型1(B)和同工型2(C)的相对表达表明，这两种同工型主要在出生后第20天首次出现的单倍体生殖细胞中产生。将第0天的值设为1，所有其他年龄相对于该值表示。(D)野生型和Mot纯合突变体睾丸组织及附睾尾精子中RABL2的定位(红色)。插图显示在免疫荧光之前用过量免疫肽预吸收一抗时获得的染色。白色箭头指示精子尾部中段的位置。黄色箭头指示主段的位置。DNA用DAPI标记(蓝色)。成年组织中Rabl2同工型1(E)和2(F)的相对表达。每组N = 3只小鼠。将睾丸设为1，所有其他组织相对于该值表示。
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图3. 在RablZ 雄性中观察到的不育表型。10周龄野生型(A)和RablZ (B)雄性的睾丸组织学切片。切片用PAS染色。精子发生在质量上看起来正常。比例尺代表100 µm。(C)与野生型(WT)同窝仔相比，Rabl2 (突变体)动物的睾丸重量显著降低。(D)10周龄野生型(WT)和Rabl2Mot/Mott(突变体)雄性的每日精子产量。野生型(WT)(E)和Rabl2Mott/Mut(突变体)的苏木精和伊红染色精子显示基因型之间没有明显差异。比例尺代表 (G)然而，与野生型(白色)同窝仔的精子相比，9周龄Rabl2 (黑色)的精子在任何形式的运动能力上都有显著受损，并且在渐进性运动能力方面有非常明显的缺陷。(H)来自四种不同野生型和三种不同Rabl2 雄性(每条泳道一只小鼠)的精子用于检测RABL2蛋白
内容。使用精子头部蛋白ACRBP对蛋白质上样进行标准化。(J - K)野生型(WT)(I)和Rabl2MorMot雄性(J)精子中段横截面的电子显微镜检查显示超微结构没有明显差异。(I)野生型(WT)和Rabl2Mot/Mot(突变体)雄性精子尾部的长度。(* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001)。
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与RAB GTPases一样，RABL2拥有GTP结合所需的所有五个共有基序(图1C)，但它缺乏经典上与RAB功能相关的膜相互作用所需的C末端异戊二烯化信号[20]。RAB蛋白中参与GTP/GDP结合的基序的存在(图1C)增加了RABL2也可能在GTP结合的“活性”形式和GDP结合的“非活性”形式之间循环的可能性。
为了预测Mot突变对RABL2功能的影响，从而预测观察到的雄性不育的潜在生化原因，将RABL2蛋白序列与多种相关Ras GTPases的结构进行比对。分析表明，Mot突变发生在一个 - 折叠中心的RABL特异性氨基酸中，该折叠对于介导整个超家族的一系列蛋白质 - 蛋白质相互作用至关重要(例如与胍解离因子和胍交换因子GEF，DRRA复合的RAB1B:pdb标识符3JZA(图S3)。在RAB蛋白的背景下，GEF蛋白的功能是促进核苷酸结合位点中GDP与GTP的交换，从而将RAB从非活性状态转变为活性状态，在该状态下它们能够结合一组特定的效应蛋白。如果RABL亚组中保持相同的生物化学过程，我们假设Mot突变会阻碍RABL2与伴侣蛋白结合，包括与它的GEF结合，并导致非活性GDP结合的RABL2向活性GTP结合的RABL2的转化减少。最终，这将导致效应蛋白向靶位置的递送减少，在这种情况下是精子尾部。
RABL2与IFT复合物B的组分结合，并且GTP结合的RABL2对于将关键组分递送至发育中的精子尾部至关重要
衣藻中RABL2与RABL4以及锥虫中RABL5之间的序列同源性，加上纯合Mot突变雄性的精子尾部表型，使得RABL2也可能与IFT机制的组分相互作用并在确定精子尾部(运动性纤毛)长度中发挥作用这一可能性增加。为了研究这一假设，我们使用睾丸匀浆和特异性IFT复合体B组分抗体进行免疫沉淀，然后用蛋白质印迹法检测RABL2。数据显示RABL2与所有的IFT27、IFT81和IFT172之间存在相互作用(图4A)。有趣的是，在存在GTP或GDP的情况下，与IFT27和IFT81的结合显然是相等的。然而，IFT172优先结合GDP-RABL2。目前尚不清楚优先结合无活性RABL2的意义。
免疫荧光显微镜检查显示，在睾丸内细长精子细胞的中段，RABL2与IFT27、IFT81和IFT172中的每一个都存在共定位(图4B - 4E)。在发育中的精子的主段中经常观察到游离的(未与RABL2共定位的)IFT蛋白，因此，位于中段和主段交界处的环可能作为RABL2移动的屏障，这增加了这种可能性。
与野生型雄性小鼠相比，Rabl2 雄性小鼠精子尾部长度减少了17%，这进一步支持了RABL2在确定精子尾部长度方面的作用(每种基因型的 与 相比)(图3K)。总体而言，这些数据支持RABL2在精子尾部组装中的作用。然而，目前尚无法确定RABL2是否专门参与沿纤毛区室全长的蛋白质运输，或者精子尾部表型是否是RABL2介导的(与IFT成分一起)细胞质(包括精子中段)蛋白质运输中更普遍缺陷的次要结果。
如上所述，RABs中存在GTP结合的5个特征基序，这增加了RABL2可能在GTP结合的活性状态和GDP结合的非活性状态之间循环的可能性。如果属实，预计活性GTP结合的RABL2会与一组效应蛋白结合，并将它们递送至发育中的精子尾部分隔，作为RABL2定位的主要部位和Rabl2Mot/Mot表型的介导者。为了验证这一假设并鉴定假定的效应蛋白，在大肠杆菌中产生了重组RABL2(异构体2)，并以GTP结合或GDP结合状态与琼脂糖偶联，然后与成年小鼠睾丸提取物一起孵育。经过大量洗涤后，使用质谱法鉴定了优先与“活性”GTP结合的RABL2结合的蛋白条带(图S4)。鉴定出89种蛋白质(表S1)。其中，基于在生育力或纤毛功能方面的已知作用、分析试剂的可用性以及对RABL2的GTP结合形式的优先结合的确认，选择了5种进行进一步分析(图5A)。分析的假定效应蛋白包括:ATP6V1E1，它是一种定位于包括嗅觉上皮在内的几种纤毛组织的蛋白交换器[21]；微管正端运输蛋白EB1，它参与视网膜中的中心体功能和初级纤毛发育[22]；HK1，它是精子尾纤维鞘的一个组成部分，在糖酵解中起作用[23]；伴侣蛋白HSP4AL，它在减数分裂前期I和单倍体生殖细胞发育中起作用[24]；以及LDHC，它也是糖酵解途径的一个组成部分，定位于纤维鞘[25]。值得注意的是，LDHC或HK1的基因或化学抑制会导致ATP生成减少以及轴丝微管滑动受到抑制，从而导致精子运动能力丧失[23,25]。使用针对效应蛋白的抗体通过共免疫沉淀证实了RABL2与所有五种效应蛋白之间的特异性相互作用(图5B)。这些数据表明，与RAB蛋白一样，GTP结合的RABL2与一组特定的货物蛋白结合。
图4. RABL2与IFT复合体B的组分结合。(A) 从睾丸提取物中对IFT复合体B组分(IFT27、IFT81和IFT172)进行免疫沉淀，结果显示这三种组分均与RABL2结合。Ig = 免疫球蛋白同种型及浓度匹配的对照。-/+表示睾丸匀浆中存在外源性GTP，以探究GTP结合状态对与RABL2结合的潜在调节作用。(B - E) 在生精上皮内伸长精子细胞的中段(白色箭头)中，RABL2(红色)与IFT27(B)、IFT81(C)和IFT172(D)各自的共定位情况。(E) 一个代表性的一抗对照，其中染色方案中省略了一抗。比例尺等于 。doi:10.1371/journal.pgen.1002969.g004
然后，通过使用免疫荧光和蛋白质印迹法检测从野生型和Rabl2 小鼠收集的精子中相对效应蛋白含量，来测试Mot突变对精子发育及效应蛋白最终命运的影响(每个基因型n = 3只小鼠)。值得注意的是，野生型和Rabl2 小鼠的精子在相同条件下并行进行免疫标记和拍照。在野生型小鼠的精子中，ATP6V1E1、EB1、HK1和LDHC主要定位于精子尾部的主段(图6)。在尾部中段观察到HK1的染色较弱。HSPA4L染色表现为沿精子尾部中段和主段的斑点状染色。此外，在精子头部的顶体周围区域观察到所有的ATP6V1E1、EB1和HSPA4L(图6)。与Mot突变会导致效应蛋白递送减少的假设一致，Rabl2Mot/Mot小鼠的精子尾部中，所有的ATP6V1E1、EB1、HK1s、HSP4AL和LDHC的含量相对于野生型小鼠的精子都较少(图6)。在正常条件下，RABL2优先定位于中段，效应蛋白优先定位于精子尾部的主段，而在Rabl2 雄性小鼠的精子中，HK1定位于中段而非主段，这表明RABL2在将效应蛋白递送至环部但不超过环部的过程中发挥作用。与精子尾部中ATP61E1、EB1和HSPA4L含量明显降低相反，它们与精子头部顶体周围区域的结合没有明显变化。该数据与IFT转运是蛋白质转运到纤毛/鞭毛区室的特定要求一致。
图5. RABL2效应蛋白的鉴定。(A) 通过对额外亲和柱洗脱液进行蛋白质印迹，证实候选效应蛋白与GTP - RABL2(活性状态)的结合优于与GDP(非活性状态)的结合。(B) 通过从睾丸匀浆中对效应蛋白(EP)进行免疫沉淀，然后在蛋白质印迹中检测与RABL2的结合，证实效应蛋白与RABL2的特异性结合。使用平行反应证实免疫沉淀的特异性，其中沉淀抗体被同种型及浓度匹配的免疫球蛋白替代。doi:10.1371/journal.pgen.1002969.g005
蛋白质印迹法证实，与野生型精子相比，Rabl2Mot/Mot雄性小鼠精子中的效应蛋白含量降低(图6)。由于RABL2对尾部发育明显存在特定需求，通过蛋白质印迹法测量的每个精子的相对效应蛋白含量需要加以限定，因为它测量的是精子的总含量，即头部和尾部。无论如何，除EB1外，所有效应蛋白均减少。
总体而言，这些数据表明RABL2的功能受GTP结合调节，并且D73突变损害了效应蛋白向生长中的精子尾部的递送。Rabl2 精子中存在残余水平的效应蛋白，这表明Mot突变要么是亚效等位基因，要么与其他蛋白质存在某种功能冗余。
RABL2在小鼠中对含有运动性纤毛的组织表现出表达偏向性
为了确定RABL2在小鼠中的分布情况，进而确定可能出现其他病理变化的组织，我们采用定量PCR方法对Rabl2的表达进行了组织调查。Rabl2亚型1和2的mRNA在雄性生殖系中均有富集(图2E - 2F)。然而，这两种形式均广泛表达，尤其在其他含有运动性纤毛的组织中，包括肺、气管、脑、卵巢和肾脏。在任何检测的组织中均未检测到亚型3(数据未显示)。
总结评论
通过随机诱变，我们确定RABL2是一种进化上保守的蛋白质，在雄性生育中起关键作用。据我们所知，Mot品系是任何物种中第一个Rabl2功能障碍的模型。在此，我们证明RABL2以GTP调节的方式与一组特定的效应蛋白结合，包括参与纤毛发育和功能的关键蛋白，并将它们输送到生长中的精子尾部。在此，我们还确定了纤维鞘成分运输到尾部的途径的第一个组成部分。此外，类似于最近关于莱茵衣藻中RABL5功能的报道[26]，RABL2在哺乳动物中与IFT复合物B的成分结合，RABL2功能障碍导致精子尾部缩短。Mot小鼠品系中观察到的不育可能是由于效应蛋白的缺失介导的。
在Mot小鼠品系中观察到的生殖表型与一部分不育男性非常相似。这些男性将被归类为少弱精子症，即精子产量减少和严重的运动缺陷，但精子形态正常，通常会被检查是否患有原发性纤毛运动障碍(PCD)[1,27]。PCD通常是一种隐性综合征，在20000 - 60000例活产中有1例发生(《人类孟德尔遗传》编号232,650)，最常见的特征是复发性肺部疾病(从儿童期开始)、鼻窦炎和成人男性不育[5,28]。更具变异性的是，PCD与脑积水、侧位缺陷和多囊肾病有关。已知的人类不育原因包括轴丝成分基因DNAI₂、DNAH₅、DNAH₁₁、DNAAF₂和LRRC50、RSPH4A和RSPH9的突变，这些基因有助于轴丝中央微管的发育，TXNDC是一种硫氧还蛋白，以及由CCDC39和CCDC40编码的卷曲螺旋蛋白，它们参与轴丝组装的早期阶段[29,30]。然而，总体而言，在<60%的病例中潜在病因仍不明。通过小鼠研究还鉴定了几个额外的候选基因，例如Pacrg [31]、Spef2 [32]、Chy [33]和Pcdp1 [34]。然而，从人类和小鼠研究中都清楚地看到，纤毛(包括运动性纤毛)的组成在不同组织之间存在细微差异，因此导致纤毛病的一系列临床表现(http://v3.ciliaproteome.org，[35])。无论如何，Rabl2表达数据表明RABL2可能是原发性纤毛运动障碍的候选基因。
图6. Mot突变导致效应蛋白向精子尾部的输送减少。野生型和Rabl2Mo4Mot小鼠精子中RABL2效应蛋白(红色)的免疫定位。DNA用DAPI标记。使用蛋白质印迹法(右手面板，上部条带)对单个效应蛋白的总精子含量的百分比变化进行定量。精子蛋白上样量以精子头部蛋白ACRBP进行标准化(右手面板，下部条带)。每个蛋白质印迹总共进行了三次，并对结果进行平均。此图包含代表性图像。显示了近似的百分比变化(四舍五入到最接近的10%以反映ECL检测方法的非线性)和 值。每种基因型每种效应蛋白 只动物。
doi:10.1371/journal.pgen.1002969.g006
方法
Mot品系的鉴定
动物实验程序已获得澳大利亚国立大学和莫纳什大学动物实验伦理委员会的批准，并按照澳大利亚国家卫生与医学研究委员会(NHMRC)的动物实验伦理准则进行。点突变小鼠在C57BL/6背景上产生，并与CBA杂交两代，然后如前所述进行杂交[8]。为了鉴定含有导致不育突变的品系，每个品系的八对G3代兄妹被共同饲养，并监测幼崽的存在情况。如果六周后未观察到幼崽，则将小鼠与野生型配偶重新配对，以确定不育的原因。监测交配栓的存在作为交配行为的指标。对那些在明显正常交配行为下约四分之一出现雄性不育的品系进行进一步分析。
Mot品系中导致不育的突变鉴定及基因分型
使用基于单核苷酸多态性(SNP)的方法定位导致不育的突变。来自五只受影响雄性的基因组DNA在澳大利亚基因组研究设施与Affymetrix 5K小鼠SNP芯片杂交，并将序列与野生型C57BL6和CBA序列进行比较。使用额外的小鼠和SNP(www.well.ox.ac.uk/mouse/INBREDS/)缩小连锁区间。使用Amplifluor SNP基因分型系统(Chemicon)进行SNP分型，并在BMG Fluostar Optima荧光酶标仪上读取平板。通过澳大利亚基因组研究设施对睾丸表达的候选基因的所有蛋白质编码外显子和侧翼内含子的 进行测序，以确定其序列。
在鉴定出导致表型的突变后，使用Amplifluor系统对小鼠进行基因分型，使用野生型特异性引物 -GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACA-GAGTTGTGTTCTTGTTGCAGA-3’、突变等位基因引物5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGAGTTGTGTTCTT-GTTGCAGG-3’、反义引物5’-AGCCTTGTGGTAG-TAGGAAGCA-3’和Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen):1个循环， 个循环， : ，并在 进行最终延伸。
不育特征分析
Mot不育按照[10]中概述的方案进行分类。如前所述[36]，使用Triton X-100核溶解法测定每日精子产量。使用计算机辅助精子分析(每个基因型n = 6)[37]评估精子活力，并使用电子显微镜(每个基因型n = 2，每只小鼠平均10个精子)[38]评估超微结构。用苏木精和伊红染色后测量附睾尾精子的尾长(10周龄， 基因型)。使用成像技术MetaMorph软件(Molecular Devices)测量每只小鼠40条尾巴。
直系同源搜索和序列比对
为了鉴定RABL2直系同源物，小鼠RABL2亚型2序列被用作查询序列，在NCBI的生物特定BLAST搜索中针对蛋白质序列数据库进行搜索。得分最高的命中序列与小鼠预测蛋白质组进行反向BLAST搜索。只有那些小鼠RABL2被鉴定为最高匹配的序列才被认为包含RABL2直系同源物。搜索的物种数据库包括智人、猕猴、阴道毛滴虫、嗜热四膜虫、绿安乐蜥、家短尾负鼠、鸭嘴兽、斑马鱼、原鸡、热带爪蟾、硕大利什曼原虫、莱茵衣藻、昆士兰海绵、科氏囊舌虫、微小隐孢子虫、小泰勒虫、盘基网柄菌、秀丽隐杆线虫、新型隐球菌、吉氏巴贝斯虫、酿酒酵母、小立碗藓、拟南芥、丽蝇蛹集金小蜂、恶性疟原虫、黑腹果蝇、海滨沙筛贝、短柄单歧藻、假微型海链藻、致病疫霉、格氏变形虫、刚地弓形虫、嗜热栖热放线菌、四膜虫、克氏锥虫、布氏锥虫和柔嫩艾美耳球虫。
使用ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)对选定的RABL2直系同源物进行比对。小家鼠RABL2转录本2序列(ENSMUST000-00023294，CCDS49704)与从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的其他八个分类群序列进行比对。序列包括:智人(NP_009013.1和NP_001003789.1)；原鸡(XP_424473.1)；热带爪蟾(NP_001072451.1)；斑马鱼(NP_001038428.1)；绿安乐蜥(XP_003229013.1)；硕大利什曼原虫(XP_001685503.1)；莱茵衣藻(XP_001697212.1)；以及布氏锥虫(XP_829561.1)。
系统发育树的构建
使用muscle将选定的RABL2直系同源物与一个主RAB数据集进行比对，该数据集包含先前鉴定为存在于最后一个真核生物共同祖先中的所有RAB亚家族的代表，以及作为外群的代表性Ran序列[15,39]。在Mesquite中编辑比对结果以去除高度分化的区域，并使用Mr Bayes v3.2和RAxML v7.0.3构建系统发育树[40,41]。删除高度分化的序列并进行第二轮分析。这些数据证实RABL2属于RAB样GTPase分组，并且是单系的，因此是一个独特的旁系同源家族。
RABL2表达
使用Brilliant Fast SYBR Green QPCR Master Mix(Stratagene)在安捷伦Mx 3000P QPCR系统中通过定量PCR确定出生后睾丸发育(第0 - 70天)及其他成年组织中Rabl2的相对表达: ，2分钟； ；然后 ，共50个循环。引物为:Rabl2201 5’-TCGATTAG-CTGTGGCTTACAAA-3’和3’-CCTGTAAAACCTCGTC-CATGA-5’；Rabl2202 5’-CTGCACCTGGGTGACAGTAA-3’和3’-CATCTTGGGAAGGGAAACAA-5’。在出生后睾丸表达分析中，以18S表达作为参照。使用 方法[42]分析差异表达。每个年龄组 只小鼠。
重组RABL2的产生
使用引物: -ATAACCCGGGGTTCTG-CAGGGGACAGAAACAGGCA-3’和5’-ATCTCCATGGT-TAGGAAGGAGATGGGCTCTTG-3’从野生型睾丸cDNA中扩增全长Rabl2(异构体2)，然后克隆到pET32a(Novagen)的XmaI和Ncol位点。如前所述[43]产生重组RABL2并去除组氨酸标签。
根据制造商说明，使用Gateway克隆系统(Life Technologies)，利用pDEST15载体和引物Rabl2-attB1:5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGAAAAC-CTGTATTTTCAGGGCGCAGGGGGACAGAAACAGG-3’和Rabl2-attB2:5’-AGCCCATCTCCTTCCTAATACCCAGC-TTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC -3’以及pDOR222和pDEST15产生N端标记的GST-RABL2。如上述产生重组蛋白。
RABL2抗体的产生
在莫纳什大学抗体技术设施中针对重组RABL2异构体2产生RABL2小鼠单克隆抗体。如所述[44]扩增并纯化克隆。使用Protein G FF琼脂糖珠(GE Healthcare)从培养基中纯化免疫球蛋白，用PBS透析并使用DC测定法(Biorad)测定浓度。
免疫荧光显微镜检查
在固定的冷冻睾丸切片和用4%多聚甲醛后固定的精子涂片上进行RABL2和IFT蛋白免疫定位。一抗包括RABL2(RG2 - G8) 毫升、IFT27 4微克/毫升(圣克鲁斯公司)、IFT81 10微克/毫升(圣克鲁斯公司)、IFT172 6微克/毫升(圣克鲁斯公司)。效应蛋白定位在1:1甲醇:丙酮固定的精子上[45]。一抗包括:HK1 0.4微克/毫升(西格玛公司)、ATP6V1E1 4微克/毫升(艾博抗公司)、EB1 4微克/毫升(圣克鲁斯公司)、HSPA4L 4微克/毫升(艾博抗公司)、LDHC (西格玛公司)。二抗包括:驴抗小鼠Alexa Fluor 555、驴抗兔Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555和驴抗山羊Alexa 555(赛默飞世尔科技公司)。使用 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚(DAPI)对DNA进行可视化。图像在莫纳什大学显微成像设施中使用尼康C1 Eclipse C1 plus 90i正立式自动显微镜或徕卡SP5 5通道共聚焦倒置显微镜拍摄。根据与二抗偶联的Alexa荧光染料使用不同的激发激光(408纳米、488纳米或561纳米)。通过在没有一抗的情况下对平行切片进行染色来确定免疫标记的特异性。通过在免疫化学之前用500倍摩尔过量的免疫肽预吸收抗体并与未预吸收的阳性对照平行来确定RABL2染色的特异性。
RABL2效应蛋白的鉴定及蛋白质免疫印迹法
如前所述[46]，使用加载有GTP或GDP的RABL2亲和柱来创建活性和非活性RABL2，从而鉴定推定的RABL2睾丸效应蛋白。洗脱的蛋白质在12% SDS - PAGE凝胶上用考马斯亮蓝可视化。优先结合GTP - RABL2的蛋白质被切下并在澳大利亚蛋白质组分析设施通过纳升液相色谱电喷雾串联质谱(nano - LC ESI MS/MS)进行测序。只有与至少40分Mascot分数有两个或更多独特肽段匹配的蛋白质才被视为推定的效应蛋白。在鉴定出的89种非冗余蛋白质中，基于在精子或纤毛功能中的已知作用以及分析试剂的可用性选择了5种进行进一步分析。通过对额外柱洗脱物进行蛋白质免疫印迹以及使用针对推定效应蛋白的抗体进行共免疫沉淀来确认对GTP - RABL2的优先结合。简要地说，将 成年小鼠睾丸裂解物与 目标抗体:HK1(圣克鲁斯公司)、ATP6V1E1(艾博抗公司)、EB1(圣克鲁斯公司)、HSPA4L(艾博抗公司)、LDHC(安诺优达公司)一起孵育，并补充 GTPγS(耶拿生物科学公司)。相互作用的蛋白质通过蛋白G磁珠(密理博公司)捕获并用0.1 M甘氨酸(pH 2.7)洗脱。通过蛋白质免疫印迹评估蛋白质与RABL2的结合。阴性对照反应包括用适当物种的免疫球蛋白以匹配浓度进行孵育。
使用来自野生型与突变型小鼠 每条泳道的精子蛋白进行蛋白质免疫印迹法，测定精子中RABL2和效应蛋白的相对含量( ，每条泳道包含一只小鼠的精子)。样品通过12% SDS - PAGE分离并转移到PVDF膜上。膜先用含5%脱脂奶粉的PBS封闭，然后与一抗在 孵育过夜。样品分别用以下抗体检测。ATP6V1E1 ，EB1 ，HSPA4L ，HK1 ，LDHC 。使用前顶体结合蛋白(ACRBP)含量对样品上样量进行标准化，数值在三只小鼠中取平均值并在不同基因型之间进行比较。使用精子头部蛋白进行标准化，因为使用尾部蛋白(如肌动蛋白)会因短精子尾巴是表型的一个组成部分而使数据产生偏差。通过ImageJ(http://imagej.nih.gov/)测量并分析阳性条带强度。 的P值被认为具有统计学意义。
如前所述[8,47]，针对肽段CEMNELYDDSWRSQSTG和CLLRNQNRKMSRMR在山羊中制备了ACRBP抗体，并以1:100000的稀释度使用。
如上文所讨论的，使用与IFT172、IFT81、IFT27(圣克鲁斯)抗体 孵育的成年睾丸裂解物 进行共免疫沉淀，探索RABL2与IFT途径成分相互作用的可能性。免疫沉淀复合物在12% SDS - PAGE凝胶上分离，然后如上文所述在蛋白质免疫印迹中检测RABL2( )。
统计学
使用Graphpad Prism 5.0软件的学生t检验比较两个群体的均值。P值<0.05被用于定义统计学显著性。
支持信息
图S1 Rabl2 突变对体重和附睾组织学的影响。(A)Rabl2 突变在9周龄时对体重没有明显影响， 。(B - C)WT(B)和Rabl2 动物(突变体，C)的附睾组织学没有明显差异。标尺长度为 。(TIF)
图S2 与可能的RABL2直系同源物相比，RAB亚家族选定代表的系统发育。节点上的数字表示MrBayes后验概率/PhyML自展支持值，并展示了PhyML拓扑结构。所包含的RABL2物种如下:智人(RABL2A和RABL2B)、小家鼠、布氏锥虫和莱茵衣藻。其余数据是用于Elias等人[15]图3的序列子集。该重建表明RABL2序列被排除在真正的RAB组之外，尽管有证据表明它们比外群Ran更接近RABs。在他的重建中，有证据表明与RTW RAB样GTP酶关系密切，表明RABL2和RTW是单系的。在一个单独的重建中，去除了RTW序列，RABL2序列被稳健地重建为单系，也消除了长枝吸引假象。连同一些典型序列特征的缺失，这些数据与将RABL2注释为RAB样一致。
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(TIF)
图S3 Mot突变在RAB蛋白结构中的位置。与GEF结构域(3JZA [48]，蓝色)结合的Rabl(绿色)结构。Rab1/GEF界面处D93(Rabl中的Q60)的位置显示为红色球体(Q60与RABL2中D73的位置相当)。该位置靠近RAB蛋白与包括SEC2p在内的其他结合伙伴形成的界面。该图使用PYMOLSEC2 p制作。
(TIF)
图S4 GTP-RABL2(GTP，活性)和GDP-RABL2(GDP，非活性)亲和柱洗脱液的SDS-PAGE尺寸分级。线条表示通过质谱分析的凝胶切片位置。
(TIF)
表S1推定的RABL2效应蛋白。
(DOC)
致谢
我们感谢澳大利亚表型组学网络的基础设施和工作人员管理ENU小鼠筛选，感谢基因组学研究团队协助突变检测，感谢Stephanie Smith和Jo Merriner提供技术援助，感谢David de Kretser和Alexandre Benmerah进行讨论。我们感谢莫纳什显微成像设施提供仪器和培训。
作者贡献
实验的构思与设计:JCYL、CB、MCF、BW、CCG、CJO、MKO。实验的执行:JCYL、DJ、AEO、CB、BJC、JCW、MCF、VA、TI、BW。数据分析:JCYL、DJ、CB、JCW、MCF、TI、RJA、BW、CCG、CJO、MKO。论文撰写:JCYL、DJ、JCW、MCF、RJA、CCG、CJO、MKO。
RABL2,雄性生育,GTP,精子鞭毛
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