Ras的激活需要肌动蛋白通过ERM依赖的方式与质膜相连
发布时间：
2026-03-17 21:23
Ras的激活需要肌动蛋白通过ERM依赖的方式与质膜相连
托比亚斯·斯珀卡 ，卡佳·J·盖斯勒 ，乌尔里克·默克尔 ，英格玛·朔尔 ，伊格纳西奥·鲁维奥 ，彼得·赫里希 ，海伦·L·莫里森
1. 莫里森实验室，莱布尼茨老龄研究所以及弗里茨·李普曼研究所(FLI)，德国耶拿；2. 赫里希实验室，莱布尼茨老龄研究所以及弗里茨·李普曼研究所(FLI)，德国耶拿；3. 分子细胞生物学研究所，分子生物医学中心，弗里德里希·席勒大学，德国耶拿
摘要
背景:受体酪氨酸激酶(RTK)参与多种信号通路，其中一些通过小G蛋白Ras起作用。Ras激活的一个重要成分是七号less之子(SOS)，它催化Ras上的核苷酸交换。
主要发现:我们现在可以证明，Ras的激活还需要埃兹蛋白、根蛋白和/或膜突蛋白(ERM)(一类肌动蛋白结合蛋白)以及肌动蛋白的必要参与。破坏ERM蛋白与共受体的相互作用、通过小干扰RNA下调ERM蛋白、表达ERM蛋白的显性负突变体或破坏丝状肌动蛋白，都会消除生长因子诱导的Ras激活。埃兹蛋白/肌动蛋白催化由RTK、共受体、Grb2、SOS和Ras组成的多蛋白复合物的形成。我们还确定了埃兹蛋白上Ras和SOS的结合位点；这些结合位点的突变会破坏相互作用并抑制Ras激活。最后，我们表明埃兹蛋白依赖复合物的形成对于增强SOS的催化活性从而激活Ras是必要的。
结论:综合这些发现，我们提出ERM蛋白是SOS活性控制水平上的新型支架，这与正常Ras功能以及已知在几种人类癌症中发生的功能障碍都相关。
引用:斯珀卡T，盖斯勒KJ，默克尔U，朔尔I，鲁维奥I等。(2011年)Ras的激活需要肌动蛋白通过ERM依赖的方式与质膜相连。《公共科学图书馆·综合》6(11):e27511。doi:10.1371/journal.pone.0027511
编辑:埃夫西米奥斯·M·C·斯科拉基斯，希腊亚历山大·弗莱明生物医学科学研究中心
2011年8月9日收到；2011年10月18日接受；20,11年11月21日发表
版权:©2011斯珀卡等人。这是一篇开放获取文章，根据知识共享署名许可协议分发，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
资助:作者有三项资助支持这项工作:1)癌症援助107089(www.krebshife.de)；2)德国研究基金会(He551/10.3)；3)DFG的SFB604多功能信号蛋白(www.dfg.de/index.jsp)。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定发表或稿件准备方面没有作用。
利益冲突:作者声明不存在利益冲突。
* 电子邮件:helen@fli - leibniz.de
引言
小G蛋白Ras作为分子开关，将细胞外刺激传递至多种细胞内效应通路，这些通路负责控制细胞增殖、运动和分化。由于Ras发挥着核心作用，其活性及其下游信号通路必须受到严格调控。目前已知在Ras水平上的主要决定因素是鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)，它催化Ras加载GTP以取代紧密结合的GDP，以及GTPase激活蛋白(GAP)，它通过增强Ras结合的GTP水解来下调活性状态。GEF活性的特异性，例如七less之子(SOS)，不仅通过衔接蛋白生长因子受体结合蛋白2(Grb2)与活性RTK相连，其活性还通过与膜脂的相互作用受到影响 。通过在质膜中鉴定蛋白质和脂质的纳米簇，人们发现了Ras通路中进一步但了解较少的复杂性，这些纳米簇被认为集中了效应器级联反应的成分[4]。此外，还发现了支架蛋白(例如Ras激酶抑制因子(KSR)和sprouty相关蛋白(spred))，它们被认为可以协调下游信号成分的动力学并防止生理上不适当信号的激活[5,6]。
我们之前发现了Ras依赖性MAP激酶通路的另一个调控层面:特定RTK的共受体将MAP激酶激活集中到该受体上[7,8]。我们的观察结果引发了我们对确定这种控制在何种水平发挥作用的兴趣。大多数RTK需要共受体，如整合素或其他细胞粘附分子 。在细胞外侧，共受体的功能之一似乎是局部富集或正确呈递受体配体[10,11]。在细胞内侧，共受体的细胞质结构域是RTK依赖性信号传导所必需的[12,13,14]。此外，我们鉴定出了MAP激酶激活所需的一个新成分——丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)结合蛋白埃兹蛋白(或埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ERM)家族的其他成员)，它将肌动蛋白细胞骨架与质膜连接起来。初步证据表明，ERM蛋白与共受体的细胞质结构域结合，并且从这个位置开始是生长因子诱导的Ras-MAP激酶激活所必需的。然而，迄今为止它们的确切作用机制仍然难以捉摸。
在本研究中，我们探讨了ERM蛋白如何精确影响MAP激酶通路。我们将ERM蛋白催化的步骤定位到Ras的激活。生长因子诱导的Ras激活会被以下任何一种情况严重抑制甚至消除:ERM蛋白与共受体相互作用的破坏、通过siRNA依赖性下调ERM蛋白、埃兹蛋白显性负突变体的表达或F-肌动蛋白的破坏。与肌动蛋白相关的埃兹蛋白具有与共受体、Ras以及GEF七less之子(SOS)的自抑制双同源(DH)结构域的独立结合位点，稳定了由受体、共受体、Grb2、SOS、埃兹蛋白-肌动蛋白和Ras组成的复合物。这些结合位点的突变会破坏相互作用并抑制Ras的激活。此外，埃兹蛋白(用作ERM蛋白的原型)不仅作为组装Ras和SOS伙伴的支架，而且似乎还是SOS活性的重要调节剂。因此，我们的数据揭示了Ras信号传导的一个新方面，这可能与正常生理学以及人类癌症相关。
结果
信号转导催化所需的埃兹蛋白结构域
我们通过三种独立方法并在几种细胞系中确定了ERM蛋白对Ras信号传导的需求。首先，我们过表达了一种可溶性肽——共受体CD44的细胞质尾巴，它能隔离ERM蛋白[10,15,16]。作为Ras活性的衡量指标，我们使用了Erk磷酸化。野生型肽而非在ERM蛋白结合方面有缺陷的突变体(图S1A)，强烈降低了基础状态和血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的Erk磷酸化(图S1B)。对PDGF信号传导的动力学解析显示，Erk激活减弱，其特征是磷酸化最大值发生偏移(从1分钟到5分钟)且诱导倍数降低(从19倍到5倍；图S1C、D)。因此，从共受体上移除ERM蛋白会干扰信号传导。
其次，通过针对所有三种ERM蛋白的两种独立siRNA混合物下调ERM蛋白，降低了血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的细胞外信号调节激酶(Erk)磷酸化，但并未损害PDGF受体(PDGFR)自身的激活(图1A；图S1E、F)。如下文所示，至少在NIH3T3细胞中，三种ERM蛋白中的每一种都有助于信号激活(图1F)。重要的是，所有三种人类ERM蛋白或单独的埃兹蛋白(ezrin)的过表达挽救了小鼠siRNA依赖性抑制(图1A)。我们得出结论，ERM蛋白对于PDGF向Erk的信号传导至关重要。
第三，我们通过埃兹蛋白的突变干扰ERM蛋白功能。由此，我们还确定了参与Ras激活的埃兹蛋白结构域。埃兹蛋白突变体过表达以与内源性ERM蛋白竞争细胞内相互作用。我们首先构建了C末端缺失的埃兹蛋白(图1B；Nterm和ΔABD删除肌动蛋白结合结构域)。这些突变蛋白仍然能够与质膜上的共受体结合，但不能与F-肌动蛋白相互作用。这些缺失突变体(作为绿色荧光蛋白(GFP)融合体)的稳定过表达消除了PDGF诱导的Erk磷酸化(图C，左图)。由于这些缺失可能消除的不仅仅是埃兹蛋白与肌动蛋白的结合，我们使用了埃兹蛋白R579A(见图1B)，这是一种在F-肌动蛋白结合方面完全有缺陷但在其他方面功能完整的突变体[14]。该突变体的过表达而非野生型埃兹蛋白的过表达降低了PDGF依赖性和白细胞介素-6(IL-6)依赖性的Erk磷酸化(图1C，右图；图S2A、B)。值得注意的是，埃兹蛋白R579A对Ras依赖性信号传导具有特异性，因为它既不干扰蛋白激酶C(PKC)诱导的Erk磷酸化(图S2B)，也不干扰IL-6依赖性的信号转导和转录激活因子3(STAT3)激活，后者独立于Ras(图S2B)。总之，F-肌动蛋白结合或与埃兹蛋白/F-肌动蛋白相互作用相关的未知步骤对于PDGF向Erk的信号传导至关重要，可能在Ras水平或其上游。
埃兹蛋白R579A阻止Ras激活
为了研究这些突变体是否直接干扰Ras的激活，我们测量了PDGF依赖性的GTP加载到Ras上的情况。埃兹蛋白R579A的过表达(图1C、D)抑制了Ras的激活。由于Ras激活减少，强力霉素诱导的埃兹蛋白R579A表达抑制了由突变型表皮生长因子受体2(ErbB2)驱动的RT4细胞的琼脂集落形成(图1G)。有趣的是，埃兹蛋白的作用不仅限于PDGFR的信号传导，对其他受体酪氨酸激酶(RTK)也很重要。表皮生长因子(EGF)诱导的Ras激活也被消除(图1D)，这表明ERM蛋白对于RTK诱导的Ras激活是普遍需要的。此外，使用相应的突变体根蛋白R576A和膜突蛋白R570A研究了单个ERM蛋白对信号转导的贡献。在NIH 3T3细胞中过表达每个突变体均抑制了自发的和PDGF诱导的Ras激活(图1H)。特异性siRNA下调(图1F)表明，单个敲低对Ras激活具有部分抑制作用，三种siRNA组合最为有效。因此，所有三种ERM蛋白都参与催化向Ras的信号转导，任何一个突变体的过表达都与所有三种野生型蛋白的功能竞争。
由于埃兹蛋白R579A在与F-肌动蛋白结合方面存在缺陷，我们研究了肌动蛋白本身在Ras激活中是否发挥作用。肌动蛋白聚合抑制剂拉特runculin B(Spector等人，1983年)在数分钟内导致应力纤维减少(图2A)。它还抑制了血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的Ras激活和下游向细胞外调节蛋白激酶(Erk)的信号传导(图B)，而受体的磷酸化(图2B)及其与生长因子受体结合蛋白2(Grb2)的结合(未显示)不受影响。有趣的是，它对信号传导的影响并非不加区分。除了PDGF信号传导外，拉特runculin B还特异性干扰溶血磷脂酸诱导的cAMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化(图2C)和Erk磷酸化(未显示)，以及白细胞介素6(IL-6)诱导的Erk磷酸化(图2D)，但它不抑制对IL-6的信号转导和转录激活因子3(STAT3)激活(图2D)。此外，对佛波酯的反应中，不依赖Ras的蛋白激酶C(PKC)依赖性Erk磷酸化不受影响(图2E)。因此，尽管这种抑制剂会导致肌动蛋白细胞骨架普遍破坏(在更长的观察期内可能是致命的)，但至少在生长因子刺激后的这个早期阶段，它对通过Ras-Erk途径的信号转导具有非常特异性的影响。
埃兹蛋白与SOS和Ras相互作用
由于埃兹蛋白的肌动蛋白结合功能是Ras激活所必需的，我们推测存在一种涉及埃兹蛋白的肌动蛋白相关蛋白复合物。通过免疫沉淀确实证实了这样一种多蛋白复合物的存在并确定了其组成。使用温和的裂解条件和用于溶解跨膜蛋白复合物的去污剂Lubrol，获得了包括血小板衍生生长因子受体(PDGFR)在内的复合物的最佳分离。在血小板衍生生长因子刺激后，针对PDGFR的抗体共沉淀了共受体β1整合素和ERM蛋白(图3A)。此外，PDGF激活的复合物还包含Ras(图3D)，这表明作为Ras调节剂的SOS也可能是该复合物的一部分。实际上，针对SOS的抗体以及针对PDGFR的抗体沉淀了包括内源性……在内的多蛋白复合物。
图1. ERM蛋白对于血小板衍生生长因子受体(PDGFR)信号传导是必需的。A，ERM蛋白的下调降低了血小板衍生生长因子(PDGF)依赖性的细胞外信号调节激酶(Erk)磷酸化。将低密度接种的NIH 3T3细胞用针对小鼠ERM蛋白的小干扰RNA(siRNA)SMARTpool组合处理24小时。为了对外源人ERM进行重组，用编码人埃兹蛋白 - VSVg、根蛋白 - Flag和无标签的埃莫辛或单独的埃兹蛋白 - VSVg的质粒DNA转染细胞。在用PDGF处理5分钟之前，细胞过夜血清饥饿。如所示对裂解物进行免疫印迹。B，埃兹蛋白突变体结构的示意图。C，埃兹蛋白突变体抑制PDGF依赖性的Erk磷酸化。将低密度的RT4细胞用空载体(对照)或埃兹蛋白突变体(埃兹蛋白N端 - GFP或肌动蛋白结合结构域缺失的埃兹蛋白ezrinΔABD - GFP)转染(左图)，埃兹蛋白野生型或埃兹蛋白突变体R579A(右图)。通过荧光激活细胞分选术(FACS)对高GFP表达的细胞进行分选，以低细胞密度重新接种并过夜血清饥饿，然后用PDGF诱导5分钟。如所示对裂解物进行免疫印迹。D，将NIH 373细胞低密度接种，以5:1的比例与编码埃兹蛋白野生型 - GFP或埃兹蛋白突变体 - GFP的构建体以及潮霉素抗性构建体共转染，用潮霉素选择1天，并在使用PDGF或表皮生长因子(EGF)处理3分钟之前过夜血清饥饿。对于Ras - GTP水平，用谷胱甘肽 - S - 转移酶(GST) - Raf1 - Ras结合结构域(RBD)处理裂解物。用抗Ras抗体对共沉淀的蛋白质进行免疫印迹。如所示对裂解物进行免疫印迹。E，埃兹蛋白R579A也抑制RT4细胞中PDGF依赖性的Ras激活。实验与D相同，只是使用了编码埃兹蛋白野生型 - VSVg或埃兹蛋白突变体 - VSVg的构建体。F，使用特异性siRNA混合物下调单个ERM蛋白可降低NIH 373细胞中PDGF依赖性的Ras激活。Ras活性如D中所测定。G，埃兹蛋白突变体而非野生型埃兹蛋白抑制RT4细胞中的集落形成。生成了多西环素诱导的野生型或突变型埃兹蛋白表达细胞，并置于软琼脂中( - 和 + 多西环素)。结果表示为至少三个独立实验的平均绝对集落数 标准差， 使用学生t检验，P < 0.01。H，埃莫辛(R570A，中图)和根蛋白(R576A，右图)的F - 肌动蛋白结合突变体抑制NIH 3T3细胞中PDGF依赖性的Ras激活。实验设置如D。在所有图中，如所示对裂解物进行免疫印迹。结果代表至少三个独立测定，每个图代表来自同一印迹和相同曝光的实验。
doi:10.1371/journal.pone.0027511.g001 我们或过表达的ERM蛋白(图3B、C、D)。这些结果表明SOS和Ras都是该复合物的一部分。然而，埃兹蛋白R579A不能与SOS或PDGFR共沉淀(图3C、D)，因此，埃兹蛋白R579A的表达阻断了PDGFR复合物的形成。
图2. 拉特runculin B模拟埃兹蛋白突变体。A用拉特runculin B处理后肌动蛋白丝减少。将亲本施万细胞瘤细胞RT4以低密度接种并用地衣霉素B(1.25 μM，10分钟)处理。细胞按照材料和方法中所述进行处理(比例尺 )。B拉特runculin B抑制信号传导。低密度的RT4细胞血清饥饿过夜，然后在用血小板衍生生长因子(PDGF，10 ng/ml，5分钟)处理之前用地衣霉素B(1.25 M，5分钟)处理。裂解物用GST-Raf1-RBD处理(用于下拉Ras-GTP)。共沉淀的蛋白质用抗Ras抗体进行免疫印迹。裂解物如所示进行免疫印迹。C、D、E地衣霉素B对信号传导的特异性干扰。如A图所示制备并用地衣霉素B处理RT4细胞，然后用溶血磷脂酸(LPA，20 μM，5分钟，B图)、白细胞介素-6(IL-6，1 ng/ml，5分钟，C图)或佛波酯(TPA，100 ng/ml，5分钟，D图)刺激。裂解物如所示进行免疫印迹。结果代表至少三次独立实验，每个图代表来自同一张印迹和相同曝光的实验。
doi:10.1371/journal.pone.0027511.g002
图3. 埃兹蛋白与SOS和Ras形成复合物。A，内源性ERM蛋白与血小板衍生生长因子受体(PDGFR)及其共受体β1整合素相关。将RT4细胞以低密度接种，血清饥饿过夜，并用PDGF处理1分钟。与PDGFR共免疫沉淀(CoIP)的蛋白质进行免疫印迹，兔IgG用于对照免疫沉淀。B，内源性ERM蛋白与SOS和Ras相关。如A中所述处理RT4细胞。用兔SOS特异性抗体免疫沉淀SOS，兔IgG用于对照免疫沉淀。共免疫沉淀的蛋白质进行免疫印迹。C，埃兹蛋白R579A不能与SOS和Ras结合。表达多西环素诱导的埃兹蛋白野生型或R579A突变体的RT4细胞以低密度接种，血清饥饿过夜，并在处理PDGF之前用多西环素孵育1分钟。与SOS共免疫沉淀的蛋白质(如B中所述)如所示进行免疫印迹。D，埃兹蛋白R579A不能与PDGFR和Ras结合。细胞如 中所述处理，然后进行PDGFR-CoIP(如A中所述)。与PDGFR共免疫沉淀的蛋白质如所示进行免疫印迹。结果代表至少三次独立实验，每个图代表来自同一张印迹和相同曝光的实验。
doi:10.1371/journal.pone.0027511.g003
埃兹蛋白与Ras的直接相互作用对Ras激活至关重要
由于Ras与SOS的结合应该是短暂的，并且对于免疫沉淀来说不够稳定，共免疫沉淀数据可能表明埃兹蛋白形成了一个稳定的支架，组装Ras和SOS。我们采用三种独立技术，为Ras与埃兹蛋白之间的直接相互作用提供了证据(图4)。首先，埃兹蛋白N端与GST的融合蛋白，而不是单独的GST，从细胞裂解物中下拉Ras(图4A)。此外，GST与Ras的融合蛋白沉淀了纯化的埃兹蛋白N端，但没有沉淀C端(图4B)。最后，纯化的His标签埃兹蛋白沉淀了纯化的Ras(图4C)。
其次，如果埃兹蛋白与Ras的相互作用在核苷酸交换之前用于稳定与SOS的复合物，那么Ras-GDP应该是埃兹蛋白的首选相互作用伙伴。事实上，用His标签埃兹蛋白下拉的是Ras-GDP(图4C)。另一种使用加载有荧光标记GDP(mantGDP-Ras)的Ras的技术也证明了相互作用。当将埃兹蛋白添加到mantGDP-Ras中时，荧光强度以浓度依赖的方式增加(图4D)，表明Ras-GDP和埃兹蛋白确实相互作用。
最后，埃兹蛋白在其N端结构域带有一个基序，该基序类似于Raf1激酶的Ras结合结构域[20]。为了测试该基序是否参与埃兹蛋白与Ras的相互作用，我们在该基序内分别突变了几个氨基酸[21,22]。在这些突变体中，埃兹蛋白R40L最显著地丧失了与Ras结合的能力(图4E)。埃兹蛋白R40L的表达消除了血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的Ras激活(图4F)，并抑制了血清依赖性的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入(图4G)。因此，对这些发现最直接的解释是，Ras和埃兹蛋白直接相互作用，并且这种相互作用是Ras激活所需的埃兹蛋白支架功能的一部分。
埃兹蛋白与SOS的双鸟苷酸交换因子(DH)-普列克底物蛋白同源(PH)结构域相互作用
埃兹蛋白突变体将埃兹蛋白鉴定为SOS和Ras的组织者。通过绘制与埃兹蛋白相互作用的SOS结构域(SOS构建体如图5A所示并进行了描述)，进一步表明埃兹蛋白作为SOS支架的能力。免疫共沉淀和共亲和沉淀实验确定DH-PH串联结构域是埃兹蛋白的相互作用位点(图5B、C)。如图3的免疫共沉淀实验以及缺乏与肌动蛋白结合能力的埃兹蛋白突变体R579A所表明的，纯化的重组蛋白形成了埃兹蛋白与SOS(全长)和F-肌动蛋白而非G-肌动蛋白的三聚体复合物(图5D)。野生型埃兹蛋白仅在F-肌动蛋白存在的情况下与SOS(全长)结合，F-肌动蛋白结合缺陷的突变体(R579A)则不结合(用His标签标记的埃兹蛋白进行下拉实验)。因此，有趣的是，埃兹蛋白与F-肌动蛋白一起似乎采用了一种特定的SOS结合构象，从而能够与SOS的DH/PH结构域相互作用。
图4. 埃兹蛋白直接与Ras相互作用。A，埃兹蛋白N端与Ras相互作用。将RT4细胞裂解物与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-埃兹蛋白N端或单独的GST一起孵育。如所示对GST下拉产物进行免疫印迹分析。B，通过GST下拉确定Ras与埃兹蛋白之间的直接相互作用。将纯化的GST-Ras或单独的GST琼脂糖与纯化的重组埃兹蛋白N端或C端半段一起孵育。对下拉产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后进行胶体考马斯亮蓝染色。C, 埃兹蛋白与负载GDP的Ras结合。将负载GDP或不可水解的鸟苷-5’-O-(3-硫代三磷酸)(GTPγS)的重组Ras与His-野生型埃兹蛋白一起孵育。对His下拉产物进行免疫印迹分析。D，埃兹蛋白在溶液中结合荧光GDP-Ras。用荧光mantGDP负载细菌表达的Ras。然后将1μM mantGDP-Ras与增加量的重组野生型埃兹蛋白一起孵育，并测量荧光强度。E，埃兹蛋白R40L不能结合Ras。将表达强力霉素诱导型野生型埃兹蛋白-VSVg或埃兹蛋白R40L-VSVg的NIH 373细胞裂解物与负载GDP或GTPγS的GST-Ras琼脂糖或单独的GST琼脂糖(对照)一起孵育。如所示对GST下拉产物进行免疫印迹分析。F，埃兹蛋白R40L抑制血小板衍生生长因子(PDGF)依赖性的Ras激活。将表达强力霉素诱导型野生型埃兹蛋白或R40L突变体的NIH 373细胞以低密度接种，血清饥饿过夜，然后用PDGF处理三分钟。如1D中所述测定Ras活性。对裂解物进行免疫印迹分析。G，埃兹蛋白R40L而非野生型埃兹蛋白抑制BrdU掺入，用荧光素偶联的BrdU抗体进行定量分析。生成表达强力霉素诱导型野生型或突变体埃兹蛋白的NIH 373细胞，并置于软琼脂中(-和+强力霉素)。定量结果表示至少三个独立实验的平均值 标准差， 使用学生 检验。结果代表至少三个独立分析，每个图表示来自同一印迹和相同曝光的实验。
doi:10.1371/journal.pone.0027511.g004
埃兹蛋白与SOS变构位点的相互作用增强SOS活性
GEF SOS自身受到复杂的调控。DH-PH结构域通过折回到催化结构域并限制对催化结构域远端第二个Ras结合位点的可及性来降低催化活性。这种变构Ras结合位点对于SOS的完全激活是绝对必需的，这表明Ras本身是SOS调控的关键决定因素[23]。虽然我们鉴定出埃兹蛋白是一种为Ras和SOS组装的支架蛋白，但我们考虑埃兹蛋白是否还可能通过消除这种空间位阻并将Ras-GDP呈递给SOS上对SOS活性至关重要的变构位点来帮助激活SOS[23]。这种有趣的可能性促使我们在有或没有埃兹蛋白的情况下测量细胞中的SOS活性。此外，随后进行了体外实验，比较了SOS与与埃兹蛋白形成复合物的SOS。
首先，我们通过追踪 -GTP进入渗透细胞的摄取情况以及 -GTP加载到Ras上的情况，测试了埃兹蛋白在体内对于SOS核苷酸交换活性是否必需。静息细胞中的核苷酸交换活性很高；然而，它对ERM蛋白敲低以及埃兹蛋白突变体R579A或R40L的表达不敏感，这表明基础SOS活性不依赖于ERM蛋白(图6A-C)。目前，我们无法解释静息细胞中这种高SOS活性，另一组也报道过这种情况[24]。与基础SOS活性形成鲜明对比的是，PDGF引发核苷酸摄取到Ras上的加速被ERM蛋白敲低以及埃兹蛋白R579A或R40L的表达完全消除(图6A-C)。这些埃兹蛋白突变体的破坏作用反映了埃兹蛋白/F-肌动蛋白和埃兹蛋白-Ras复合物对生长因子依赖性SOS活性增强的重要贡献。我们得出结论，ERM蛋白定位于质膜/F-肌动蛋白界面，在那里它们组装SOS和Ras。这种作用可能有助于解除SOS的自抑制，从而使Ras能够呈递给SOS的变构调节位点。
图5. 埃兹蛋白与SOS的DH-PH结构域相互作用。A，所用SOS构建体结构的示意图。B，ERM蛋白与SOS的DH-PH结构域相互作用。用His-SOS DH-PHcat-或His-SOScat与RT4裂解物孵育。His下拉产物按所示进行免疫印迹。C，ERM蛋白与SOS的DH-PH结构域相互作用。用表达SOS的Myc标签片段(特定条带用红色星号标记)的构建体或空载体对照转染NIH 373细胞。共沉淀的蛋白质用针对ERM蛋白的抗体进行免疫印迹。D，全长SOS仅在F-肌动蛋白存在下在体外与埃兹蛋白相互作用。在丝状(F)或球状(G)肌动蛋白存在下，将SOS与野生型埃兹蛋白-或R579A-His孵育。His下拉产物按所示进行免疫印迹。结果代表至少三次独立实验，每个图表示来自同一印迹和相同曝光的实验。doi:10.1371/journal.pone.0027511.g005
埃兹蛋白在体外控制SOS活性
基于这些体内数据，我们使用沉淀复合物研究了埃兹蛋白对体外SOS活性的影响。通过GST-Grb2下拉(确定Grb2与SOS的化学计量相互作用等于SOS水平)收集表达野生型或R579A埃兹蛋白的细胞总裂解物中的PDGF诱导的蛋白质复合物。将复合物与预加载有放射性GTP的重组Ras孵育；通过加入过量的非放射性GTP S启动交换反应。尽管存在等量的SOS(图6D，右图)，但与从表达埃兹蛋白R579A的细胞中沉淀的复合物相比，在含有SOS-野生型埃兹蛋白复合物的样品中观察到更高的交换活性(图6D)。后一种沉淀物不含埃兹蛋白(图6D，右图)。这个体外实验表明，SOS仅在与野生型埃兹蛋白结合时才发挥显著的核苷酸交换活性。
讨论
我们在此表明，Ras的激活与肌动蛋白动力学以及ERM蛋白的存在有关。GEF SOS调节Ras的经典模型涉及在RTK配体刺激后，通过衔接蛋白使SOS进行局部组装。其中一种衔接蛋白Grb2，将SOS带到受体附近，据认为在此处SOS与Ras相互作用。然而，我们现在可以证明在Ras控制方面有一个新步骤，即质膜 - 细胞骨架界面的调节因子ERM蛋白，对于RTK活性下游的Ras激活至关重要。我们表明，ERM蛋白与F - 肌动蛋白一起与共受体(如β1 - 整合素)结合，将ERM蛋白集中到与共受体相连的RTK活性相关位点。我们的观察结果表明，破坏ERM蛋白与共受体的相互作用(通过螯合、siRNA下调或ERM蛋白的显性负突变体表达)会消除生长因子诱导的Ras激活，这有力地证明了ERM蛋白在Ras控制中的作用。
图6. ERM蛋白影响全长SOS对Ras的GEF活性。A，体内GEF活性与ERM蛋白的存在相关。用siERM混合物处理NIH 373细胞，然后在存在[α3 PJ]-GTP和PDGF处理的情况下用链球菌溶血素O渗透。测量捕获在免疫沉淀的Ras结合口袋中的结合[α3 P]-GTP。B，体内GEF活性与野生型ezrin相关，而与R579A ezrin无关。用多西环素处理多西环素诱导的ezrin野生型(ezrinWT)或R579A(ezrinRA)NIH 373细胞，然后如 中所述测量体内GEF活性。C，体内GEF活性与野生型ezrin相关，而与R40L ezrin无关，表明GEF活性依赖于ezrin的Rs结合。用多西环素处理多西环素诱导的ezrin野生型(ezrinWT)或R40L(ezrinRL)NIH 3T3细胞，然后如C中所述测量体内GEF活性。结果表示至少3次独立实验的平均值 标准偏差。进行了单向方差分析统计分析。D，SOS/野生型ezrin复合物具有高体外GEF活性。(左图)将SOS/ezrin复合物与预加载有[a PJ-GTP的Ras一起孵育。反应由过量的GTPyS引发，并测量Ras结合的放射性GTP的损失。定量结果表示至少3次独立实验的平均值 标准偏差， 使用学生t检验。(右图)免疫印迹显示从早期野生型和表达R579A的细胞中沉淀的SOS量相等。结果代表至少三次独立测定，每个图代表来自同一印迹和相同曝光的实验。
doi:10.1371/journal.pone.0027511.g006
针对生长因子PDGF，我们可以证明ERM/肌动蛋白催化形成由RTK、共受体、Grb2、SOS和Ras组成的多蛋白复合物。此外，我们确定ezrin以及可能的其他ERM蛋白是Ras和SOS的新细胞内支架伙伴。Ezrin通过ezrin的不同结构域直接组装Ras和SOS，并且无法与Ras或SOS相互作用的ezrin突变体严重损害了PDGF或EGF诱导的Ras活性。此外，在渗透细胞中，PDGF诱导的Ras鸟嘌呤核苷酸摄取刺激被ERM蛋白的siRNA下调或显性负ezrin突变体的表达特异性阻断。这些数据表明，功能性ezrin直接组装Ras和SOS是PDGF依赖性刺激Ras上核苷酸交换所必需的。
除了具有支架功能外，埃兹蛋白可能是SOS调节所需的一种新的细胞内伙伴。与其他鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)一样，SOS是一种具有自身抑制结构域的大型蛋白质。根据突变数据[23]，SOS需要展开才能使Ras进入变构调节位点，从而释放催化活性。然后催化结构域促进另一个Ras分子上的GTP与GDP交换。用从细胞中分离出的纯化SOS进行的体外Ras激活试验表明，只有与埃兹蛋白结合时，其GEF活性才会增强。我们提出，埃兹蛋白不仅通过其不同结构域组装Ras和SOS，而且它与SOS的自身抑制性DH-PH结构域相互作用，可能有助于解除SOS的自身抑制和/或将Ras呈递给SOS的变构调节位点(图7展示了所提出的SOS激活机制模型)。
图7. 埃兹蛋白介导的SOS激活模型。生长因子(GF)诱导促进埃兹蛋白激活，其定位于共受体/黏附受体，而SOS与激活的受体酪氨酸激酶(RTK)偶联。埃兹蛋白与F-肌动蛋白结合，与SOS的DH-PH结构域结合，形成与膜的稳定锚定，并协助解除SOS的自身抑制。随着远端/变构位点的暴露(现在用黄色星号表示暴露位点；灰色表示掩盖构象)，埃兹蛋白与Ras-GDP的结合增加了Ras-GDP与该变构位点结合的能力，促进了SOS催化核苷酸交换的能力(两个红球表示GDP，三个红球表示GTP)。
doi:10.1371/journal.pone.0027511.g007
虽然这项研究提供了证据表明埃兹蛋白是SOS激活所必需的；然而，我们应该考虑到，SOS的完全激活还需要其他伙伴。一个可能的候选者是质膜，因为它距离较近。事实上，我们用分离的SOS进行的体外GEF试验中，除了埃兹蛋白外还含有脂质。先前已表明脂质相互作用可解除SOS的自身抑制。例如，磷酸肌醇与PH结构域的结合[1]以及磷脂酸与SOS的组蛋白样结构域的结合是其自身抑制的重要调节因子[2,25,26]。综合这些发现，埃兹蛋白在体内靶向质膜及其与SOS的直接相互作用都是SOS完全激活的关键特征(见图7中的模型)。值得一提的是，这些埃兹蛋白介导的SOS激活原理可能具有更广泛的意义。由于其他几种GEF也需要解除自身抑制，埃兹蛋白也可能促进这些GEF的激活。事实上，几个实验室已报道除SOS外的其他GEF，如Dbl和Dock180，与ERM蛋白结合[27,28,29]。然而这些研究小组未探讨其作用机制。
埃兹蛋白激活Ras所需的另一个特征是与F-肌动蛋白的结合。埃兹蛋白R579A的显性负效应(其消除了与F-肌动蛋白的结合但保留了与膜蛋白的结合)以及肌动蛋白聚合抑制剂的类似效应证明了这一点。对这些发现最直接的解释是，F-肌动蛋白是稳定复合物的一部分，它将ERM蛋白特异性地聚焦于质膜上的RTK。然而，我们的体外数据表明，埃兹蛋白只有在F-肌动蛋白存在时才能与SOS相互作用，这意味着其作用不止是支架功能:埃兹蛋白可能只有在与F-肌动蛋白结合时才会采取特定的激活SOS的构象。虽然我们的发现表明埃兹蛋白-肌动蛋白连接在信号传导中起作用，但肌动蛋白在信号传导中另一个有趣但不同的功能与转录因子血清反应因子(SRF)的激活有关。游离G-肌动蛋白的丰度通过将其共激活因子之一MAL保留在细胞质中来抑制SRF活性[30]。抑制F-肌动蛋白解聚或促进丝状体组装的信号通路共同作用以防止SRF/MAL复合物的激活——该复合物调控SRF靶基因的一个子集，例如肌动蛋白启动子本身[31]。另一个需要SRF与共激活因子TCF相互作用的子集由细胞外调节蛋白激酶(Erk)调控[32]，并且可能依赖于此处呈现的皮质F-肌动蛋白的信号促进作用。
共受体与埃兹蛋白/F-肌动蛋白的偶联可被视为一个协调和限制SOS与Ras相遇的平台，从而微调生长因子信号。Ras活性的控制至关重要，并且在多个水平上可能因突变而出现问题，例如Ras的致癌突变[33]或编码神经纤维瘤蛋白的基因NF1的失活突变[34]。此外，受体酪氨酸激酶(RTK)的失调通常是癌症发生和维持的原因[35]。毫不奇怪，此处鉴定出的RTK依赖性信号传导步骤的组分，如共受体和ERM蛋白，在癌症中常常过表达[7,36,37,38]。因此，我们提出的埃兹蛋白介导的SOS激活模型现在使我们能够设想共受体的这种不适当激活，例如RTK c-Met的共受体CD44v6的错误表达[39]，以及埃兹蛋白[37]、根蛋白[38]和膜突蛋白[36]的表达升高可能如何促进癌症进展和转移。
方法
生长因子、抗体和试剂
重组人血小板衍生生长因子BB(PDGF)(Biomol公司)；重组人白细胞介素-6(IL-6)、表皮生长因子(EGF)、溶血磷脂酸(LPA)、12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)、Igepal CA-630、Triton-X-100、GDP、GTPγS和强力霉素(dox；Sigma公司)；mantGDP、mantGTP和GST蛋白(耶拿生物科学公司)；Lubrol 17A17(尤尼吉玛公司)；ATP(罗氏公司)；GST-Grb2谷胱甘肽琼脂糖(GST-Grb2)、Rafl-Ras结合结构域谷胱甘肽琼脂糖(GST-Rafl-RBD)、GST-Ras和GST-琼脂糖(奥普斯泰特公司)；拉特罗毒素B(卡尔 Biochem公司)；谷胱甘肽琼脂糖(圣克鲁斯公司)。抗体:GST(B-14)、整合素-β1(M-106)、Erk1(K23)、埃兹蛋白(C-19)、膜突蛋白(C-15)、根蛋白(C-15)、肌动蛋白(I-19)、SOS1(C-23)、PDGFR-β(958)、GFP(B-2)、Myc(9E10)、微管蛋白(TU-02)(圣克鲁斯公司)；Ras(RAS10)(奥普斯泰特公司)；VSVg、HA(罗氏公司)；Flag(F1804)(Sigma公司)；埃兹蛋白(3C12)(NeoMarkers公司)；针对磷酸化蛋白的抗体:PDGFR-β(Y716)(奥普斯泰特公司)；Erk(Thr202/Tyr204)、Stat3(Tyr705)、CREB(Ser133)、埃兹蛋白(Thr567)/根蛋白(Thr564)/膜突蛋白(Thr558)(细胞信号传导公司)。
质粒
埃兹蛋白野生型、N端和C端-GFP，以及埃兹蛋白(ΔABD)-EGFP-N1(安东尼奥·塞奇，不伦瑞克)。埃兹蛋白野生型和T567D-VSVg(pCB6)，埃兹蛋白N端和C端-GST，人埃兹蛋白野生型和T567D-Myc在pcDNA3.1中(莫妮克·阿尔潘，巴黎)。埃兹蛋白野生型和T567D-VSVg片段被亚克隆到pUHD10.3 rtTA反应性克隆载体(EcoR1/Xbal)中。埃兹蛋白N端和C端-GST被克隆到pGEX4T-1载体(BamH1/EcoR1)中。人肌动蛋白结合蛋白野生型(多米尼克·拉勒芒德，巴黎)表达构建体在pcDNA3.1中产生(Kpnl/Not1)，并且一个多西环素诱导的根蛋白野生型-Flag(pcDNA3人根蛋白野生型-Flag，大卫·古特曼，圣路易斯，华盛顿)在pUHD10.3中构建(BamH1/EcoR1)。Myc-SOS和His-SOScat构建体通过PCR产生，然后克隆到pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体(英杰公司)中。pEBG-GST中的GST-CD44尾和GST-CD44尾突变体如莫里森等人2001年所述产生。pcDNA3.1中的Myc-H-Raps和HA-RasWT(美国密苏里大学罗拉分校UMR cDNA资源中心)。为了蛋白质纯化，埃兹蛋白野生型-His被克隆到pET15TEV表达载体(C. 布赖特豪普特-坦，哈雷)中。pProEX HTb表达载体中的His-SOScat(氨基酸残基564 - 1094)从多特蒙德的A. 维廷霍费尔处获得。His-SOS DH-PHcat(氨基酸残基198 - 1049)、His-SOS HDPcat(氨基酸残基1 - 1049)和His-H-Ras(氨基酸残基1 - 166)被克隆到pET15TEV表达载体(BamH1)中。所有点突变使用定点诱变试剂盒(Stratagene)产生。
小干扰RNA实验
根据[40]中所述的程序，使用小干扰RNA(siRNA)下调ERM蛋白。单个siRNA寡核苷酸购自Ambion(仅报告有义链):埃兹蛋白(大鼠，第一组):5’-UCAACUAUUUUCGAGAUCAAAA-3’(开放阅读框606 - 629)，埃兹蛋白(大鼠，第二组):5’-GGGACUCAGGCCUGUUUAUtt-3’(开放阅读框2710 - 2732)；根蛋白(大鼠，第一组):5’-CUCGUCUGAGAAU-CAAUAAGC-3’(开放阅读框752 - 775)，根蛋白(大鼠，第二组):5’- GCUGUGGCUGGGCGUUGAUtt-3’(开放阅读框852 - 874)；膜突蛋白(大鼠，第一组):5’-GGCUGAAACUCAUAAGAAGGAGG-3’(开放阅读框171 - 194)，膜突蛋白(大鼠，第二组):5’-GGCCCUGCUGCAGGCUU-CUtt-3’(开放阅读框1299 - 1321)；埃兹蛋白(小鼠，第一组):5’-GCCGUAU-GUAGACAAUAAAGG-3’(开放阅读框139 - 161)，埃兹蛋白(小鼠，第二组):5’-GGCCAAGUUCGGAGAUUAUtt-3’(开放阅读框528 - 550)；根蛋白(小鼠，第一组):5’-GCACCUCGUCUGAGAAUCAAU-3’(开放阅读框809 - 822)，根蛋白(小鼠，第二组):5’-GCUGUGGCUAG-GUGUUGAUtt-3’(开放阅读框1195 - 1217)；膜突蛋白(小鼠，第一组):5’- GCAAGCCUGACACCAUUGAGG-3’(开放阅读框882 - 905)，膜突蛋白(小鼠，第二组):5’-GGCCCUGCUGCAGGCUUCUtt-3’(开放阅读框1388 - 1410)；对照(Ctr)siRNA(针对萤火虫荧光素酶)5’- CGUACGCGGAAUACUUCGA-3’。针对埃兹蛋白(小鼠)、膜突蛋白(小鼠)和根蛋白(小鼠)的SMART池(四种siRNA的混合物)购自Dharmacon(序列将根据要求提供)。在HeLa和RPM-MC中下调ERM蛋白使用以下siRNA双链体:埃兹蛋白(人，第一组):5’-CCCCAAAGAUUGG-CUUUCC-3’(开放阅读框704 - 722)，埃兹蛋白(人，第二组)；5’- UCCACUAUGUGGAUAAUAA-3’(开放阅读框140 - 158)；膜突蛋白(人，第一组):5’-AAAAGCCCCGGACUUCGUC-3’(开放阅读框786 - 804)，膜突蛋白(人，第二组):5’-AGAUCGAGGAACAGA-CUAA-3’(开放阅读框1058 - 1076)；根蛋白(人，第一组):5’-GCA-GUUGGAAAGGGCACAA-3’(开放阅读框948 - 966)，根蛋白(人，第二组):5’-CUCGUCUGAGAAUCAAUAA-3’(开放阅读框752 - 775)。作为对照，使用以下乱序双链体(源自第一组双链体):埃兹蛋白5’-CCGUCACAUCAAUUGCCGU- ，膜突蛋白 -ACUAGACGAACCGUCGCUC- ，根蛋白 - GAUGCAGCAGCAUGAAGAG-3’。
细胞培养
RT4-D6P2T(RT4)大鼠雪旺细胞瘤细胞系 经ENU诱导的RT4-D6P2T大鼠雪旺细胞瘤细胞系(突变的ErbB2激活Ras-MAP激酶级联反应)[41]，NIH 3T3小鼠成纤维细胞和HeLa人宫颈上皮样癌细胞系(欧洲动物细胞培养物保藏中心)。携带强力霉素(dox)诱导型埃兹蛋白野生型或埃兹蛋白突变体的RT4和NIH 3T3细胞(分别命名为RT4tetEzrin或NIH 3T3tetEzrin)按照Morrison等人2001年所述方法制备。细胞在补充有10%胎牛血清(FCS；Gibco-BRL)或用于NIH 3T3的10%供体小牛血清(Gibco-BRL)的杜氏改良 Eagle培养基(DMEM；Gibco-BRL)中培养。所有细胞在湿度为 、温度为 的环境中培养。所有细胞培养实验中dox的浓度为 。
细胞的稳定转染和瞬时转染
转染(包括RNA干扰和质粒DNA转染)使用Lipofectamine(Invitrogen)按照制造商说明进行。为了生成稳定克隆或混合克隆，细胞与pCEP4(潮霉素抗性)(Invitrogen)共转染，并在 潮霉素(罗氏)中筛选。注意，dox诱导型埃兹蛋白野生型或埃兹蛋白突变体以及表达埃兹蛋白的稳定/混合克隆中外源埃兹蛋白的表达量比内源性埃兹蛋白水平高35倍以上。
培养皿中生长条件的定义
低细胞密度(=对数或指数生长)定义为在每 接种500个细胞后在 记录的密度。高细胞密度(=汇合生长条件)定义为在每 接种 个细胞(每 个NIH 3T3 细胞)后在 记录的密度。
荧光显微镜检查
细胞在置于六孔板中的盖玻片上生长。细胞在室温下用“细胞骨架缓冲液”(CB: PIPES、 EGTA、 葡萄糖、 ，pH 7.0)中的4%多聚甲醛固定20分钟，在CB中洗涤3次，并在PBS中0.05% Triton-X-100中通透1分钟。用与Alexa 594偶联的鬼笔环肽(Molecular Probes)以1:50的稀释度检测肌动蛋白纤维1小时。细胞洗涤3次，用 Prolong抗淬灭试剂(Molecular Probes)固定在载玻片上，并使用配备Plan-Apochromat NA油浸物镜的Axiovert 135 TV显微镜(蔡司)通过落射荧光获得图像。图像用由IPLab Spectrum软件(Scanalytics)驱动的冷却背照式CCD相机(TE/CCD-1000 TKB，Princeton Instruments)记录。
GEF活性测量 - 链球菌溶血素O
细胞内鸟苷酸交换因子(GEF)活性的测定方法如de Vries-Smits等人1995年以及Stephens等人1993年所述。简而言之，将NIH 3T3细胞以 个细胞 接种于6孔板中。次日进行siRNA双链体或表达ezrinWT、R579A的DNA构建体的转染(使用R40L一种多西环素诱导型突变细胞系)。再一天后，在ERM敲低或构建体表达 (添加多西环素的情况已注明)后，细胞过夜血清饥饿以进行测定。在用 渗透缓冲液 (HEPES pH 7.5、 谷氨酸钾、 乙二醇双乙醚二胺四乙酸、 三磷酸腺苷、30 U/ml链球菌溶血素O(阿尔托生物试剂公司)、 -鸟苷三磷酸(哈特曼分析公司)和 -/+ 10 ng/ml血小板衍生生长因子)替换培养基后开始测定动力学。在指定时间点，通过加入1 ml裂解缓冲液(50 mM HEPES pH 7.5、100 mM氯化钠、10 mM氯化镁、1% NP - 40、100 μM鸟苷二磷酸、100 µM鸟苷三磷酸 S、蛋白酶抑制剂混合物“不含乙二胺四乙酸的完全混合物”(罗氏公司)和5 μg/ml抗Ras抗体Y13 - 259)终止交换反应。通过离心清除裂解物，补充至含有 氯化钠、0.6%脱氧胆酸钠和0.06%十二烷基硫酸钠，并用蛋白Gplus琼脂糖(癌基因公司)免疫沉淀Ras。沉淀物用 Ras洗涤缓冲液(50 mM HEPES pH 7.5、500 mM氯化钠、5 mM氯化镁、0.1% Triton - X - 100和0.005%十二烷基硫酸钠)洗涤六次，然后进行切伦科夫计数。
鸟苷酸交换因子(GEF)活性测定 - 来自细胞的含SOS复合物
按照Downward等人1995年以及Rubio等人1999年所述方法进行SOS对Ras的核苷酸交换活性测定。简而言之，使用了四个15厘米的培养皿。在每个培养皿中接种 阿霉素诱导的NIH 3T3细胞(阿霉素可诱导ezrinWT或ezrinR579A突变体)。第二天，细胞进行血清饥饿处理并加入阿霉素过夜。接下来的一天，在每个培养皿中，细胞在 血小板衍生生长因子(PDGF)刺激(50 mM HEPES pH 7.4、0.5% Lubrol 17A17、 钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物“complete w/o EDTA”)后，用 裂解缓冲液裂解。裂解物混合后再分成四份，使用GST - Grb2将SOS下拉 。通过免疫印迹确认SOS含量相等且存在ezrin。下拉产物保存在冰上，直至用于交换测定。Ras加载:重组H - Ras 在 用 - GTP在 加载缓冲液(50 mM HEPES pH 7.5、5 mM EDTA和 牛血清白蛋白)中加载 。通过在冰上加入 终止反应。加入高镁缓冲液 (50 mM HEPES pH 7.5和5 mM )和1 mM冷的、非放射性的GTP，并将 调整至 。将此混合物 加入免疫沉淀物中，并在 测定核苷酸交换 。通过放在冰上并加入 Ras洗涤缓冲液、 牛血清白蛋白和 Y13 - 259抗Ras抗体终止反应。用蛋白Gplus琼脂糖免疫沉淀Ras。沉淀物用 Ras洗涤缓冲液洗涤四次，并进行切伦科夫计数。
从大肠杆菌中纯化蛋白质
表达载体pET15TEV在蛋白质的N端融合了一个多组氨酸标签，随后是一个烟草蚀纹病毒(TEV)切割位点。用SOS、埃兹蛋白或Ras蛋白表达构建体转化大肠杆菌细胞(Rosetta 2 DE3，Novagen)，并在补充有抗生素(100 mg/1氨苄青霉素和100 mg/l氯霉素；Carl Roth)的LB培养基中培养。在细胞密度对应于在 时吸光度为 时，用 IPTG(用于Ras；Carl Roth)、 IPTG(SOS)或 IPTG(埃兹蛋白)诱导蛋白质表达，蛋白质在 过夜表达(Ras)，在 表达 (SOS)或在 表达 (埃兹蛋白)。通过在 以 离心收集细胞，重悬于含有蛋白酶抑制剂的Ras重悬缓冲液(RB； Tris 、 GDP和0.5% Triton-X-100)、SOS重悬缓冲液(50 mM Tris pH 7.4、1 M NaCl和0.5% Triton-X-100)或埃兹蛋白重悬缓冲液(50 mM Tris pH 8.0和150 mM NaCl)中，并在液氮中速冻。解冻后，加入溶菌酶(Carl Roth)。通过超声处理(15秒脉冲，30秒间隔)进行细胞裂解。在JA 25.50转子中以15,000 xg离心 收集细胞碎片。所有纯化均在 进行。将剩余清澈的裂解物与Ni-Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare)孵育过夜，并转移至Glass Econo-Column Columns(Bio-Rad)。在用RB和添加了 咪唑的RB进行几次洗涤步骤后，使用相应RB中的 咪唑洗脱蛋白质(对于Ras包括 NaCl)。收集含有蛋白质的级分，并针对以下缓冲液进行透析:Ras(50 mM Tris pH 7.4、5 mM MgCl 和1 mM DTT)；SOS(20 mM Tris pH 8.0和100 mM NaCl)；以及埃兹蛋白(50 mM Tris pH 8.0和150 mM NaCl)。将SOS和Ras蛋白分装，速冻并储存在 。埃兹蛋白要么保存在 ，要么保存在 。需要时，按照制造商说明使用TEV蛋白酶(Promega)切割His标签。
从昆虫细胞中纯化蛋白质
全长SOS1基本上按照[42]中所述制备。简而言之，在三层培养瓶中用编码与N端Glu-Glu表位标签(EYMPME)融合的全长人SOS1序列的杆状病毒感染Sf9细胞(德国默克生物科学公司)(克隆于转移载体pAcC13，由旧金山的Frank McCormick惠赠)，感染后72小时收获细胞。细胞用PBS洗涤一次，重悬于每毫升细胞沉淀的 冰冷低渗溶液( Tris ， DTT和蛋白酶抑制剂)中，并在冰上放置 。细胞在冰上用Dounce匀浆器匀浆20次，通过在 以 离心 去除不溶性碎片。将上清液加载到预先在缓冲液A(50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5 mM MgCl ， DTT和蛋白酶抑制剂)中平衡的1-2毫升抗Glu-Glu柱上，缓冲液A先前是按照制造商的说明将 抗Glu-Glu抗体(伦敦的Julian Downward惠赠)偶联到1毫升Actigel基质(Sterogene)制备的。柱依次用 缓冲液A、补充有0.5%NP-40的 缓冲液A、补充有 的10毫升缓冲液A和 缓冲液A洗涤。通过施加含有 EYMPME肽的缓冲液A洗脱Glu-Glu-SOS。收集SOS级分，浓缩，对 Tris pH 7.5、 DTT和50%甘油进行透析，并在 储存。以这种方式保存，SOS对重组H-Ras的核苷酸交换活性至少保持两周。
##基于BrdU的增殖测定
将表达多西环素诱导型埃兹蛋白野生型或R40L突变体的NIH 3T3细胞以低密度接种在置于12孔板中的盖玻片上，随后用 孔溴脱氧尿苷(BrdU，Oncogene)孵育 。细胞在室温(RT)下用“细胞骨架缓冲液”(CB:10 mM PIPES， EGTA， 葡萄糖和 ，pH 7.0)中的 多聚甲醛固定 ，在PBS中洗涤三次，并在含0.1% Triton-X-100的PBS中通透1分钟。在 BSA中封闭 后，盖玻片用 DAPI(Invitrogen)、 -BrdU/荧光素(Alexis)、 DNase缓冲液、DNase和 -myc/TRITC的混合物处理 。细胞在PBS中洗涤三次，用 Prolong抗荧光淬灭试剂(Molecular Probes)固定在载玻片上，并使用Axiovert 135 TV显微镜(Zeiss)通过落射荧光获得图像。
软琼脂试验
用0.25%胰蛋白酶将稳定转染的RT4细胞从培养板上分离下来，重悬于完全培养基中并计数。细胞 重悬于含10% FCS的 培养基中。将此母液分成两份，向其中一半加入多西环素 ，并向每个混合物中加入 温热的琼脂溶液(储备液在无菌PBS中为3.3%)并混合。将混合物迅速以 体积分装到24孔板中，并在 下冷却 。10至14天后计数菌落。
siRNA实验
单个siRNA寡核苷酸购自Ambion，所用的siRNA序列见补充方法。简而言之， 细胞在 平板中过夜接种。所有siRNA的转染均按照制造商的说明使用脂质体进行。第二天，给细胞更换新鲜培养基并使其恢复至少 。在 血小板衍生生长因子(PDGF)刺激5分钟之前，细胞过夜血清饥饿。
外源性重组人埃兹蛋白、根蛋白和膜突蛋白的siRNA
使用脂质体将ERM siRNAs转染到NIH 3T3细胞中。第二天，给细胞更换新鲜培养基并使其恢复至少8小时。然后按照制造商的说明使用脂质体将含人埃兹蛋白、根蛋白和膜突蛋白的质粒DNA转染到细胞中。在 血小板衍生生长因子(PDGF)刺激5分钟之前，细胞过夜血清饥饿。
亲和沉淀和免疫沉淀
对于使用GST-Rafl-RBD进行的下拉实验，细胞在含有25 mM HEPES(pH 7.5)、150 mM NaCl、10 mM MgCl2、1% Igepal CA-630、10%甘油、1 mM EDTA、1 mM钒酸钠、 苯甲基磺酰氟、 抑肽酶和 亮抑酶肽的缓冲液中裂解。对于亲和沉淀，将上清液与 重组融合蛋白在 转速下孵育 。对表达ezrin野生型的合并克隆与ezrin R579A突变体进行Ras检测。 细胞在 平板中过夜接种。在 血小板衍生生长因子(PDGF)刺激 之前，细胞过夜血清饥饿。对于使用GST-N末端ezrin或GST-Grb2进行的下拉实验，细胞在含有25 mM HEPES(pH 7.5)、20 mM NaCl、10 mM MgCl2、0.5% Lubrol 17A17、1 mM钒酸钠、1 mM苯甲基磺酰氟、10 mg/ml抑肽酶和 亮抑酶肽的缓冲液中裂解。上清液与 重组融合蛋白在 转速下过夜孵育。对于所有下拉实验， 细胞在10 cm平板中过夜接种。
按照莫里森等人2001年[16]所述的免疫沉淀程序。简而言之， 细胞在 平板中接种过夜。在进行 血小板衍生生长因子(PDGF)刺激1分钟之前，细胞进行过夜血清饥饿处理。细胞在含有 HEPES(pH 7.5)、20 mM氯化钠、0.5% Lubrol 17A17、1 mM钒酸钠、 苯甲基磺酰氟(PMSF)、 抑肽酶和 亮抑肽酶的溶液中裂解。上清液与 抗体在 下旋转孵育 。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹和考马斯亮蓝染色
使用7.5 - 12.5%的SDS - PAGE凝胶进行电泳后，将蛋白质转移至PVDF膜(密理博)上，并用封闭缓冲液(5%脱脂牛奶、0.1%吐温 - 20、pH值为7.6的 Tris和 )在室温下处理 。然后将膜在封闭缓冲液中与一抗在室温下再孵育一小时，或在 下过夜。三次洗涤后，将膜与二抗在室温下孵育 ，然后使用增强化学发光法(安玛西亚)进行显影和可视化。对于考马斯亮蓝染色的凝胶，使用帝国蛋白染色溶液(赛默飞世尔科技)。使用Quantity One软件(伯乐生命医学产品公司)进行免疫印迹定量分析。注意:除非另有说明，αERM的免疫印迹使用ezrin(C - 19)、radixin(C - 15)和moesin(C - 15)的混合物。对于单个ezrin印迹，使用3C12抗体。
使用重组蛋白的下拉实验
Ras/埃兹蛋白。针对不同条件(GTP S-Ras与GDP-Ras)以及不同纯化的埃兹蛋白突变体测试了Ras/埃兹蛋白的相互作用。按照Margarit等人2003年[43]所述方法进行Ras的核苷酸加载。将各自带有His标签的埃兹蛋白 连接到Ni-琼脂糖上，并在 相互作用缓冲液 (HEPES pH 7.5， 和0.5% Triton-X-100)中与 加载有Ras的蛋白在 下持续旋转过夜孵育。次日，用 冰冷洗涤缓冲液 (HEPES pH 7.5， 和0.5% Triton-X-100)洗涤探针四次，每次洗涤之间进行短暂离心步骤。在最后一次洗涤步骤中，完全去除洗涤缓冲液，剩余蛋白质进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。SOS/埃兹蛋白:SOS/埃兹蛋白相互作用研究在有或没有F-肌动蛋白/G-肌动蛋白的情况下进行。按照制造商的方案将G-肌动蛋白(细胞骨架)聚合成F-肌动蛋白。然后在F-肌动蛋白缓冲液(5 mM Tris pH 8.0， 和0.5 mM DTT)或G-肌动蛋白缓冲液(5 mM Tris pH 8.0，0.2 mM ATP和 DTT)中按照上述程序进行SOS与埃兹蛋白以及F-肌动蛋白/G-肌动蛋白之间的相互作用。
体外荧光鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)活性测量
如先前在Margarit等人2003年[43]中所述，对Ras进行核苷酸加载和核苷酸交换测量。解离速率在结合了停流装置的荧光光谱仪(SFM-400；BioLogic)上进行测量。当有指示时，含有 mantGDP-Ras的底物溶液与补充有 GDP以及其他蛋白质如SOS和/或埃兹蛋白的反应缓冲液自动混合。测量 的解离。数据使用Origin 8Pro程序拟合为线性 (核苷酸解离速率 绝对值(B))、单指数 )或双指数 函数(I为截距， 为斜率， 为振幅， 为无限时间的荧光值， 为表观解离速率常数， 为时间)。
支持信息
图S1 ERM蛋白是PDGFR信号传导所必需的。A，CD44点突变后ERM与CD44尾部的结合丧失。与GST融合的CD44尾部在保持低密度的RT4细胞中过表达。细胞裂解后，对GST-CD44尾部进行亲和沉淀，并用针对ERM蛋白的抗体混合物和用于上样的GST通过蛋白质印迹分析所得复合物。突变的CD44尾部显示ERM结合虽未完全缺失但明显减少。B - D，从质膜上的共受体中去除ERM蛋白会干扰信号传导。用表达CD44的可溶性埃兹蛋白结合结构域(GST-CD44tail)或埃兹蛋白结合缺陷的点突变结构域(GST-CD44tail突变体)的构建体转染RT4细胞。将转染的细胞以低密度接种，在用PDGF(10 ng/mL)诱导之前血清饥饿过夜，然后按所示进行裂解和免疫印迹。B，与突变体相比，在表达可溶性ERM结合结构域(野生型GST-CD44尾部)的细胞中，PDGF诱导的Erk刺激(5分钟)减弱。C，D，在表达可溶性ERM结合结构域的细胞中PDGF诱导信号传导的动力学解析。在表达突变体的细胞中，PDGF在1分钟内诱导Erk磷酸化急剧上升
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图S2埃兹蛋白R579A突变体抑制血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的细胞外信号调节激酶(Erk)磷酸化。A，表达多西环素诱导型埃兹蛋白野生型-VSVg的RT4细胞以低密度接种，血清饥饿过夜，然后用PDGF(20 μM，5分钟)、佛波酯(TPA，100 ng/ml，5分钟)或白细胞介素-6(IL-6，1 ng/ml，5分钟)处理。按所示进行裂解物免疫印迹分析。B，表达多西环素诱导型埃兹蛋白R579A突变体-VSVg的RT4细胞以低密度接种，血清饥饿过夜，然后用PDGF(20 μM，5分钟)、TPA(100 ng/ml，5分钟)或IL-6(1 ng/ml，5分钟)处理。按所示进行裂解物免疫印迹分析。(TIF)
致谢
我们感谢阿尔弗雷德·维廷霍费尔在质粒和蛋白质方面的慷慨相助。我们还要感谢于尔根·韦兰德、特蕾西亚·斯特拉达尔和莫妮克·阿尔潘提供的有益建议和鼓励。感谢乌塔·佩茨提供的技术支持。
作者贡献
实验构思与设计:HM PH。实验执行:HM TS KJG UM IS。数据分析:HM TS。提供试剂/材料/分析工具:IR。论文撰写:HM PH。
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Ras,ERM蛋白,F‑actin,细胞骨架,Ras‑GDP,Ras‑MAPK
表观信息
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