一种体外MEX-5驱动的PGL-3/RNA凝聚物解体机制
发布时间：
2026-04-23 21:17
一种体外MEX-5驱动的PGL-3/RNA凝聚物解体机制
娜塔莎·S·刘易斯 D，西尔贾·泽德利茨 D，汉内斯·奥瑟沃格 ，帕特里克·M·麦考尔 D，拉尔斯·胡巴茨 ，马尔切·布赫施 ，马尔切·纽雷-格鲁斯 D，卡斯滕·赫格 ，弗兰克·尤利歇尔格(b)，克里斯蒂安·R·埃克曼 D，托马斯·P·J·诺尔斯 D，安东尼·A·海曼 D
单位信息见第10页。
由安东尼·A·海曼供稿；2024年7月8日收到；2025年4月7日接受；由本杰明·舒勒和埃文·斯普鲁伊特审阅
MEX-5调节秀丽隐杆线虫胚胎中P颗粒的形成和解体，但其活性的热力学基础仍不清楚。在这里，我们使用时间分辨的体外重组系统表明，MEX-5通过改变RNA可用性和移动相界来溶解预先组装的类液体PGL-3/RNA凝聚物。我们开发了一种微流控分析方法来系统地分析MEX-5如何影响相分离。通过测量PGL-3对相分离的贡献，我们表明MEX-5降低了PGL-3的自由能，使平衡向溶解方向移动。我们的发现为理解RNA结合蛋白如何调节凝聚物稳定性提供了一个定量框架，并展示了微流控技术在精确绘制相变方面的强大功能。
相分离 | 秀丽隐杆线虫 | 极性
P颗粒是线虫秀丽隐杆线虫 生殖系中富集的无膜细胞器的一个例子，由多种蛋白质和RNA组成(3 - 6)。这些蛋白质包括富含RGG的蛋白质如PGLs(7, 8)、RNA解旋酶如GLHs(9)以及内在无序蛋白质如MEG-3/4(10 - 12)。在卵母细胞中，P颗粒对称分布在细胞质和核孔上，而在受精后并伴随着极化，细胞质中的P颗粒聚集到单细胞阶段胚胎的一端。有人提出，P颗粒的聚集是未来生殖系形成所必需的(13)，并受胚胎极性机制控制。在单细胞阶段，皮层分为两个区域，其形成导致细胞质中MEX-5梯度的形成(视频1)，并且已表明这种MEX-5梯度是P颗粒聚集所必需的(14 - 17)。
P颗粒聚集的机制被认为与P颗粒是通过从细胞质中相分离形成的液体这一事实有关。这表明P颗粒通过位置依赖性相分离聚集，相分离在细胞的后部有利，而在前部不利(18)。由于MEX-5梯度与P颗粒聚集的梯度相反，也有人提出P颗粒聚集是由MEX-5活性导致的，MEX-5活性抑制前部的P颗粒凝聚，使P颗粒能够在后部通过相分离形成(18, 19)。关于MEX-5如何抑制P颗粒凝聚的线索来自于观察到MEX-5对RNA具有高亲和力但低特异性。因为P颗粒组装也需要RNA，MEX-5可能会与P颗粒蛋白竞争RNA结合，从而通过在前极竞争RNA来抑制P颗粒形成(19)。然而，MEX-5干扰P颗粒并导致其解体的机制尚不清楚。
在此，我们建立了一种体外检测方法，以研究MEX-5在调节P颗粒形成中的直接作用。我们发现，MEX-5可溶解预先组装的类液态PGL-3/聚rU RNA凝聚物，并将凝聚物形成的阈值转移到更高浓度的RNA和PGL-3。为了量化这些影响，我们采用了一个高通量微流控平台，该平台允许系统地绘制相边界并精确测量稀相PGL-3浓度。这种方法揭示，MEX-5降低了PGL-3对相分离的自由能贡献，这表明MEX-5通过改变RNA的可用性和化合价来调节凝聚物稳定性。总之，我们的研究结果为MEX-5如何控制最小P颗粒凝聚物的溶解提供了机制性见解，并展示了微流控技术在高精度剖析生物分子相行为方面的强大功能。
意义
细胞利用生物分子凝聚物来组织无膜的生化反应，但这些结构如何形成和溶解仍知之甚少。在早期秀丽隐杆线虫胚胎中，P颗粒必须解体以确保正确的细胞命运，这一过程与RNA结合蛋白MEX-5有关。使用重组系统，我们发现MEX-5通过改变RNA可用性、移动相边界和降低凝聚物形成的自由能来溶解P颗粒。我们的研究结果提供了定量见解，有助于理解细胞如何调节凝聚物稳定性，对理解发育和疾病中的相分离具有重要意义。
作者贡献:N.S.L.、S.Z.、H.A.、C.R.E.、T.P.J.K.和A.A.H.设计研究；N.S.L.、S.Z.、P.M.M.、L.H.和M.N.进行研究；M.R.-G.和C.H.提供新试剂/分析工具；N.S.L.、S.Z.、L.H.、F.J.和A.A.H.分析数据；N.S.L.、S.Z.、H.A.、C.H.、T.P.J.K.和A.A.H.撰写论文。
审稿人:B.S.，苏黎世大学；E.S.，拉德堡德大学。
利益冲突声明:A.A.H.是露点疗法公司的创始人兼科学顾问委员会成员。T.P.J.K.是过渡生物公司的联合创始人，T.P.J.K.和H.A.是该公司的顾问。T.P.J.K.是过渡生物公司的首席技术官和董事会成员。这种关系没有以任何方式影响这项工作，该公司也没有为这项工作做出贡献。
版权所有©2025作者。由美国国家科学院院刊出版。这篇开放获取文章根据知识共享署名许可协议4.0(CC BY)分发。
如有通信需求，请联系。邮箱:hyman@mpi-cbg.de。
本文在https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.2412218122/-/DCSupplemental上包含在线支持信息。
于2025年5月12日发表。
结果
RNA降低了秀丽隐杆线虫中组成型P颗粒蛋白PGL-1和PGL-3的饱和浓度 。首先，我们想要在体内确认RNA在P颗粒组装中的作用。为此，我们通过向线虫性腺中显微注射核糖核酸酶A(一种切割单链RNA的核酸内切酶(20))来降解性腺中的RNA(图1A)。显微注射核糖核酸酶A导致测试线虫中核周PGL-1和PGL-3凝聚物的消失(视频2)。相比之下，显微注射相同浓度但与核糖核酸酶抑制剂RNaseOUT混合的核糖核酸酶A的对照线虫维持了各自P颗粒蛋白的核周组装(图1B)。尽管显微注射体积无法与性腺体积归一化，但这些定性实验表明RNA是性腺中P颗粒完整性所必需的。类似的实验表明组装应激颗粒也需要RNA(21)。
RNA序列和浓度调节体外PGL-3凝聚物的饱和浓度和性质。
接下来，我们希望重建PGL凝聚物的RNA依赖性组装。此前已证明这具有挑战性(参考文献19)，因为在RNA存在的情况下添加PGL-3时，它会迅速变硬，蛋白质的动力学也会减慢(补充材料附录，支持信息文本)。为了解决这个问题，我们研究了RNA序列和浓度在体外调节PGL-3凝聚物组装和生物物理特性中的作用。胚胎中PGL-3的浓度约为 (参考文献19)。与之前的观察结果(参考文献19)类似，我们发现体外形成凝聚物需要0.5-1 μM的PGL-3和RNA。据推测，体内的mRNA会被解旋酶解开，从而防止其被困在P颗粒中(参考文献19、22)。为了通过未折叠的RNA减轻这种影响，我们测试了四种不同的同聚RNA(分别表示为聚-rC、聚-rG、聚-rA和聚-rU)对1 μM PGL-3凝聚物形成的影响。在广泛的浓度范围内，聚-rC存在时PGL-3凝聚物不会组装(图2A)。与聚-rG孵育的PGL-3确实形成了凝聚物，尽管在最高浓度下这些凝聚物不是球形的(图 )。PGL-3凝聚物也能与聚-rA和聚-rU形成，与聚-rG的情况不同，这些凝聚物在广泛的浓度范围内都是球形的(图2A)。对于后两种RNA类型，凝聚物内部相对于稀相的PGL-3富集度随RNA浓度增加，直到分别达到1或 ，随后在更高浓度下停滞或略有下降。我们注意到，在最高浓度下，聚-rG的富集度下降最大(图2B)。对于聚-rA和聚-rU，通过荧光显微镜估计的密相体积分数是非单调的，在 RNA左右增加到最大值，然后在更高浓度下下降(图2C)。虽然聚-rG的密相体积分数也持续增加直到 μL，但在这种情况下趋势是否非单调尚不清楚，因为凝聚物形状的不规则性使得在更高RNA浓度下无法准确评估体积。FRAP分析(图 和 )表明，在低聚-rU和聚-rA浓度下，PGL-3的扩散系数与之前在体内测量的PGL-3的 平均值相似(参考文献23)。例如，我们测量了在体外使用1至 μL聚-rU制备的凝聚物中PGL-3的扩散系数为0.04至 。
鉴于秀丽隐杆线虫91%的mRNA在3’UTR中含有尿苷序列(参考文献24)，我们随后专注于由聚-rU组装的凝聚物。用定量相成像(参考文献25)对凝聚物内部生物聚合物PGL-3和聚-rU的总质量浓度进行定量分析，结果显示出非单调行为:随着聚-rU总浓度的增加，凝聚物内部的总聚合物浓度最初增加，然后在超过 RNA时下降(图2 、 和 附录，图S1)。结合扩散(图 和 )、富集度(图 )和体积分数(图2C)测量，这些数据揭示了在该相空间区域中，凝聚物组成和物理性质对平均RNA浓度的复杂依赖性。
图1. RNA降低了秀丽隐杆线虫中组成型P颗粒蛋白PGL-1和PGL-3的饱和浓度。(A) 成年蠕虫性腺注射示意图(上图)以及表达PGL-3-mEGFP的合胞体生殖细胞共聚焦z切片的最大强度投影(下图)。成像ROI位于注射点的紧邻上游或下游。(B) PGL-3-mEGFP或mEGFP-PGL-1凝聚物的示意图(上图)和共聚焦z切片的最大强度投影(下图)。测试注射含有RNaseA(浓度范围为5至15μg/ml)，对照注射是与RNaseOUT预孵育的RNaseA(浓度范围为5至15μg/ml)。在测试和对照蠕虫注射后15分钟拍摄图像(n = 3)。由于注射导致测试条件下的卵母细胞停滞，我们无法跟踪注射的卵母细胞进入胚胎发育过程。箭头指向核周PGL-3-mEGFP、mEGFP-PGL-1凝聚物。
先前的工作表明，重组的PGL-3凝聚物表现出时间依赖性特性，包括随着液滴老化粘度和密度增加(19, 25, 26)。由于与老化相关的分子流动性降低可能会损害凝聚物解体的研究，我们接下来试图评估重组的PGL-3/聚rU凝聚物的时间依赖性。首先，我们使用定量相成像来观察大约3小时内总密相聚合物浓度的变化(图2 和 )。我们发现平均RI差异从 时的 (SEM， 个液滴)增加到 时的 (SEM， 个液滴)，对应于密相聚合物浓度从 增加到 。虽然聚合物密度的这种1.8%的增加表明老化，但我们注意到这种影响很小，特别是与我们在早期观察到的作为RNA浓度函数的约33%的密度变化相比(图 )。接下来，我们比较了在 PGL-3与增加量的聚rU相分离后， 和 时PGL-3-mEGFP的扩散系数(补充材料附录，图S2)。在没有RNA的情况下，我们发现 ，表明扩散随时间减慢，这与先前关于PGL-3凝聚物老化的报道一致(25, 26)。然而，我们还发现，随着向系统中添加越来越多的聚rU，这个扩散系数比单调下降(补充材料附录，图S2)。总之，这些数据表明，虽然RNA并没有完全消除PGL-3在密相中的老化或时间依赖性扩散，但它确实抑制了通常与凝聚物老化相关的扩散动力学减慢。
MEX-5通过锌指结构域与聚尿苷结合对于体外PGL-3/聚尿苷凝聚物的解体是必要的。为了证实我们的体内结果，即添加核糖核酸酶A后P颗粒会解体(图1)，我们确定了体外形成的PGL-3/聚尿苷凝聚物的体积分数与核糖核酸酶A浓度之间的关系。体积分数由z投影液滴半径计算得出。图 和 表明，随着核糖核酸酶A浓度的增加，凝聚物的体积分数降低。这表明PGL-3凝聚物形成后的RNA降解可诱导PGL-3凝聚物解体。
先前的研究表明，MEX-5通过与RNA结合来阻止最小P颗粒凝聚物液滴的组装(19)。这是基于数据显示，含有RNA结合锌指的MEX-5片段在mRNA存在的情况下可以阻止PGL-3液滴的组装。然而，由于体外在mRNA存在下PGL-3液滴会硬化，因此无法研究MEX-5在体外分解形成的P颗粒蛋白液滴中的作用。为了建立这样一种检测方法，我们纯化了功能性全长MEX-5(MEX-5)及其锌指缺失变体(MEX-5ΔZF)(SI附录，图S3和支持信息文本)。天然凝胶显示，MEX-5和MEX-5ΔZF均有主要的单体部分和较小比例的二聚体(SI附录，图S3)。这支持了关于MEX-5通过富含谷氨酸的 末端可能自我缔合的预测(16)。
为了比较这里使用的全长MEX-5与先前与MEX-5ZF片段一起使用的(GUU) RNA的相互作用，使用滤膜结合测定法测量了对这种RNA类型的亲和力。我们发现，与先前报道的MEX-5ZF片段的值相比，全长MEX-5与 RNA的结合亲和力高50倍(图3A)。此外，我们评估了MEX-5对液体PGL-3/聚尿苷凝聚物(以下称为PGL-3/RNA凝聚物)动力学的影响(图3B)。虽然MEX-5能够在一小时内定量收缩预先组装的PGL-3/RNA凝聚物，但锌指缺失突变体MEX-5ΔZF不会改变凝聚物体积(图3C)。在预先组装的PGL-3/RNA凝聚物中加入MEX-5会导致其体积在2小时内随着MEX-5浓度的增加而逐渐减小(图3D)。加入不同浓度的MEX-5ΔZF时，未观察到凝聚物体积有类似的减小(图3E)。全长MEX-5对RNA序列的高亲和力以及较低聚尿苷浓度下凝聚物更快的解体动力学(图3F)支持了先前提出的RNA结合竞争模型，即MEX-5通过隔离RNA来溶解PGL-3/RNA凝聚物(12,19)。
MEX-5在体外改变PGL-3/聚尿苷凝聚物中的相分离边界。综上所述，我们目前的数据表明，使用PGL-3和单一RNA物种可以评估MEX-5在控制简化的最小P颗粒系统稳定性方面的活性。为了研究MEX-5对PGL-3/聚尿苷依赖性相分离的影响，我们采用了组合液滴微流控平台(27 - 29)。在这种方法中，在芯片上制备大量单个油包水液滴，每个液滴由不同浓度的溶质组成，通过改变组分流速来控制(图 )。孵育后，随后对水性液滴进行成像，并通过卷积神经网络对相分离进行分类以生成相图。
我们首先通过改变MEX-5、多聚尿苷(poly-rU)和PGL-3的浓度记录了一个三维相图(图4A)。相分离(红色)和混合(蓝色)的颜色编码对应于在PGL-3通道中检测到的凝聚物。我们发现，增加MEX-5的浓度会导致诱导凝聚物形成所需的PGL-3和多聚尿苷浓度都升高，这证实了我们之前在时间依赖性实验中的观察结果。有趣的是，添加MEX-5会使相界向增加PGL-3和多聚尿苷的饱和浓度方向移动(图4B)。
我们进一步发现，在低RNA浓度下，MEX-5对相界的影响最大，而对于较高的多聚尿苷浓度这种影响变得不那么明显，并且在 以上趋于平稳。在这里，达到了双节线的下端，相界移动变得与RNA浓度无关(图4C)。我们得出结论，由于MEX-5与PGL-3在化学计量上竞争RNA结合位点，在低浓度下RNA结合位点的占据变得更具挑战性。
为了证实MEX-5如上述假设那样因其与多聚尿苷结合的能力而影响相界，将锌指缺失突变体MEX-5ΔZF添加到最小P颗粒系统中(图4D)。与未添加MEX-5的PGL-3/多聚尿苷相图的边界相比，在低于 (4.4 nM)的低RNA浓度下，仅可见非常轻微的变化，这在测量误差范围内。因此，所得相图证实了MEX-5诱导的相界移动与其RNA结合活性相关。
MEX-5的作用机制。为了进一步研究MEX-5对PGL-3/RNA凝聚物的作用机制，我们在每个单独的微流体液滴环境中量化了PGL-3稀相浓度，并研究了其在RNA、PGL-3和MEX-5总浓度变化时的响应。至关重要的是，PGL-3稀相浓度的变化反映了相分离的溶质分配(30, 31)和热力学(32, 33)，因为它描述了热力学分离过程。简而言之，在PGL-3/RNA相图中，可以从数据中评估恒定稀相PGL-3浓度的等高线。在精确的双组分系统中，相分离区域中恒定稀相浓度的线与连接稀相和浓相组成的系线重合。然而，一般来说，其他溶质物种的存在意味着这些等高线的斜率(此后用 表示)提供了PGL-3/RNA系线组分比的下限(32)。 与真正的系线组分比之间的差异取决于相界的形状，并且在相界与PGL-3轴平行的区域中这种差异最小。我们通过首先在PGL-3轴上定义间隔为 的阈值浓度来可视化PGL-3稀相等高线，从而得到8个稀相带，然后为这些带中的数据点分配交替的浅/深蓝色(混合)和红色(分离)颜色(图5A)，浅/深阴影带之间的边界在双节线上是连续的，代表“PGL-3稀相等高线”。在均匀区域中，等高线如预期的那样与RNA轴平行，因为稀相浓度等于总PGL-3浓度。在相分离区域中，等高线呈现正斜率，表明PGL-3和RNA共分配到凝聚物中。为了估计PGL-3/RNA系线组分比，我们观察到1.55至1.95 μM PGL-3之间的相界大多与PGL-3轴平行，因此我们在这个窗口中计算 。通过在不同的MEX-5浓度下进行此过程，我们表明随着MEX-5浓度增加， 降低(图5B)。这表明在浓相中化学计量向较低的PGL-3与RNA比例变化(图5C)，揭示了引入MEX-5也会影响PGL-3/RNA凝聚物的化学计量和组成。
图2. RNA序列和浓度在体外调节PGL-3凝聚物的性质。(A) 分别用聚rA、聚rU、聚rG和聚rC(0.1至200 ng/μI RNA)处理PGL-3::6xHis::mEGFP(1 μM)凝聚物，在诱导凝聚物形成后40至60分钟获取共聚焦z切片的最大强度投影。箭头指向200 ng/μl聚rG时未完全融合的非球形凝聚物(N = 3，n = 15)。(B) 相对于本体，液滴内PGL-3:€xHis:rnmGFP的相对富集随着RNA增加而增加。由于液滴内饱和，RNA进一步增加会降低液滴内PGL-3相对于本体的富集。所有观察结果用连接平均体积分数和个体观察值的线图表示，个体观察值为散点。(C) PGL-3::6xHis::mEGFP(1 μM)凝聚物的体积分数显示，RNA(聚rC除外)最初增加，随后减少。所有观察结果用连接平均体积分数和个体观察值的线图表示，个体观察值为散点。(D) PGL-3:6xi-His:mEGFP(1 μM)凝聚物与聚rA、聚rG或聚rU的共聚焦z切片最大强度投影的热图，以及半FRAP前(-1 )、0"或350"后的热图(N = 3，n = 9)。(E) 分别用聚rA、聚rG和聚rU滴定的PGL-3:6:xHis::mEGFP(1 μM)的扩散常数。PGL-3::6xHis::mEGFP的扩散常数对于聚rA增加，对于聚rU在最初增加后饱和，而对于聚rG则降低。(f) 增加聚rU浓度时PGL-3::6xHis::mEGFP(3 μM)凝聚物的定量相衬图像。色条给出以弧度为单位的局部光学相移。(6) 由PGL-3::6xHis::mEGFP(3 μM)和聚rU(1至200 ng/μl)形成的凝聚物的总聚合物浓度(左)和折射率差(右)的分布。彩色圆圈对应个体测量值，白色圆圈表示中位数，粗黑条是四分位间距，须线延伸超出四分位间距1.5倍。总聚合物浓度先增加，随后再次降低。(H) 诱导相分离后0.5小时和3.3小时，由PGL-3:6xHis::rnEGFP(3 μM)与聚rU(1 ng/μl)形成的凝聚物的定量相衬图像。(/) 针对(H)中的条件，通过QPI测量的总聚合物浓度(左)和折射率差(右)的分布。箱线图和须线与(G)中相同，0.5小时的数据从(G)中复制以方便比较。分布平均值在约3小时内仅增加1.8%。(J) 添加RNaseA(0至36.5 μM)60分钟后，获取PGL-3::6xHis::mEGFP(1 µM)与聚rU(50 ng/μl)凝聚物的共聚焦z切片最大强度投影(N = 3，n = 15)。(K) 随着RNaseA浓度增加，PGL-3::6xHis::mEGFP(1 μM)与聚rU(50 ng/μl)凝聚物的体积分数显著降低。*** *P < 0.001。
图3. MEX-5锌指结构域对于体外PGL-3/多聚-rU凝聚物的解体是必需的。(A) 在100 mM KCl条件下，通过滤膜结合试验检测MBP-MEX-5-tagRFP在体外与RNA的结合。该图显示了结合MBP-MEX-5-tagRFP的(GUU) A RNA寡核苷酸的量与蛋白质浓度的函数关系。实线对应于 形式的拟合，其中 和 是常数， 是MBP、MEX-5-tagRFP与放射性标记RNA之间结合的解离常数(cpm)。(B) 实验范式示意图，向预先组装好的体外PGL-3/多聚-rU凝聚物中添加MEX-5构建体；MBP-MEX-5-tagRFP和MBP-MEX-5ΔZF-tagRFP，并通过显微镜评估解体情况。(C) 引入MBP-MEX-5-tagRFP 1小时后，PGL-3/多聚-rU凝聚物的归一化体积在1和3 μM时均显示出与MBP-MEX-5ΔZF-tagRFP相比显著降低(N = 3, n = 15)。(D) 在添加0 - 3 μM的MBP-MEX-5-tagRFP 0分钟和1小时后，采集PGL-3-6xHis-mEGFP(1 μM)与多聚-rU(1 ng/μl)凝聚物的共聚焦z切片的最大强度投影。(E) MBP-MEX-5ΔZF-tagRFP。凝聚物大小似乎仅在MBP-MEX-5-tagRFP中减小，而在MBP-MEX-5ΔZF-tagRFP中未减小。虚线圆圈标记0分钟时凝聚物的外围。凝聚物内部MEX-5适度富集所需的ZF结构域的存在。3 μM时MBP-MEX-5-tagRFP的广泛富集情况在S/附录图S4中详细说明。凝聚物的归一化体积用连接平均归一化体积和作为散点的各个归一化体积观测值的线图表示。(F) 在添加1 μM的MBP-MEX-5-tagRFP 0分钟和3小时后，采集两种不同浓度多聚-rU(5和25 ng/μl)的PGL-3-6xHis-mEGFP(1 μM)凝聚物的共聚焦z切片的最大强度投影。与较高浓度(25 ng/μl)相比，较低多聚-rU(5 ng/μl)时凝聚物大小似乎减小得更多。MBP-MEX-5-tagRFP似乎以类似方式分配到不同多聚-rU浓度的凝聚物中(N = 3, n = 15)。在固定的MBP-MEX-5-tagRFP浓度下，与较高浓度(25 ng/μl)相比，较低多聚-rU(5 ng/μl)时凝聚物的归一化体积显示出更陡峭的体积减小。所有观测值用连接平均归一化体积和作为散点的各个归一化体积观测值的线图表示。***p < 0.001。
图4. MEX-5在PGL-3/聚rU相图中移动相分离边界。(A) 在22°C下记录了200 mM KCl中PGL-3、聚rU和MEX-5的七个二维切片的三维相图堆栈。通过改变芯片上的流速来改变微滴中的组分浓度。孵育一段时间后，对微滴进行成像。从相分离(参考)到均匀(蓝色)的尺度描绘了图像分类中相分离的概率，揭示了一个清晰的相边界。色条适用于图(A)、(B)和(D)。(B) (A)中堆栈所选切片的二维可视化。MEX-5导致边界逐渐移动。(C) 在不同聚赖氨酸浓度下，PGL-3饱和浓度对MEX-5浓度的剂量反应。在较高的RNA浓度下，相分离抑制变得不那么明显，并在20 ng/μL(22 nM)和25 ng/μL(28 nM)之间趋于平稳。在相应RNA浓度±0.2时，相分离概率在0.46和0.54之间的标准差被描绘为透明误差带。(D) 对于低聚rU和PGL-3浓度，MEX-5锌指缺失突变体对PGL-3/聚rU相边界几乎没有影响。
蛋白质稀相浓度的测量进一步使我们能够提取有关驱动相分离的自由能贡献的信息(31 - 33)。具体来说，我们确定相对于相分离时总自由能变化的PGL-3的自由能贡献，并且该分数在此后被称为优势度(图5D)。在实验中，可以通过在固定的聚rU浓度下绘制PGL-3稀相浓度与其总浓度的关系来获得(图 )。假设凝聚物体积很小，优势度由优势度 给出，其中 是稀相的响应梯度，其对应于图中相分离区域中各点的线性回归斜率(图5E)。对于30(33)至 聚rU之间增加的MEX-5浓度，PGL-3优势度降低(图5F)。因此，MEX-5的引入降低了PGL-3对驱动相分离的自由能变化的相对贡献。结合MEX-5的凝聚物溶解特性，我们推断MEX-5作为调节剂削弱了涉及PGL-3的相互作用(32)。由于MEX-5与RNA结合，一种可能的溶解机制是MEX-5与PGL-3竞争RNA结合位点，从而隐含地破坏PGL-3/RNA结合，并进一步证实MEX-5影响PGL-3在凝聚物环境中与其他组分的集体相互作用。
我们还使用微流控系统对MEX-5与RNA的亲和力进行了正交测量。在这种方法中，通过测量蛋白质在芯片上的扩散运动来确定其大小(流体动力学半径)(34)。通过扩散大小测量在溶液中测得的PGL-3和MEX-5的亲和力低于过滤结合测定法(图3A)，但显示出相同的趋势。MEX-5对聚rU的结合亲和力比PGL-3高七倍。MEX-5ΔZF不显示与聚rU的结合(SI附录，图S5)。测得的MEX-5的 为 ，而PGL-3对聚rU的 为 。
图5. RNA与MEX-5结合的热力学参数及假设机制。(A) [MEX-5] = 2.5 µM时的示例性相图，在指定蛋白质浓度下描绘了稀相带。稀相轮廓的正斜率提供了有关PGL-3和RNA分配到浓相的信息。(B) 在相边界处测量1.55至1.95 µM PGL-3之间的稀相轮廓斜率 ，显示添加MEX-5后 降低。误差条对应于研究窗口内的标准差。(C) 这表明随着MEX-5浓度增加，形成的凝聚物内部PGL-3与RNA的比例降低。(D) 麦克斯韦构造显示相分离前( )和后((1 - - )) )的自由能以及一维表示( : 包含 N种溶质的样品中溶质的总浓度， : 稀相和浓相表面的溶质浓度， : 浓相相对于整个系统的体积)(33)。(E) 优势度可以从PGL-3稀相响应梯度获得，如在 (33 nM)处的切片示例所示(33)。(F) 添加MEX-5后PGL-3优势度降低，导致假设MEX-5在相分离机制中直接干扰PGL-3。误差条对应于拟合R值的标准差。(6) 通过微流体扩散尺寸分析，可以测量MEX-5(1 μM)和PGL-3(1 μM)与聚rU结合后的流体动力学半径。结合曲线(黑色)的拐点对应于 ，显示MEX-5对RNA的亲和力比PGL-3高七倍。误差条对应于确定的 值的标准差。(H) MEX-5招募RNA的拟议机制。溶解凝聚物后，MEX-5通过形成MEX-5-RNA-聚rU组装体抑制PGL-3/RNA相互作用。
讨论
生物分子凝聚体的形成和溶解调控是细胞生物学中的核心问题。在本文中，我们证明了在试管中由 秀丽隐杆线虫P颗粒蛋白PGL - 3和RNA形成的凝聚体，可通过添加MEX - 5蛋白来溶解。
我们的研究基于先前的一项体外实验 (19)，在该实验中，蛋白质 MEX - 5 的 RNA 结合片段可阻止 PGL - 3 与 RNA 形成凝聚物。研究提出了一种 RNA 竞争机制，即 MEX - 5 通过隔离 RNA 来阻止 秀丽隐杆线虫胚胎前部的 P 颗粒组装。然而，由于 PGL - 3/RNA 凝聚物迅速硬化 (19)，之前的实验无法测试 MEX - 5 在溶解最小 P 颗粒凝聚物中的作用。鉴定出能维持 RNA/PGL - 3 凝聚物流动性的合成 RNA 序列，并成功制备全长 MEX - 5(这在之前的 P 颗粒重建实验中是无法实现的 (12, 19))，使得我们能够开发出一种可用于研究 MEX - 5 对最小 P 颗粒凝聚物调控作用的实验方法。添加聚 rU 后，体外 PGL - 3 凝聚物与体内 PGL - 3 凝聚物在生物物理性质上表现出重要的相似性，因为含聚 rU 的体外 PGL - 3 凝聚物的扩散系数与体内 PGL - 3 相当 (23)。
通过协调添加MEX-5后的相界移动、稀相轮廓和相对自由能贡献，我们可以提出一种改进的最小P颗粒凝聚物溶解机制:凝聚物主要基于PGL-3与RNA的相互作用形成(图5H，左)。假设在PGL-3/RNA凝聚物中，RNA分子通常同时被多个PGL-3分子结合，并且PGL-3本身能够与多个RNA相互作用，那么在添加MEX-5后，可以形成PGL-3-RNA-MEX-5组装体(图5H，中)。然而，MEX-5以这种方式与RNA结合会阻断RNA与PGL-3相互作用的结合位点，因此，影响RNA/PGL-3相互作用并降低PGL-3对凝聚物形成的自由能贡献。MEX-5通过RNA与PGL-3的这种“间接”结合有助于解释相图中RNA和PGL-3轴上的移动。此外，PGL-3与RNA比例的降低与MEX-5进入形成的凝聚物的致密相是一致的。最后，MEX-5完全隔离RNA(图5H，右)，这导致PGL-3/RNA凝聚物完全溶解。综上所述，MEX-5不仅通过RNA结合竞争起作用，还可能直接干扰驱动相变的PGL-3-聚rU相互作用。
此处进行的体外RNA结合测量证实了早期的观察结果，即与PGL-3相比，MEX-5对RNA具有显著更高的结合亲和力(24)。然而，先前报道的使用滤膜结合测定法的测量显示，MEX-5锌指结构域对 mRNA的亲和力比此处测定的高20倍，且总体 值更低(19)。在滤膜结合测定中，复合物附着在膜上，未结合的化合物在过滤时被去除，而微流体扩散筛分测量溶液中物质种类的流体动力学半径。结合亲和力的差异可能是由于各自实验设置中盐浓度不同的结果，也可能与相互作用几何形状的差异有关，因为基于表面的相互作用无法准确代表溶液条件下的结合事件(35)。另一个因素是所使用的RNA类型不同，以及聚rU以一系列不同长度提供这一事实，这可能导致解离常数的差异。尽管MEX-5具有更高结合亲和力，但仍需要过量的MEX-5来溶解PGL-3/RNA凝聚物，这可能是由于结合位点的差异。PGL-3有6个RNA结合位点，而MEX-5只有2个(19)。
MBP::MEX-5::tagRFP和PGL-3::His::mEGFP均被纯化并以其标记形式使用。预计荧光蛋白标签会改变凝聚行为(36,37)。事实上，在体外，当标记的PGL-3浓度超过20%时，饱和浓度会降低(38)。我们的目标是开发一种体外系统，该系统类似于秀丽隐杆线虫胚胎中的情况，其中MEX-5或PGL-3在内源位点被完全标记。PGL-3和MEX-5标记的CRISPR品系的产卵量和繁殖力与野生型线虫相当(SI附录，图S6)。在我们的体外试验中，MEX-5::tagRFP带有一个额外的N端MBP标签以避免其聚集。尽管标记的MEX-5::mEGFP在体内似乎完全有功能，但我们无法构建MEX-5::tagRFP品系。当与MEX-5融合时，tagRFP是否需要特定的接头，或者其他红色荧光蛋白如mScarlet是否可行，目前正在研究中。鉴于此，未来的工作可能会更倾向于MEX-5::mEGFP变体。尽管我们看到全长MEX-5会导致凝聚物解体，而缺少锌指的MEX-5ΔZF变体则不会，但我们不能排除标签会损害活性的可能性。
我们的实验是一个涉及RNA、MEX-5和PGL-3的三溶质系统，但它仍与胚胎中的情况有显著差异。MEX-5是两种激酶MBK-2和PLK-1的底物，这两种激酶在卵母细胞到胚胎的转变过程中被激活(39 - 41)。尽管PAR-1维持了MEX-5在前部的富集，但在mbk-2和plk-1突变体中，P颗粒分别均匀分布并扩展到单细胞胚胎的前半部分，这支持了多种激酶在P颗粒解体的时空调节中的相互作用(41 - 43)。未来需要开展工作来研究激酶在体外对MEX-5活性的影响。除了PGL蛋白外，MEX-5还调节P颗粒蛋白MEG-3的梯度，MEG-3是一种仅在早期胚胎中表达的mRNA募集蛋白(12)，是P颗粒分离所必需的。对与PGL-1和MEG-3结合的转录本的分析表明，MEG-3是主要的mRNA募集蛋白，而PGLs在胚胎中仅结合非常小一部分mRNA(44)。有人提出，MEG-3/4通过MEX-5/6梯度定位于胚胎的后端，而PGL-1/3则定位于这些颗粒并控制其大小(11, 12)。因此，MEG蛋白很可能对依赖MEX-5的PGL-3/RNA溶解有重大影响。由于我们的实验中使用了同聚RNA，除了G-四链体之外，我们预计不会有二级结构。然而在体内，像GLHs这样的解旋酶的存在变得至关重要，因为它们能积极解开RNA二级结构(22)。P颗粒内部RNA浓度、序列和结构的变化在调节体内解体速率中的作用是一个令人兴奋的未探索领域。
表1. 本研究中使用的重组DNA
| 重组DNA | 来源 |
| 用于杆状病毒表达PGL-3-His6-mEGFP的基于pOEM1的质粒 | 已发表(19) |
| 用于杆状病毒表达MBP-PS-MEX-5-opt-TEVtagRFP的基于pOEM1的质粒 用于杆状病毒表达MBP-PS-MEX-5ΔZF-opt-TEVtagRFP的基于pOEM1的质粒 | 本研究(TH1767) 本研究(TH2549) |
材料与方法
蛋白质表达与纯化。使用杆状病毒感染系统(45)从Tni昆虫细胞中纯化MBP::MEX-5::tagRFP和MBP::MEX-5ΔZF::tagRFP。病毒感染后 收获昆虫Tni细胞，并通过LM-20微流体处理器(Microfluidics)在裂解缓冲液(25 mM HEPES pH 7.25、300 mM精氨酸、100 mM KCl、20 μL核酸酶(Benzonase)、1片蛋白酶抑制剂(赛默飞世尔科技)、1 mM MgCl₂、2片PhosStop(罗氏)以及1 mM DTT用于100 ml裂解缓冲液)中裂解。裂解物在JA25.50(贝克曼库尔特)转子中于16,000 rpm下在 离心 。将上清液与在含25 mM HEPES pH 7.25、300 mM精氨酸、100 mM KCl和1 mM DTT的MBP结合缓冲液中洗涤过的直链淀粉树脂(NEB)在转子上于4°C孵育2小时。珠子以800 rpm离心3分钟。然后将沉淀的珠子用MBP结合缓冲液以800 rpm洗涤3分钟。该洗涤步骤重复3次。用含25 mM HEPES pH 7.25、300 mM精氨酸、100 mM KCl、10 mM麦芽糖和1 mM DTT的MBP洗脱缓冲液洗脱MEX-5蛋白。从直链淀粉珠上洗脱的物质用含25 mM Tris pH 8、1%甘油和1 mM DTT的肝素稀释缓冲液稀释5.6倍，以达到50 mM KCl用于与肝素琼脂糖珠结合。将平衡好的肝素琼脂糖珠与在肝素稀释缓冲液中纯化的MBP-MEX-5在室温下孵育3分钟。MEX-5在含25 mM Tris pH 8、150 mM KCl、1%甘油和1 mM DTT的肝素洗脱缓冲液中洗涤并洗脱。
PGL-3::6xHis::mEGFP如前所述(19)进行纯化。所有使用的昆虫细胞均用杆状病毒系统(45)感染。所有纯化的蛋白质均分装成小份，在液氮中速冻，并在-80 保存(表1)。
线虫中的核糖核酸酶A注射。如图1所示，在琼脂糖垫上的氟代烃油中对线虫进行显微注射。挑选年轻成年线虫并转移到油中。使用线虫挑针将线虫的头部和尾部牢固地压在垫上，使其附着在垫上(46)。将含有核糖核酸酶A(默克)或核糖核酸酶A(默克)和核糖核酸酶抑制剂(赛默飞世尔科技)的微量毛细管针(艾本德FemtoJet)注射到生殖系合胞体中。线虫立即转移到干净的琼脂糖垫上，并用M9缓冲液洗涤。使用参考文献46中描述的方法将线虫固定在琼脂糖垫上，并使用配备63x/1.3 NA甘油物镜的Visitron旋转盘系统每隔 立即成像 。线虫品系列于下表(表2)。
RNA 同聚物滴定分析。如图 2 和图 3 所示的 PGL-3-6xHis-mEGFP 液滴，是通过将蛋白质从高盐储存缓冲液(300 mM KCl)稀释到生理缓冲液(150 mM KCl)，方法是加入含有同聚物 RNA(0 mM KCl)的空白缓冲液。使用的同聚物 RNA 是聚 rA(Sigma-Aldrich，P9403)、聚 rU(Sigma-Aldrich，P9582)、聚 rG(Sigma-Aldrich，P4404)和聚 rC(Sigma-Aldrich，P4903)。PGL-3/RNA 凝聚物组装后 40 至 60 分钟内对 PGL-3 的凝聚物进行成像。成像规格在材料与方法部分如下所述。所有使用 PGL-3 和 RNA 的体外分析均在生理缓冲液(25 mM HEPES pH 7.25、150 mM KCl 和 1 mM DTT)中进行。
荧光恢复后光漂白(FRAP)。如图 2 所示，通过在 FIJI(47)中液滴最大直径处选择一条六个像素宽的条纹，覆盖暗部和亮部，沿短边平均并减去相机背景，获得横跨半 FRAP 感兴趣区域(ROI)的线性强度分布。在漂白之前，利用边缘处的强度下降自动找到液滴边缘。对恢复的每个时间帧都执行此过程。随后，将第一个分布用作具有实验确定边界条件的一维扩散方程的初始条件(48)。拟合也如参考文献 48 中所述进行。完整代码可在 https://git.mpi-cbg.de/hubatsch/droplet-frap/ 找到。
表 2. 本研究中使用的线虫菌株列表
| 菌株编号 | 基因型 |
| TH561 | PGL-3::mEGFP [pgl-3(dd29)(pgl-3::mEGFP)] |
| TH586 | PGL-1::mEGFP [pgl-1(dd54)(pgl-1::mEGFP)] |
| TH626 | MEX-5::mEGFP [mex-5(dd58)(mex- 5::mEGFP)]; PGL-3::mCherry(knu99) |
PGL-3和RNA的稀相测量。使用QubitTM蛋白质检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司)在Qubit荧光计(赛默飞世尔科技公司)上进行PGL-3的稀相测量。RNA测量使用NanoPhotometer(IMPLEN)进行。
定量相成像与分析。如前所述(25)，使用基于(49)的相干控制全息显微镜(Q-Phase G2，Telight，布尔诺，捷克)对多组分凝聚体进行如图2所示的定量相成像。
如上所述制备含有RNA/PGL-3凝聚体的样品。然而，为了提高相成像测量的准确性，我们通过在 的较高平均PGL-3浓度下制备样品来增加平均液滴尺寸。制备后立即将 的样品加载到温度控制的流通池中。流通池由通过加热粘附到带有 parafilm 条的蓝宝石载玻片 上的聚乙二醇化盖玻片 制成。通道两端用双组分硅胶胶水Twinsil(Picodent，维珀菲尔特，德国)密封，液滴在测量前静置 。如前所述(50)，使用水冷珀耳帖元件将载玻片的温度保持在 进行所有测量。
样品用通过设置为NA为0.30的聚光镜的10纳米带宽陷波滤波器在 处滤波的LED光源照明。用 干物镜(0.9 NA，尼康)采集图像。通常，在靠近盖玻片表面的第一个平面上为几个视野采集全息图 -堆栈 。使用SophiQ软件(Telight，布尔诺，捷克)从原始全息图构建幅度和补偿相图像。
随后如前所述(25)使用用MATLAB编写的自定义代码分析所有相图像。简要地说，通过基于强度的分割在每个图像中识别单个液滴。对于每个识别出的液滴，通过将测量的相移 拟合到以物体为中心的感兴趣区域内来确定折射率差 、几何参数 和 ，分别表示液滴半径、质心的(x, y)坐标以及液滴赤道平面在盖玻片上方的高度。
这里， 是球冠的遍历高度， 是恒定的相偏移， 是正则化函数[详情请见(25)]。随后使用Track.m(https://site.physics.georgetown.edu/matlab/index.html)通过z跟踪z堆栈内的所有液滴。对于每个液滴，代表性参数取为拟合的Adj. 最大的那些参数。所有最佳拟合的Adj. 的检测对象都被丢弃。在每种情况下，我们发现单个液滴的 围绕中心平均值紧密且对称地分布。
凝聚体组成:估计与测量。在这项工作中，我们使用两种不同的分析方法从定量相成像提取的折射率差推断聚-rU PGL-3/RNA凝聚体的组成。第一种表示对PGL-3/聚-rU凝聚体中局部聚合物质量浓度的估计，用于图2G。下面，我们依次介绍基本光学模型和两种分析方法。
遵循先前的工作(25)，我们对PGL-3/聚-rU凝聚体与周围稀相之间的折射率差采用简单的线性模型
其中 和 分别表示物种 的浓度和折射率增量。下标 和 分别表示蛋白质和RNA，而上标分别指定凝聚相和稀相浓度。该模型表明，折射率差异源于两相中蛋白质和RNA浓度的差异。折射率增量表明，对于每种聚合物物种，给定的浓度不平衡对折射率差异有多大贡献。对于 ，我们使用先前测量的聚-rARNA的 值(25)。使用参考文献51中描述的计算器工具，我们根据PGL-3的氨基酸序列估计 为 。请注意， 中引用的不确定性是后续误差传播所必需的，并且是根据 测量的相对不确定性估计为 。
接下来，我们试图从式(2)中的模型获得PGL-3/聚-rU凝聚物中聚合物总质量密度的估计值。为此，我们做了两个合理的假设，这使得可以进行简化近似。第一个假设是，稀相中蛋白质和RNA的浓度都非常低，与凝聚相浓度相比可以忽略不计。基于这个假设，我们将式(2)中的稀相浓度近似为零。鉴于我们随后的发现，在我们探索的区域中，凝聚相浓度比稀相浓度高100到6000倍，这个假设只会在聚合物总质量浓度上引入至多1%的小高估。第二个假设是PGL-3和聚-rU的折射率增量非常相似。事实上，我们上面的估计使它们彼此相差在1%以内。基于这个假设，我们在式(2)中近似 。有了这些近似，模型简化为
图2G中呈现的聚合物总质量浓度分布和 是根据式(3)计算的，使用通过定量相成像测量的单个PGL-3/聚-rU凝聚物的折射率差异分布和 计算得出。
PGL-3/聚-rU凝聚物RNaseA添加测定的组装后。通过加入不含KCI的含有聚-rU的稀释缓冲液来降低盐浓度，从而诱导PGL-3-6xHis-mEGFP(在pH 7.25的25 mM HEPES、1 mM DTT、300 mM KCI中)组装，得到最终缓冲液组成:在pH 7.25的25 mM HEPES、1 mM DTT和150 mM KCI中。在聚-rU/PGL-3凝聚物形成后40至60分钟加入RNaseA(Merck)，并在孵育1小时后成像。成像规格在下面的材料和方法、图像采集部分。
用于测试MEX-5与RNA之间结合的滤膜结合测定。使用参考文献19中发表的方案。
体外实验:PGL-3/RNA凝聚物拆解实验。如图3所示的PGL-3液滴是通过将蛋白质从高盐储存缓冲液(300 mM KCl)稀释到生理缓冲液(150 mM KCl)来组装的，方法是加入含有聚rU(0 mM KCl)的空白缓冲液。诱导相分离后，立即在室温下以100 g离心PGL-3/RNA凝聚物(Eppendorf)，加速设置为9，减速设置为9，持续20至25分钟。所有涉及PGL-3和RNA的体外实验均在生理缓冲液(25 mM HEPES pH 7.25、150 mM KCl、1 mM DTT)中进行，体积为 的MEX-5构建体 ，在 Tris 8、150 mM KCl和1 mM DTT被添加到PGL-3/RNA凝聚物实验中。添加MEX-5后，每隔 立即使用倒置的Andor STORM旋转盘显微镜采集图像，持续 。
荧光成像。图3所示的PGL-3/RNA凝聚物的共聚焦z切片使用倒置的Andor STORM旋转盘显微镜、Andor iXON 897 EMCCD相机、60x/1.2平场复消色差VC、水、尼康物镜进行成像。在10至 深度，步长为 。
体外PGL-3凝聚物的分割。在体外，使用自定义编写的Fiji宏管道对图3中的PGL-3/RNA凝聚物进行分割。简而言之，图像堆栈被分析为二维(2D)最大投影。所有图像堆栈首先减去相机的暗强度计数。图像经过滤波。通过对PGL-3/RNA凝聚物进行分割获得掩码。为了测量PGL-3/RNA凝聚物的体积分数和蛋白质最大强度投影的分配系数，然后将分割后的PGL-3/RNA凝聚物分为PGL-3/RNA凝聚物(内部)值和主体(外部)值。测量分割后的PGL-3/RNA凝聚物的半径以计算液滴的体积。将液滴的总体积除以成像区域中主体的体积以获得体积分数。从PGL-3/RNA凝聚物内部标记蛋白质和标记聚rU的平均荧光强度除以主体中的平均荧光强度来测量标记蛋白质和标记聚rU的相对富集。代码可根据要求提供。
统计学。使用R(1.1.447)对数据进行分析和导出。使用t检验比较样本之间的均值。显著性水平为*P < 0.5，**P < 0.01，***P < 0.001
微流控设备的设计与制造。用于相图测量的设备(图4)如前所述进行制造(29)。简要来说，使用AutoCAD(欧特克)设计三入口和四入口设备，并打印在光掩膜上(微光刻)。在涂覆有SU8 - 3050光刻胶(微化学)(50μm)的硅片上，通过紫外线曝光(40秒)雕刻结构。用丙二醇甲醚醋酸酯(西格玛奥德里奇)去除多余的光刻胶后，将涂覆并压印的硅片烘烤(1分钟，95°C)。然后，将其放入培养皿中，倒入聚二甲基硅氧烷(Sylgard 184，道康宁)和交联剂的10:1混合物。在真空下除去空气(1小时)，随后，将培养皿烘烤 。使用手术刀切割设备并添加入口孔。将干净的载玻片和设备在氧等离子体炉中活化(30秒，60%功率，飞秒，迪纳电子)并键合。在用于微流控平台之前，微流控通道用三氯(1H,1H,2H,2H - 全氟辛基)硅烷(1% v/v，西格玛奥德里奇)在HFE - 7500(氟化学)中处理并加热 。
相图采集与成像。PGL - 3::His6::mEFP、MBP::MEX - 5::tagRFP、MBP::MEX - 5ΔZF::tagRFP和聚 - rU的储备溶液在200 mM KCl(英杰思)中制备。RNA用AF647(赛默飞世尔科技)进行条形码标记。将设备连接到HFE - 7500/008 - 氟表面活性剂(RAN生物技术)混合物、缓冲液(25 mM HEPES pH 7.3、200 mM KCl和1 mM DTT)以及蛋白质/RNA储备溶液。为了达到广泛的浓度范围，通过压力泵(弗卢金特)调节各组分的流速。在芯片上制备油包水液滴(图3)。在成像室中，使用配备10倍物镜(尼康CFI Plan Fluor 10×，NA 0.3)的落射荧光显微镜(凯恩研究)每5秒对其进行成像。
通过自定义编写的Python脚本对PhaseScan图像进行分析。通过经过训练的卷积神经网络检测液滴和PGL - 3/RNA凝聚物。将记录图像的荧光强度与校准图像进行比较，从而转换为浓度。通过液滴内最暗的5%至25%像素确定PGL - 3的稀相浓度，用于系线和优势评估。
微流控扩散尺寸分析。在 蛋白质以及不断增加的聚 - rU(0至6800 ng )条件下制备样品，随后孵育(15分钟)，然后离心以将凝聚相与上清液分离。将制备好的样品孵育15分钟，随后离心(5分钟，15000转/分钟，艾本德5424 R)以减少溶液中RNA/PGL - 3凝聚物的数量。然后，将缓冲液(25 mM HEPES pH 7.3、200 mM KCl和1 mM DTT)和样品添加到芯片上(流体分析)，并在Fluidity One - M仪器(流体分析)上以标准设置(488 nm，尺寸范围3至 )进行测量(图4)。按照文献(52, 53)中所述进行曲线拟合以提取 。
BN-PAGE。将5μg磷酸化的MEX-5在样品缓冲液中稀释至最终浓度为 ，装入含有4%至16% Bis-Tris的NativePAGETM凝胶(赛默飞世尔科技，BN1002BOX)，该样品缓冲液含有6N HCl、50mM NaCl、10%(w/v)甘油和0.001%丽春红S，pH 7.2。使用1×NativePAGE TM运行缓冲液(赛默飞世尔科技，BN2001)作为阳极缓冲液，并将NativePAGETM运行缓冲液与NativePAGETM阴极添加剂(赛默飞世尔科技，BN2002)混合制成1×阴极缓冲液，其最终浓度为0.002% G-250考马斯亮蓝。凝胶在150V恒压下运行2小时，用去离子水洗涤，用40%甲醇、10%乙酸固定，用含0.02%考马斯R-250的30%甲醇和10%乙酸染色。
聚尿苷酸标记。将40μg聚尿苷酸、1×T4 RNA缓冲液(新英格兰生物实验室)、10%(V/V)二甲基亚砜、1mM ATP、40μM对氯苯磷酸酯- Cy5(耶拿生物科学公司)和10U T4 RNA连接酶1(新英格兰生物实验室)混合。在 下孵育反应过夜。将反应加热至 持续 以灭活连接酶。使用旋转柱(西格玛)纯化反应。在 下于乙醇中沉淀过夜，然后用75%乙醇洗涤并重悬于无核酸酶水中。
数据、材料和软件可用性。图的原始数据已存于平台Zenodo，DOI:10.5281/zenodo.12193456(54)。
致谢。我们感谢钱道远(剑桥大学)提供分析脚本并进行有益的讨论。此外，我们还要感谢托马斯·斯奈德里斯、埃拉·德·奇勒里、罗布·斯克鲁顿(剑桥大学)以及竹中浩一郎(马克斯·普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所(MPI-CBG))就该项目进行的富有成效的讨论。我们感谢埃里克·盖茨马、芭芭拉·博尔戈诺沃、雷吉斯·勒梅特尔、阿廖娜·博格达诺娃(MPI-CBG的蛋白质表达、纯化和表征设施)以及扬·佩希尔和布里塔·施罗特 - 迪茨(MPI-CBG的光学显微镜设施)提供的技术支持。我们感谢安德烈·波兹尼亚科夫斯基提供所有蛋白质的DNA构建体。我们也感谢苏珊娜·恩斯特在秀丽隐杆线虫实验中的技术协助。A.A.H.感谢杰拉尔丁·赛杜克斯阅读论文的早期版本并提供有益的评论。本研究是在德国联邦教育与研究部(BMBF)与马克斯·普朗克学会合作支持的马克斯·普朗克生命物质学院内进行的。A.A.H.感谢德国研究基金会(DFG)在德国卓越战略 - EXC - 2068 - 390729961 - 生命物理学卓越集群下的支持。C.R.E.和M.N.分别感谢DFG资助EC369/6 - 1和NO1402/1 - 1。T.P.J.K.感谢欧盟地平线2020研究与创新计划下欧洲研究理事会通过ERC资助DiProPhys(协议编号101001615)提供的资金。开放获取资金由马克斯·普朗克学会提供。
4. J. A. Schisa, J. N. Pitt, J. R. Priess, Analysis of RNA associated with P granules in germ cells of C. elegans adults. Dev. Biol. 128, 1287 (2001), 10.1242/dev.128.8.1287.
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6. C. M. Phillips, D. L. Updike, Germ granules and gene regulation in the Caenorhabditis elegans germline. Genetics 220, iyab195 (2022), 10.1093/genetics/iyab195.
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作者单位:a德国德累斯顿马克斯·普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所，01307德累斯顿；b德国海德堡马克斯·普朗克物质到生命学院，69120海德堡； 英国剑桥大学尤素福·哈米德化学系错折叠疾病中心，剑桥CB2 1EW；d德国德累斯顿系统生物学中心，01307德累斯顿；e德国德累斯顿工业大学生命物理学卓越集群，01307德累斯顿；’德国德累斯顿莱布尼茨聚合物研究所，01069德累斯顿； 德国德累斯顿马克斯·普朗克复杂系统物理研究所，01187德累斯顿；德国哈雷-维滕贝格马丁·路德大学生物学研究所，哈雷，萨勒06120；以及 英国剑桥大学物理系卡文迪许实验室，剑桥CB3 0HE
秀丽隐杆线虫,MEX-5,RNA,锌指结构,PGL-3
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