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AcrVIB1通过促进无活性的crRNA结合来抑制CRISPR-Cas13b免疫，这种结合易受核糖核酸酶攻击

发布时间：

2026-04-24 21:56

AcrVIB1通过促进无活性的crRNA结合来抑制CRISPR-Cas13b免疫，这种结合易受核糖核酸酶攻击

图形摘要

要点

AcrVIB1在没有crRNA的情况下与Cas13b结合
结合的AcrVIB1促进crRNA与Cas13b结合
crRNA与Cas13b的结合无活性且易被核糖核酸酶作用
AcrVIB1与Cas13b的螺旋2结构域结合，阻止其固定crRNA

作者

卡塔琳娜·G·万德拉、斯特凡·施梅尔茨、安格拉·米古尔、……、内娃·卡利斯卡恩、伍尔夫·布兰肯费尔德、蔡斯·L·贝塞尔

通信作者

wulf.blankenfeldt@helmholtz-hzi.de (W.B.)

chase.beisel@helmholtz-hiri.de (C.L.B.)

简而言之

万德拉等人报道了AcrVIB1的抑制机制，AcrVIB1是唯一已知的针对VI-B型CRISPR-Cas系统的抗CRISPR蛋白。他们表明，Acr将Cas13b效应核酸酶转化为一个crRNA汇集器，增强了crRNA的结合，但阻止了靶RNA介导的激活，并使crRNA易被宿主核糖核酸酶作用。

文章

AcrVIB1通过促进可被核糖核酸酶攻击的无效crRNA结合来抑制CRISPR-Cas13b免疫

卡塔琳娜·G·万德拉，斯特凡·施梅尔茨，安格拉·米古尔，阿努贾·基贝，皮尔·卢卡特，塔贾娜·阿赫梅多夫，内娃·卡利斯坎，伍尔夫·布兰肯费尔德特，以及蔡斯·L·贝塞尔

基于RNA的感染研究亥姆霍兹研究所(HIRI)，亥姆霍兹感染研究中心(HZI)，德国维尔茨堡97080 亥姆霍兹感染研究中心(HZI)，德国不伦瑞克38124

不伦瑞克工业大学生物化学、生物技术和生物信息学研究所，德国不伦瑞克38106 维尔茨堡大学医学院，德国维尔茨堡97080

这些作者贡献相同

当前地址:雷根斯堡大学生物化学中心，德国雷根斯堡93053 主要联系人

*通讯作者:wulf.blankenfeldt@helmholtz-hzi.de(W.B.)，chase.beisel@helmholtz-hiri.de(C.L.B.)https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.01.020

摘要

抗CRISPR蛋白(Acrs)抑制CRISPR-Cas免疫防御，几乎所有已知的Acrs都作用于Cas核酸酶-CRISPR(cr)RNA核糖核蛋白(RNP)复合物。在这里，我们表明来自鸭疫里默氏菌的AcrVIB1是唯一已知的针对Cas13b的Acr，它主要通过促进无效的crRNA结合然后进行crRNA降解，在RNP复合物形成的上游发挥作用。AcrVIB1与Cas13b紧密结合，但不与Cas13b-crRNA复合物结合，导致crRNA结合增强而不是被阻断。然而，结合更紧密的crRNA不会被加工，即使有靶RNA也无法激活附带的RNA切割。结合的crRNA也可被核糖核酸酶作用，导致体内crRNA周转，即使在存在Cas13b的情况下也是如此。最后，冷冻电子显微镜(cryo-EM)结构显示AcrVIB1结合Cas13b的一个螺旋结构域，该结构域负责固定crRNA，使该结构域处于游离状态。这些发现揭示了一种将效应核酸酶转化为crRNA汇以抑制CRISPR-Cas防御的Acr。

引言

细菌与(细菌)噬菌体之间古老而持续的军备竞赛导致了众多抗噬菌体防御系统以及噬菌体编码的反防御机制的进化。一种普遍的配对包括CRISPR-Cas系统和抗CRISPR蛋白(Acrs)。CRISPR-Cas系统通过储存作为CRISPR RNA(crRNAs)表达的外来遗传物质片段来赋予适应性免疫，这些片段由系统的效应核酸酶指导抗噬菌体防御。这些系统拥有多种赋予免疫防御的分子机制，当前的分类方案将CRISPR-Cas系统分为2类、7型以及超过33个亚型和变体。 Acrs是通常由噬菌体编码的较小(52-528个氨基酸)的蛋白质，它们抑制基于CRISPR的免疫的不同步骤。这些蛋白质抑制剂已被证明与CRISPR-Cas系统一样多样，有五种CRISPR-Cas类型和13个亚型与至少一种抑制作用相关以及广泛的抑制机制。

在Acr所展现出的多种抑制机制中，绝大多数直接作用于由Cas效应核酸酶与其crRNA形成的核糖核蛋白(RNP)效应复合物。在CRISPR-Cas各类型中最常见的一种模式里，Acr直接结合效应复合物以阻断靶标识别或结合。作为这种模式的例子，AcrIF1附着于I-F型效应复合物中的六聚体Cas7f骨架上，以阻断crRNA向导与靶标DNA的杂交， AcrIIA4占据II型效应核酸酶Cas9的原间隔相邻基序(PAM)相互作用位点，以防止对DNA的检测，而AcrVIA1结合VI-A型效应核酸酶Cas13a的向导暴露部分，以阻断crRNA向导与互补靶标RNA的杂交。 Acr也可导致效应复合物非特异性结合DNA，如AcrIF9所示或使效应复合物或核酸酶乙酰化，以阻断对crRNA靶标侧翼PAM的识别，如AcrVA5所示。其他Acr在复合物结合靶标后对RNP复合物发挥作用。例如，AcrIIC4在PAM结合后但在R环形成前作用于Cas9效应复合物。另外，AcrIIA5在R环形成后通过阻断RuvC核酸内切酶结构域作用于Cas9效应复合物。因此，已经阐明了多种抑制机制，其中Acr作用于预先形成的RNP复合物。

相比之下，仅出现了两种仅在RNP复合物形成之前起作用的机制。在一种以AcrIIC2和AcrIIA17为代表的机制中，Acr结合Cas9，阻碍crRNA结合。在另一种以AcrVA2为代表的机制中，Acr在翻译过程中与V-A型效应核酸酶Cas12a的N端相互作用，导致模板mRNA降解。虽然这两个例子表明RNP效应复合物形成上游的机制步骤可以是Acr的抑制靶点，但RNP形成上游的其他步骤以及许多可能的抑制机制表明还有更多模式有待发现。

在这项工作中，我们表明AcrVIB1是唯一报道的作用于VI-B型效应核酸酶Cas13b的Acr，它也在RNP复合物形成上游起作用，但具有独特的作用机制:促进而非抑制crRNA与Cas13b的结合。然而，这种结合是无效的，它阻止了前体crRNA(pre-crRNA)的加工，并阻断了通常驱动细胞休眠的附带RNA切割的诱导。结合的crRNA也易受RNase攻击，尽管被Cas13b更紧密地结合，但仍导致细胞内的广泛降解。最后，冷冻电子显微镜(cryo-EM)结构表明，Acr将Cas13b锁定在一种可被crRNA部分结合的灵活状态。这些发现为噬菌体如何克服VI-B型CRISPR-Cas系统介导的防御并通过将Cas核酸酶从免疫效应物转变为crRNA的死胡同(即crRNA汇)建立独特的抗CRISPR防御提供了分子见解。

结果

AcrVIB1在体外RNP形成上游抑制Cas13b的附带RNA切割

我们之前使用无细胞转录-翻译(TXTL)进行的实验表明，当在核糖核蛋白(RNP)复合物形成之前起作用时，AcrVIB1对PbuCas13b的RNA附带切割活性具有最强的抑制作用。为了在完全可控的条件下探究这一观察结果，我们使用纯化的组分在体外进行了附带RNA切割实验。作为实验的一部分(图1A)，将PbuCas13b与AcrVIB1或体外转录的crRNA混合。15分钟后，加入剩余的组分(AcrVIB1或crRNA)以及靶RNA和连接荧光团与淬灭剂的附带RNA底物。然后随时间测量通过附带RNA切割使荧光团与淬灭剂分离所产生的荧光。作为实验的一部分，测试了具有加工或未加工末端重复序列的crRNA，以防crRNA的加工状态影响AcrVIB1的抑制作用。

与我们之前的TXTL结果一致，在crRNA之前而不是之后添加AcrVIB1时，其抑制作用更强(图1B和S1)。具体而言，在加工后的crRNA-1之前添加AcrVIB1时，其将PbuCas13b的附带RNA切割活性降低了97%，在之后添加时降低了88%(图1C和S1)。另外两种加工后的crRNA也观察到了类似趋势，在crRNA之前或之后添加AcrVIB1时，其将附带RNA切割活性分别降低了(crRNA-2)94%或70%，(crRNA-3)97%或23%(图1B、1C和S1)。这些附带活性的降低不能归因于添加crRNA的15分钟差异，因为延迟添加时附带切割相似甚至略强(图1B和S1)。当比较加工和未加工的crRNA时，在AcrVIB1之前而不是之后添加crRNA，加工后的crRNA比未加工的crRNA抑制作用更强(crRNA-1为12%对64%，crRNA-2为30%对41%，crRNA-3为77%对105%)(图1C和S1)。我们将未加工的crRNA抑制作用更强归因于加工后的crRNA更容易与PbuCas13b结合，这一点通过加工后的crRNA与未加工的crRNA相比具有更高的荧光输出得到支持(图1B和S1)。除了抑制附带底物的切割外，AcrVIB1还抑制靶RNA的切割(图1D)。总体而言，AcrVIB1抑制靶RNA和附带RNA的切割，抑制步骤主要在RNP复合物形成之前。

AcrVIB1在体内使crRNA不稳定，但不使Cas13b不稳定

在确认AcrVIB1主要在RNP复合物形成上游抑制PbuCas13b的附带RNA切割后，我们开始探索抑制的分子机制。之前对同样在RNP复合物形成上游起作用的三种Acr(AcrIIC2、AcrIIA17和AcrVA2)的研究作为参考点，AcrIIC2和AcrIIA17通过阻止与Cas9结合导致crRNA降解，AcrVA2通过翻译抑制导致Cas12a降解。由于这些Acr在体内导致crRNA或Cas核酸酶降解，我们在大肠杆菌中异源表达未加工的crRNA-1和PbuCas13b以及AcrVIB1时，测量了crRNA和PbuCas13b的丰度(图2A)。

我们首先进行了蛋白质免疫印迹分析以测量PbuCas13b的水平。共表达AcrVIB1和PbuCas13b导致PbuCas13b的表达或稳定性没有差异(图2B)，排除了与AcrVA2类似的机制。因此，我们转向RNA印迹分析来测量crRNA的水平。在这里，在存在PbuCas13b且不存在AcrVIB1的情况下，未加工的和加工后的crRNA - 1均可检测到(图2C)。相比之下，在不存在PbuCas13b以及同时存在PbuCas13b和AcrVIB1的情况下，两种crRNA产物均大大减少。因此，PbuCas13b保护crRNA不被周转，而在存在AcrVIB1的情况下这种保护作用会被逆转。

AcrVIB1与Cas13b结合而非与crRNA结合

虽然AcrVIB1导致大肠杆菌中crRNA的不稳定，但AcrVIB1可能与PbuCas13b或crRNA相互作用。因此，我们使用微量热泳动(MST)测量了AcrVIB1与PbuCas13b或crRNA之间的结合程度(图3和S2)。作为测量的一部分，使用荧光标记的三(羧甲基)氨基甲烷 - 次氮基三乙酸(NTA)部分通过其His标签追踪AcrVIB1。MST测量显示AcrVIB1与PbuCas13b之间紧密结合，计算出的解离常数为 (图3A)。相比之下，MST未检测到AcrVIB1与加工后的crRNA - 1之间的任何结合(图3B)。通过共免疫沉淀和质谱法验证了AcrVIB1与PbuCas13b之间的结合，当两者在体外孵育时(图S3、S4A和S4B)。

《分子细胞》

图1. AcrVIB1主要在体外RNP形成上游抑制PbuCas13b的RNA附带切割

(A) 体外附带切割测定的设置。在添加所有其他成分之前，将PbuCas13b与相应的crRNA或AcrVIB1孵育15分钟。荧光标记的FAM报告基因和与crRNA匹配的靶RNA总是最后添加。随时间测量荧光，在选定时间显示附带切割的值，以确保最高荧光信号未饱和。完整的时间进程见图S1。对于给定的crRNA，无论加工与否，孵育时间相同(crRNA - 1为2小时，crRNA - 2为5小时，crRNA - 3为1小时)。

(B) 使用一组三种crRNA(crRNA - 1 - 3)测量的Cas13b附带切割活性。点代表单个荧光测量值，线和误差条代表三次独立测量的平均值和标准偏差。

(D) RNA靶标切割抑制。在指示时间添加成分，然后孵育60分钟。凝胶图像代表两个独立实验。

另见图S1。

当两者在体外孵育时，通过共免疫沉淀和质谱法进行了验证(图S3、S4A和S4B)。

如果AcrVIB1紧密结合从而抑制PbuCas13b，而crRNA的存在会降低这种抑制作用，那么crRNA与PbuCas13b的结合可能会对随后与AcrVIB1的相互作用产生负面影响。为了直接评估这种可能性，我们进行了微量热泳动(MST)实验，以测量AcrVIB1与已经与crRNA复合的PbuCas13b之间的结合(图3C)。在这种情况下，我们追踪了一个在其5’端用荧光团标记的crRNA，该荧光团不会被Pbu-Cas13b的加工过程去除。标记的是crRNA而不是AcrVIB1或PbuCas13b，因为只有当PbuCas13b同时结合crRNA和AcrVIB1时才会记录到结合相互作用。虽然在这种设置下未检测到AcrVIB1的结合(图3C)，但质量光度分析表明AcrVIB1与PbuCas13b:crRNA复合物之间存在一些相互作用(图S4A)。根据熔解曲线测定，这种相互作用比先添加AcrVIB1时形成的相互作用更不稳定(图S4B)。最后，电泳迁移率变动分析(EMSA)表明，将PbuCas13b与crRNA预孵育会降低标记的AcrVIB1的结合(图S4C和S4D)。因此，我们可以得出结论，AcrVIB1优先结合PbuCas13b而不是PbuCas13b:crRNA复合物，这与AcrVIB1主要在核糖核蛋白(RNP)形成之前抑制PbuCas13b的附带RNA切割作用一致(图1B)。

图2. AcrVIB1在体内逆转PbuCas13b对crRNA的稳定作用

(A) 在大肠杆菌BL21(DE3)中表达PbuCas13b-FLAG、AcrVIB1-His和crRNA的构建体。

(B) PbuCas13b和AcrVIB1的蛋白质免疫印迹分析。检测GroEL作为上样对照。另见表S1。

AcrVIB1促进crRNA与PbuCas13b的结合

在确定AcrVIB1紧密结合PbuCas13b之后，我们接下来研究crRNA的后续结合是如何受到影响的。遵循AcrIIC2和AcrIIA17的先例，我们假设AcrVIB1会阻碍crRNA的结合，这可以解释在RNP形成之前的抑制作用(图1B)以及AcrVIB1在体内导致crRNA不稳定(图2C)。为了验证这一假设，我们再次应用MST来测量标记的crRNA-1与已经与AcrVIB1复合的PbuCas13b的结合程度(图3D、3E和S2)。令人惊讶的是，在有AcrVIB1存在的情况下，crRNA的结合明显比没有时更紧密，各自的值分别为和 (图3D和3E)( )。通过EMSA我们也得到了类似的结果，其中crRNA与PbuCas13b的结合需要高浓度(200 nM)的核酸酶，并且当PbuCas13b与AcrVIB1预孵育时结合增强(图S4E)。虽然与引导RNA和化脓性链球菌Cas9之间测量的皮摩尔亲和力相比，这些结合亲和力较低，但这种亲和力很少被测量，并且在不同的Cas单效应核酸酶之间可能有很大差异(图1B)。总体而言，与AcrIIC2和AcrIIA17形成鲜明对比的是，AcrVIB1增强而不是阻碍crRNA的结合。

结合的crRNA未被加工并导致靶RNA结合改变

虽然AcrVIB1促进crRNA与PbuCas13b结合，但形成的复合物对靶标依赖性的靶标RNA和附带RNA切割能力大幅降低(图1B和1D)。因此，我们评估了AcrVIB1结合对crRNA结合与附带RNA切割之间的两个中间步骤的影响:crRNA加工和靶标RNA结合。从

《分子细胞》

图3. AcrVIB1通过直接与PbuCas13b相互作用促进crRNA结合

(A - E) MST分析，用于量化(A) PbuCas13b与His标签标记的AcrVIB1、(B) crRNA与His标签标记的AcrVIB1、(C) AcrVIB1与PbuCas13b:crRNA复合物(带有5’标记的crRNA)、(D) PbuCas13b与5’标记的crRNA以及(E) PbuCas13b:AcrVIB1复合物与5’标记的crRNA之间的相互作用。在所有实验中，带标记的组分用星号表示。点表示分子在特定浓度下响应温度梯度的移动。误差条表示三次独立测量的标准差。相应的MST曲线见图S3A - S3E。crRNA与PbuCas13b(D)以及与PbuCas13b:AcrVIB1(E)的结合亲和力有显著差异。另见图S2 - S4。

关于crRNA加工，我们将3’标记的crRNA - 1与全长末端重复序列和下游截短的间隔区一起，单独与PbuCas13b孵育，或与已与AcrVIB1形成复合物的PbuCas13b孵育(图4A)。虽然单独的PbuCas13b能完全加工crRNA，但与AcrVIB1形成复合物的PbuCas13b不再能加工crRNA，尤其是在AcrVIB1浓度较高时。在有AcrVIB1存在的情况下，crRNA也保持完整，排除了Acr或与AcrVIB1结合的Cas13b直接介导的任何降解。因此，AcrVIB1与Cas13b的相互作用阻止了crRNA加工。

虽然对crRNA加工的抑制表明其他下游步骤受到干扰，但crRNA加工本身对于Cas13b识别其靶标RNA并激活附带RNA切割并非必需。因此，我们评估了第二个中间步骤，靶标RNA结合(图4B和4C)。我们再次使用MST，通过5’标记追踪靶标RNA。我们还使用了一种螯合游离镁离子的缓冲液，以允许靶标RNA结合，而不会受到附带RNA切割的干扰，这与之前对Cas13b的研究类似。在这些条件下，将PbuCas13b与AcrVIB1预孵育导致PbuCas13b:crRNA - 1核糖核蛋白复合物对靶标RNA的结合适度但显著降低，从的85降至。在没有AcrVIB1的情况下，值与之前报道的相似(27 - 42 nM) 。通过EMSA进行类似的分析显示，结合的靶标RNA有明显的条带模式，表明在有AcrVIB1存在的情况下，PbuCas13b:crRNA与靶标RNA之间的相互作用发生了改变(图S5A)。使用crRNA - 2和crRNA - 3通过EMSA观察到，结合的靶标RNA的条带模式有类似变化，并且在有AcrVIB1存在的情况下靶标RNA结合减少(图S5B和S5C)。在crRNA加工中断和靶标RNA识别改变之间，crRNA与PbuCas13b:AcrVIB1增强的结合可被认为是无效的。

文章

图4. AcrVIB1完全抑制crRNA加工，部分抑制靶标RNA结合，甚至在有PbuCas13b存在的情况下也能促进RNase对crRNA的降解

(A) 在有无AcrVIB1的情况下评估PbuCas13b对crRNA的加工。以填充灰色(100 nM)和黑色(1000 nM)圆圈表示的两种浓度添加AcrVIB1。凝胶图像代表两次独立重复实验。

(B) MST分析，用于量化PbuCas13b:crRNA复合物与5’标记的靶标RNA之间的相互作用。

(C)进行 MST 分析以量化 PbuCas13b:AcrVIB1:crRNA 复合物与标记的靶 RNA 之间的相互作用。缓冲条件允许结合，但可防止靶 RNA 的切割，以防止可能扭曲测量的的 RNA 周转(见 STAR 方法)。点表示分子在特定浓度下响应温度梯度的移动。误差条表示三次独立测量的标准偏差。对应于(B)和(C)的 MST 曲线可在图 S3F 和 S3G 中找到。靶 RNA 与 PbuCas13b:crRNA 以及与 Pbu-Cas13b:AcrVIB1:crRNA 的结合亲和力存在显著差异。

(D)体外 RNase 降解分析的设置，将 PbuCas13b、AcrVIB1 和 crRNA-1 暴露于 RNase T1 或 RNase A。

(E)对经过 RNase 降解分析的 5’ 标记 crRNA 进行 PAGE 分析。每个凝胶图像代表两个独立重复实验。

(F)对(B)中所示的凝胶图像进行分析，使用暴露于 RNase T1 或 RNase A 的样品与未暴露样品之间条带的差异来计算 crRNA 的保护程度。* 。另见图 S2、S4 和 S5。

《分子细胞》

文章

AcrVIB1 的存在使与 Cas13b 结合的 crRNA 易受 RNase 攻击

我们表明，AcrVIB1 与 PbuCa13b 的相互作用导致无效的 crRNA 结合，这会阻止 crRNA 加工、改变靶 RNA 结合并阻碍靶标依赖性的附带 RNA 切割。然而，尚不清楚的是这些机制如何在体内降低 crRNA 的稳定性(图 2C)，因为预计在 AcrVIB1 存在下 crRNA 与 PbuCas13b 的结合增强会导致 crRNA 对宿主 RNases 的更大保护。因此，我们假设无效的 crRNA 结合使结合的 crRNA 易被 RNases 识别，从而导致即使在存在 Cas13b 的情况下 crRNA 在体内也会周转。

为了验证这一假设，我们在有或没有 PbuCas13b 和 AcrVIB1 的情况下，将 crRNA-1 暴露于 RNase T1(一种在单链 RNA 中鸟嘌呤核苷酸后切割的内切核糖核酸酶)或 RNase A(一种在胞嘧啶和尿嘧啶残基后切割的内切核糖核酸酶)(图 4D)。在我们的测试条件下，单独的 crRNA 被两种 RNases 完全降解(图 4E)。PbuCas13b 的存在显著但部分地保护了 crRNA 免受 RNase T1 的降解(图 4E 和 4F)，我们将不完全保护归因于 PbuCas13b 与 crRNA 之间较差的结合亲和力(图 3D)，这会导致 crRNA 定期释放。在 PbuCas13b 和 AcrVIB1 存在的情况下，与不存在 RNase 相比，保护作用显著下降(图 4E 和 4F)，尽管更多的 crRNA 将与 PbuCas13b 结合。因此，我们得出结论，在 AcrVIB1 存在的情况下，crRNA 更容易被 RNase 降解，这解释了尽管 Acr 增强了 crRNA 与 PbuCas13b 的结合，但 crRNA 在体内仍不稳定的现象。

AcrVIB1 阻止 Cas13b 围绕 crRNA 闭合

AcrVIB1可阻断crRNA加工及附带切割的激活，但对靶RNA结合的影响更为微妙，这表明Acr对PbuCas13b产生了结构效应，从而阻碍了核酸酶执行不同功能的能力。因此，我们测定了在不存在或存在AcrVIB1的情况下，PbuCas13b与crRNA结合的冷冻电镜结构(图5)。当省略Acr时，我们观察到一种单一的紧密结构，该结构可精修至3.1 Å分辨率(图5A)，且与先前发表的结晶化PubCas13b:crRNA复合物(PDB: 6DTD)相似。简而言之，PbuCas13b呈现出心形构象，其中位于蛋白质N端和C端的两个高等真核生物和原核生物核苷酸结合(HEPN)结构域(HEPN-1和HEPN-2)形成了包含Cas13b核酸酶活性位点的顶点，而两个螺旋结构域(螺旋-1和螺旋-2)与一个盖子结构共同形成了一个可溶剂进入的腔室，该腔室结合茎环，并为crRNA未配对的延伸部分以及靶RNA的部分留出空间。重要的是，在该复合物中，crRNA的茎环紧密夹在螺旋-1和螺旋-2结构域之间，这两个结构域分别位于HEPN-2和HEPN-1结构域之上，并且还与盖子接触。因此，crRNA在蛋白质没有结构重排的情况下无法离开复合物，这意味着PbuCas13b采用更开放的构象来加载crRNA。基于从晶体结构中获得的先前观察结果， crRNA重复序列的部分在冷冻电镜结构中变得可见，支持了先前的假设，即该延伸部分通过位于与PbuCas13b的HEPN活性位点相对的面的大开口离开腔室(图5A)。

将AcrVIB1与PbuCas13b和crRNA一起使用会导致颗粒异质性增加且不那么紧密。这些样品中唯一可追踪的构象可精修至整体分辨率为4.2 Å(图5B)。虽然所得图谱的质量无法揭示单个二级结构元件，但它清楚地表明螺旋-2结构域已失去与HEPN-1和盖子结构域的接触，导致在其尖端发生摆动。结果，crRNA现在完全暴露于溶剂中，其末端指向远离Cas13b核酸酶核心的方向，并朝向摆动出的螺旋-2结构域的方向(图5B)。

AcrVIB1结合Cas13b的螺旋-2结构域，从而阻止crRNA被固定

由于Cas13b:crRNA复合物的这种开放发生在AcrVIB1存在的情况下，可以想象Acr必须与复合物结合，从而阻止其作为将crRNA保护并固定到位的夹子的作用。然而，由于分辨率较低，AcrVIB1的确切位置在冷冻电镜图谱中并不明显。在考虑不同的可能位置时，我们注意到移位的螺旋-2结构域周围的密度比蛋白质的其余部分分辨率更低。较低的分辨率可能是局部灵活性的结果，在图谱中捕获了具有不同开放程度的构象。或者，较低的分辨率可能表明AcrVIB1与螺旋-2结构域结合。

随着最近AlphaFold3的出现，我们探究了AcrVIB1是否与螺旋-2结构域或PbuCas13b上的其他部位相互作用。由于对完整核酸酶和AcrVIB1的计算结果不明确，我们仅对AcrVIB1与螺旋-2结构域构建了复合物模型。与使用先前版本软件AlphaFold2的类似方法不同，更新的版本得到了一个可重复的1:1复合物的高可信度模型(图6A)。当将该模型映射到Cas13b:crRNA复合物的开放构象时，AcrVIB1楔入盖子和螺旋-2结构域之间(图6B)。重要的是，当将螺旋-2:AcrVIB1模型叠加到PbuCas13b的封闭构象上时，AcrVIB1会到达内部RNA结合腔，并与核酸酶的部分区域发生严重冲突，这就解释了为什么在我们的实验中AcrVIB1不与预先形成的PbuCas13b:crRNA复合物结合。另一方面，开放构象预计会使crRNA更容易进入其在PbuCas13b中的结合位点，这可以解释为什么AcrVIB1会增强crRNA的结合。同时，crRNA在该复合物中未受到保护，正如我们在实验中观察到的那样(图4D - 4F)，它容易被核糖核酸酶降解。解旋酶-2结构域无法围绕crRNA闭合，这可能阻止了先前假设的作为激活附带RNA切割必要步骤的进一步构象变化。

为了通过实验验证AlphaFold3模型，我们重组表达了螺旋-2结构域并进行了评估

《分子细胞》

图5. AcrVIB1的存在使PbuCas13b的螺旋-2结构域解开束缚，暴露结合的crRNA

(A) 结合crRNA的PbuCas13b的冷冻电镜结构。该结构(9FCV)的平均分辨率为3.09 Å。冷冻电镜图谱根据先前报道的PbuCas13b的线性结构域组织进行着色。 crRNA用绿色(引导序列)和黑色(重复序列)着色，HEPN活性位点的保守残基用浅红色着色。左侧展示了冷冻电镜颗粒的代表性二维分类。

(B) 在AcrVIB1存在下观察到的处于开放构象的PbuCas13b:crRNA复合物。该模型通过将(A)中所示结构变形为分辨率为4.23 Å的图谱获得。左侧展示了冷冻电镜颗粒的代表性二维分类。

通过多角度光散射尺寸排阻色谱法(SEC - MALS)和光谱位移滴定法分析与AcrVIB1的复合物形成。该分析揭示了预期分子量的1:1复合物(图6C)，解离常数为251 nM(图6D)。虽然重组复合物难以结晶，但我们可以通过对34 kDa螺旋-2:AcrVIB1颗粒的低分辨率冷冻电镜重建来证实预测的二级结构元件的整体形状和位置(图6E和6F)。

为了探究预测的PbuCas13b与AcrVIB1之间界面处残基的重要性(图S6A)，我们使用我们先前报道的无细胞转录翻译(TXTL)测定法测试了PbuCas13b和AcrVIB1中相关的氨基酸取代。该测定法通过沉默靶向GFP转录本来读出核酸酶活性，而表达的AcrVIB1的抑制作用可逆转这种活性(图S6B)。在PbuCas13b测试的三个取代(K627A、N634A和R662A)以及AcrVIB1测试的取代(D37A/D38A、S56A和T70A)中，PbuCas13b中的R662A以及AcrVIB1中的D37A/D38A和T70A介导了抑制作用的显著逆转(图S6C和S6D)。抑制作用减弱支持了AcrVIB1与PbuCas13b的螺旋-2结构域之间的预测相互作用，而在其他测试残基处缺乏抑制作用可能反映了共同促成结合和抑制的多位点相互作用。

作为探究结合相互作用的另一种方法，我们评估了鸭疫里默氏菌(Ran)Cas13b，它具有

《分子细胞》

图6. AcrVIB1与PbuCas13b的螺旋-2结构域结合

(A) 与AcrVIB1结合的PbuCas13b螺旋-2结构域(残基579 - 747)的AlphaFold3模型。左:根据建模置信度(预测局部距离差异测试[pLDDT]分数)着色的结构。右:模型旋转180°并着色以指示AcrVIB1(紫色)和螺旋-2结构域(蓝色)。一条深蓝色线表示为稳定分离的螺旋-2结构域而引入的人工二硫键的位置。

(B) 结合了cRNA(重复序列为深灰色，引导序列为绿色)的全长PbuCas13b(浅灰色)以及与图(F)中所示冷冻电镜复合物叠加的开放且延伸的螺旋-2结构域。AcrVIB1着紫色，PbuCas13b螺旋-2结构域着蓝色，HEPN活性位点着红色。

(C) AcrVIB1(紫色)、PbuCas13b螺旋-2结构域(蓝色)及其二者复合物(红色)的尺寸排阻色谱 - 多角度激光散射(SEC - MALS)图谱。获得的分子量与预期值高度吻合(AcrVIB1:13.6 kDa，PbuCas13b螺旋-2结构域:20.4 kDa，复合物:34.0 kDa)。结果代表两次独立重复实验。

(D) PbuCas13b螺旋-2结构域与荧光标记的AcrVIB1的结合亲和力测量。橙色点:基于荧光染料的670/650 nm发射率分析。蓝绿色方块:基于微量热泳动(MST)对相同样品的分析。点/方块和误差条表示4次独立重复实验的平均值和标准差。

(E) 包含PbuCas13b螺旋-2结构域(残基579 - 747)和AcrVIB1的34 kDa复合物的代表性二维分类图。

(F) 将(A)中的AlphaFold3模型与分辨率为的34 kDa AcrVIB1:PbuCas13b螺旋-2结构域(残基579 - 747)复合物进行叠加。

另见图S6。

与PbuCas13b有43%的序列一致性。RanCas13b和AcrVIB1共存于同一鸭疫里默氏菌基因组中，尽管AcrVIB1对这种Cas13b的抑制作用较弱。我们推测，螺旋2结构域相关部分内的少数氨基酸差异阻止了AcrVIB1的抑制作用(图S6E)。将RanCas13b中的四个残基替换为与PbuCas13b中对齐的残基(K559N、Y609K、W627R和R630Q)，我们发现在无细胞转录翻译(TX-TL)分析中，一个替换(R630Q)显著增强了AcrVIB1的抑制作用(图S6F)。因此，螺旋2结构域这一区域的序列差异似乎限制了AcrVIB1的宿主范围。总体而言,我们的突变分析有助于证实AcrVIB1直接与PbuCas13b的螺旋2结构域结合。

讨论

基于我们的总体结果，我们提出了一个详细模型，阐述了AcrVIB1(唯一已知的Cas13b核酸酶抑制剂)的作用机制(图7)。在没有Acr的情况下，Cas13b结合并加工前体crRNA，之后可识别靶RNA以激活附带RNA切割。在有Acr的情况下，AcrVIB1通过螺旋2结构域紧密结合Cas13b，从而将Cas13b锁定在开放构象，更易于前体crRNA的结合。不过，前体crRNA的结合是无效的，阻止了前体crRNA的加工。crRNA的引导部分仍可自由与靶RNA杂交，尽管亲和力略有降低。

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图7. AcrVIB1抑制基于Cas13b的免疫的模型示意图

Cas13b与crRNA弱结合形成核糖核蛋白(RNP)复合物，随后进行crRNA加工。然后，RNP复合物可识别激活附带RNA切割的靶RNA。AcrVIB1与Cas13b结合，导致crRNA与Cas13b:AcrVIB1复合物的结合更强。结合的crRNA不进行加工，但仍可与靶RNA杂交。然而，靶RNA杂交不会激活附带RNA切割。与Cas13b结合的crRNA受到核糖核酸酶保护，而与Cas13b:AcrVIB1复合物结合的crRNA易受细胞核糖核酸酶攻击。

亲和力。然而，即使有靶RNA杂交，与AcrVIB1结合的Cas13b也无法发生预测的结构变化，以使附带RNA切割所需的HEPN结构域对齐。由于结合的crRNA没有完全固定，核糖核酸酶可接触到它并至少部分降解crRNA。如果降解的crRNA被释放，Cas13b:AcrVIB1复合物随后可能结合但无法保护其他crRNA分子，实际上将Cas13b变成了一个crRNA汇。总之，在有靶RNA存在的情况下，AcrVIB1阻断Cas13b的免疫激活。如果crRNA已经与Cas13b结合，那么AcrVIB1就会失去抑制免疫激活的能力，因为螺旋2结构域上的结合表面被埋在Cas13b:crRNA复合物中。

除了支持所提出的AcrVIB1抑制机制外，冷冻电镜分析还揭示了Cas13b的crRNA装载步骤。由于目前仅有两个Cas13b:crRNA复合物的晶体结构，且这些结构没有提供Cas13b核酸酶结构域间灵活性的直接证据，这一步骤此前一直不清楚。 AcrVIB1的结合揭示了一种替代构象，其中螺旋2结构域保持向外摆动的构象。由于该结构域在Cas13b:crRNA结构中直接与crRNA相互作用，我们认为它打开以容纳crRNA结合。可以想象，同一个结构域也会移动以适应crRNA与靶RNA之间的完全杂交，尽管此前提出的盖子结构域也可能起到这个作用。因此，Cas13b激活的许多特征仍然不清楚，例如靶标识别如何导致核酸酶激活。对AcrVIB进行进一步研究可能有助于剖析这些步骤。

已阐明的作用机制代表了进入已知的在核糖核蛋白(RNP)形成上游起作用的Acr(抗CRISPR蛋白)的简短但多样的列表中的一个独特条目。在已知机制中，有效应蛋白mRNA的降解以及crRNA的封闭以防止RNP复合物形成。与Acr不同，最近发现一种名为Racr的基于RNA的抗CRISPR元件通过模拟形成无功能RNP的crRNA重复序列在RNP形成上游起作用。 AcrVIB1通过促进而非封闭crRNA结合为这个列表引入了一种独特的机制，但以一种阻断靶标依赖性激活并导致体内crRNA降解的方式。至多，这种机制类似于AcrVA1的机制，AcrVA1切割Cas12a crRNA的引导区域。然而，AcrVA1仅在形成的RNP内切割crRNA，而AcrVIB1促进形成无功能的RNP。鉴于AcrVIB1和其他少数几种Acr及Racr所展示的多样机制，可能还有其他Acr有待发现。例如，这些假设的Acr可能通过类似机制作用于除Cas13b之外的其他Cas核酸酶，或者

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表1. 冷冻电镜数据收集、结构精修及验证统计

数据收集与处理	PbuCas13b:crRNA复合物(蛋白质数据银行编号:9FCV，电子显微镜数据银行编号:EMD - 50322)	AcrVIB1:PbuCas13b:crRNA复合物(电子显微镜数据银行编号:EMD - 51509)	AcrVIB1/PbuCas13b螺旋 - 2结构域(电子显微镜数据银行编号:EMD - 51513)
放大倍数	130,000	130,000	130,000
电压(千伏)	200	200	200
电子曝光量(电子 )	40	40	60
散焦范围(微米)	-0.6至-2.0	-0.6至-2.00	-0.6至-1.6
像素大小(埃)	0.91	0.91	0.91
施加的对称性	C1	C1	C1
图像堆栈数量	3,778	10,707	8,206
初始颗粒图像数量	1,903,944	1,250,433	7,229,692
最终颗粒图像数量	356,629	120,153	1,078,020
图谱分辨率(埃)	3.09	4.23	5.11
傅里叶壳层相关(FSC)阈值	0.143	0.143	0.143
精修
蛋白质残基数量	1,057	-	-
RNA碱基数量	44	-	-
原子数量	19,225	-	-
均方根偏差(RMSDs)
键长(埃)	0.002	-	-
键角(度)	0.404	-	-
蛋白质数据银行验证
冲突分数	2.34	-	-
不良旋转异构体比例(%)	0.00	-	-
C-β偏差	0.00	-	-
拉氏图
有利区域比例(%)	97.7	-	-
允许区域比例(%)	2.2	-	-
不允许区域比例(%)	0.1	-	-

在核糖核蛋白(RNP)形成的其他上游步骤发挥作用，例如Cas核酸酶或前体crRNA的转录、宿主因子(如RNase III或RNase E)对crRNA的加工，或作为间隔序列获取的一部分。

鉴于AcrVIB1和其他这些例子在RNP效应复合物形成后将不再有效，这就提出了一个问题:在哪些感染条件下，这些例子有助于规避基于CRISPR的免疫？抑制作用不太可能使携带Acr的噬菌体在初始感染中受益，因为表达的Acr(或Racr)不会抑制预先形成的用于监测入侵噬菌体基因组的RNP复合物。相反，这些Acr可以协助后续的噬菌体感染浪潮，这种利他效应也与抑制一些DNA靶向CRISPR-Cas系统的Acr有关。如果噬菌体含有突变的靶位点，但该位点可以驱动引发，那么在RNP形成上游起作用的Acr可以在获取新的间隔序列并产生匹配的crRNA之前抑制CRISPR免疫。由于Acr通常在抗防御岛中共同存在，在RNP复合物形成上游和形成过程中起作用的多种抑制机制在不同的感染条件下也可能产生更强有力的抗防御作用。总体而言，更多探索Acr在不同感染条件下不同抑制机制影响的工作可能会进一步揭示细菌 - 噬菌体军备竞赛。

在阐明AcrVIB1作用机制时的一个显著观察结果是，PbuCa13b与其crRNA之间的结合亲和力较差，至少与针对Spy-Cas9测量的结果相比是这样。我们仍然观察到附带的RNA切割活性，因此PbuCas13b与crRNA之间的低结合亲和力不会损害RNP激活。这一观察结果提出了一个问题，即Cas效应核酸酶与其crRNA之间的结合亲和力可以有多大差异以及它们对CRISPR免疫的潜在影响。就Cas13b和AcrVIB1而言，我们推测较差的结合亲和力为AcrVIB1提供了一个在crRNA结合之前抑制Cas13b的机会；否则，AcrVIB1将既无法结合Cas13b也无法作为crRNA汇而失效。

除了其与细菌 - 噬菌体相互作用的相关性之外，AcrVIB1的鉴定和表征为其用于控制基于Cas13的功能奠定了基础。事实上，Cas13核酸酶已被应用于许多以RNA为中心的应用，包括转录后沉默、RNA编辑、分子诊断和体内成像。目前，抑制VI型CRISPR-Cas系统的Acr数量有限，并且只有一个已发表的将Acr用于噬菌体工程的应用。在这种情况下，通过同源重组将Cas13a抑制剂AcrVIA1与感兴趣的基因一起作为选择标记引入。由于AcrVIA1对Cas13a的抑制活性，只有携带感兴趣基因和AcrVIA1的噬菌体才能在Cas13a靶向中存活。由于AcrVIB1在RNP复合物形成之前起作用，依赖预先形成的RNP复合物的应用不太合适，例如噬菌体工程或分子诊断。然而，还有其他应用中RNP复合物不是预先形成的。例如，作为转录后沉默的一部分，AcrVIB1可用于在Cas13诱导之前减少渗漏表达，或者它可以通过Acr的组织特异性表达将沉默限制在特定细胞类型。因此，进一步探索Cas13 Acr的潜在用途可以扩展和增强当前的CRISPR技术能力。

研究的局限性

在本研究中，我们提供了多条证据表明，AcrVIB1通过将PbuCas13b效应核酸酶转化为crRNA汇，抑制CRISPR免疫，该汇更容易结合crRNA，但会阻断目标触发的附带RNA切割，同时使crRNA暴露于细胞核糖核酸酶。然而，在解释所呈现的结果时，有一些局限性需要权衡。首先，起作用的核糖核酸酶仍然未知，并且在大肠杆菌和VI-B CRISPR-Cas系统的天然宿主之间可能有所不同。我们也不能排除除核糖核酸酶之外的其他宿主因子(例如伴侣蛋白和基因调控因子)的参与，这些因子可能有助于体内crRNA丰度的降低。其次，由于AcrVIB1:PbuCas13b:crRNA复合物的高度灵活性以及缺乏可用的靶标结合结构，我们无法获得更深入的结构见解，这使我们无法阐明AcrVIB1与PbuCas13b的螺旋-2结构域之外的其他组成部分之间的确切相互作用。此外，关于螺旋-2结构域的运动如何与crRNA加工、靶标RNA识别以及附带RNA切割的激活相关联，仍然缺乏全面的了解。最后，我们的研究仅限于PbuCas13b，这是迄今为止唯一被测试显示受到AcrVIB1强烈抑制的核酸酶。这种抑制机制如何扩展到其他被抑制的Cas13b直系同源物，尤其是我们观察到的与PbuCas13b相关的弱crRNA结合在Cas13核酸酶中是否独特以及是否影响AcrVIB1对Cas13b全酶的作用，仍有待确定。

资源可用性

主要联系人

如需进一步信息以及资源和试剂请求，请联系主要联系人Chase L. Beisel教授(chase.beisel@helmholtz-hiri.de)，他将予以满足。

材料可用性

本研究中构建的关键质粒已存入Addgene。所有其他质粒可在合理请求下向Chase L. Beisel教授(chase.beisel@helmholtz-hiri.de)获取。

数据和代码可用性

图1、2、4、5、6、S2、S4和S5的原始凝胶图像已存入Mendeley Data(https://doi.org/10.17632/kvhr9y39pc.1)。Cas13b:crRNA结构(PBD: 9FCV)以及Cas13b:crRNA复合物(EMDB: EMD-50322)、Cas13b:crRNA:AcrVIB1复合物(EMDB: EMD-51509)和AcrVIB1:PbuCas13b螺旋-2结构域复合物(EMDB: EMD-51513)的电子密度图可通过蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)获得。自发表之日起，存档数据将公开可用。
本文未报告原始代码。
如需重新分析本文报告的数据所需的任何其他信息，可向主要联系人请求获取。

致谢

我们感谢鲁道夫·菲尔绍中心(综合与转化生物成像中心)的蛋白质表达设施在蛋白质纯化方面提供的出色支持和专业知识。我们还要感谢Ute Widow在蛋白质生产方面提供的出色技术协助。我们也感谢Thomas Gaudin在使用Echo 525声学液体处理仪进行实验方面提供的帮助，以及Mitchell O’Connell进行的初步讨论和技术支持。本研究得到了德国研究基金会SPP 2141计划(C.L.B.获得BE 6703/1-2资助)、欧洲研究理事会巩固奖(C.L.B.获得865973资助)以及亥姆霍兹感染研究中心的内部资金(N.C.、W.B.和C.L.B.获得)的支持。

作者贡献

概念构思:K.G.W.和C.L.B.；实验:K.G.W.、S.S.、A.M.、A.K.、P.L.和T.A.；撰写 - 初稿:K.G.W.、S.S.、P.L.、W.B.和C.L.B.；撰写 - 审阅与编辑:所有作者；可视化:K.G.W.、S.S.、P.L.、W.B.和C.L.B.；监督:N.C.、W.B.和C.L.B.；资金获取:N.C.、W.B.和C.L.B.