非洲侏儒爪蟾的FISH图谱完善了对基因组重排的理解，并揭示了非洲爪蟾的跳跃核仁组织区
发布时间：
2026-05-01 11:44
非洲侏儒爪蟾的FISH图谱完善了对基因组重排的理解，并揭示了非洲爪蟾的跳跃核仁组织区
芭博拉·贝格尔洛娃 、瓦茨拉夫·格沃日迪克 和马丁·克尼特
© 作者 2025
染色体重排是导致基因组多样化的基本进化驱动力。非洲爪蟾(爪蟾属，包括滑爪蟾亚属和爪蟾亚属)代表了一个异源多倍体模型系统，每个亚属内具有相同倍性的物种中染色体数目保守。已鉴定出两种重要的染色体间重排:在滑爪蟾亚属中发现的9号和2号染色体之间的易位，以及可能在爪蟾亚属中广泛存在的9号和10号染色体之间的融合。在这里，我们基于使用染色体测量和荧光原位杂交(FISH)的深入核型分析，研究了异源四倍体非洲侏儒爪蟾(爪蟾亚属)。我们设计了与易位和融合相关基因的FISH探针，以检测这两种主要重排类型的存在。我们还研究了5S和28S核糖体串联重复序列的位置，前者通常与端粒区域相关，后者与核仁组织区(NORs)相关。与易位相关的基因图谱未在非洲侏儒爪蟾中检测到易位，支持了易位仅限于滑爪蟾亚属的假设，但反而在2S染色体上鉴定出一个着丝粒周围倒位。与融合相关的基因图谱证实了9号和10号染色体的融合，支持这种融合是爪蟾亚属的祖先状态。正如预期的那样，5S重复序列主要在几乎所有染色体的端粒区域发现。核仁28S重复序列位于6S染色体上，这一位置以前仅在密切相关的物种非洲副蛙中发现，而其他系统发育上更远的物种的NORs位于不同染色体上。因此，我们假设一种跳跃机制可以解释爪蟾进化过程中NORs位置相对频繁的变化。
《遗传》；https://doi.org/10.1038/s41437-025-00749-x
引言
两栖动物是一类小型脊椎动物，具有高度多样化的倍性水平，从二倍体到十二倍体(梅扎萨尔马等人，2023年)，但同时它们的基因组在核型结构、直系同源染色体之间的同线性以及染色体重排率低方面高度保守(布雷德森等人，2024年；达席尔瓦等人，2021年；特谢拉等人，2016年；宇野等人，2013年)。由于染色体具有很强的稳定性，青蛙的基因组进化被描述为“缓慢”(布雷德森等人，2024年)。代表核型结构创新的例外情况是罗伯逊易位和端对端融合(布雷德森等人，2024年)，一般被认为是青蛙进化的驱动力(莫雷斯卡尔基，1973年)。
负子蟾科的青蛙包括四个属，即爪蟾属、膜蟾属、拟膜蟾属和负子蟾属。其中，至少有两个属(爪蟾属和膜蟾属)既有二倍体物种也有多倍体物种(格沃日迪克等人，2024年；蒂莫夫斯卡，1991年)。此外，负子蟾科涉及两个模式物种——二倍体热带爪蟾和四倍体 。光滑爪蟾——经常用于生物学和生物医学研究(坎纳特拉和德萨，1993年；坦登等人，2017年)，其高质量的染色体水平基因组组装已经有多个更新版本(布雷德森等人，2024年；赫尔斯特伦等人，2010年；米特罗斯等人，2019年；塞申等人，2016年)。此外，负子蟾科青蛙还包括其他新兴模式物种，如北方爪蟾、膜蟾属物种和有可用基因组草图序列的小负子蟾(布雷德森等人，2024年；卡雷等人，2020年；埃文斯等人，2022年)。
非洲爪蟾属包含两个亚属，即非洲爪蟾亚属和滑爪蟾亚属(按照埃文斯等人2015年的分类法)，它们在4500万至5000万年前(百万年前)就有了深度的进化分歧(冯等人，2017年；塞申斯等人，2016年)。整个属中唯一已描述的二倍体物种， .热带爪蟾，与三个四倍体物种:卡氏爪蟾、中热带爪蟾和表热带爪蟾同属滑爪蟾亚属。热带爪蟾有20条染色体，这被认为是整个负子蟾科的祖先染色体数目(布雷德森等人，2024年；梅扎萨尔马等人，2015年)。滑爪蟾亚属中的四倍体有40条染色体，它们的基因组由两个拥有20条染色体的二倍体祖先融合而成(钱恩等人，2008年；埃文斯等人，2004年)。祖先基因组的互补部分，即亚基因组，可以通过测序和细胞遗传学方法相互区分(埃文斯等人，2005年；克尼特等人，2017年、2023年；塞申斯等人，2016年)。滑爪蟾亚基因组被称为a - 和b - 亚基因组(按照克尼特等人2017年的分类法)，有时也被称为α - 和β - 亚基因组(按照埃文斯等人2005年的分类法)。a - 亚基因组比b - 亚基因组与 .热带爪蟾基因组的关系更密切(埃文斯等人，2005年、2015年)。非洲爪蟾亚属在物种多样性和倍性水平方面比滑爪蟾亚属更为多样。该亚属包括25个物种和三个倍性水平(四倍体、八倍体、十二倍体)(埃文斯等人，2015年；蒂莫夫斯卡，1991年)。非洲爪蟾亚属中的亚基因组单位被称为L - 和S - 亚基因组(更长的、更短的；按照松田等人2015年的分类法)。L - 亚基因组更稳定，因此更抗重组，所以L - 亚基因组与 .热带爪蟾基因组之间的差异比S - 亚基因组与 .热带爪蟾基因组之间的差异更小(刘等人，2020年)。S - 亚基因组比L - 亚基因组更有可能发生染色体重排和基因丢失(塞申斯等人，2016年)。非洲爪蟾亚属中的所有四倍体物种有36条染色体，八倍体有72条染色体，十二倍体有108条染色体(埃文斯等人，2015年；蒂莫夫斯卡，1991年)。非洲爪蟾属中的所有多倍体，包括滑爪蟾亚属中的多倍体，都是异源多倍体，它们的基因组来自不同的亲本物种(埃文斯等人，2005年、2015年；克尼特等人，2023年；塞申斯等人，2016年；蒂莫夫斯卡，1991年)。滑爪蟾亚属中a - 和b - 亚基因组(亲本物种)的分歧时间估计为1000万年前(埃文斯等人，2015年)，而在非洲爪蟾亚属中估计为3000万至3500万年前(塞申斯等人，2016年)。后一个亚属中的异源四倍体化事件至少发生在1700万至1800万年前，随后的多倍体辐射至少在1700万年前开始，并形成了三个主要分支，其中 .米勒里物种组最先分支， .光滑爪蟾和 .阿米蒂物种组在1000万至1700万年前左右分裂(埃文斯等人，2015年、2024年；福尔纳尼等人，2023年；塞申斯等人，2016年)。
细胞生物学系，查尔斯大学，维尼奇纳7号，布拉格12843，捷克共和国。 捷克科学院脊椎动物生物学研究所，布尔诺，捷克共和国。
动物学系，捷克共和国国家博物馆，布拉格，捷克共和国。 生物学系，麦克马斯特大学，西大街1280号，汉密尔顿
L8S4K1安大略省，加拿大。副主编:萨拉·古德阿克。 电子邮件:martin.knytl@natur.cuni.cz
尽管爪蟾的核型相对保守，但已鉴定出两种染色体间重排——每个亚属各一种。在滑爪蟾亚属(X. mellotropicalis)中，已发现9b和2b染色体之间着丝粒周围区域的非相互易位(Knytl等人，2017年，2018年)。a染色体和b染色体分别是a亚基因组和b亚基因组的分区，也是L亚基因组和S亚基因组内的L染色体和S染色体(Knytl等人，2017年；Matsuda等人，2015年)。因此，易位发生在 . mellotropicalis的b亚基因组中，但在二倍体 . tropicalis中未发生(Knytl等人，2017年，2018年)。尚未测试这种易位是否与爪蟾亚属的物种共有。在爪蟾亚属中，已描述了祖先 . laevis的9号和10号染色体之间的另一种染色体间重排，它们融合形成了9_10L和9_10S染色体(Session等人，2016年)。这种融合可能发生在爪蟾亚属祖先的二倍体状态(Session等人，2016年)，因此假定存在于爪蟾亚属的所有其他物种中。然而，除了X. laevis之外，尚未对爪蟾亚属其他物种的融合进行深入研究以检测断点和融合接头。
基因组重组也可以通过以串联重复单元形式沉积的重复DNA簇发生，这些重复单元有时被称为多基因家族(Dias等人，2024年；Sember等人，2020年)。这些单元经历协同进化，这一过程导致全基因组中旁系同源拷贝的同质化和一致性(Wang等人，2023年)。串联重复的一个例子是核糖体DNA(rDNA)，它可能(核仁型，例如28S rDNA)或可能不(非核仁型，例如5S rDNA)与核仁的形成相关，具体而言，与核仁组织区(NOR)相关(Fornaini等人，2024年；Symonová和Howell，2018年)。传统上，使用C带或硝酸银染色等传统细胞遗传学技术在爪蟾属中定位NOR，但这些技术通常针对异染色质块，可能不足以检测有时在细胞周期的前一间期为常染色质或无活性的活性NOR(Dobigny等人，2002年；Sánchez等人，1995年；Unal Karakus等人，2024年)。检测真正NOR的一个合理解决方案是荧光原位杂交(FISH)。
在本研究中，我们研究了异源四倍体侏儒爪蟾X. pygmaeus(爪蟾亚属，X. amieti物种组，2n = 36)，旨在通过爪蟾属中的染色体重排更好地理解基因组进化。我们质疑:(1)X. pygmaeus是否具有与X. mellotropicalis(滑爪蟾亚属)相同的9 - 2染色体间易位，和/或(2)是否具有与X. Iaevis(爪蟾亚属)中发现的9 - 10融合相同的情况，和/或(3)X. pygmaeus中是否存在另一种可能驱动基因组进化的重排。为了回答上述问题，我们使用核糖体(与NOR相关)和选定的单拷贝基因的FISH定位来提供X. pygmaeus核型的详细分辨率。然后，我们将我们定位的位置与来自同一亚属的异源四倍体 . laevis( . laevis物种组，分歧时间约10 - 17 Mya)以及来自滑爪蟾亚属的二倍体 . tropicalis和异源四倍体 . mellotropicalis(分歧时间45 - 50 Mya)中相同基因的位置进行比较。
材料与方法
样本来源及原代细胞培养物的制备
来自刚果民主共和国(科科洛波里、亚洛科勒，靠近洛河，0.2056华氏度，22.8884华氏度)的非洲侏儒爪蟾被用于本研究，是该地区发现的非洲爪蟾属的唯一代表(Badjedjea等人，2022年)。一对亲代在没有任何激素刺激的情况下繁殖。母亲和父亲的ID分别是CD18.538和CD18.537b(Evans等人，2024年)。从NF55(±1)阶段的四只蝌蚪的后肢建立原代细胞培养物(Sinzelle等人，2012年)，非洲爪蟾阶段见https://www.xenbase.org/xenbase/anatomy/alldev.do。蝌蚪用MS - 222麻醉。用于细胞培养的四只蝌蚪的ID是XPYTaF1 - 1 - XPYTaF1 - 4。培养基的组成与Knytl等人(2023年)所述相同。细胞在 用 培养。培养基在一周内每天更换，此后每周更换三次(Fornaini等人，2023年)。传代用胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸进行(Knytl等人，2017年)。对于细胞培养，我们使用了同一杂交的同胞。同一杂交的其他同胞被饲养并用作单拷贝基因图谱绘制的探针(ID XPYTaF1 - 5)。所研究蝌蚪的父母通过简化代表性基因分型测序和对线粒体基因组中的16S核糖体RNA(rRNA)基因的一部分进行测序进行基因分型(Evans等人，2024年)，这证实了物种的身份。
核型分析
根据Khokha等人(2009年)描述的方案并做了微小改动(Krylov等人，2010年)，从细胞培养物中制备染色体悬液。即用型悬液保存在甲醇:乙酸3:1固定液中，温度为 。按照Courtet等人(2001年)的方法将染色体悬液滴到显微镜载玻片上，然后进行荧光原位杂交(FISH)操作。每个样本用带有荧光4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的Pro-Long® Diamond抗褪色封片剂(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技旗下的Invitrogen公司产品)进行染色，以标记中期的每条染色体。为了分析核型，使用ImageJ V 1.53k(Schneider等人，2012年)以像素为单位测量每个染色单体的短臂(p)和长臂(q)。p臂和q臂的长度按照Knytl和Fornaini(2021年)所述进行量化。为了识别每条染色体，我们计算了染色体长度(/)、着丝粒指数(i)以及p/q和q/p臂比 (Levan等人，1964年；Tymowska，1991年)；公式见Knytl等人(2023年)。将每个测量得到的染色体与其在 中的对应染色体进行比较。Tymowska(1991年)指定的黑猩猩核型。然而，Tymowska(1991年)没有测量染色体臂，因此，我们以非洲爪蟾的测量值为模板(Matsuda等人，2015年；Tymowska和Kobel，1972年)来识别黑猩猩的染色体。染色体命名取自Matsuda等人(2015年)。还根据 值为每条染色体指定了一个染色体类别。如果 值等于或大于37.5，则该染色体归类为中着丝粒染色体。如果 值等于或高于25且低于37.5，则该染色体归类为亚中着丝粒染色体，如果 值等于或大于12.5且低于25，则该染色体归类为近端着丝粒染色体。使用R软件V 4.3.1(R核心团队，2020年)中的ggplot2和ggpubr包对数据进行统计分析。为了检验两条同源染色体之间的/和/值是否存在显著差异，使用从Knytl和Fornaini(2021年)修改而来的R脚本进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey检验。所有关于测量值如何计算以及如何处理成表格和图表(包括中期图像)的步骤，可在https:// github.com/martinknytl/2024_pygmaeus_karyotype上获取。对11张中期图像进行核型分析；每个FISH实验分析10至20张中期图像。
表1. 物种名称、FISH分析中使用的标记、用于DNA和RNA提取的器官、PCR引物序列、扩增子长度、为FISH选择的质粒克隆的工作名称、GenBank登录号以及设计引物的研究参考文献。
| 物种 | 基因符号 | 基因名称 | 组织 | 引物序列 | 大小(碱基对) | 克隆 | 登录号 | 参考文献 |
| 热带爪蟾 | 28S | 28S核糖体RNA | 肝脏 | 28SA:5’-AAACTCTGGTGGAGGTCCGT-3’ | 250 | - | - | 内藤等人(1992年) |
| 28SB:5’-CTTACCA AAAGTGGCCCACTA-3’ | ||||||||
| 5S | 5S核糖体RNA | XTR 5S F:5’-AATGGGAGCGCACCTACCT-3’ | 251 | - | - | 克尼特和福尔纳尼(2021年) | ||
| XTR 5S R:5’-CATCCACAATGCACTGGTCT-3’ | ||||||||
| 非洲侏儒爪蟾 | fn1 | 纤连蛋白 | Xen_fn1_F1:5’-AATGGGAGCGCACCTACCT-3’ | 1161 | B | PQ438168 | 本研究 | |
| Xen_fn1_R1:5’-CATCCACAATGCACTGGTCT-3’ | ||||||||
| sf3b1 | 剪接因子3b亚基1 | 肺 | Xen fs3b1_F:5’-TTGCGAAAACACACGAAGATATTG-3’ | 1458 | A | PQ438169 | ||
| Xen_fs3b1_R1:5’-GTGTAGATTCATCAACATCAACCA-3’ | ||||||||
| ndufs1 | NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基S1 | 肝脏 | Xen_ndufs1_F:5’-AGAAACCCATTGTGGTGGTTG-3’ | 982 | A | PQ438170 | ||
| Xen ndufs1 R2:5’- GGTAATAAACCATTTTAATAAGTTTACAAG-3’ | ||||||||
| cept1 | 胆碱/乙醇胺磷酸转移酶1 | 肺 | Xen_cept1_F:5’-GTGGAAATCCCTACCAAACAG-3’ | 1190 | E | PQ438171 | ||
| Xen_cept1_R2:5’-CACTTAGTGATGATTAAAACGTGC- 3 | ||||||||
| gyg2 | 糖原合酶2 | Xen_GYG2_F:5’-TACTGTCAAGGAGCCCTGG-3’ | 1298 | C | PQ438172 | |||
| Xen GYG2 R2:5’- GCAAAACTAAATAGCTCTAATTTATTTG-3’ | ||||||||
| bmp7 | 骨形态发生蛋白7 | 脾脏 | Bmp7 F:5’-GAGAAGGGCAGGTGCTGTAG-3’ | 1211 | B | PQ438173 | ||
| Bmp7_R:5’-TGGCTTTGGAACAGTGTCTG-3’ | ||||||||
| nomo3 | NODAL调节因子3 | NOMO3 F:5’-GAGTTTCGCTTTGAGCCATC-3’ | 1165 | C | PQ438174 | |||
| NOMO3 R:5’-AAGGTCCAGGGTCCTCAAGT-3’ | ||||||||
| sox9 | SRY盒转录因子9 | 肝脏 | SOX9 F:5′-GAGAACACCAGACCCCAAGA-3′ | 985 | B | PO438175 | ||
| SOX9 R:5′-CTGTTGCTGCTGGTCACTGT-3′ |
克隆列中的破折号表示扩增子未被克隆。
登录号列中的破折号表示序列未上传至GenBank数据库。
28S和5S核糖体基因的定位
.热带爪蟾(象牙海岸)的实验室菌株，在捷克共和国查尔斯大学长期培育，用作扩增285和5S rDNA探针的来源。按照制造商说明，使用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，德国希尔德)从成年爪蟾肝脏中提取总基因组DNA。28S和5S的引物序列(Integrated DNA Technologies，美国爱荷华州珊瑚维尔)列于表1。分别使用了Gvoždík等人(2024年)和Knytl与Fornaini(2021年)中相同的热带爪蟾5S(与登录号OR360596 100%相同)和28S(与登录号XR_004223792 - XR_00422379,8 100%相同)序列并进行标记。28S和5S探针的制备，包括PCR条件、分别用洋地黄毒苷-11-dUTP和生物素-16-dUTP(均为耶拿生物科学公司产品)标记以及纯化，在Knytl & Fornaini(2021年)中有详细描述。28S和5S探针与 .侏儒爪蟾的染色体涂片杂交。杂交混合物的组成和杂交过程按照Knytl等人(2023年)所述进行。杂交后洗涤和封闭反应按照Krylov等人(2010年)中荧光原位杂交涂染的描述进行。探针信号按照Knytl等人(2017年)所述进行可视化处理。
单拷贝基因的定位
使用E.Z.N.A. Total RNA Kit I(Omega Bio-tek；美国佐治亚州诺克罗斯)从成年 .侏儒爪蟾后代的多个器官中提取RNA(表1)。使用RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(赛默飞世尔科技旗下的Gibco)将RNA逆转录为cDNA。扩增了八个常染色体基因:胆碱/乙醇胺磷酸转移酶1(cept1)、糖原素2(gyg2)、纤连蛋白1(fn1)、NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基S1(ndufs1)、剪接因子3b亚基1(sf3b1)、NODAL调节因子3(nomo3)、骨形态发生蛋白7(bmp7)和SRY盒转录因子9(sox9)。根据 .光滑爪蟾和 .热带爪蟾的可用直系同源序列设计引物。所有引物及其相应基因名称总结于表1。基因选择的理由在结果部分“单拷贝基因的定位”中给出。扩增的基因使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡马里奥)进行克隆。使用E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I(Omega Bio-tek)从每个基因的4 - 5个细菌菌落中分离质粒DNA，通过电泳检查，并送去测序。使用Geneious Prime 2023.0.4版本将序列与光滑爪蟾的序列进行比较。cDNA序列已存入GenBank数据库(表1)。
酪胺信号放大荧光原位杂交(FISH - TSA)方案采用自Krylov等人(2007年)，并如Knytl等人(2018年)所述进行了微小修改。FISH探针用洋地黄毒苷-11-dUTP(罗氏，德国曼海姆)标记，信号通过抗洋地黄毒苷-POD、Fab片段(罗氏)检测，并使用TSA TM-Plus四甲基罗丹明系统试剂盒(NEL742001KT，珀金埃尔默公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行放大。
荧光原位杂交图像的显微镜检查与处理
使用配备荧光装置的徕卡DM6正立显微镜、徕卡DFC7000 T相机和徕卡应用套件X软件版本3.7.3.23245(德国韦茨拉尔徕卡微系统公司)拍摄荧光FISH图像。用核糖体探针进行双色FISH的图像在三个不同通道采集:蓝色(DAPI)、红色(带生物素和链霉亲和素 - Cy3的28S探针)和绿色(带地高辛配基和抗地高辛配基 - 荧光素的5S探针)。单色FISH - TSA的图像在两个通道采集:蓝色(DAPI)和红色(带地高辛配基和抗地高辛配基 - 过氧化物酶 - 罗丹明的单拷贝基因探针)。使用Adobe Photoshop版本CS7(美国加利福尼亚州圣何塞)合并红 - 绿 - 蓝(RGB)和红 - 蓝通道。
结果
核型分析
所有四个个体始终有36条染色体 ，其中 表示现存物种的单倍体染色体数， 表示现存物种最近的二倍体祖先的单倍体染色体数。这一发现证实了所有分析个体的生物学二倍体和进化古四倍体，这与Tymowska(1991年)的研究结果一致。
从11个中期分裂相中测量每条染色体的臂，并计算 和 的中位数。将 的值量化为所有染色体 总和的百分比，以考虑我们图像分辨率和像素大小的变化。 . pygmaeus的核型由10对中着丝粒(m)、1对亚中着丝粒(sm)和7对近端着丝粒(st)染色体组成(表2)。 . pygmaeus核型中既不存在近端着丝粒染色体(i区间0 - 12.5)也不存在端着丝粒染色体(无p臂； )。
随后，我们根据 (x轴)和 (%，y轴)在图表上绘制每条染色体，以确定同源染色体对是否具有相似的染色体形态以及它们是否紧密聚集在一起(图1A)。还绘制了对应于每条染色体1L - 9_10S的 和 值(图1B、C)。使用统计离散度指标四分位距 来评估每对同源染色体的形态差异程度。同源染色体之间最大的差异出现在8L和8S染色体之间。8L和8S染色体的 分别在2.41%至2.58%和1.64%至1.82%之间。 中第二大差异出现在同源对 (2.35 - 2.53%)和7S(1.87 - 1.99%)内(图1B，表S1)。同源染色体之间 的最大差异出现在8L和8S染色体之间，在 内分别相差20.2 - 22.5和41.5 - 48.2。8L和8S每条同源染色体都被归类为不同的形态类别(st和m；表2)。基于 区间的第二大差异出现在6L(46.1 - 49.5)和6S(40.4 - 44.1)之间(图1C，表S2)。单因素方差分析和Tukey检验显示所有同源对之间以及1L和1S、2L和2S、6L和6S以及8L和8S染色体之间在 上存在统计学显著差异(图1B、C)。该分析证实了使用术语L表示每对同源染色体中较长的染色体和S表示较短的染色体的适当性。
表2. 非洲侏儒蛙每条单倍体染色体的染色体特征，以染色体长度中位数 、p/q臂比 和着丝粒指数 表示。
| 染色体 | 1 (%) | i | 类别 | |
| 1L | 4.25 | 0.70 | 41.35 | m |
| 1S | 3.69 | 0.68 | 40.49 | m |
| 2L | 3.45 | 0.61 | 37.82 | m |
| 2S | 3.09 | 0.56 | 35.85 | sm |
| 3L | 2.94 | 0.25 | 20.00 | st |
| 3S | 2.74 | 0.28 | 21.97 | st |
| 4L | 2.8 | 0.30 | 1月23日 | st |
| 4S | 2.44 | 0.26 | 20.29 | st |
| 5L | 3.03 | 0.64 | 39.22 | m |
| 5S | 2.77 | 0.62 | 38.08 | m |
| 6L | 3.03 | 0.93 | 48.19 | m |
| 6S | 2.67 | 0.72 | 42.13 | m |
| 7L | 2.42 | 0.72 | 41.91 | m |
| 7S | 1.93 | 0.75 | 42.77 | m |
| 8L | 2.46 | 0.28 | 21.73 | st |
| 8S | 1.71 | 0.80 | 44.49 | m |
| 9_10L | 2.38 | 0.26 | 20.80 | st |
| 9_10S | 2.21 | 0.32 | 24.24 | st |
染色体类别对应于 中着丝粒染色体、 亚中着丝粒染色体和 近端着丝粒染色体。
图1 小熊猫染色体短臂和长臂长度的测量与统计分析。L亚基因组用蓝色表示，S亚基因组用红色表示。A着丝粒指数(i，x轴)与染色体长度(l，y轴)之间的关系。黑色虚线垂直线划定了0 - 12.5、12.5 - 25、25 - 37.5和37.5 - 50的区间，分别对应于近端着丝粒染色体、亚端着丝粒染色体、亚中着丝粒染色体和中着丝粒染色体。绘制的i和I值是每条染色体的中位数。图(B)显示了18条小熊猫染色体单倍体互补的/值(y轴)的染色体内变异(x轴)。C 18条小熊猫染色体单倍体互补的 值(y轴)的染色体内变异性(x轴)。B、C黑色虚线垂直线定义了同源染色体对。上下须分别显示最小值和最大值；框包含下 和上(Qs)四分位数；框内的水平线表示中位数(Q2)；异常值用蓝色(L)和红色(S)表示。须之上和之下的点。(B、C)顶部 和 值的显著性代码定义了基于方差分析和Tukey检验同源染色体对是否显著不同。显著不同的同源物用显著性代码***、**和*表示，分别显示 值为 和 。
28S和5S核糖体基因的定位
为了确定基因组中核糖体基因的位置和数量，我们使用了28S和5S rDNA探针进行荧光原位杂交(图2)。使用28S rDNA探针，我们定位了核仁组织区(NORs)。我们预计在异源四倍体 小熊猫中检测到一对同源NORs，假设如Session等人(2016年)、Knytl等人(2017年)、Knytl等人(2023年)在其他四倍体中所提出的那样，一对NORs将从祖先遗传而来，另一对NORs将丢失。事实上，如图2B、D、E所示，我们仅在6S染色体长臂的端粒上鉴定出一对NORs。
我们将5S rDNA基因座定位在几乎所有染色体的端粒区域，但有一条染色体(8S，核型中最短的染色体)除外，如图2C、D、E所示。2L染色体的两条臂上都带有5S rDNA信号。6S染色体同时带有28S和5S rDNAs - 这两个区域在空间上紧密相邻(见图2B、C)。4L和5L染色体信号强度较低，表明每个5S rDNA基因座的拷贝数较少。
单拷贝基因的定位
对每个扩增的小爪蟾cDNA(cept1、gyg2、fn1、ndufs1、sf3b1、nomo3、bmp7和sox9)的4至5个质粒克隆进行测序，以区分同源拷贝。将所有cDNA克隆的序列进行比对(每个基因单独比对)，以比较它们之间的相似性。除sox9外，克隆之间的同一性为99 - 100%(克隆A和B之间的同一性为93.35%)。这一发现证实，除sox9基因外，我们为每个基因仅扩增了一个同源序列，其中克隆A和B是不同的同源拷贝。然后使用BLASTn将每个序列与 . laevis基因组数据库(版本10.1)进行比较，以确定哪个是L拷贝，哪个是S拷贝。在非洲爪蟾基因组数据库中，cept1和gyg2的两个同源拷贝中只有一个被注释。cept1基因在S亚基因组中被注释，gyg2基因在L亚基因组中被注释。我们从小爪蟾获得的cept1和gyg2 cDNA序列与来自 . Iaevis数据库的cept1.S和gyg2.L mRNA的同一性分别为98.7%和90.64%。因为我们扩增的gyg2 cDNA序列与来自 . laevis数据库的gyg2.L的相似性低于这两个物种同一亚基因组内cDNA序列之间的相似性，所以我们有可能扩增出了gyg2.S和cept1.S拷贝。然而，在下文，用作FISH探针的cept1和gyg2未指定为L或S拷贝。根据fn1、ndufs1、sf3b1、nomo3、bmp7和sox9序列与数据库中相同基因的mRNA序列之间的相似性比较，我们的每个序列被指定为L或S拷贝:fn1、ndufs1、nomo3和bmp7被指定为L拷贝，而sf3b1被指定为S拷贝。我们扩增的 . pygmaeus序列与更相似的同源 . laevis序列之间的相似性为 。对于sox9基因，两个拷贝均被扩增，克隆A被鉴定为S拷贝，克隆B被鉴定为L拷贝。选择L拷贝用于FISH - TSA(表1)。尽管我们为大多数基因仅鉴定出一个拷贝(我们设计的引物仅与两个同源拷贝中的一个退火)，但这可能是由于同源 . pygmaeus序列之间的高度差异，以及 . pygmaeus和 . laevis之间的显著差异。
图2 使用FISH对小爪蟾(样本XPYTaF1 - 1)中期染色体铺展上的核糖体基因进行定位。A 经DAPI(黑白，B&W)复染的中期染色体铺展显示所有36条染色体。B 用洋地黄毒苷标记的28S rDNA探针进行FISH(B&W)，在6S染色体长臂上显示一个信号，表明核仁二级缢痕。C 用生物素标记的5S rDNA探针进行FISH(B&W)，突出显示了小爪蟾中除8S染色体外的几乎所有染色体。D 合并的中期(RGB)图像，带有DAPI(蓝紫色)染色、28S(红色)和5S(绿色)信号。比例尺代表 。E 根据 和 值排列的核型(RGB)。白线表示着丝粒的位置。
我们之前在 . mellotropicalis中鉴定出9b和2b染色体之间存在一个巨大的异染色质块易位(Knytl等人，2017年)。该易位涉及sf3b1基因从9b染色体重新定位到2b染色体(或在二倍体祖先中从9号染色体到2号染色体)(Knytl等人，2018年)。然而，关于染色体类别从2a重新指定为2b的情况，请参阅Knytl等人(2023年)的研究。为了检验 . pygmaeus中也存在相同易位的假设，我们绘制了五个单拷贝基因——cept1、gyg2、fn1、ndufs1和sf3b1——这些基因位于 . mellotropicalis中易位区域的侧翼(易位相关基因)，这是通过动物荧光原位杂交(Zoo-FISH)和荧光原位杂交-酪酰胺信号放大(FISH-TSA)揭示的(Knytl等人，2017年，2018年)。cept1和gyg2基因位于 . tropicalis中2号染色体的短(p)臂上。在 . laevis中，cept1和gyg2分别位于2号染色体的长(q)臂和p臂上。同时，其他三个基因(fn1、ndufs1和sf3b1)位于 . tropicalis中9号染色体的q臂上以及 . Iaevis中9_10号染色体的q臂上(Knytl等人，2018年；Session等人，2016年；Uno等人，2013年)。
我们还测试了9号和10号染色体之间的融合是否也存在于 . pygmaeus中，正如在 . laevis中所揭示的那样(Session等人，2016年)。为了实现这一点，我们选择了三个与融合相关的基因:bmp7，它位于 . tropicalis 10号染色体的p臂上；nomo3位于9号染色体的p臂上；sox9位于10号染色体的q臂上(Session等人，2016年；Uno等人，2013年)。还使用了三个与易位相关的基因fn1、ndufs1、sf3b1来检测9号和10号染色体之间的融合。此外，我们假设定位基因的顺序将揭示祖先染色体的方向和融合点。
非洲爪蟾中与易位相关的基因:fn1、ndufs1和sf3b1基因定位于9_10号染色体的q臂(图3、S3 - S4)，cept1和gyg2基因定位于2号染色体(图3、S1 - S2)。因此，9号和2号染色体之间的易位并未在 非洲爪蟾或其四倍体祖先中发生。有趣的是，cept1和gyg2均定位于2L号染色体的p臂和2S号染色体的q臂。由于cept1和gyg2定位于2L和2S号染色体的非同源区域(p臂和q臂)，S亚基因组中发生了涉及gyg2和cept1基因的着丝粒周围倒位。此外，对gyg2和cept1基因的定位分析可能会改善非洲爪蟾基因组组装中这两个基因的注释，在该组装中每个基因的一个同源拷贝尚未注释(cept1.L和gyg2.S)。更多细节见讨论部分，基因组重排导致的进化。
在侏儒非洲爪蟾中与融合相关的基因:fn1、ndufs1、sf3b1和nomo3基因定位于9_10号染色体的q臂上(图3、S3 - S4)，而bmp7和sox9基因定位于9_10号染色体的p臂上(图3、S5)。与 .热带爪蟾中相同基因的顺序相比，侏儒非洲爪蟾9_10号染色体上与融合相关基因的顺序表明，祖先的9号和10号染色体通过它们的 臂融合，并且9号染色体的着丝粒丢失，10号染色体的着丝粒保留(图3)。
图3 通过FISH-TSA对单拷贝基因进行定位，在小家鼠染色体(XPY)上有阳性红色信号，样本为XPYTaF1-1。cept1和gyg2探针均定位于小家鼠2L和2S染色体。fn1.L、ndufs1.L、sf3b1.S和nomo3.L基因座分别位于 .小家鼠9_10L、9_10L、9_10S和9_10L染色体的q臂上。bmp7.L和sox9.L定位于 .小家鼠9_10L染色体的p臂上。白线表示着丝粒的位置。
讨论
尽管最近已经产生了新的两栖动物基因组组装(例如，Bredeson等人，2024年；Dittrich等人，2024年；Holtz等人，2023年；Kuhl等人，2024年)，但两栖动物基因组的大尺寸和高质量基因组测序的高成本使得需要快速的细胞遗传学替代方法来识别染色体结构的重排。利用四种非洲爪蟾的可用测序基因组，热带爪蟾(X. tropicalis，Bredeson等人，2024年；Mitros等人，2019年)、非洲爪蟾(X. Iaevis，Session等人，2016年)、北方爪蟾(X. borealis，Evans等人，2022年)和姬蛙属(Hymenochirus sp.，Bredeson等人，2024年，将其视为博氏姬蛙(H. boettgeri)，但见Gvoždik等人，2024年)，可以设计用于PCR的引物和用于FISH的探针，并检验关于尚未进行基因组测序的物种中是否发生任何重排的假设。凭借已知的非洲爪蟾属的进化史(Evans等人，2015年)，可以估计染色体进化的动态、祖先染色体结构以及重排的时间(Knytl等人，2017年、2018年、2023年)。在本研究中，我们利用 热带爪蟾(Silurana亚属)和非洲爪蟾(Xenopus亚属)的基因组为Xenopus亚属的一个物种，侏儒爪蟾(X. pygmaeus)设计FISH探针，以探索直系同源同线性，并增加关于非洲爪蟾染色体重排进化动态的知识拼图。
基因组重排导致的进化
第一步是根据测量 . pygmaeus染色体的 和 臂，并计算 和 值，以确定哪条染色体带有FISH信号，从而识别每条 . pygmaeus染色体。尽管J. Tymowska早在1991年就发表了该物种的核型，但对 . pygmaeus核型的这种详细分析还是首次进行。
为了探究重排的时间，我们纳入了 . tropicalis、 . mellotropicalis(均为Silurana亚属)、X. pygmaeus和X. Iaevis(均为Xenopus亚属)的同线图(本研究；Knytl等人，2018年；Session等人，2016年；Uno等人，2013年)。用于作图的基因是从已描述的染色体间重排附近选择的:在Silurana亚属(X. mellotropicalis；Knytl等人，2017年)中发现的易位(与易位相关的基因)和据推测在Xenopus亚属中广泛存在的融合(与融合相关的基因)(Session等人，2016年)。此外，在 . laevis的S亚基因组的2S、3S、4S、5S和8S染色体上鉴定出了染色体内重排——倒位(Session等人，2016年)。
我们对与易位相关基因的作图分析支持了这样一种假设，即9号和2号染色体之间的易位仅发生在Silurana亚属中(图4A - B)。然而，这种易位在Silurana亚属内的不同物种中分布有多广泛还有待研究。关键物种是 . epitropicalis，它是 . mellotropicalis的姐妹物种，因此它可能发生在哪个进化时期(Knytl等人，2023年)。
重要的是，我们对cept1和gyg2探针的定位揭示了在 . pygmaeus的2S染色体上发生的倒位(图4B)。在非洲爪蟾(X. laevis)的2S染色体上也发现了这种大的倒位，但在非洲爪蟾的2L染色体或热带爪蟾(X. tropicalis)的2号染色体上未发现(Session等人，2016年)。然而，尚不清楚cept1和gyg2基因是否参与了这种倒位。现有基因组数据显示，在 . laevis中，cept1仅位于2S染色体上，gyg2位于2L染色体上。在 . laevis中仅存在cept1的S拷贝，这与S亚基因组经历基因缺失和丢失的假设不一致(Session等人，2016年)，因为cept1应该在L亚基因组中丢失。因此，缺少的cept1.L注释可能是由于 . laevis基因组组装中的缺口或测序假象。为了探究cept1基因是否参与了 . laevis 2S染色体上的倒位，我们将2S染色体上着丝粒位置的坐标(54,347,978 - 55,190,352)(Smith等人，2021年)与同一染色体(基因组数据库)上cept1基因的坐标(55,993,167 - 56,072,139)进行了比较。因此，如图4B所示，cept1基因位于 . laevis 2S染色体的q臂上，证明cept1确实参与了倒位。因为我们的荧光原位杂交(FISH)分析揭示了 . pygmaeus 2S染色体上的倒位与 . Iaevis中的倒位区域同源，这表明该倒位发生在 . pygmaeus和 . laevis的共同四倍体祖先中，大约在1000万年前(Evans等人，2015年、2024年；Fornaini等人，2023年，进化关系见图4D)，甚至更早发生在 . pygmaeus、 . laevis和 . borealis的共同四倍体祖先中，或者发生在S亚基因组的二倍体祖先中(Knytl等人，2024年)。然而，这种倒位是否也存在于非洲爪蟾属的其他物种中仍有待研究。确定其在其他物种中的存在将有助于更准确地确定倒位发生的时间。通过FISH在 . pygmaeus中检测到的同源cept1和gyg2拷贝数与通过检查基因组数据库在 . laevis中检测到的不一致，可能是由于这些脆弱区域的高度差异，使得非洲爪蟾有足够的时间丢失一个拷贝。这种不一致的另一种解释是，cept1和gyg2基因的两个同源拷贝都存在于{{F}}0 . pygmaeus和 . laevis的基因组中。
在同源染色体之间观察到的 和 值的最大差异出现在非洲侏儒爪蟾(X. pygmaeus)的8S和8L染色体之间。这一发现突出了8S和8L染色体是核型中形态上最不同的同源染色体。在非洲爪蟾中， 的最大差异也出现在8L和8S染色体之间(Matsuda等人，2015年)。因为两者
图4 四个非洲爪蟾物种中选定单拷贝基因的位置，以及这些物种相对于核仁组织区(NOR)位置的系统发育关系。热带爪蟾(X. tropicalis)和非洲爪蟾(X. laevis)的基因位置取自基因组数据库(Bredeson等人，2024；Session等人，2016)。梅洛热带爪蟾(X. mellotropicalis)和侏儒爪蟾(X. pygmaeus)的基因定位分别取自Knytl等人(2018)的研究和本研究。与易位相关的基因(cept1、gyg2、fn1、ndufs1和sf35b1)显示在细爪蟾亚属(Silurana)(A)和非洲爪蟾亚属(Xenopus)(B)中。A 在热带爪蟾(细爪蟾亚属)中，基因被认为处于祖先位置。在梅洛热带爪蟾中，sf351基因从9b号染色体易位到2b号染色体的着丝粒周围区域(由虚线箭头指示，并用红色字体描述)。B 在非洲爪蟾中，与易位相关的基因cept1和gyg2分别标注在一条同源染色体上，具体分别位于2S和2L号染色体上。其余与易位相关的基因fn1、ndufs1和fn1标注在9_10L和9_10S这两条同源染色体上。相比之下，我们在 侏儒爪蟾的两条同源染色体上都标注了所有与易位相关的基因。此外，cept1和gyg2基因在2S号染色体上的位置发生了颠倒(由虚线箭头指示，并用红色字体描述)。C 与融合相关的基因(fn1、ndufs1、sf351、nomo3、bmp7和sox9)显示在热带爪蟾的9号和10号染色体，以及非洲爪蟾和侏儒爪蟾的9_10L和9_10S号染色体上。这三个物种中与融合相关基因的顺序表明，9号和10号染色体之间的融合在非洲爪蟾和侏儒爪蟾中是共有的。D 显示NOR定位变异的系统发育示意图。为了清晰理解A、B和C中所示的重排进化情况，展示了细爪蟾亚属的两个物种(热带爪蟾、梅洛热带爪蟾)和非洲爪蟾亚属的两个物种(侏儒爪蟾、非洲爪蟾)。括号中与每个物种相关的染色体是携带NOR的染色体(本研究；Gvoždik等人，2024；Knytl等人，2017；Tymowska，1991)。以膜爪蟾属(Hymenochirus sp.)作为外群。A - C 使用BioRender.com创建，(D):使用Geneious Prime创建并在Adobe Photoshop中修改。
倭蛙属的 和光滑爪蟾属的 的8号小染色体包含着丝粒周围倒位(本研究；Knytl等人，2024年；Session等人，2016年；Uno等人，2013年)，这表明倭蛙属的 和光滑爪蟾属的 共享相同的倒位，这可能导致了8号大染色体和8号小染色体之间最大的形态差异。非洲爪蟾属的倒位似乎是亚基因组趋异进化和重新二倍体化过程的重要驱动因素。
侏儒爪蟾中与融合相关基因的位置与非洲爪蟾中这些基因的位置相对应(Session等人，2016年；Uno等人，2013年)。这两个物种中这些基因的相同定位证实，祖先的9号和10号染色体融合成9_10染色体很可能发生在非洲爪蟾亚属的一个共同二倍体祖先中，至少在30 - 35百万年前两个亚基因组分化之前。荧光原位杂交(FISH)图谱还揭示了侏儒爪蟾中融合点和着丝粒的命运(图4C)，这与在非洲爪蟾(Session等人，2016年)和北方爪蟾(Evans等人，2022年)中发现的相同融合相对应，并且可能与非洲爪蟾亚属所有其他物种中的融合相对应，因为所有这些物种的染色体数都是18的倍数(Tymowska，1991年)。
核糖体基因的进化和核仁组织区的位置
在非洲侏儒爪蟾(X. pygmaeus)的一对同源染色体上存在28S rDNA，这证实了先前提出的假设，即在非洲爪蟾属的四倍体物种/祖先中，有一对同源的核仁组织区(NORs)已经丢失，因为一般认为，在Silurana和非洲爪蟾两个亚属中，所有多倍体物种的二倍体祖先都携带一对NORs。在本文中，一个NOR等于一对同源的NORs，即每个单倍体补体中有一个NOR。然而，NOR位置的变异与Silurana a-和非洲爪蟾L-亚基因组更稳定，而Silurana b-和非洲爪蟾S-亚基因组更容易发生重排的假设不一致(Knytl等人，2023年；Session等人，2016年)。非洲爪蟾(Xenopus laevis)、吉利爪蟾(X. gilli)和彼得斯爪蟾(X. petersii)(当时称为“X. species nova IX”；这三个都来自非洲爪蟾物种组)在3L染色体的p臂上有NOR(Roco等人，2021年；Session等人，2016年；Tymowska，1991年；Tymowska和Kobel，1972年)。非洲侏儒爪蟾和 . parafraseri(当时称为“ . fraseri”，根据地理来源“喀麦隆富拉西”重新鉴定；这两个物种都来自 . amieti物种组)在6S染色体上有NOR(本研究；Tymowska，1991年)。在 . clivii( . muelleri物种组的姐妹谱系)和 . borealis(非洲爪蟾muelleri物种组)中，在4L染色体上检测到NOR(Schmid和Steinlein，2015年； . borealis基因组数据库)，在非洲爪蟾muelleri(非洲爪蟾muelleri物种组)中，在5L染色体上检测到NOR(Schmid和Steinlein，2015年；Tymowska，1991年)。此外，Silurana亚属中NOR的位置与非洲爪蟾亚属中NOR的位置不同(热带爪蟾(X. tropicalis)在7号染色体上有NOR；卡氏爪蟾(X. calcaratus)、表热带爪蟾(X. epitropicalis)和中热带爪蟾(X. mellotropicalis)在7a号染色体上有NOR；Knytl等人，2017年，2023年；Tymowska，1991年)，并且NOR在每个亚属中独立进化(Roco等人，2021年)。NOR结构显示出高度动态的特征，并且倾向于在两个亚基因组之间从一条染色体转移到另一条染色体。由于在L-亚基因组中除了一个NOR位置外都已确定，因此6S染色体可能存在错误鉴定。我们使用了 和 值的测量，这些值在非洲侏儒爪蟾的5L、5S、6S和7L染色体上相似(图1B、C)。需要一个与NOR在同一染色体上共定位的额外映射标记来准确识别携带NOR的染色体。此外，Tymowska(1991年)在非洲侏儒爪蟾6S染色体上鉴定出NOR，因此我们倾向于得出结论，NOR(不是那些已经丢失的祖先NOR)通过跳跃在染色体和亚基因组之间改变了位置，而没有事先的缺失或重复。跳跃机制支持了非洲爪蟾S-亚基因组中发生丢失的假设。我们提出，祖先NOR在S-亚基因组中丢失，随后，NOR从L-亚基因组跳跃到S-亚基因组，如在当代非洲侏儒爪蟾中观察到的那样。一般认为，跳跃机制是由复制粘贴或剪切粘贴转座引起的转座元件的水平转移。这些元件会导致染色体断裂并增加重排的概率(Castro等人，2001年；Chan等人，2008年；McClintock，1950年；Rebollo等人，2010年)。也有人提出了一种类似的机制，该机制触发了膜蟾属(Hymenochirus)中小核DNA重复序列的重排(Gvoždík等人，2024年)。跳跃机制也与性别决定基因的水平易位有关(例如，Tennessen等人，2018年)。
综合NOR位置和起源的差异，我们无法明确确定非洲爪蟾亚属中NOR的祖先位置，尽管在姬蛙亚属中，NOR的祖先位置在7号染色体上(图4D，Knytl等人，2017年、2023年；Tymowska，1991年)。鉴于 . clivii和 . borealis中NOR的位置相同，我们可以推测非洲爪蟾亚属中NOR的祖先位置在4L染色体上。后两个物种属于 . muelleri物种组，而 . clivii是该亚属中最基部的谱系之一。NOR的序列内容也值得研究，以确定非洲爪蟾属中跳跃的NOR周围是否存在以及存在何种类型的转座元件。
另一个重要特征是每个位点的重复序列拷贝数。重复序列的拷贝数可能在一个亚基因组中减少，但在另一个亚基因组中增加，正如Fornaini等人(2023年)对 . laevis所提出的那样。在我们的重点研究物种非洲侏儒爪蟾中，我们无法计算每个位点的28S拷贝数，因为其基因组尚未测序。我们认为，每个NOR位点的低拷贝数通过FISH定位可能无法检测到。 . pygmaeus基因组中存在比我们的FISH方法检测到的更多NOR位点的可能性较小，因为在 . Iaevis的基因组中也仅鉴定出一个NOR(Session等人，2016年)，并且其他细胞遗传学研究在整个非洲爪蟾属中也仅鉴定出一个NOR(Tymowska，1991年综述)。大多数青蛙的整个基因组中仅存在一个NOR的模式，无论其倍性水平如何(Gvoždík等人，2024年；Schmid等人，2015年；da Silva等人，2024年；Stöck等人，2005年；Tymowska，1991年)，表明这些结构在异源多倍体中完全功能性二倍体化。青蛙中的例外包括四倍体美洲齿蟾(齿蟾科)和八倍体饰纹角花蟾(角花蟾科)，它们显示出两个NOR。两个NOR的发现表明亲本NOR的共显性表达，并且它们的基因组最近通过同源多倍体化从单个祖先物种产生(Schmid等人，2015年综述)。本研究结果与 . pygmaeus的异源四倍体起源以及一个祖先NOR的丢失一致。
5S rRNA(连同5.8S和28S rRNAs)形成一个大核糖体亚基，其数量在两栖动物中有所不同，但位置通常在端粒处(Knytl等人，2017年；Pardue，1974年；Pardue等人，1973年)。使用FISH方法，我们发现除一条染色体外，所有非洲侏儒爪蟾染色体都携带5S位点。在非洲爪蟾属中，仅有少数研究对5S rDNA位点进行了定位。非洲爪蟾在几乎所有染色体上都有5S rDNA信号(Pardue等人，1973年)，与在6L染色体上有5S rDNA位点的 . muelleri相反(Schmid和Steinlein，2015年)。姬蛙亚属的物种无论二倍体和四倍体倍性水平如何都有多个5S rDNA位点(Knytl等人，2017年、2023年)。 . pygmaeus中5S rDNA信号的数量与四倍体 . laevis和二倍体 . tropicalis最相似。鉴于在两个非洲爪蟾亚属中检测到的5S rDNA位点丰度很高，我们推测几乎所有染色体上5S rDNA位点的存在至少在45 - 50百万年前就已与其共同祖先共享(Feng等人，2017年；Session等人，2016年)，并且这些位点的数量通过多倍体化事件发生了复制。然而，在一些物种中，如 . muelleri，发生了5S rDNA的大量缺失(Schmid和Steinlein，2015年)。
性染色体
非洲爪蟾属的所有物种都具有同型性染色体(Tymowska，1991年)，这使得性染色体的细胞遗传学研究具有挑战性。由于我们是从幼体蝌蚪中制备染色体，因此无法识别个体的性别。我们分析了四个个体，未发现染色体结构和形态上的差异，这表明性染色体不存在异型性，从而证实了它们的同型性。非洲侏儒爪蟾具有8L染色体作为性染色体，其上含有一个性连锁基因座，根据非洲爪蟾参考基因组的坐标，该基因座位于117 - 135 Mb处，代表一个端粒区域(Evans等人，2024年)。除了5S基因座外，我们在非洲侏儒爪蟾染色体上定位的基因均不在8L染色体上。虽然8L染色体上的5S基因座定位于端粒，但鉴于非洲侏儒爪蟾基因组中存在多个5S rDNA信号，没有迹象表明这个5S基因座与性别相关。
结论
非洲爪蟾属是进化和遗传学研究的一个特殊模型，因为它具有广泛多样的基因组特征，例如动物中最高的倍性水平变异之一(Tymowska，1991年)以及性别决定机制的高度变异性(Evans等人，2024年；Furman等人，2020年；Song等人，2021年)。这种变异性通常可以通过各种无性繁殖方式产生，例如孤雌生殖(Dedukh等人，2022年)、雌核发育(Knytl等人，2022年)或杂种发育(Dedukh等人，2020年)。然而，非洲爪蟾属中尚未描述这些无性繁殖方式中的任何一种。因此，一定存在另一种机制来解释这些青蛙中异常的基因组变异。驱动倍性水平变异的最可能机制是不同祖先之间的杂交，这一假设已被反复提出并得到证实(例如，Evans等人，2005年、2015年；Knytl等人，2023年；Session等人，2016年)。然而，自然杂交种的出现很少见，仅在密切相关的物种中有所记录(Kobel等人，1981年)。在本研究中，我们发现并强调非洲爪蟾属中的核仁组织区(NORs)是动态跳跃结构，有趣的是，它们的数量并不反映倍性水平，因为所有研究的物种都只有一个NOR。此外，不同的四倍体物种在非同源染色体上具有NORs，证明了跳跃现象。然而，在Silurana亚属和Xenopus亚属的物种组(即密切相关的物种)中，NOR位置存在一些一致性。倍性水平高于四倍体的物种中NOR的数量和位置也需要进行研究。有趣的是，除了跳跃的NORs外，非洲爪蟾属中的染色体间重排很少见。
数据可用性
用于分析核型(包括中期图像)的R脚本可在GitHub页面上获取(见材料与方法部分，核型分析)。DNA序列已存入GenBank，这是一个可公开访问的数据库(登录号见表1)。本研究所有其他支持研究结果的数据均包含在文章及其补充信息中。
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异源四倍体,非洲侏儒爪蟾,FISH,基因组,6S染色体,核仁
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2026-09-07
2026-09-06
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