通过富含辣根过氧化物酶的单链DNA修饰的金包铁 纳米颗粒基于CRISPR-Cas12a的一锅法病毒DNA检测
发布时间：
2026-05-13 21:24
通过富含辣根过氧化物酶的单链DNA修饰的金包铁 纳米颗粒基于CRISPR-Cas12a的一锅法病毒DNA检测
朴东赫 ，伊扎蒂·海赞 ，安敏珠 ，崔敏宇 ，金敏贞 和崔振河 D
1 韩国全北国立大学化学工程学院清洁能源研究中心，百济大路567号，德津区，全州市54896，全罗北道，韩国；201610776@jbnu.ac.kr (朴东赫)；minyu5089@jbnu.ac.kr (崔敏宇)；minjeong413@jbnu.ac.kr (金敏贞)
2 韩国全北国立大学生物过程工程系，百济大路567号，德津区，全州市54896，全罗北道，韩国；izzatihaizan22@jbnu.ac.kr
3 韩国全北国立大学生物技术系，戈邦路79号，益山市54596，全罗北道，韩国；ahnminju@jbnu.ac.kr
* 通讯作者:jhchoi@jbnu.ac.kr
摘要:在病毒爆发的背景下，对早期准确诊断的需求变得越来越迫切。除了对有效控制疾病至关重要外，及时准确地检测病毒感染对于实施基本的公共卫生措施也很有必要，尤其是在大流行期间。在这些措施中，即时检测(POCT)作为一种强大的方法脱颖而出，有可能彻底改变病毒诊断的格局。在本研究中，我们开发了一种基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas12a的一锅法病毒DNA检测系统，专为POCT量身定制；该方法利用多酶修饰的 纳米颗粒。作为核酸扩增的替代方法，我们的方法使用单链DNA延伸来促进多酶修饰；这保证了提高的灵敏度并加快了诊断过程。我们实现了令人满意的 检测限，证明了该方法无需复杂设备即可具有显著的灵敏度。 磁性纳米颗粒的加入有助于样品分离，进一步简化了工作流程并增强了我们方法的简便性。这种综合方法为POCT场景中的灵敏病毒DNA检测提供了一种实用解决方案，推动了快速准确诊断领域的发展。
关键词:信号放大； 纳米颗粒；CRISPR生物传感器；早期诊断；即时检测
1. 引言
宫颈癌是一个重大的全球健康问题，是全球第四大常见癌症，也是全球女性癌症相关死亡的第四大原因[1-4]。据估计，约 的女性在一生中会感染人乳头瘤病毒(HPV)，但大多数(约90%)会在9 - 12个月内通过自身的先天免疫自然清除感染[5-7]。HPV16/18是高危HPV类型，是最具侵袭性和持续性的[8-10]。它们与宿主基因组整合并导致宫颈瘤变，是与生殖系统癌症相关的两种最重要的HPV类型，占宫颈癌病例的很大一部分(高达50%)。此外，它们还与其他形式的生殖系统癌症有关，类似于不同的HPV毒株[11]。
2018年5月，世界卫生组织总干事发起了消除宫颈癌的行动呼吁；这促成了2019年全球战略的制定[12]。2030年的宏伟目标包括实现90%的人乳头瘤病毒(HPV)疫苗接种覆盖率，确保70%的女性在一生中接受两次筛查，并为90%的女性提供针对宫颈癌前病变和癌症的治疗及姑息治疗[13,14]。虽然传统的基于细胞学的筛查方法存在局限性，包括敏感性以及需要频繁筛查，但HPV检测和疫苗的出现，其敏感性更高但特异性略低，标志着重大进展[15,16]。即便有了这一进展，基于HPV的筛查的实施仍然有限，尤其是在低收入/中等收入国家(LMICs)，那里的宫颈癌患者面临挑战。这些限制包括检测成本、对实验室基础设施的需求以及处理时间，这阻碍了单次就诊方法(SVA)的可行性[17]。
检查更新
引用:Park, D.H.; Haizan, I.; Ahn, M.J.; Choi, M.Y.; Kim, M.J.; Choi, J.-H. 通过富含辣根过氧化物酶的延伸单链DNA修饰的Au@Fe 纳米颗粒基于单锅CRISPR-Cas12a的病毒DNA检测。生物传感器 2024, 14, 26. https://doi.org/ 10.3390/bios14010026
收到日期:2023年12月13日
修订日期:2023年12月29日
接受日期:2023年12月30日
发表日期:2024年1月2日
(cc) ①
版权:© 2024作者。瑞士巴塞尔MDPI出版社授权。本文是一篇开放获取文章，根据知识共享署名(CC BY)许可协议(https:// creativecommons.org/licenses/by/ 4.0/)的条款和条件分发。
因此，为了在LMICs广泛采用原发性HPV筛查，迫切需要经济实惠的即时检测(POCT)HPV检测以实现单次就诊方法(SVA)。这将有助于实现世界卫生组织到2030年消除宫颈癌的战略目标[18 - 21]。有效的疾病控制在很大程度上取决于及时准确地识别病原体。早期病毒检测对于实施接触者追踪、隔离和检疫等重要公共卫生措施至关重要，这些措施有助于遏制进一步传播[22,23]。POCT在这方面已成为一种关键方法。通过在患者床边提供快速诊断结果，POCT有助于迅速做出决策、进行干预和控制疫情[22,24]。可适应POCT的酶联免疫吸附测定(ELISA)是用于抗体测量的代表性比色生物传感器；然而，其敏感性不足[25,26]。这一局限性导致早期诊断的敏感性不够，因此不适用于早期疾病检测。虽然聚合酶链反应(PCR)在检测病毒DNA和RNA方面具有高敏感性，但它存在操作程序耗时、成本高以及可能出现假阳性信号的问题[27,28]。这些缺点阻碍了它在POCT场景中的应用。因此，迫切需要既便携又易于实施的POCT系统。在现有的POCT系统中，单锅技术采用单管配置，适合在LMICs使用。为了消除交叉污染风险以及对单独的扩增前和扩增后工作空间的需求，可以通过在单管中同时进行扩增和基于CRISPR/Cas的切割来实现额外的特异性增强层[29,30]。
基于CRISPR的生物传感器作为一种用于精确核酸检测的有前途的方法受到了广泛关注[31]。通过利用以其基因组编辑能力而闻名的多功能CRISPR-Cas系统，这些生物传感器在检测目标DNA或RNA序列时在实现特异性和敏感性方面表现出色[32,33]。CRISPR-Cas家族的CRISPR-Cas12a变体具有独特的反式切割(旁系)能力，这使其在使用其相应的目标DNA激活后能够非特异性地切割附近的单链DNA(ssDNA)[34 - 36]。这一独特特性越来越多地被用于创建创新的生物传感方法。通过工程设计，可以产生可检测信号，包括与目标序列结合时的荧光或颜色变化。这一特性提供了具有视觉或自动读出选项的简化检测过程。然而，在考虑将它们集成到POCT场景中时，CRISPR生物传感器很难在保持敏感性和特异性的同时简化检测流程。复杂的样品制备、核酸提取和扩增步骤的需求可能会阻碍CRISPR生物传感器无缝融入便携式快速检测平台[37 - 39]。
为应对这些挑战，我们提议开发一种系统，该系统能确保即时检验(POCT)应用的简易性和更高灵敏度。在本研究中，我们开发了一种基于CRISPR的新型DNA生物传感器，该传感器在比色框架内利用磁性酶复合物的功能实现高灵敏度病毒DNA检测(图1)。在此，我们将 磁性纳米颗粒称为金纳米杂化物(AuNHs)。采用这一术语是为了简洁地概括其杂化性质，即将金(Au)纳米颗粒的独特性质与氧化铁 的磁性能力相结合[40]。AuNHs通过磁芯构建而成，便于通过磁力轻松分离，其外壳为金，以增强与单链DNA(ssDNA)的强结合亲和力。多个辣根过氧化物酶(HRP)修饰的ssDNA固定在AuNHs上以促进信号放大[41]。为进一步增强信号，我们在ssDNA延伸过程中加入生物素-dUTP；这增强了链霉亲和素-HRP的结合[42]。利用CRISPR-Cas12a的反式切割反应，AuNHs上附着的ssDNA发生酶促降解，释放出多个HRP。这导致上清液中存在大量HRP，并在 -四甲基联苯胺(TMB)反应过程中导致可观察到的颜色变化。这种颜色变化是由于在HRP介导的 还原过程中TMB底物的氧化，直观地表明了目标病毒DNA的存在。我们的方法利用CRISPR-Cas12a系统固有的特异性和可编程性，无需传统核酸扩增步骤即可实现灵敏检测。通过无需核酸扩增并利用ssDNA延伸进行信号放大，我们的单锅系统实现了更高的灵敏度和显著的时间效率。值得注意的是，使用AuNHs便于通过磁力在5分钟内轻松分离，从而无需离心机等专门设备。这种基于磁性纳米颗粒的分离方法显著提高了我们方法的简易性。我们基于CRISPR的比色生物传感器为早期病毒感染诊断提供了一种有前景的解决方案，展示了集成到即时检验系统中的潜力。
图1. 基于目标存在的CRISPR-Cas12a单锅检测策略示意图。
2. 材料与方法
2.1. 材料和试剂
ssDNA和目标DNA购自Bioneer。使用的特定ssDNA为[硫醇]-5’-ATATATATATA-3’-[生物素]和[硫醇]-5’-ATATATATATA-3’。对于目标，使用了以下DNA:HPV16L1:5’-GTGCTGCCATATCTACTTCA-T’，HPV18L1:5’-TGTGTAGAAGCACATATTGT-3’，HBV:5’-TTGGCTTTCAGTTATATGGATG ATGTGGTA-3’，以及BRCA-1:5’-GAACAAAAGGAAGAAAATCA-3’。crRNA和Cas12a购自IDT，使用的crRNA为HPV16L1 crRNA:5’-UAAUU UCUACUAAGUGUAGAUUGAAGUAGAUAUGGCAGCAC-3’和HPV18L1 crRNA:5’-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUACAAUAUGUGCUUCUACACA-3’。末端转移酶、链霉亲和素-HRP、dATP和TMB溶液购自Sigma-Aldrich。生物素-16-dUTP购自耶拿生物科学公司。使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM；Gemini500，蔡司，耶拿，德国)和Cs校正场发射透射电子显微镜(FE-TEM；JEM-ARM200F，日本电子，东京，日本)对样品进行表征；显微镜安装在全北国立大学的全校研究设施中心(CURF)。使用多模式微孔板读数器(Tecan，TECAN infinite 200 PRO，瑞士曼纳多夫)收集荧光光谱和吸收光谱。
2.2. 用于磁芯的 纳米颗粒的合成
纳米颗粒(MNP)的制备涉及几个详细步骤。首先，所有玻璃器皿都进行干燥并储存在 。此后，将1,2 - 十六烷二醇、油胺、油酸和Fe(acac) 的混合物置于烧瓶中，加热至 长达 以蒸发残留水分。温度升至 保持两小时，然后再升至 持续额外一小时，随后缓慢冷却至室温。一旦温度低于 ，从烧瓶中收集MNP溶液。向MNP溶液中加入乙醇并离心以弃去上清液。将剩余沉淀重新分散在甲苯中，然后再次离心，将上清液与乙醇合并并再次离心。弃去最终上清液，将沉淀重新分散在甲苯中，得到 MNP。
2.3. AuNHs的合成
通过改进的方案[43,44]合成了金纳米壳(AuNHs)。最初，将 的CO - 520分散在 的环己烷中，并在 搅拌 ，之后加入 的 毫微米颗粒(MNP)并再搅拌一小时。随后，依次加入 的 和 的正硅酸四乙酯(TEOS)，并分别搅拌 和 。继续该过程，加入3 - 氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)并在室温下再搅拌 。通过引入 的 四甲基氢氧化铵(TMAOH)/甲醇溶液对形成的 纳米颗粒进行纯化，该溶液被短暂摇晃。使用磁铁收集纳米颗粒。丢弃溶剂后，将纳米颗粒用乙醇和去离子水(DIW)的混合物在 洗涤 次，并重新分散在 的DIW中。通过将 的 与 的DIW混合并搅拌 来单独制备金种子溶液。此后，加入 的1%四(羟甲基)氯化鏻(THPC)和 的 ，每次加入后搅拌混合物。为了形成金壳，将 的 溶液与 的金种子溶液混合并搅拌 。在洗涤和离心以去除过量的金种子后，将溶液重新分散在 的水中。最后的反应包括向纳米颗粒溶液中加入 的 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液和 的 (进一步搅拌)；在加入制备的磁性金纳米颗粒(MGNP)溶液和 的 盐酸后，混合物再搅拌 ，直到出现蓝绿色，表明形成了金纳米壳。然后用水洗涤AuNHs以完成该过程。
2.4. 单链DNA的延伸及AuNH - DNA - HRP复合物的制备
在一条11bp的单链DNA上进行了转移酶反应，该单链DNA仅在 端进行了硫醇化修饰。对于该单链DNA，使用 的生物素-16-dUTP和 的dATP作为核苷酸。将其与末端转移酶、TdT反应缓冲液和 混合，并在 下反应 。然后用DTT处理单链DNA，为其连接到金纳米棒做准备。制备好的金纳米棒用去离子水洗涤三次，然后与经DTT处理的单链DNA混合，并在 下孵育 ，得到DNA包覆的金纳米棒。然后使用由 牛血清白蛋白组成的封闭缓冲液进行过夜孵育。接着在室温下用链霉亲和素-HRP孵育 。经过三次洗涤步骤后，混合物在 下孵育 ，然后再洗涤两次，得到制备好的金纳米棒-DNA-HRP复合物。
2.5. 使用金纳米棒上的活化CRISPR-Cas12a复合物检测病毒DNA
通过在无RNase的水中使 Cas12a与 crRNA反应 ，在 下形成活化的CRISPR-Cas12a复合物。复合物形成后，将靶DNA在切割缓冲液(20 mM HEPES、150 mM KCl、10 mM 、1%甘油和0.5 mM二硫苏糖醇)中引入到CRISPR-Cas12a复合物中。然后将活化溶液与金纳米棒-DNA-HRP在 下孵育 。随后，使用磁铁分离金纳米棒 ，上清液进行TMB反应 。
3. 结果
3.1. 金纳米棒的表征以及使用末端转移酶对单链DNA的延伸
具有独特性质的杂化纳米粒子的合成在各个研究领域引起了广泛关注。由磁性 核和金(Au)壳组成的金纳米空心球(AuNHs)，因其在药物递送和生物传感方面的潜在应用而备受关注。首先，我们采用种子生长法合成了AuNH纳米粒子，重点关注 核便于磁分离的优势以及Au壳便于更轻松地连接DNA以进行进一步功能化的优势。如2a图所示，AuNH纳米粒子是采用种子生长法合成的。最初，使用化学沉淀法合成了 纳米粒子。随后，将 纳米粒子用作种子，通过还原反应生长Au壳。在图2(bi)中，展示了 的透射电子显微镜(TEM)图像。图2(bii)中的后续TEM分析揭示了 二氧化硅壳的存在，证明成功形成了核壳结构。在图2(biii)中，TEM分析证实 核被包裹在Au壳内。这一观察结果证明成功合成了AuNH核壳纳米结构。吸收光谱在 处出现一个峰，表明Au纳米粒子的等离子体共振(图2c)，进一步验证了AuNHs的合成。
对于单链DNA(ssDNA)延伸，使用三磷酸脱氧腺苷(dATP)和生物素 - 脱氧尿苷三磷酸(biotin - dUTP)作为核苷酸来延伸11个碱基对的ssDNA(图2d)。延伸后的DNA产物的琼脂糖凝胶电泳显示出对应正常DNA和延伸后DNA的明显条带(图2e)。观察到延伸后的DNA片段长度超过100个碱基对，表明延伸成功。相对较长的DNA片段的存在表明掺入了多个生物素部分，这可以增强链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶(streptavidin - HRP)的结合能力以进行进一步功能化。为确保ssDNA成功附着到AuNH纳米粒子上，我们使用荧光标记的ssDNA(3’-FAM)进行了初步研究。孵育3小时(图2f)，之后对纳米粒子进行磁分离，能够分离出AuNH - ssDNA复合物，而任何未结合的ssDNA留在上清液中。通过测量孵育后上清液的荧光强度，我们确定了ssDNA与AuNH纳米粒子结合的程度。结果，孵育 后上清液中的荧光强度大幅下降，表明ssDNA成功结合到AuNH纳米粒子上。此外，我们测量了AuNH和ssDNA包覆的AuNHs的zeta电位。将AuNHs与ssDNA孵育 ，随后进行两次洗涤步骤，之后评估zeta电位。结果表明，ssDNA包覆的AuNHs表现出增加的负电荷，证实ssDNA成功包覆在AuNH表面(图2g)。
图2. 颗粒和DNA延伸的表征。(a) AuNH合成策略；(b) (i) 、(ii) 、(iii) AuNH的透射电子显微镜图像；(c) AuNHs的紫外可见吸收光谱；(d) 单链DNA延伸策略；(e) 在 下使用4%琼脂糖凝胶对单链DNA进行 延伸电泳，泳道分别为10 bp梯度尺 (e1)、相同浓度的单链DNA样品 (e2) 和所得转移酶产物 (e3)；(f) 在 孵育后，对与单链DNA复合并用 -FAM标记的AuNH进行荧光观察；(g) AuNH和单链DNA包覆的AuNH的zeta电位。
3.2. 在基于CRISPR的DNA检测中，利用AuNH纳米颗粒上的延伸DNA进行信号放大
信号放大对于提高DNA检测分析的灵敏度至关重要。在我们的研究中，我们使用末端转移酶和生物素-dUTP来延伸一条11 bp的单链DNA；这产生了一条相对较长的DNA链，带有多个链霉亲和素-HRP结合位点。将这种信号放大策略与使用正常的11 bp DNA(3’-生物素)进行了比较，预计延伸的DNA链由于链霉亲和素-HRP结合位点数量的增加会产生更强的信号(图3a)。
接下来，为了验证基于CRISPR的DNA检测中的信号放大，我们比较了用11 bp单链DNA和延伸DNA功能化的AuNHs。设计具有多个链霉亲和素-HRP结合位点的延伸DNA链比正常的11 bp DNA(仅具有一个链霉亲和素-HRP结合位点)能更有效地增强信号强度。首先将AuNHs与各自的DNA和链霉亲和素-HRP缀合。经过彻底洗涤以去除未结合的分子后，我们获得了AuNH-ssDNA-HRP复合物。在CRISPR反应之前，AuNHs分别用正常DNA和延伸DNA进行功能化。然后制备AuNH-ssDNA-HRP复合物并进行TMB反应。在图3b中，即使在相同的AuNH浓度下，延伸DNA比正常DNA能结合更多的HRP。结果，从AuNH-ssDNA-HRP复合物中观察到更强的信号，特别是来自附着延伸单链DNA的AuNHs，与其他颗粒相比信号高出38.5%。随后，我们使用CRISPR Cas12a反式切割活性评估信号放大效率。该酶切割附着在AuNH上的单链DNA，并且使用磁铁可以高效且容易地分离纳米颗粒，断裂的DNA链和与之结合的HRP留在上清液中。对上清液进行TMB反应以量化从断裂的DNA链产生的信号。CRISPR反应后对TMB反应吸光度峰的分析表明，在目标DNA浓度为 时，11 bp正常DNA与阴性对照之间几乎没有差异。相比之下，在相同浓度下，延伸DNA与阴性对照相比显示出明显且显著的信号增加。具体而言，在图3c中，在CRISPR和DNase的核酸切割反应之后，上清液中来自附着延伸单链DNA的AuNHs显示出更强的信号。此外，延伸DNA与阴性对照相比显示出明显且显著的信号增加。这些令人信服的发现为成功增强信号放大以实现即使在低浓度下对CRISPR靶标的灵敏检测提供了充分的证据，证明了我们信号放大策略的有效性。
图3. 基于CRISPR的DNA检测中的信号放大。(a) 通过HRP增强信号的策略；(b) AuNH-DNA-HRP复合物与正常单链DNA或延伸单链DNA在 处的吸光度比较；(c) CRISPR反应上清液中正常单链DNA和延伸单链DNA在 处的吸光度比较。
3.3. 使用具有增强信号放大功能的基于CRISPR的生物传感器系统进行特定DNA靶标的检测
在本研究中，我们验证了基于CRISPR的生物传感器系统检测特定DNA靶标的能力。该系统利用与HPV16L1 crRNA复合的CRISPR - Cas12a核糖核蛋白(RNP)，以实现对相应DNA靶标的选择性检测。
在应用该系统之前，我们首先使用凝胶电泳确认了特异性，其中只有当crRNA与靶DNA互补时才会发生反式切割反应。如图4a所示，当靶DNA与HPV16L1 cr - RNA匹配时，仅发生酶促反应，凝胶电泳上没有明显的条带(第3泳道)。相反，当使用HPV18L1 crRNA时，酶促反应仅发生在与HPV18L1匹配的靶DNA上，凝胶电泳上的特定条带证明了这一点(第6泳道)。只有第2泳道中的单链DNA对照组以及第4和5泳道中未发生CRISPR反应的组出现了20 bp的条带，这归因于 硫醇DNA的强SH - SH键。
图4. 根据crRNA序列进行的特定靶标检测。(a)CRISPR反应后的电泳结果，10 bp梯度(1)、相同浓度的单链DNA样品(2)、靶向HPV16L1的HPV16L1 crRNA(3)、HPV18L1(4)以及分别靶向HPV16L1(5)和HPV18L1的HPV18L1 crRNA(6)；(b)使用针对HPV16L1、HPV18L1、HBV和BRCA - 1靶标的HPV16L1 crRNA进行CRISPR反应后上清液在 处的吸光度，所有样品均用延伸的单链DNA进行测试；(c)使用HPV18L1 crRNA对产物进行类似测量的吸光度。
由于crRNA与靶DNA之间的互补结合，预计该系统会与特定的DNA靶标发生选择性反应。图4b显示了基于CRISPR的生物传感器系统中针对HPV16L1靶标的TMB反应结果在 处的吸光度峰值。存在与HPV16L1 crRNA互补匹配的HPV16L1 DNA靶标产生了明确的信号，表明Cas12a已完成反式切割。相比之下，HPV18L1、HBV和BRCA - 1靶标未发生明显反应；因此，观察到的信号水平与阴性对照相似。这种选择性反应进一步证实了生物传感器系统的特异性，只有HPV16L1靶标引发了明显且可靠的信号，而其他非互补靶标显示出与阴性对照相似的最小信号强度。图4c显示了使用HPV18L1 crRNA进行的测试；HPV 18L1 DNA靶标产生了明显的信号。相比之下，非互补DNA靶标和阴性对照均未显示任何明显反应。此外，通过增加HRP附着增强了信号强度。特定crRNA与其相应靶DNA之间的选择性结合确保了准确检测，并与非靶DNA有明显区分。该系统在HPV16L1和HPV18L1靶标上的成功验证突出了其在未来测试中检测其他病毒DNA靶标的潜力。
3.4. 基于CRISPR的DNA病毒检测生物传感器系统的灵敏度验证和靶标检测
为了评估我们基于CRISPR的DNA病毒检测生物传感器系统的灵敏度和能力，我们使用CRISPR Cas12a和HPV16L1 cr - RNA进行了测试。这些测试专门设计用于检测HPV16L1靶标，无论是单独检测还是在人血清中混合检测，以证明生物传感器在不同场景下的有效性。
灵敏度测试涵盖的总靶标浓度范围为 至 。图5a显示了使用HPV16L1 crRNA检测HPV16L1靶标的结果。随着总靶标浓度从 降至 ，生物传感器系统成功地以可靠信号检测到了靶标。图5b展示了为这些测试绘制的线性曲线，证明了该方法的准确性， 值为0.98，检测限(LOD)为 。
图5. 基于CRISPR的生物传感器系统的灵敏度分析。本图展示了使用CRISPR生物传感器进行的灵敏度测试结果，其中在两种不同设置下靶向HPV16L1。首先，使用标准HPV16L1靶标进行测试，随后使用混入人血清中的HPV16L1靶标进行测试。在每种情况下的CRISPR反应后，分离上清液，并在TMB反应后评估其在 处的吸光度。(a) 在 至 范围内检测HPV16L1靶标。(b) 检测限为0.25 nM的线性曲线。(c) 在 至 范围内检测人血清中的HPV16L1靶标。(d) 在人血清环境中检测限为 的线性曲线。
为模拟实际样品条件，我们以1/20的比例用PBS在人血清中稀释靶DNA。如图5c所示，结果表明该生物传感器即使在人血清中也能有效识别HPV16L1靶标，突出了其实际适用性。相应的线性曲线(图5d)的 值达到0.99，再次证实了该方法的精密度和准确性，在人血清存在下检测限为 。
4. 讨论
在本研究中，我们成功开发了一种基于CRISPR的生物传感器系统，用于灵敏且特异的检测DNA病毒靶标(HPV16L1和HPV18L1)。我们合成了具有核壳结构的AuNH，其作为功能化和易于磁分离的优良平台。通过使用末端转移酶和生物素 - dUTP延伸单链DNA，我们通过增加链霉亲和素 - HRP的结合能力实现了信号放大。这种信号放大策略实现了低至 的检测限，为DNA病毒检测提供了更高的灵敏度。通过特异性验证，我们确认基于CRISPR的生物传感器系统以独特且特异的信号选择性地检测HPV16L1和HPV18L1靶标。此外，我们通过修改crRNA序列证明了该系统在检测其他DNA病毒靶标方面的适应性；灵敏度和检测效率仍然得以保持。总体而言，本研究中的基于CRISPR的生物传感器系统在DNA病毒检测的实际应用中具有前景，包括早期诊断和监测。该系统的高灵敏度、特异性和多功能性突出了其作为病毒检测领域有价值工具的潜力。该系统有助于有效管理和控制病毒感染。然而，值得注意的是，在灵敏度测试期间，与人血清一起测试的吸光度总体上似乎比纯靶标低。这种差异可能归因于人血清复杂的样品基质[45]，这可能阻碍了我们系统中的酶反应。此外，从CRISPR反应到TMB检测的整个过程耗时较长，为3小时。因此，为了在即时检验(POCT)系统中实施，减少检测时间被认为至关重要。这一限制将在不久的将来的下一个实验中进一步研究和解决。未来的应用可能涉及检测各种DNA病毒靶标以及开发用于快速准确病毒检测的即时诊断设备。
5. 结论
本研究中开发的基于CRISPR-Cas12a的生物传感器系统在增强DNA病毒检测方面显示出巨大潜力，尤其是HPV16L1。其有效性的关键在于使用延伸单链DNA提高灵敏度的新型信号放大策略。该系统能够在极低浓度下检测HPV16L1，相较于当前诊断技术有显著改进，凸显了其在早期准确疾病检测方面的潜力。值得注意的是，该系统适用于即时检验(POCT)，对资源有限的环境有利。系统的简单性和快速响应对于疾病中有效病毒检测及疫情控制至关重要。然而，我们的研究认识到在优化检测灵敏度方面存在挑战，并强调需要进一步研究以提高其在检测目标时的灵敏度，这对于其在不影响特异性的情况下在POCT中的广泛应用至关重要。由于HPV是一个全球性问题且与宫颈癌相关，我们的生物传感器准确检测高危DNA病毒的能力对公共卫生意义重大。它在改善疾病监测、辅助早期诊断以及促进全球疾病预防和控制方面具有巨大潜力，使其成为病毒诊断和公共卫生领域的一项值得关注的进展。
作者贡献:概念构思，D.H.P.和J.-H.C.；方法学 - Fe 合成，I.H.，金纳米合成，M.J.A.，传感，D.H.P.；软件可视化(Origin Pro)，M.Y.C.；验证，D.H.P.和M.Y.C.；形式分析与调查，D.H.P.；数据管理，I.H.和M.J.K.；撰写 - 原始草案准备，D.H.P.(牵头)，I.H.，M.J.A.，M.Y.C.和M.J.K.；撰写 - 审阅与编辑、监督和资金获取，J.-H.C.。所有作者共同撰写了手稿。所有作者已阅读并同意手稿的发表版本。
资金:本研究得到了韩国政府(科学技术信息通信部)资助的韩国国家研究基金会(NRF)项目(NRF-2022R1C1C1008797)的支持，以下是由韩国教育部和韩国国家研究基金会支持的“产学研合作3.0领军者”项目的研究成果。
机构审查委员会声明:不适用。
知情同意声明:不适用。
数据可用性声明:数据包含在文章中。
致谢:使用透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)的分析在全校研究设施中心(CURF)的协助下进行。
利益冲突:作者声明无利益冲突。
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