二聚体去泛素化酶USP28整合53BP1和MYC功能以限制DNA损伤
发布时间：
2026-05-14 21:58
二聚体去泛素化酶USP28整合53BP1和MYC功能以限制DNA损伤
Chao Jin , Elias Einig , Wenshan Xu , Ravi Babu Kollampally , Andreas Schlosser , Michael Flentje 和Nikita Popov 19,1,2,*
德国图宾根大学医院医学肿瘤学和肺病学系，Otfried-Müller-Str 14，72076图宾根 德国图宾根大学卓越集群2180“图像引导和功能指导肿瘤治疗”(iFIT)
德国维尔茨堡大学医院放射肿瘤学系，Josef-Schneider-Str. 2，97080维尔茨堡
德国维尔茨堡大学鲁道夫·菲尔绍中心，整合与转化生物成像中心，Josef-Schneider-Str 2，97080维尔茨堡
*通讯作者联系方式。电话:+49 72071 2984399；电子邮件:nikita.popov@med.uni-tuebingen.de 现地址:
Wenshan Xu，中国上海浦东新区航和路1000号，邮编201317。
Ravi Babu Kollampally，德国维尔茨堡大学分子感染生物学研究所，Josef-Schneider-Straße 2，97080维尔茨堡。
摘要
DNA复制是肿瘤细胞内源性DNA损伤的主要来源，也是细胞对基因毒性应激反应的关键靶点。DNA复制可被癌蛋白如转录因子MYC失调，MYC在许多人类癌症中异常激活。MYC受到泛素系统的严格调控——例如，泛素化控制延伸因子PAF1c的募集，PAF1c对MYC活性至关重要。奇怪的是，一种关键的靶向MYC的去泛素化酶USP也通过介导蛋白53BP1控制细胞对DNA损伤的反应。USP28形成稳定的二聚体，但USP28二聚化的生物学作用尚不清楚。我们在此表明，二聚化限制了USP28的活性，并限制了MYC对PAF1c的募集。单体USP28的表达使MYC稳定并促进PAF1c的募集，导致异位DNA合成和与复制相关 的DNA损伤。53BP1刺激USP28二聚化，53BP1选择性结合USP28二聚体。基因毒性应激减少53BP1-USP28相互作用，促进USP28二聚体的解离，并刺激MYC对PAF1c的募集。这在对基因毒素的早期反应中触发DNA复制起点的激发，并加剧DNA损伤。我们提出，USP28的二聚化可防止转录活跃染色质上的异位DNA复制，以维持基因组稳定性。
图形摘要
收到日期:2023年4月14日。修订日期:2023年12月21日。编辑决定日期:2023年12月22日。接受日期:2024年1月4日
©作者2024年。由牛津大学出版社代表核酸研究社出版。
引言
细胞对DNA损伤的反应是基因组维持和肿瘤抑制的核心要素。激活的癌基因可促进基因组不稳定，导致肿瘤异质性和治疗抗性(1)。另一方面，DNA损伤是许多癌症治疗的效应器。因此，了解诱导和应对DNA损伤的机制有助于开发有效的治疗方法。
DNA损伤反应(DDR)信号传导的关键要素是PI3K相关激酶的激活，包括ATM和DNA-PK(2)。DDR依赖的组蛋白(最显著的是H2A变体H2AX)和介导蛋白如53BP1的磷酸化促进DNA修复因子募集到DNA损伤处(3)。同时，DDR信号传导靶向细胞周期和复制机制的多个调节因子，以抑制DNA合成并停止细胞周期进程，直到DNA修复。基因毒素通常诱导G1或G2期停滞，因此在后一种情况下，细胞在应激下复制DNA，仅在进入有丝分裂前停滞(4)。一个关键问题是细胞如何在基因毒性应激下控制DNA复制，以及这些机制是否可用于治疗。
一种与基因组不稳定相关的关键癌蛋白是转录因子MYC(也称为cMYC)，它对于包括肝脏、肺、皮肤和肠道在内的不同组织的肿瘤发生至关重要(5 - 7)。MYC足以诱导细胞周期进程并刺激静息细胞中的DNA复制，然而这些特性对于MYC驱动的肿瘤发生是否必不可少仍存在争议(8,9)。早期研究表明，MYC通过与Max蛋白形成异二聚体复合物结合E - 盒元件来调节特定的依赖RNAPII的基因的表达(10 - 12)。全基因组染色质结合数据表明，MYC广泛地与启动子和远端调控元件(如增强子)结合，包括缺乏共有E - 盒的序列(13 - 15)。一些研究提出MYC会放大所有活跃基因的表达(16,17)，而其他研究则表明它对特定基因群有激活和抑制作用(18 - 20)。
虽然MYC诱导的基因表达变化具有背景依赖性，但在大多数分析系统中，MYC的染色质结合是真正全基因组范围的(9,16 - 20)，这表明MYC的一些关键功能可能独立于基因表达。例如，MYC通过与复制解旋酶的组分相互作用参与对DNA复制的直接控制(21 - 23)。最近的研究表明，神经组织中MYC的旁系同源物MYCN招募BRCA1和外泌体复合物以促进R - 环(依赖RNAPII的DNA - RNA杂交体)的解离，限制RNAPII与复制体的碰撞(转录 - 复制冲突，TRCs)(24,25)。另一种机制涉及MYC介导的延伸因子PAF1c的招募，PAF1c是一种多亚基复合物，可调节RNAPII的持续合成能力、RNA加工和核输出。除了在转录中的作用外，PAF1c还促进TRCs的解离并促进DNA修复(26 - 28)。从机制上讲，PAF1c刺激组蛋白H2B的泛素化(29)，这反过来又稳定了复制叉并促进同源重组。然而，PAF1c也会导致R - 环的积累并刺激ATR信号传导，加剧复制应激(30,31)，这表明PAF1c在基因组稳定性中的功能取决于遗传或信号背景。
MYC是一种寿命短暂的蛋白质，其功能受到泛素系统的严格控制(32,33)。几种泛素连接酶，包括基于Cul1的SCF(FBW7)和SCF(Skp2)复合物，维持MYC低蛋白水平，这是正常未转化细胞的特征。这些连接酶在一部分人类癌症中的突变会延迟MYC的降解(34 - 37)。有趣的是，泛素缀合可以正向调节MYC的转录功能(36,37)。例如，泛素化(可能由Huwe1连接酶介导)破坏了MYC与PAF1c的抑制复合物，并促进PAF1c在RNAPII上的转移(26,27)。
MYC的泛素化可以被几种去泛素酶逆转，包括USP36和USP28(38,39)。奇怪的是，USP28在细胞对DNA损伤的反应中也起着重要作用——它稳定关键的DDR介质蛋白53BP1，并促进对电离辐射的ATM依赖性信号传导(40,41)。一个有趣的问题是，USP28在调节MYC和53BP1方面的不同功能是如何在细胞对DNA损伤的反应中整合的。
最近的结构和生化研究表明，USP28在体外和细胞中形成二聚体(42,43)，但USP28二聚化的生物学作用尚不清楚。在这里，我们表明USP28的二聚化限制了MYC的去泛素化，从而控制与PAF1c的相互作用。单体USP28的表达促进PAF1c的招募，减少TRCs并刺激DNA复制。我们证明53BP1选择性地与USP28二聚体相互作用并使其稳定，限制与复制相关的DNA双链断裂。这种调节在基因毒性应激时被破坏，引发异常的DNA合成，放大DNA损伤。
材料和方法
细胞培养和试剂
HLF(细胞osaurus编号CVCL_2947)和p19 - / - Nras细胞(44)由Ramona Rudalska(图宾根大学医院)提供。HeLa(细胞osaurus编号CVCL_2947)细胞是Martin Eilers(维尔茨堡大学)馈赠的。MEFs的分离和永生化先前已有描述(45)。所有细胞系均在含有10%胎牛血清(PAN - Biotech)、1%青霉素 - 链霉素(Gibco)和1%非必需氨基酸(Gibco)的杜氏改良 Eagle培养基(Sigma)中，于 和 的湿度环境下培养。除非另有说明，使用以下试剂及浓度:依托泊苷(开曼，5 )、环己酰亚胺(Sigma，100 µg/ml)、胸苷(Sigma，2 mM)、10074 - G5(Biomol，10 µM)、拓扑替康(Sigma，1 )、博来霉素(InvivoGen，100 µg/ml)、顺铂(赛默飞，10 μM)、吉西他滨(Sigma，10 μM)、奥拉帕尼(Biomol，10 µM)、西穆罗塞替布(MedChemExpress，2 µM)、KU - 55933(Selleckchem，2 µM)、米林(Biomol，25 µM)。
质粒、寡核苷酸和抗体
编码USP28 - WT或USP28 - M的开放阅读框被克隆到pRRL - hygro载体中(由维尔茨堡大学的Martin Eilers馈赠)。His - Ub质粒先前已有描述(46)。用于生成USP28 - GFP融合蛋白的sfGFP开放阅读框由Michael Knop(海德堡ZMBH)慷慨提供。对于shRNA介导的沉默，将shRNA寡核苷酸克隆到pLKO1.puro(由Bob Weinberg馈赠；Addgene质粒#8453)中，针对hCTR9(TRCN0例000008739/TRCN0000008741)和hCDC73(TRCN0000008728/TRCN0000011464)的pLKO1.puro中的shRNAs购自Sigma。编码sgRNA的寡核苷酸被克隆到pSpCas9(BB) - 2A - Puro(PX459)V2.0载体中(由Feng Zhang馈赠；Addgene质粒#62988)。pRetro.Super载体中针对CDC34A/B的shRNAs先前已有描述(46)。对于USP28 - R406Q/R428T/R510S/R519W，将寡核苷酸克隆到pcDNA3载体中(45)。所有克隆插入片段的序列通过Sanger测序进行了确认。寡核苷酸序列见补充表S1。抗体详细信息见补充表S2。
转染和慢病毒转导
对于瞬时转染，根据制造商的建议使用PolyJet(SignaGen Laboratories)或Fugene转染试剂(Promega)。
对于USP28的CRISPR - Cas9敲除，根据制造商的建议使用Fugene转染试剂(Promega)。在嘌呤霉素选择(0.5 μg/ml)后，将细胞稀释并接种到96孔板中挑选单克隆，通过免疫印迹进一步确认敲除情况。
对于慢病毒转导，将目标质粒与包装和包膜质粒(pPAX2和pMD2.G，由Didier Trono馈赠，Addgene质粒#12260和12259)一起使用聚乙烯亚胺(Sigma)转染到LentiX细胞中(由图宾根大学医院的Michael Hudecek馈赠)。含有慢病毒的培养基经过过滤，并在存在 聚凝胺(Sigma)的情况下与目标细胞孵育 ，随后进行抗生素选择并通过免疫印迹进行确认。
免疫印迹
细胞沉淀用PBS洗涤，并在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma，1:1000)的TNT-150缓冲液(25 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，1% Triton-X100)中于冰上裂解10分钟。细胞裂解物通过在 、 和 条件下离心澄清。加入等体积的4X Laemmli上样缓冲液(277.8 mM Tris-HCl pH 6.8，44.4%(v/v)甘油，4.4% LDS，0.02%溴酚蓝，10%(v/v)β-巯基乙醇)，裂解物在 条件下变性10分钟。样品在12% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到PVDF膜上，然后用目标特异性抗体进行封闭和免疫印迹。
为了进行定量，使用ImageJ对感兴趣的蛋白质条带的灰度强度进行定量。结果首先进一步归一化为上样对照(环己酰亚胺测定)、总蛋白(去泛素化酶活性测定)或参考蛋白(免疫沉淀，His-Ub测定)，然后归一化为对照组进行定量。
免疫沉淀
细胞沉淀用PBS洗涤，并在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma)的TNT-250缓冲液(25 mM Tris-HCl pH 7.4，250 mM NaCl，1% Triton-X100)中于冰上裂解10分钟。细胞裂解物通过在 和 条件下离心10分钟澄清。澄清的细胞裂解物与抗体和 的A/G琼脂糖珠(赛默飞世尔科技，50%悬液)蛋白在4°C下于旋转摇床上孵育过夜。通过离心收集沉淀的复合物，并用裂解缓冲液洗涤三次。样品通过与 Laemmli上样缓冲液在 条件下孵育 进行变性，然后通过免疫印迹分析。
LC-MS/MS分析，胶内消化
对于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析，将USP28和53BP1免疫沉淀产物在Laemmli缓冲液中于 孵育进行变性处理。蛋白质在SDS-PAGE凝胶上进行分离。每个凝胶泳道切成15片。切下的凝胶条带用 乙腈在 中脱色，用100%乙腈收缩，然后在真空浓缩器(德国艾本德公司的Concentrator 5301)中干燥。每个凝胶条带用 胰蛋白酶在 于 (pH 8)中进行过夜消化。去除上清液后，用乙腈和5%甲酸从凝胶切片中提取肽段，每个凝胶切片提取的肽段上清液合并。在配备PicoView离子源(New Objective)并与EASY-nLC 1000(赛默飞世尔科技公司)联用的Orbitrap Fusion(赛默飞世尔科技公司)上进行纳升液相色谱-串联质谱(NanoLC-MS/MS)分析。肽段加载到用ReproSil-Pur 120 C18-AQ、1.9 µm(Dr Maisch)自装填的毛细管柱(PicoFrit， 内径，New Objective)上，并用30分钟线性梯度从3%到30%乙腈和0.1%甲酸以及流速为 进行分离。
MS和MS/MS扫描均在Orbitrap分析仪中进行，MS扫描分辨率为60000，MS/MS扫描分辨率为15000。采用归一化碰撞能量为35%的高能碰撞解离(HCD)碎裂方式。使用固定循环时间为 的Top Speed数据依赖型MS/MS方法。应用动态排除，重复计数为1，排除持续时间为 ；单电荷前体被排除在选择之外。前体选择的最小信号阈值设定为50000。预测自动增益控制(Predictive AGC)用于MS扫描，AGC目标值为2e5，用于MS/MS扫描，AGC目标值为5e4。使用EASY-IC进行内部校准。
质谱数据分析
原始质谱数据文件用MaxQuant版本1.6.2.2(47)进行分析。使用集成在所用版本MaxQuant中的Andromeda进行数据库搜索。搜索针对UniProt人类数据库(2018年9月，UP000005640，73099条记录)进行。此外，使用了一个包含常见污染物的数据库。搜索采用胰蛋白酶切割特异性，允许三次错切。蛋白质鉴定在错误发现率(FDR；蛋白质和肽段水平上FDR<1%)控制下进行。除MaxQuant默认设置外，搜索针对以下可变修饰进行:蛋白质N端乙酰化、谷氨酰胺到焦谷氨酸形成(N端谷氨酰胺)、氧化(甲硫氨酸)、磷酸化(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)和甘氨酰甘氨酸(赖氨酸)。将氨甲酰甲基(半胱氨酸)设置为固定修饰。使用内部开发的R脚本进行进一步数据分析。对照样品中缺失的LFQ强度用接近基线的值进行估算。数据估算使用来自标准正态分布的值，均值为合并后的 转换后LFQ强度的5%分位数，标准差为0.1。为了鉴定显著富集的蛋白质，在至少300个蛋白质的强度区间中识别箱线图异常值。分别将样品与对照的 转换后蛋白质比率值超出 (显著性1)或 (显著性2)四分位数间距(IQR)的视为显著富集。蛋白质组学数据存于PRIDE数据库(提交编号#616633)。
细胞增殖评估
将每种测试细胞系的100,000个细胞接种到6孔板的每孔中，培养至其中一孔接近汇合。细胞用PBS洗涤，并用1%多聚甲醛在室温下固定 ，去除多聚甲醛，向每孔中加入 结晶紫溶液(Sigma)，并在室温下孵育 。固定后的细胞用 PBS洗涤三次以去除残留的结晶紫溶液，然后对孔进行扫描以进行定量分析。
集落形成试验
将每种测试细胞系的5000个细胞与低熔点琼脂糖(终浓度0.25%)在 DMEM培养基中充分混合，接种到6孔板的一孔中(预先用 普通琼脂糖包被)，并培养7天直至形成集落。
免疫荧光
细胞在6孔板中的 圆形玻片上培养，用1%多聚甲醛在PBS中于室温下固定10分钟，用1%牛血清白蛋白(Sigma，在TBST中)通透/封闭20分钟。加入一抗(1:100 - 1:1000)并在室温下孵育 ，然后在三次PBS洗涤后加入二抗(1:100)并在室温下孵育1 - 4小时。玻片进一步用含DAPI的封片剂封片，用指甲油密封，并在 黑暗中保存。
EdU/EU掺入
细胞在6孔板中的 圆形玻片上培养，在用1%多聚甲醛在室温下固定10分钟之前，用EdU( )或EU( )处理20分钟，并用0.3% Triton - X100(在TBS中)通透10分钟。通过加入 磺基 - Cy3 - 叠氮化物、100 mM抗坏血酸钠(在PBS中)进行点击反应，并在黑暗中于室温下孵育30分钟，然后用PBS洗涤三次，进一步用含DAPI的封片剂封片，用指甲油密封，并在 黑暗中保存。
邻近连接分析
细胞在6孔板中的 圆形玻片上培养，用1%多聚甲醛在室温下固定10分钟。细胞用0.3% Triton - X100(在TBS中)通透20分钟，并用2.5%牛血清白蛋白在TBST中封闭。根据制造商的说明(Sigma)，使用Duolink®原位检测试剂红色或绿色试剂盒进行分析。对于用抗生物素抗体的PLA，在与抗体孵育之前，按照“EdU/EU掺入”部分所述进行点击反应(用生物素 - 叠氮化物代替磺基 - Cy至 - 叠氮化物)。
实时定量PCR
根据制造商的方案，用TRIzol试剂(Sigma)提取总RNA，并加入DNase I(NEB)以去除残留的DNA。根据制造商的方案，用M - MLV逆转录酶(Promega)逆转录生成cDNA。将靶mRNA的表达水平标准化为 - 肌动蛋白的表达水平。引物序列见补充表S1。
DUB活性分析
从6孔板收集的细胞沉淀用PBS洗涤，并在含有1:1000蛋白酶和磷酸酶抑制剂的PBS中的 Triton-X100中于冰上裂解 ，然后在 和 下离心 。上清液与含有或不含有 浓缩探针(VS/VME-泛素，UbiQ)的 PBS在室温下孵育5分钟。通过加入 Laemmli上样缓冲液终止反应，并在 孵育 使蛋白质变性，然后通过免疫印迹分析。
泛素下拉分析
将MYC、His标签泛素和USP28变体的表达载体用PolyJet转染试剂(SignaGen Laboratories)转染到HeLa细胞系中。转染12小时后，更换细胞培养基。转染48小时后，收集细胞并在室温下于 尿素缓冲液( 尿素，PBS中的 咪唑)中裂解。裂解物短暂超声处理，然后在室温下以13000 rpm离心 以澄清。上清液在室温下与 - NTA磁珠(Cube Biotech，50%悬液)进一步孵育过夜并旋转。磁珠离心，用尿素缓冲液洗涤两次，在 用4X Laemmli上样缓冲液变性10分钟，然后在Bis-Tris凝胶上分离并进行免疫印迹分析。
新生染色质捕获分析
新生染色质捕获分析如前所述(48)进行，略有修改。细胞在低渗缓冲液(50 mM KCl，10 mM HEPES)中用生物素-16-dUTP和生物素-16-dCTP(各0.5 µM，Jena Bioscience)混合物处理5分钟，然后在常规DMEM培养基中再进行5分钟dUTP/dCTP处理(对于依托泊苷处理的样品，在dUTP/dCTP处理前20分钟加入依托泊苷并保持至细胞固定)。然后细胞在室温下用0.2% PFA固定5分钟，并用 甘氨酸共孵育1分钟淬灭。细胞与蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Sigma，1:1000)一起重悬于TNT-300缓冲液(Tris-HCl pH 7.4，300 mM NaCl，1% Triton-X100)中，超声处理(30%振幅，45秒开/15秒关，共10分钟)，然后在室温下在旋转轮上与 链霉亲和素磁珠(50%悬液，NEB)孵育45分钟。磁珠通过离心收集，用TNT-300缓冲液洗涤三次。样品在 用 Laemmli上样缓冲液孵育 使其变性，然后通过免疫印迹分析。
DNA纤维分析
纤维分析如前所述进行(49)。简要地说，细胞在每个 与 IdU一起孵育，随后在 与 一起孵育。收获后，细胞在PBS中重悬并转移到盖玻片上，加入裂解液(200 mM Tris pH 7.5、50 mM EDTA、0.5% SDS)，玻片倾斜晾干以使DNA在玻片上展开。在用2.5 M HCl孵育100分钟之前，先用预冷的甲醇:乙酸(2:1)固定DNA。玻片封闭后，用抗IdU和CldU抗体对DNA纤维进行染色。为了进行定量，使用ImageJ测量DNA纤维长度，并使用以下公式将其转换为叉速:1 。
中性彗星试验
用胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies)使细胞脱离，将沉淀(含10000 - 20000个细胞)用PBS洗涤，并重悬于 的 低熔点琼脂糖中以获得单细胞悬液。将 的混合物滴加在预先用0.8%普通琼脂糖包被的载玻片上，并用盖玻片覆盖。凝固后，再加入 的0.7%低熔点琼脂糖作为顶层覆盖。细胞在裂解液(2.5 M NaCl、0.1 M EDTA、10 mM三羟甲基氨基甲烷碱pH = 10、1% N-月桂酰肌氨酸、0.5% Triton X-100、最终10% DMSO)中于 黑暗中裂解过夜，然后在含 的TAE缓冲液中进行1小时的电泳。然后用无水乙醇固定细胞，并用溴化乙锭( 于水中)染色用于显微镜观察。
切割与运行
使用CUT&RUN分析试剂盒(CST)按照制造商的建议对经多聚甲醛(PFA)固定的细胞进行Cut&Run分析。简而言之，将100万个经0.2% PFA固定的细胞用 洗涤缓冲液(20 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，0.5 mM亚精胺，蛋白酶/磷酸酶抑制剂1:1000)洗涤，2%留作输入样本。其余细胞在室温下与 伴刀豆球蛋白A包被的磁珠(G生物科学公司，预洗涤并重悬于C&R结合缓冲液(20 mM HEPES，pH 7.5，10 mM KCl，1 mM CaCl2，1 mM MnCl2))一起孵育10分钟，期间旋转。样本用洗涤缓冲液洗涤，沉淀与抗LEO1抗体或IgG在 抗体缓冲液(C&R TritonX洗涤缓冲液和 EDTA)中于 在摇床上以 孵育过夜。随后，磁珠用C&R TritonX洗涤缓冲液(含0.1% TritonX - 100的C&R洗涤缓冲液)洗涤，并在150 μl C&R TritonX洗涤缓冲液中与蛋白A/G - MNase(1:2000，CST)于 以 孵育 。磁珠再用TritonX洗涤缓冲液和低盐冲洗缓冲液(20 mM HEPES，pH 7.5，0.5 mM亚精胺，0.1% TritonX - 100)洗涤，然后在 孵育缓冲液 HEPES，pH 7.5， TritonX - 100)中于 孵育 。之后，磁珠在 终止缓冲液 EGTA，0.1% TritonX - 100，50 μg/ml RNase A)中于 孵育30分钟以释放DNA片段。上清液在 与2 μl 10% SDS和5 μl蛋白酶K一起孵育过夜，随后进行酚/氯仿/异戊醇提取。DNA在无水乙醇和GlycoBlue中于 - 沉淀过夜，然后溶于水中用于qPCR。对于输入样本，它们在 TE缓冲液 Tris - HCl，pH 8.0，1 mM EDTA)中加入250 mM NaCl和0.5% SDS于 以以下参数超声处理以获得片段化DNA:100%循环，30%振幅，45秒开/15秒关，持续 。随后，样本在 与1 RNase A于 孵育 ，然后在同一缓冲液中与 蛋白酶 混合并于 孵育过夜。之后，样本按上述方法提取和沉淀用于qPCR。
RNA测序
使用TRIzol试剂(Sigma)按照制造商的方案提取总RNA，并加入DNase I(NEB)以去除残留的DNA。根据NEBNext® Ultra™ RNA文库制备试剂盒(用于Illumina®)(E7530)和NEBNext®多重寡核苷酸(用于Illumina®)(双索引引物集1)(E7600)的制造商方案，对纯化RNA的 进行处理。文库在Illumina Novaseq 6000仪器上进行测序。使用STAR(50)对fastq文件进行比对，并使用EdgeR(51)鉴定差异表达基因。本出版物中讨论的RNA测序数据已存入NCBI的基因表达综合数据库，可通过GEO系列登录号GSE213892访问(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE213892)。
图像分析
使用免费软件FIJI/ImageJ 1.53f版本(https://imagej.net/software/fiji/)自动分析图像。简而言之，基于DAPI通道中的核区域对图像进行分割，然后，针对每个细胞核测量其他通道(免疫荧光测定和EdU/EU掺入测定)中的染色强度或(PLA测定)中的病灶数量。对于PLA，在使用“查找最大值”命令计算PLA病灶数量之前，通过最大强度投影将多个z层组合成单个图像。对于中性彗星试验，使用免费插件“OpenComet”(https://cometbio.org/)。
统计分析
使用GraphPad Prism 9(GraphPad软件公司)进行统计分析。对于两组之间的比较，根据数据的正态分布使用双尾、不成对t检验或Mann-Whitney检验；对于多组之间的比较，根据数据的正态分布使用普通单因素方差分析，然后进行合适的事后检验或Kruskal-Wallis检验。使用非线性拟合模型-单相衰减来确定蛋白质半衰期。使用线性回归进行相关性分析。样本量和 值显示在图注中。
结果
USP28的二聚化控制MYC的周转
MYC的泛素化部分通过破坏MYC与延伸因子PAF1c的复合物来控制其转录功能(27)。USP28的缺失促进MYC泛素化(45)，预测在USP28缺陷细胞中MYC-PAF1相互作用减弱且MYC靶基因表达增强。为了验证这一假设，我们使用CRISPR在肝癌(HCC)细胞系HLF中删除USP28基因(补充图S1A)。USP28的缺失下调了MYC蛋白，而相关去泛素化酶USP25的敲除不影响MYC水平(补充图S1B)。环己酰亚胺试验证实USP28敲除降低了MYC蛋白稳定性(补充图S1C)。RNA-seq分析表明，USP28的缺失使MYC依赖性转录失调 - 在4205个失调基因中，已知的MYC结合和调控基因是富集程度最高的组(图1A；补充图S1D)。这伴随着MYC与PAF1c亚基CDC73、CTR9和PAF1的结合显著减少(图1B)，与先前的观察结果一致(27)。
在体外和细胞内，USP28形成同二聚体，二聚化界面内的关键亮氨酸单点突变(L545E)可破坏该二聚体(42,43)。为了分析USP28二聚化对MYC调控的影响，我们使用慢病毒转导，用HA标签的野生型(USP28-WT)或单体(USP28-M)USP28等位基因重建了USP28缺陷的HLF细胞。通过针对USP28和MYC的抗体进行PLA分析确定，两种USP28变体均定位于细胞核(补充图S1E)并与内源性MYC相互作用(补充图S1F)。与野生型USP28相比，单体USP28对HLF细胞以及从自发肿瘤建立的p19Arf缺陷、Nras转化的小鼠肝癌细胞系(p19-/-Nras)中的MYC具有更强的稳定作用(44)。在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和HeLa细胞中也获得了类似结果(图1C和D；补充图S1，G和H)。另一种USP28底物Jun也被USP28-M稳定(补充图S1H)，表明二聚化可减弱USP28在各种细胞环境中对不同底物的催化活性。与此观点一致，用DUB反应探针Ub-VME和Ub-VS(52,53)孵育表达USP28-WT或USP28-M的细胞裂解物，发现单体USP28向Ub修饰形式的转化更完全(图1E)。
在用表达MYC、His标签泛素和USP28变体的载体转染的USP28-KO HeLa细胞(45)中进行的泛素下拉分析表明，与野生型USP28相比，USP28-M更有效地促进了MYC的去泛素化(图1F；补充图S1I)。由于USP28可以拆解降解性的K48和K11连接的泛素链(53,54)，我们使用带有K48或K11作为唯一内部泛素受体的His-Ub变体进行下拉分析，比较了USP28的活性。USP28-M比USP28-WT更强烈地减弱了K11连接链的MYC-Ub信号，而两种变体对MYC偶联的K48链的减少作用相似(图1G)。为了控制这些分析中内源性泛素的贡献，我们使用针对CDC34A和CDC34B的两种shRNA敲低了CDC34，CDC34是与FBW7(SCF) E3复合物一起作用以在MYC上组装K48链的E2酶(46,55)。CDC34的缺失降低了USP28-WT对MYC偶联的K11链上的作用，而USP28-M仍然有效地使MYC去泛素化(补充图S1J)。我们得出结论，USP28的二聚化限制了其活性，主要是对K11连接的泛素链的活性。
USP28单体刺激DNA复制
与对MYC周转的影响一致，PLA实验表明，与USP28-WT相比，在表达USP28-M的细胞中MYC-PAF1c相互作用增强(图2A，补充图S2A)。用针对PAF1c亚基LEO1的抗体进行的Cut&Run分析表明，与USP28-WT相比，在表达USP28-M的细胞中，PAF1c对MYC靶启动子的募集增加(图2B)。出乎意料的是，转录组分析表明，USP28-WT和USP28-M在USP28-KO细胞中的表达同样调节了MYC靶基因的表达(图2C)。相反，USP28-WT和USP28-M在标准生长条件下和软琼脂中对集落形成的影响明显不同(尽管在不同细胞系中有所变化，补充图S2，B、C和D)，这表明USP28-M对MYC的异位稳定作用在很大程度上具有非转录效应。
MYC和PAF1c在DNA复制中都具有转录非依赖性功能(21,22,28)。特别是，PAF1c有助于解决TRCs并在应激条件下促进DNA复制(28)。用抗pS5-RNAPII和PCNA抗体进行的PLA分析以评估TRCs(56)表明，与USP28-WT相比，USP28-M的表达降低了冲突发生率(图2D)。此外，与USP28-WT细胞相比，表达USP28-M的细胞显示EdU掺入率提高(图2E)，表明DNA复制加速。新生染色质捕获分析(48)显示，USP28-M细胞中新生DNA上RNAPII和CTR9的富集增加(图2F)，表明单体USP28在RNAPII/PAF1c结合位点附近刺激DNA复制。CTR9的缺失消除了USP28-M细胞中EdU掺入的增加(图2E；补充图S2E)，表明USP28-M通过PAF1c刺激DNA复制。
单体USP28诱导复制依赖性DNA损伤
失调的DNA复制会导致基因组不稳定(57,58)。因此，我们使用免疫印迹和免疫荧光分析比较了表达USP28-WT和USP28-M的细胞中 (一种DNA损伤标志物)的水平。与USP28-WT相比，USP28-M的表达上调了 水平(图3A和B；补充图S3A和B)。PAF1c的敲低降低了 水平，这与对DNA复制的影响一致(图3A和B；补充图S3，A和B)。重要的是，添加过量胸苷(其抑制核糖核苷酸还原酶并阻断DNA合成(59))减少了表达USP28-M的细胞中 的增加(图3C)。血清剥夺使细胞周期停滞也降低并使两种细胞系中的 水平相等(补充图S3C)，表明单体USP28诱导的DNA损伤需要DNA复制。
使用中性彗星试验(60)评估DNA断裂显示，与USP28-WT相比，表达USP28-M的细胞中DSBs水平增加(图3D)。PAF1c亚基的缺失逆转了这种效应(图3D)，表明在表达USP28-M的细胞中PAF1的异位募集是DNA损伤诱导的基础。至于 水平，添加胸苷减少了USP28-M细胞中的彗星尾长度(图3E)，表明这些细胞中的DNA损伤取决于DNA复制。
二聚化结构域内的USP28突变发生在多种人类癌症中(61)，并且可能影响二聚体形成。为了测试几种此类突变对USP28二聚化的影响，我们表达了FLAG标签的USP28-WT和HA标签的USP28野生型或突变等位基因，并用HA抗体进行免疫沉淀。分析的突变体，尤其是R519W，显示形成二聚体的能力降低(补充图S3D)。这一结果在使用FLAG和HA标签抗体的PLA实验中得到证实(补充图S3E)。重要的是，R519W变体的表达上调了 水平(补充图S3F)，表明癌症相关突变可损害USP28二聚化并导致肿瘤细胞中的基因组不稳定。
图1. USP28的二聚化控制MYC的稳定性及其与PAF1c的相互作用。(A) 与HLF对照(USP28-Ctrl)细胞相比，HLF USP28-KO细胞中基因表达的RNA测序分析。根据Enrichr门户(98)的分析，突出显示了Encode TF ChiP和MsigDB数据集中富集程度最高的前几组。另见补充图S1D。(B) 在HLF USP28-Ctrl/KO细胞中，使用抗MYC和PAF1c亚基(CDC73/CTR9/PAF1)的抗体或非特异性logG对照抗体(logG)进行的PLA分析。定量显示了来自三个独立生物学重复实验 的一个代表性实验的数据点。至少对71个细胞进行了定量分析。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较，****P < 0.0001。比例尺 = 10 µm。(C) 用环己酰亚胺(100 μg/ml)处理指定时间点后，对表达USP28-WT或USP28-M的USP28-KO HLF细胞进行免疫印迹分析。图像显示了来自三个独立生物学重复实验 的一个代表性实验。MYC蛋白半衰期通过非线性拟合模型确定。右图显示了三个独立生物学重复实验的平均值。误差条表示标准差。(D) 根据图(C)、图S1B及重复实验所示数据计算得出的HLF USP28-Ctrl、USP28-KO或用USP28-WT或USP2B-M变体重构的USP28-KO细胞中MYC的半衰期。(E) 在表达USP28-WT或USP28-M的HLF细胞全细胞裂解物中进行去泛素化酶活性分析。图像显示了一个代表性实验 。星号表示Ub-VS/VME修饰的USP2E。下图显示了三个独立生物学重复实验的平均值 。数据采用双尾、不成对 检验进行分析，*****P 0.0001。(F) 对表达MYC、WT His-Ub和USP28-WT/M的HeLa USP28-KO细胞进行泛素下拉分析。图像显示了一个代表性实验 。右图显示了四个独立生物学重复实验的平均值。数据采用普通单因素方差分析，随后对选定的配对进行Tukey多重比较检验，**P < 0.01，***P < 0.0001，****P < 0.0001。 对表达MYC、仅K48或仅K11 His-Ub和USP28-WT/M的HeLa USP28-KO细胞进行泛素下拉分析。图像显示了一个代表性实验(n = 2)。
图2. USP28二聚化限制PAF1c募集到染色质并限制DNA复制。(A) 在表达Usp28-WT/M或对照载体的HLF USP28-KO细胞中，用抗MYC、CDC73或IgG抗体进行的PLA分析。定量显示一个代表性实验的数据点(n = 2)。至少对67个细胞进行了定量。数据用Kruskal-Wallis检验分析，随后对选定的配对进行Dunn多重比较， ，**P < 0.01，****P < 0.0001。比例尺 = 10 µm。(B) 进行Cut&Run分析，然后进行qPCR分析，显示在表达USP28-WT或USP28-M的HLF USP28-KO细胞中，PAF1c亚基LEO1在MYC靶启动子上的丰度。定量显示一个代表性实验的数据点 。数据来自三个技术重复，对每对进行双尾、不成对 检验分析，** ， 。(C) 在表达USP28-WT或USP28-M的HLF USP28-KO细胞中，对MYC靶基因子集(MsigDB Hallmark集MYC靶标V1)的调控(log2FC)。Pearson相关系数r等于0.95。(D) 在表达USP28-WT/M的HLF USP28-KO细胞中，用抗pS5-RNAPII和PCNA或对照IgG抗体进行的PLA分析。定量显示一个代表性实验的数据点( )。至少对95个细胞进行了定量。数据用双尾Mann-Whitney检验分析， 。比例尺 。(E) 在表达shCtrl/shCTR9的HLF USP28-WT或USP28-M细胞中进行EdU掺入分析。至少对72个细胞进行了定量。定量显示一个代表性实验的数据点 。数据用Kruskal-Wallis检验分析，随后对选定的配对进行Dunn多重比较， ，无显著性差异 。比例尺 。(F) 对从HLF USP28-WT或USP28-M细胞裂解物中捕获的新生染色质上的RNAPII和CTR9蛋白水平进行免疫印迹分析。图像显示一个代表性实验 。
图3. 单体USP28诱导依赖复制的DNA损伤。(A)免疫印迹分析记录了用shCtrl/shCTR9处理的HLF USP28-WT或USP28-M细胞中 H2AX水平。图片展示了一个代表性实验(n 3)。(B)免疫荧光分析记录了表达shCtrl或shCTR9的HLF USP28-WT或USP28-M细胞中 H2AX信号强度。定量分析显示了一个代表性实验的数据点 。至少对122个细胞进行了定量。数据用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较分析，**** *P < 0.0001，ns P > 0.05。比例尺 = 10 µm。(C)用γH2AX抗体对用胸苷(2 mM)或溶剂对照处理2小时的USP28-WT或USP28-M细胞进行免疫荧光分析。定量分析显示了一个代表性实验的数据点 。至少对155个细胞进行了定量。数据用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较分析，**P 0.01，****P 0.0001。比例尺 。(D)对用shCtrl/shCTR9/shCDC73处理的USP28-WT或USP28-M细胞进行中性彗星试验。定量分析显示了一个代表性实验的数据点( )。至少对18个细胞进行了定量。数据用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较分析， ，ns 。比例尺 。(E)对用胸苷 或溶剂对照处理 的USP28-WT或USP28-M细胞进行中性彗星试验。定量分析显示了一个代表性实验的数据点 。至少对27个细胞进行了定量。数据用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较分析， ，ns 。
DDR信号传导减弱USP28二聚化
先前的研究表明，USP28催化功能由DDR信号传导激活(40,41,62)，这使我们推测USP28单体的形成可能是DDR期间USP28激活的基础。为了验证这一想法，我们构建了稳定表达HA和GFP标记的USP28蛋白的p19-/-Nras细胞系(补充图S4A)，并分析了用依托泊苷处理前后这些蛋白的相互作用，依托泊苷可增加MYC蛋白水平(63)。用HA和GFP抗体进行的PLA分析在未受应激的细胞中显示出强烈信号，在用依托泊苷或其他基因毒素处理后减弱(图4A；补充图S4B)，表明USP28二聚体的破坏是DDR中的常见事件。免疫沉淀分析(图4B，补充图S4C)以及对转染野生型USP28的HeLa细胞裂解物进行的天然凝胶电泳(补充图S4D)支持了这一观点。由于USP28是顶端DDR激酶ATM的靶点(41)，我们测试了ATM抑制对USP28二聚体的影响。用特异性ATM抑制剂KU-55933处理可防止依托泊苷诱导的USP28二聚体解离(补充图S4E，与补充图S4B比较)，表明遗传毒性应激时ATM的激活导致Usp28单体的形成。
图4. DNA损伤会削弱USP28的二聚化。(A) 在表达带有或不带有依托泊苷(5 M，30分钟)处理的GFP和HA标签的USP28的p19 Nras细胞中，使用抗GFP和HA标签的抗体进行PLA分析。定量显示了一个代表性实验的数据点(n = 3)。至少对26个细胞进行了定量。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较分析，*** 。标尺 。(B) 在表达HA和GFP标记的USP28的p19 Nras细胞中，用DMSO或依托泊苷(5 μM，30分钟)处理后，用GFP抗体进行免疫沉淀分析。右图显示了三个独立生物学重复的平均值 。数据采用双尾、非配对 检验分析，** 。(C) 用依托泊苷(5 μM)处理指定时间点的HLF USP28-Ctrl/KO细胞的免疫印迹分析。图像显示了一个代表性实验 。(D) 在转染了MYC和野生型或仅K11的His-Ub的HeLa细胞中，在依托泊苷(5 μM，30分钟)处理前后进行His-Ub下拉分析。图像显示了一个代表性实验(n = 3)。(E) 在有或没有依托泊苷(5 μM，30分钟)处理的HLF USP28-Ctrl细胞中进行DUB活性分析。星号显示Ub-VS/VME修饰的USP28。右图显示了四个独立生物学重复的平均值 。数据采用双尾、非配对 检验分析， 。(F) 记录在指定时间点用依托泊苷(5 μM)处理的HLF USP28-WT/M细胞中MYC蛋白水平的免疫印迹。右图显示了三个独立生物学重复的平均值 。线性回归分析表明回归线的斜率有显著差异 。误差条表示标准差。
用依托泊苷处理导致HLF和p19 -/- Nras细胞中MYC蛋白积累(图4C，补充图S4F)，而MYC mRNA没有受到显著影响，排除了转录调控(补充图S4G)。在USP28基因敲除细胞中MYC水平没有增加，这表明在依托泊苷处理下，MYC以USP28依赖的方式被稳定(图4C)。HeLa细胞中的泛素下拉分析表明，与用DMSO处理的细胞相比，用依托泊苷处理的细胞中MYC的泛素化减少(图4D)。USP28基因敲除消除了这种效应，表明依托泊苷通过USP28减少MYC的泛素化(补充图S4H)。与此一致，用DUB反应探针孵育总细胞裂解物显示，依托泊苷处理后USP28的活性更高(图4E)。依托泊苷没有增加表达单体USP28的细胞中MYC的丰度，这些细胞的基础MYC水平升高(图4F；补充图S4F)，这表明依托泊苷处理后MYC的稳定涉及USP28单体的形成。
53BP1控制USP28的二聚化和催化活性
USP28的一个主要结合伙伴是53BP1，它可以将USP28招募到DNA损伤位点(41,64)。我们的质谱分析和后续免疫沉淀试验表明，USP28在未受应激的细胞中与53BP1相互作用(补充图S5A和B)，这表明53BP1-USP28复合物在未受干扰的细胞周期中发挥作用(41,65)。引人注目的是，PLA和免疫沉淀试验表明，53BP1选择性地结合野生型而非单体USP28(图5A和B；补充图S5C)。依托泊苷处理以ATM依赖的方式减少了53BP1-USP28的相互作用(图5B；补充图S5D)，这与USP28二聚体的破坏相关。在p19-/-Nras细胞中耗尽53BP1会减少USP28二聚化(图5C；补充图S5E)，模拟了依托泊苷的作用。在依托泊苷处理的shCtrl细胞中，ATM抑制增加了USP28二聚化，但在sh53BP1细胞中没有增加(补充图S5F)，这表明与53BP1的相互作用可以稳定USP28二聚体，而ATM会拮抗这种作用。
由于USP28单体对MYC的活性更高，我们比较了在表达shCtrl和sh53BP1的HLF细胞中USP28的催化活性。用Ub-VME/Ub-VS探针孵育总细胞裂解物表明，耗尽53BP1会刺激USP28去泛素酶活性(图5D，补充图S5G)，而USP28的丰度没有变化(补充图S5H和I)。在53BP1基因敲除的HeLa细胞(补充图S5H和I)中，用野生型或仅含K11的泛素进行His标签泛素下拉试验，结果显示在53BP1基因敲除的HeLa细胞中MYC的泛素化减少(图5E)。与此一致，53BP1的缺失增加了MYC的稳态水平并稳定了MYC蛋白，而MYC mRNA水平略有降低(图5F；补充图S5H和J)。我们得出结论，耗尽53BP1会促进USP28单体的形成并稳定MYC。
耗尽53BP1会刺激DNA复制和复制依赖性DNA损伤
与USP28基因敲除的影响相反，耗尽53BP1会刺激MYC与PAF1c的相互作用(图6A，补充图S6A)。重要的是，在表达sh53BP1的USP28基因敲除细胞中，这种效应被消除了，这表明在53BP1缺陷细胞中USP28的激活是增强的MYC-PAF1c相互作用的基础。敲低53BP1也会刺激PAF1c与pS5-RNAPII的相互作用(补充图S6B)，这与53BP1限制PAF1c在活性启动子处积累的观点一致。用抗pS5-RNAPII和PCNA的抗体进行的PLA试验表明，与shCtrl相比，sh53BP1细胞中的邻近对减少了(图6B)，这表明在没有53BP1的情况下TRCs的发生率较低。与对照相比，在耗尽53BP1的细胞中EdU掺入增加了(图6C)，这模拟了USP28-M细胞的表型(图2E)。USP28基因敲除可逆转增强的EdU掺入(补充图S6C)，这与53BP1缺失时异位DNA合成由USP28介导的模型一致。
53BP1的缺失通过同源重组(HR)激活BRCA1依赖的DNA修复(66)，这可能会刺激53BP1缺陷细胞中的EdU掺入。为了估计我们试验中HR的程度，我们用米林处理细胞，米林是HR所需的Mre11核酸外切酶活性的抑制剂(67)。米林仅略微降低了sh53BP1细胞中的EdU掺入(补充图S6D)，这表明HR对53BP1基因敲除后增强的DNA合成没有显著贡献。
53BP1的缺失增加了 的水平(图6D)，而胸腺嘧啶孵育可使其恢复(图6D)，这表明存在复制依赖性DNA损伤。同样，中性彗星试验显示，与shCtrl细胞相比，sh53BP1细胞中的DNA断裂水平升高(图6E)，添加胸腺嘧啶可使其恢复(图6E)。重要的是，USP28的缺失减轻了由53BP1敲低诱导的 水平增加和彗星尾长增加(补充图S6E和F)，这表明USP28的激活导致53BP1缺陷细胞中的DNA断裂。
依托泊苷通过53BP1和USP28引发短暂的复制反应
在对照细胞中，用依托泊苷处理可刺激PAF1c募集至MYC，而在sh53BP1或USP28基因敲除细胞中的影响可忽略不计(图7A)。此外，依托泊苷可降低shCtrl细胞中的TRCs(RNAPII-PCNA PLA对)，但在sh53BP1细胞中则不然(图7B)，这表明在基因毒性应激下，53BP1从USP28二聚体上解离可促进PAF1c募集并解决TRCs。在依托泊苷处理的shCtrl和sh53BP1细胞中，RNA合成均减少(补充图S7A)，这表明转录并非导致两种细胞系中TRCs产生差异效应的原因。
由于USP28-M和sh53BP1细胞中TRCs的减少伴随着DNA合成的增强，我们评估了在短时间(30分钟)暴露于依托泊苷后不同时间点的EdU掺入情况。在处理释放后16小时，DNA合成减少(图7C)，这可能反映了DNA损伤诱导的细胞周期停滞。相反，在依托泊苷释放后立即，与未受挑战的细胞相比，EdU掺入增加(图7C)。在后期时间点，Mre11抑制对EdU掺入有强烈影响，但在依托泊苷释放后早期则不然(补充图S7B)，这表明同源重组介导的修复对依托泊苷诱导的DNA合成贡献不大。
DNA纤维分析表明，依托泊苷可减缓复制叉的进展(图7D)。然而，被鉴定为新起点的纤维比例在处理后显著增加(图7E)，这表明依托泊苷诱导的EdU掺入是由于异位起点激活。依托泊苷在USP28基因敲除细胞中不刺激EdU掺入(补充图S7C)。sh53BP1和USP28-M均提高了基础EdU掺入，但减弱了依托泊苷在HLF细胞中的作用(图7F，补充图S7D)。在HeLa细胞中删除53BP1也消除了依托泊苷诱导的DNA合成(补充图S7E)，这表明在不同细胞环境中，基因毒性应激可通过依赖53BP1的方式诱导DNA复制。在shCtrl细胞中，ATM抑制减弱了依托泊苷处理后EdU掺入的增加，但在sh53BP1细胞中则不然(补充图S7F)，这与对USP28二聚体的影响相关(补充图S4E)。用10074-G5化学抑制MYC-Max相互作用(68)以及敲低CTR9和CDC73也降低了依托泊苷诱导的DNA合成(图7G和H；补充图S7G)，这表明MYC对PAF1c的募集至少部分介导了这种反应。新生染色质捕获分析显示，在用依托泊苷处理表达USP28-WT的细胞后，RNAPII和CTR9在新生DNA上积累。在表达USP28-M的细胞中，依托泊苷的这种作用减弱，这表明在基因毒性应激下的异位DNA合成涉及USP28单体的形成(图7I)。
图5. 53BP1控制USP28二聚化和催化活性。(A) 用抗53BP1抗体或对照IgG对表达野生型 (WT) 或单体 (M) USP28的HLF细胞进行免疫沉淀分析。图片显示了一个代表性实验 ( )。(B) 用抗53BP1抗体和HA标签对HLF USP28-KO/WT/M细胞进行PLA分析，用二甲基亚砜 (DMSO) 或依托泊苷 (5 μM，30分钟) 处理。定量显示了一个代表性实验的数据点 ( )。至少对71个细胞进行了定量。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较 ( )。(C) 用抗GFP抗体和HA标签对用sCtrl/sh53BP1处理的inp Nras细胞进行PLA分析，用二甲基亚砜 (DMSO) 或依托泊苷 (5 μM，30分钟) 处理。定量显示了一个代表性实验的数据点 ( )。至少对42个细胞进行了定量。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较，***P < 0.0001。(D) 在HLF sh53BP1细胞中进行去泛素化酶活性分析。星号表示Ub-VS/VME修饰的USP28。右图显示了三个独立生物学重复的平均值 ( )。数据采用普通单因素方差分析，随后对选定的配对进行Tukely多重比较，**P *** 。(E) 在HeLa细胞中进行His-Ub下拉分析，用MYC、WT-Ub或仅K11的His-Ub转染，显示有无53BP1敲除时MYC的去泛素化。图片显示了一个代表性实验 ( )。(F) 对用放线菌酮 ( ) 处理指定时间点的HLF shCtrl/sh53BP1细胞中的MYC蛋白水平进行免疫印迹分析。右图显示了三个独立生物学重复的平均值 ( )。误差条表示标准差。
图6. 敲低53BP1可减少TRCs并刺激DNA合成。(A) 在HLF USP28-Ctrl/KO细胞中，使用针对MYC和CDC73/IgG的抗体进行PLA分析，shCtrl/sh53BP1处理。定量显示一个代表性实验的数据点(n )。至少对70个细胞进行了定量。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较，** P < 0.01，*** *P < 0.0001，ns P > 0.05。(B) 在HLF shCtrl/sh53BP1细胞中，使用针对pS5-RNAPII和PCNA/IgG的抗体进行PLA分析。定量显示一个代表性实验的数据点 。至少对101个细胞进行了定量。数据采用双尾Mann-Whitney检验， 。(C) 在HLF shCtrl/sh53BP1细胞中进行EdU掺入分析。定量显示一个代表性实验的数据点 。至少对69个细胞进行了定量。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较，**** 。标尺 。(D) 在有或没有胸苷处理(2 mM，2小时)的HLF shCtrl/sh553BP1细胞中，使用 H2AX抗体进行免疫荧光分析。定量显示一个代表性实验的数据点 。至少对60个细胞进行了定量。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较， 。标尺 。(E) 中性彗星实验显示有或没有胸苷处理(2 mM，2小时)的HLF shCtrl/sh53BP1细胞中的双链断裂。定量显示一个代表性实验的数据点 。至少对34个细胞进行了定量。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较， 。标尺 。
然后，我们测试了其他基因毒素对DNA合成的影响。用拓扑替康或博来霉素分别处理HLF细胞，它们分别诱导单链和双链断裂，刺激了EdU掺入(图7J)，这表明DNA复制的短暂刺激是对基因毒性应激的常见早期反应。
依托泊苷诱导的DNA合成会传播DNA损伤
在表达 sh53BP1 和 USP28-M 的细胞中观察到，依托泊苷处理后异位 DNA 复制可能促进 DNA 断裂(图 3 和图 6)。支持这一观点的是，PLA 分析显示，短暂暴露于依托泊苷后，EdU 标记后 与新生 DNA 的结合显著增加(补充图 S8A)。为了直接测试 DNA 复制对依托泊苷诱导的 DNA 断裂的影响，我们单独用依托泊苷或与胸苷联合处理细胞。免疫荧光分析表明，与胸苷共同处理可减少依托泊苷诱导的 水平升高(图 8A)。中性彗星试验显示，与单独使用依托泊苷处理相比，与胸苷共同处理的细胞中 DNA 断裂减少(图 8B)，这表明依托泊苷对 DNA 复制的异常刺激会加剧 DNA 损伤。胸苷还降低了依托泊苷诱导的细胞毒性，并促进了 HLF、p19 -/- Nras 和 HeLa 细胞的长期存活(图 8C；补充图 S8B)。在抑制 CDC7 激酶时也观察到类似的效果，CDC7 激酶是 DNA 复制起始所特需的(69)(图 8D)。相反，抑制 PARP1 以加速 DNA 复制叉的进展(58)，增加了依托泊苷在 HLF、p19 -/- Nras 和 HeLa 细胞中介导的细胞毒性(补充图 S8C)。我们得出结论，对基因毒性应激的早期复制反应会加剧 DNA 断裂并损害细胞活力。
图 7. 依托泊苷通过 53BP1 和 USP28 触发短暂的复制反应。(A) 在有或没有依托泊苷处理(5 μM，30 分钟)的 HLF shCtrl/sh53BP1 或 USP28 - KO 细胞中，用抗 MYC 和 CDC73/IgG 抗体进行 PLA 分析。定量显示一个代表性实验 的数据点。至少对 41 个细胞进行了定量。数据用 Kruskal - Wallis 检验分析，随后对选定的配对进行 Dunn 多重比较； ，ns P > 0.05。(B) 在有或没有依托泊苷处理(5 μM，30 分钟)的 HLF shCtrl/sh53BP1 细胞中，用抗 pS5 - RNAPII 和 PCNA 抗体进行 PLA 分析。定量显示一个代表性实验 的数据点。至少对 44 个细胞进行了定量。数据用 Kruskal - Wallis 检验分析，随后对选定的配对进行 Dunn 多重比较， ，ns 。(C) 在有或没有释放(16 小时)的情况下，用 DMSO 或依托泊苷处理(5 μM，30 分钟)的 HLF 细胞中的 EdU 掺入分析。定量显示
讨论
在这里，我们提供证据表明，USP28 的二聚化减弱了 MYC 的去泛素化，并限制了延伸因子 PAF1c 的募集。在基因毒性应激下，USP28 二聚体解离，导致异位 PAF1c 募集、TRCs 解离和 DNA 合成的短暂刺激。
USP28通过识别特定磷酸化降解基序的常见泛素连接酶SCF(FBW7)与MYC以及其他致癌转录因子(如Jun和Notch)相互作用(70)。USP28也可以直接或通过其他衔接蛋白结合底物(62,71)。虽然FBW7主要组装K48连接的泛素链，但其他MYC泛素连接酶可以连接不同类型的链，包括K63和K11(36,46,70,72 - 75)。我们发现单体USP28具有增强的去泛素化MYC的能力，并且对K11连接的链具有选择性活性，这表明这些链在正常细胞周期中有助于MYC的组成型周转。K11链主要由后期促进复合物Apc/c组装，但也由其他靶向MYC的连接酶组装，包括Huwe1、RNF4、RNF8和β-TrCP(46,72,74,76 - 78)。USP28单体可能类似于Apc/c介导的Claspin周转机制，拮抗这些酶对MYC的泛素化作用(79)。
泛素化对于MYC转录功能至关重要(36,37,39)。特别是，MYC的泛素化促进组蛋白乙酰化、延伸因子pTEFb和PAF1c的募集，以及PAF1c从MYC转移到RNAPII上(27)。PAF1c是一个多价复合物，控制转录暂停、持续延伸、RNA成熟和核输出(80,81)。PAF1c还促进TRC的解析，并通过刺激组蛋白H2B的泛素化促进同源重组依赖性DNA修复(26,28,82,83)。最近有研究表明，PAF1c募集到MYC上依赖于Huwe 1泛素连接酶，并提示其在转录起始位点介导DNA修复(26)。然而，其他研究发现，PAF1c在复制应激下可导致R环积累并促进基因组不稳定(30,31)。我们表明，单体USP28异位稳定MYC可刺激PAF1c的募集和TRC的解析，从而驱动异位DNA合成。这些发现支持并扩展了先前关于MYC驱动的DNA复制的研究，以及最近关于TRC在应激下可限制异位DNA复制并促进DNA修复的报道(21,23,84,85)。
USP28被认为主要以二聚体形式存在(42)，这就提出了一个问题，即是什么诱导USP28单体的形成。我们表明，USP28二聚化受到53BP1的刺激——53BP1是USP28的主要结合伙伴，也是细胞对DNA损伤和复制应激反应中的关键介导蛋白(41,86 - 89)。53BP1选择性地与USP28二聚体相互作用，53BP1的缺失有利于USP28单体的形成，这表明53BP1稳定了USP28的二聚体构象。一致地，53BP1的缺失模拟了单体USP28的表达，增加了PAF1的募集和复制依赖性DNA损伤的积累。
在基因毒性应激下，53BP1-USP28相互作用以ATM依赖的方式减弱，导致USP28单体的形成和MYC的稳定。这可以为DNA损伤和其他应激(如延长的有丝分裂和中心体破坏)时USP28的激活提供一个简单的机制(40,41,64,90 - 92)。基因毒性应激下53BP1-USP28复合物解体的分子基础仍有待研究，但可能涉及53BP1的蛋白酶体降解(93)或其在DNA损伤位点募集到修饰的组蛋白上(3)，这可能在空间上干扰USP28的结合。
一个代表性实验 。至少对69个细胞进行了定量分析。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较分析， 。标尺 。(D)对有或没有依托泊苷处理(5 )的HLF细胞进行DNA纤维分析。定量分析显示了一个代表性实验的数据点 。至少对263条纤维进行了定量分析。数据采用双尾Mann-Whitney检验进行分析， 。标尺 。(E)根据图(D)所示数据对新起始点分数进行定量分析。数据采用双尾非配对 检验进行分析， 。标尺 。(F)对有或没有依托泊苷处理(5μM，30分钟)的HLF shCtrl/sh53BP1细胞进行EdU掺入分析。定量分析显示了一个代表性实验(n = 3)的数据点。至少对124个细胞进行了定量分析。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较分析，****P ，ns P 。(G)对单独或联合使用10074-G5(10μM，2小时)和依托泊苷(5μM，30分钟)处理的HLF细胞进行EdU掺入分析。定量分析显示了一个代表性实验的数据点 。至少对43个细胞进行了定量分析。数据采用Kruskal-Walli检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较分析， ，ns 。(H)对有或没有依托泊苷处理(5 M，30分钟)的HLF shCtrl/shCTR9细胞进行EdU掺入分析。定量分析显示了一个代表性实验(n )的数据点。至少对164个细胞进行了定量分析。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较分析，**P < 0.01，****P 。(I)对有或没有依托泊苷处理(5μM，30分钟)的HLF USP28-WT或USP28-M细胞裂解物中捕获的新生染色质上的RNAPII和CTR9蛋白水平进行免疫印迹分析。图像显示了一个代表性实验(n )。(J)对有或没有拓扑替康或博来霉素处理 (拓扑替康为 ，博来霉素为 )的HLF细胞进行EdU掺入分析。至少对81个细胞进行了定量分析。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较分析，**** 。标尺 。
图8. 依托泊苷诱导的DNA合成会加剧DNA损伤。(A) 对人肺成纤维细胞(HLF)单独或联合使用依托泊苷(5 μM，30分钟)和胸苷(2 mM，2小时)处理后， H2AX强度的免疫荧光分析。定量显示了一个代表性实验 的数据点。至少对77个细胞进行了定量分析。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较， 比例尺 。(B) 中性彗星试验显示了单独或联合使用依托泊苷(5 μM，30分钟)和胸苷(2 mM，2小时)处理的HLF细胞中的双链断裂(DSB)。定量显示了一个代表性实验 的数据点。至少对78个细胞进行了定量分析。数据采用Kruskal-Wallis检验，随后对选定的配对进行Dunn多重比较，*P < 0.05。比例尺 = 10 µm。(C) 结晶紫染色显示了用依托泊苷(2.5或5 μM，30分钟)处理的HLF和p19 Nras细胞，有无胸苷(2 mM，在依托泊苷处理前1小时)。右图显示了三个独立生物学重复 的平均值。数据采用普通单因素方差分析，随后对选定的配对进行Šidák多重比较，* ，无显著性差异 。误差条表示标准差(S.D.)。(D) 结晶紫染色定量分析了用依托泊苷(2.5或5 μM，30分钟)处理的HLF和p19 Nras细胞，有无CDC7抑制剂西穆罗塞替布(2 μM，在依托泊苷处理前1小时)，显示了三个独立生物学重复(n = 3)的平均值。数据采用普通单因素方差分析，随后对选定的配对进行Sídák多重比较，* ，无显著性差异 。误差条表示标准差(S.D.)。
在我们的模型中，USP28的二聚化通过阻止PAF1异位募集到MYC来限制转录活跃位点的非计划DNA复制。我们提出，在正常细胞周期中，由于内源性DNA损伤或复制叉停滞导致的DNA损伤反应(DDR)信号可以破坏USP28二聚体，从而短暂激活USP28以进行局部起始点激发。相比之下，通过二聚体界面突变或53BP1缺失对USP28进行组成型激活会导致DNA合成的慢性刺激，并伴有DNA损伤的积累。
我们的数据表明，USP28单体主要在基因毒性应激反应中形成，导致PAF1募集并刺激DNA复制。在这些条件下，复制叉的进展会减慢，DNA复制的净刺激很可能是由于休眠起始点的激发，这些起始点被认为位于转录起始位点附近(94,95)。先前的研究表明，应激恢复过程中休眠起始点的激发提供了一种机制，用于复制被困在断裂复制叉之间的DNA区域(96,97)。与该模型一致，我们的数据表明，基因毒性应激后早期，ATM依赖的USP28激活会刺激起始点激发。然而，复制抑制剂会减少基因毒素诱导的DNA损伤和细胞毒性，这表明基因毒性应激时起始点激发与DNA断裂增加有关。显然，异位起始点激发会强制S期进展，即使以复制受损DNA为代价。如果初始损伤较低，这可能有利于S期和G2期通过同源重组(HR)介导的DNA修复，而不是G1期占主导的易错非同源末端连接。如果修复失败，加剧的DNA损伤可以有效地驱动细胞进入凋亡或衰老，以防止致癌性病变的积累。或者，基因毒素诱导的起始点激发可能反映了细胞在G1期未能停滞时对基因毒性应激的不合理病理反应。无论哪种情况，我们的观察结果都需要对基因毒素诱导的DNA复制进行进一步分析，并表明它可用于开发靶向联合疗法。
数据可用性
评估论文结论所需的所有数据均包含在论文和/或补充材料中。RNA-seq数据已存于NCBI GEO门户，登录号为GSE213892。蛋白质组学数据已存于PRIDE数据库，编号为PXD037263。
补充数据
补充数据可在NAR在线获取。
致谢
我们感谢Kseniya Popova和Stephanie Lamer提供的专业技术协助。
作者贡献:N.P.和M.F.构思了本研究并设计了实验。C.J.、E.E.、W.X.、R.B.K.、A.S.和N.P.进行了实验。C.J.、E.E.和N.P.解读了数据并制作了图表。N.P.、C.J.和E.E.撰写了手稿。
资金
德国研究基金会 [PO1458/5 - 1、PO1458/5 - 2 (FOR 2314) 以及PO1458/9 - 2授予N.P.]；维尔茨堡大学医院基金(授予M.F.)。我们感谢图宾根大学开放获取出版基金以及图宾根大学医院医学图书馆的支持。
利益冲突声明
所有作者均声明无利益冲突。
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