超螺旋依赖的DNA结合:定量建模及其在体相和单分子实验中的应用
发布时间：
2026-05-16 11:25
超螺旋依赖的DNA结合:定量建模及其在体相和单分子实验中的应用
宝琳·J·科尔贝克 ，米洛什·蒂什马 ，布莱恩·T·阿纳利克武 ，威廉·范德林登 ，塞斯·德克尔 和扬·利普费特01,2,*
德国慕尼黑路德维希 - 马克西米利安大学物理与纳米科学中心，阿马利安大街54号，80799慕尼黑； 荷兰乌得勒支大学物理与德拜纳米材料科学研究所软凝聚态物质与生物物理组，普林斯顿广场1号，3584 CC乌得勒支
荷兰代尔夫特理工大学卡夫利纳米科学研究所生物纳米科学部，2629 HZ代尔夫特
*通信作者联系方式。电话:+31 30 2532824；邮箱:J.Lipfert@uu.nl
通信也可联系威廉·范德林登。电话:+44 1316505261；邮箱:W.Vanderlinden@uu.nl
通信也可联系塞斯·德克尔。电话:+31 15 2786094；邮箱:C.Dekker@tudelft.nl
作者希望声明，在他们看来，前两位作者应被视为共同第一作者。
摘要
DNA存储我们的遗传信息，并且在各种应用中无处不在，在这些应用中它与从小分子到大型大分子复合物的各种结合伙伴相互作用。结合受到分子中的机械应变调节，并且可以改变局部DNA结构。通常，DNA以封闭的拓扑形式存在，其中拓扑结构和超螺旋为结合诱导的变形和应变调节的结合之间的相互作用增加了全局约束。在这里，我们提出了一个定量模型，该模型对DNA拓扑结构引入的全局约束如何调节结合进行了直接的数值实现。我们专注于荧光嵌入剂，其使DNA解旋并通过荧光检测实现直接定量。我们的模型正确地描述了使用具有不同起始拓扑结构、不同嵌入剂以及在广泛的嵌入剂和DNA浓度范围内的质粒进行的体相实验。我们在单分子实验中证明并定量模拟了超螺旋依赖的结合，在该实验中我们直接观察到从超螺旋DNA到切口DNA时不同的嵌入剂密度。单分子实验提供了对结合动力学和DNA超螺旋动力学的直接访问。我们的模型对DNA的检测和定量具有广泛的意义，包括使用补骨脂素进行紫外线诱导的DNA交联以量化体内的扭转张力，以及在细胞环境中调节DNA结合。
图形摘要
染色体和质粒是环状DNA分子，其超螺旋程度在体内受到严格调控(1 - 3)。在真核生物中，DNA拓扑结构和超螺旋在染色质化基因组的背景下同样发挥重要作用，例如。
引言
DNA是所有细胞生命中遗传信息的载体。在体内，双链DNA通常以环状，因此是拓扑封闭的形式存在。特别是，细菌中的。在遗传信息的压缩、处理和调控中(4 - 12)。
无论是在其生物学作用还是在许多生物技术应用中，DNA都与从小分子到大型蛋白质复合物的广泛结合伙伴相互作用。特别是，DNA的检测和定量通常依赖于用荧光小分子染色，这些小分子通常以嵌入结合模式结合(13 - 19)。配体与DNA的结合通常会局部改变DNA结构，并引入偏离平衡B型DNA构象的应变(20 - 25)。反过来，拉伸力和扭转应变已被证明会系统地影响结合平衡(20,26 - 33)。具有确定的DNA拓扑结构，例如在质粒或其他拓扑结构域中，对应变依赖的结合和结合诱导的构象变化之间的相互作用施加了全局约束，如鲍尔和维诺格拉德的开创性工作中所述(26,27,33)，随后在小分子(4,26,27,33,34)和蛋白质与DNA的结合中也得到了证明(10,35,36)。
在此，我们提出了一种定量模型，用于描述在全局拓扑约束下不同超螺旋程度的DNA - 配体结合，并将其应用于大量实验和单分子测定中，这使我们能够实时研究DNA超螺旋动力学。我们的配体与拓扑封闭DNA结合的模型结合并整合了先前工作的各个方面。特别是，我们考虑了与线性分子结合的限制(参考文献37)、有限的DNA和嵌入剂浓度(参考文献19)、配体诱导的构象变化(参考文献13、14、19、27、31)、应变对结合平衡的影响(参考文献26、33)、质粒力学的物理模型(参考文献38、39)以及由于确定的拓扑结构而具有确定的连接数所引入的全局约束(参考文献27、40、41)。重要的是，我们模型的参数具有直接的物理解释，并且可以从其他测定中确定。因此，我们的模型可以提供无自由参数的定量预测。
我们专注于先前研究中已充分表征的常用嵌入剂:溴化乙锭(EtBr)、SYBR Gold和SYTOX Orange(补充图S1)。EtBr是一种在凝胶和其他应用中非常广泛用于DNA可视化的染料(参考文献14、30 - 32、42 - 46)。SYBR Gold是一种较新开发的DNA染料，具有非常高的量子效率和亮度(参考文献19、47 - 49)。SYTOX Orange经常用于单分子实验中对DNA进行染色和超螺旋处理(参考文献49 - 53)。最后，我们将分析扩展到用作光交联剂的嵌入剂4,5’,8 - 三甲基补骨脂素(TMP；也称为三甲沙林)，它用于光疗(参考文献54)以及检测体内的超螺旋和染色质结构(参考文献7、8、10、55 - 58)。
我们首先使用天然拓扑约束的质粒DNA进行大量实验，即两条链完全完整的环状DNA(称为超螺旋形式，’sc’；图1A)，并且为了进行比较，还使用拓扑开放的DNA(切口的、开放环状的，’oc’，或线性化的，’lin’；图1B、C)。我们使用荧光检测来量化结合量，并发现与我们的模型在定量上一致。然后，我们将我们的模型应用于单分子DNA测定(参考文献50、53)，其中通过嵌入使DNA原位超螺旋。我们监测DNA分子切口时的荧光变化，这会导致从封闭拓扑突然转变为拓扑无约束的切口形式，并且再次发现与我们的模型非常一致。单分子测定使我们能够实时观察拓扑变化时结合平衡的重新调整，这使我们能够探究扭矩释放、嵌入和超螺旋松弛的动力学。
图1. 质粒DNA不同拓扑构象的概述以及全局约束下结合模型的概述。(A)线性DNA的示意图和AFM高度图像。(B)开放环状DNA的示意图和AFM高度图像，即单个位点有切口的质粒DNA。(C)负超螺旋DNA质粒的示意图和AFM高度图像。图A - C中的AFM图像是pBR322质粒DNA(4361 bp；见材料与方法)。(D)McGhee - von Hippel配体与DNA结合模型的示意图，其中结合位点大小调节结合平衡。(E)说明嵌入到DNA中如何延长和解旋B型螺旋。左:从PDB条目4C64(参考文献108)渲染的B型DNA。右:存在嵌入剂时的DNA，这里是从PDB条目1D11(参考文献110)渲染的柔红霉素。(F)示意图展示了由于拓扑结构导致的全局约束如何在拓扑封闭的DNA为负超螺旋时(左)导致结合增加，但与扭转松弛形式(中)相比，当DNA为正超螺旋时(右)结合会减少。反过来，嵌入会局部解旋DNA，因此，在拓扑封闭的DNA中，随着嵌入增加，Wr会增加。为了进行比较，下面展示了拓扑开放的DNA。
我们的研究结果具有直接的实际应用价值，因为基于凝胶的拓扑异构体鉴别和检测分析方法被广泛用于研究环状DNA以及各种改变DNA拓扑结构的酶的特性，这些酶包括拓扑异构酶、促旋酶、反向促旋酶和重组酶(59 - 61)。使用荧光染色对不同拓扑异构体进行无偏定量分析，由于处理、储存和处置放射性材料存在风险，这种方法正越来越多地用于取代放射性标记，在此过程中必须考虑观察到的拓扑依赖性。此外，我们的模型可直接应用于超螺旋DNA的单分子荧光研究，并且我们展示了对超螺旋依赖性结合动力学的实时监测。最后，我们提供了无偏检测不同拓扑异构体的实用指南，并更广泛地讨论了拓扑依赖性结合的影响。
材料与方法
质粒DNA制备
我们使用常用的质粒pBR322(NEB，产品目录编号N3033S)作为DNA底物，用于嵌入作用的批量测量。我们通过切割(即引入双链断裂)或切口(即DNA单链断裂)原始超螺旋DNA来制备不同拓扑状态的DNA，分别得到线性和开环DNA。反应在NEB Buffer 3.1(NEB)中进行，使用EcoRV酶(NEB；孵育温度37°C)制备线性DNA，使用Nt.BspQI酶(NEB；孵育温度 )制备开环DNA。反应1小时后，通过在 加热灭活 来终止反应。产物用PCR清洁试剂盒(Qiagen)纯化。对于拓扑封闭且初始为负超螺旋的条件，质粒仅用PCR清洁试剂盒(Qiagen)进行清洁，并且我们假设初始超螺旋密度为 ，如先前报道(62 - 66)。此外，我们通过与小麦胚芽拓扑异构酶I孵育来制备拓扑封闭但初始松弛的质粒。对于总体积为 ，将16.2 μl分析缓冲液(50 mM Tris HCl，1 mM EDTA，1 mM DTT，20%(v/v)甘油，50 mM NaCl，pH 7.9)、 拓扑异构酶I、 pBR322 在反应管中混合，并在 孵育 。
对照测量使用不同长度和不同序列的天然负超螺旋质粒:pUC19(2.686 kbp)和M13mp18(7.249 kbp)，均从NEB(产品目录编号分别为N3041S和N4040S)获得并使用PCR清洁试剂盒(Qiagen)纯化。使用纳米滴紫外/可见分光光度计(ThermoFisher Scientific)测定DNA浓度。在进行凝胶电泳之前，向每个 反应体积中加入 紫色凝胶上样染料(6×)(NEB，产品目录编号B7024S)。对于酶标仪和qPCR循环仪实验，不添加凝胶上样染料。
DNA稀释系列
对于负超螺旋DNA的DNA稀释系列，将不同拓扑结构混合成等摩尔混合物，并用Tris - 乙酸 - 乙二胺四乙酸(TAE)缓冲液(40 mM Tris，20 mM乙酸和1 mM EDTA，pH 8.6)和凝胶上样染料进行连续稀释，以获得7种不同的DNA浓度(表S1)。对于使用拓扑异构酶松弛DNA的实验，仅将线性和松弛拓扑结构混合成等摩尔混合物，并用TAE缓冲液和凝胶上样染料再次进行连续稀释，以获得7种不同的DNA浓度(表S1)。
DNA质粒的原子力显微镜成像
按照之前描述的方法(67 - 69)对质粒DNA进行了原子力显微镜(AFM)成像。简而言之，对于AFM成像，我们将处于不同拓扑状态的 DNA以 的终浓度沉积在新鲜裂解的聚-L-赖氨酸(西格玛奥德里奇公司，在超纯水中稀释至0.01%；PLL)包被的白云母上的TE缓冲液中。样品在 孵育，然后用 超纯水洗涤，并用过滤后的氩气流轻轻吹干。干燥后，使用配备硅探针(FASTSCAN - A，驱动频率1400 kHz，探针半径 ，布鲁克公司，美国马萨诸塞州比勒里卡)的Nanowizard Ultraspeed 2(德国柏林JPK公司)AFM在室温下以轻敲模式记录AFM图像。以 的扫描速度在不同视野上扫描图像。自由振幅设置为 。振幅设定点设置为自由振幅的80%，并进行调整以保持良好的图像分辨率。在软件SPIP(v.6.4，丹麦霍斯霍尔姆图像计量公司)中对AFM图像进行后处理，以平整图像并逐行校正图像(补充图S2)。
凝胶电泳
对于凝胶电泳，我们使用1%的宽范围琼脂糖(卡尔·罗斯公司)凝胶和TAE缓冲液。我们使用 基因尺(赛默飞世尔科技公司； )作为大小标准。凝胶在 以 运行 。随后，将凝胶从凝胶盒中取出，分别置于100 的 (原液1:100000稀释；2块独立凝胶)、 (原液1:1万稀释；7块独立凝胶)或50 μM(原液1:1000稀释；2块独立凝胶)的TAE缓冲液中的溴化乙锭中20分钟进行染色。随后，凝胶在TAE缓冲液中脱色15分钟。使用Gel Doc XR +系统(伯乐公司)对凝胶进行成像。SYBR Gold染色采用相同程序，不同之处在于凝胶在 的3 μM(原液1:4000稀释；共2块凝胶)或6 μM(原液1:2000稀释；共2块凝胶)中染色20分钟。由于琼脂糖凝胶基质和脱色步骤会降低染色中使用的染料浓度，我们使用先前确定的0.1的染色校正因子(19)，用于校正所有凝胶数据。
凝胶电泳图像分析
我们将来自Gel Doc系统的图像保存为scn格式，以便进行定量荧光强度分析。使用软件SPIP(v.6.4，丹麦霍斯霍尔姆图像计量公司)去除图像中的尖峰(不改变条带强度)，并沿凝胶的每条泳道生成平均强度分布图。下一步，我们使用Origin(美国马萨诸塞州北安普顿的OriginLab公司)平整分布图的背景，并通过计算泳道分布图下的面积，将峰分别转换为超螺旋、开环、线性和/或松弛DNA的分数(补充图S3)。
整体荧光实验
对于SYBR Gold整体荧光测量，我们使用了微孔板读数仪(Tecan Infinite M1000 PRO；微孔板:康宁黑色聚苯乙烯384孔平底微孔板，Sigma-Aldrich，产品编号:CLS3821)和qPCR循环仪(CFX96 Touch实时PCR检测系统，BioRad)。在微孔板读数仪中，将包含各种SYBR Gold浓度的DNA混合物加入微孔中，并从微孔底部读取荧光。激发和发射带宽设置为 ，增益设置为100，闪光频率设置为 ，积分时间设置为 。根据Invitrogen提供的SYBR Gold的激发和发射最大值，我们选择激发和发射波长分别为495和 。
在使用qPCR循环仪的整体荧光实验中，将DNA加入低轮廓PCR管(19)中，并用扁平、光学、超透明帽(Bio Rad，产品编号:TCS - 0803)封闭，因为荧光是从管顶部(在 )读取的。作为读出通道，选择吸收和发射波长分别为494和 的通道，因为这些与SYBR Gold的波长最匹配。
单分子荧光实验
超螺旋DNA的制备和单分子水平成像基本上如先前所述(50,53)。实验在定制的流动池中进行，该流动池通过双面胶带连接表面钝化的载玻片和盖玻片构建而成(50)。载玻片的表面制备如先前所述(70)，略有修改。简而言之，经过大量清洁后，使用APTES(10% v/v)和乙酸(5% v/v)甲醇溶液对表面进行硅烷化处理。表面用NHS - 酯PEG(5000 Da)和生物素化的NHS - 酯PEG(5000 Da)以40:1的比例进行钝化处理。生物素化的NHS - 酯PEG使我们能够通过生物素 - 链霉亲和素相互作用将DNA分子 tether 到表面。
用于与SYTOX Orange嵌入的DNA按照(71)中所述制备，不同之处在于在DNA末端引入多个生物素手柄，以对DNA旋转施加扭转约束。为了在DNA手柄上引入多个生物素，我们使用GoTaq G2 DNA聚合酶(Promega，M7845)对pBlue-script SK+(Stratagene)进行PCR，同时存在生物素-16-dUTP(Jena Bioscience，NU-803-BIO16-L)和dTTP(Thermo Fisher Scientific，10520651)分别以1:4的摩尔比。PCR使用引物:ACCGAGATAGGGTTGAGTG和CAGGGTCGGAACAGGAGAGC进行，产生一个1238 bp的DNA片段，由于存在生物素-16-dUTP修饰的核苷酸，该片段随机掺入了多个生物素。使用标准纯化试剂盒(Promega，A9282)对PCR产物进行纯化，然后我们用SpeI-HF(New England Biolabs，R3133L)在 对生物素手柄和42 kb的大DNA质粒进行 消化。通过在 随后热失活 来终止反应。这产生了线性 DNA和 生物素手柄。将消化产物混合，生物素手柄与线性质粒的摩尔过量比为10:1。然后我们在 ATP存在下加入T4 DNA连接酶(New England Biolabs，M0202L)，在 过夜，随后在 热失活 。通过在AKTA pure系统上进行尺寸排阻色谱法对所得的可卷曲 DNA构建体进行纯化，使用含有约46 ml Sephacryl S-1000 SF凝胶过滤介质(Cytiva)的自制凝胶过滤柱，用TE + 150 mM NaCl缓冲液运行。样品在 运行，我们收集 馏分。
为了固定 生物素化的DNA，我们在没有氧气清除系统成分(40 mM Tris-HCl，2 mM Trolox，2.5 mM )的成像缓冲液中以 的流速引入 DNA分子的 。DNA固定步骤期间的缓冲液在初始固定期间包含低SYTOX Orange浓度( ；为了在后续步骤中引入正超螺旋，见下文)或高浓度的SYTOX Orange(250 nM；为了在后续步骤中引入负超螺旋，见下文)。
将DNA分子引入流动池后，我们以相同流速进一步注入 不含DNA的相同缓冲液，以确保DNA另一端拉伸并 tethering 到表面(这引入了拓扑约束)，同时去除未结合的DNA分子。为了在受到扭转约束的结合DNA分子中引入plectonemic超螺旋，我们通过引入具有相同盐浓度但SYTOX Orange浓度不同的成像缓冲液以及用于成像的氧气清除系统(40 mM Tris-HCl、2 mM Trolox、2.5 mM MgCl 、65 mM KCl、2.5 mM原儿茶酸(PCA)、50 nM原儿茶酸-3,4-双加氧酶(PCD))(72)来改变SYTOX Orange浓度。对于正超螺旋，我们将固定过程中的浓度从 增加到 SYTOX Orange，而对于负超螺旋，我们将初始结合时 的浓度降低到成像时的最终浓度 。在这两种情况下，我们通过观察沿着DNA分子出现的移动焦点来检查DNA上超螺旋的可见存在(补充电影S1和S2)。因此，超螺旋是通过DNA结合步骤(通过多个生物素分子确保扭转约束)和成像步骤之间SYTOX Orange浓度的差异引入的，在成像步骤中，SYTOX Orange浓度分别增加或降低以产生正或负超螺旋。为了直接可视化挤出到侧面的plectonemic DNA(补充电影S3和S4)，我们使用了连接到注射器的第二个出口。在对无流动的超螺旋DNA进行初始成像后，我们通过侧面出口施加强烈的流出，将plectonemic DNA侧向挤出。我们使用与无流动测量相同的成像缓冲液进行侧流实验，以保持相同水平的超螺旋和环境条件。
对于荧光成像，我们使用了自制的物镜-TIRF显微镜。我们在高倾斜和层叠光学片(HiLo)显微镜模式下用561 nm(15 - 20 mW)激光进行连续激发，以成像SYTOX Orange染色的DNA以及引入DNA切口。所有图像均使用PrimeBSI sCMOS相机在20 - 200 ms的曝光时间下采集，具体取决于实验，使用 油浸、1.49 NA CFI APO TIRF(尼康)。为了进行DNA可视化和生成波形图，我们使用了在(73)中发表的自定义编写的python软件。
拓扑约束下结合模型的数值实现
为了模拟DNA拓扑结构施加的全局约束对结合的影响，我们开发了一个模型，该模型考虑了由于嵌入导致的连接数变化，反之，考虑了扭矩依赖性结合(见结果中的“拓扑约束下配体结合模型”部分)。该模型由耦合方程1 - 6组成，使用Mat-lab(Mathworks)编写的自定义例程进行迭代求解。输入参数是温度 ，对于DNA是碱基对数 、扭转刚度 、初始连接差 、DNA浓度 ，并且 通常从DNA的制备方式中得知，除非另有说明，我们使用值 nm(74 - 76)。对于单分子测定，DNA浓度定义不明确，但很低，远低于所使用的嵌入剂浓度。在这种情况下，我们使用 范围内的浓度，该浓度远低于所使用的嵌入剂浓度，但足够高以确保计算的数值稳定性。我们发现计算结果对该范围内使用的浓度不敏感。
嵌入剂的输入参数包括结合位点大小 、解离常数 、每个结合的嵌入剂引起的长度增加 、每个结合的嵌入剂引起的DNA螺旋扭曲变化 以及嵌入剂浓度 。本研究中使用的 和 的值见表1。该模型的输出包括每个DNA分子结合的嵌入剂分子数、DNA中的扭矩以及预期的总荧光强度，其中包含方程(7)中定义的整体缩放因子 。我们的数值实现使用了先前描述的McGhee-von Hippel的数值解(19,77)和一种逐次超松弛类型的方法(78)来加速收敛。实现我们模型的代码可在公共存储库YODA中获取，网址为https://doi.org/10.24416/UU01-YDNOBO。
结果
拓扑约束下配体结合的模型
我们开发了一个配体与拓扑封闭的超螺旋(如质粒)DNA结合的模型，其中拓扑结构施加了全局约束(图1D - F)。由于我们在模型中考虑的几个原因，与质粒DNA的结合不同于标准的双分子结合平衡。首先，DNA的线性结构对配体结合施加了局部约束，如果结合的配体占据 个碱基的结合大小(图1D)。在DNA浓度远低于配体浓度的情况下，使得游离和总配体浓度近似相等时，结合位点大小为 的配体的结合可以使用McGhee-von Hippel模型(31,37)进行建模。然而，对于大量测量，DNA碱基的浓度可能与配体浓度相似甚至更高，需要加以考虑(19)。因此，我们使用了McGhee-von Hippel模型的扩展，该扩展明确考虑了(19)中推导的配体 和DNA 浓度。分数结合 由下式给出
这里， 是结合的配体浓度， 是游离配体浓度， 是总配体浓度， 是解离常数(单位为M)， 是结合位点大小(单位为碱基对)。嵌入剂的结合位点大小的典型值是 ，对应于每隔一个碱基对结合。
嵌入作用通过局部解开和延长螺旋来影响DNA螺旋的局部几何形状(14,16,27,30,31,49,79,80)(图1E)。这里我们假设每个嵌入事件使DNA局部延长 并解开 。嵌入剂的典型值在 和 范围内。嵌入作用使DNA螺旋延长和解开这一事实，根据勒夏特列原理表明，分别施加拉伸力或解旋扭矩将增加嵌入结合。相反，过度缠绕螺旋将阻碍嵌入。我们假设结合常数 对施加的力 和扭矩 具有类似阿仑尼乌斯的指数依赖性:
在此， 是松弛分子的解离常数，即在没有力或扭矩的情况下， 是玻尔兹曼常数， 是绝对温度。对于自由溶液中的质粒，力为零(或至少很小，具体为 )，方程(2)中的第二个指数因子可以忽略。表1总结了所选染料的 和 值。
对于线性或开环DNA分子，不存在扭转约束，平衡时扭矩将为零；因此，结合将仅由方程(1)确定。相比之下，对于拓扑封闭的质粒，拓扑结构施加了全局约束。对于封闭质粒，连接数 是一个拓扑不变量量，并通过怀特公式(也称为卡卢加雷亚努定理或卡卢加雷亚努 - 怀特 - 富勒定理)(27,40,41,82,83)分为扭曲 和缠绕数Wr:
Tw是螺旋局部缠绕的量度，与分子中的扭转应变直接相关。相反，Wr对应于双螺旋轴在三维空间中的卷曲，在质粒中与螺旋超螺旋(以及其他缠绕构型，如环形超螺旋和卷曲)的数量有关。我们相对于扭转松弛的双链DNA表示连接数平衡，为此我们定义 ，其中 是扭转松弛DNA的自然连接数， ，其中 是DNA的自然扭曲，等于碱基对数除以螺旋圈数(裸DNA每圈 )， ，即扭转松弛构象的平均Wr为零。如果 不为零，则DNA被定义为超螺旋。
嵌入改变了螺旋的固有扭曲，因此，将分子扭转松弛时的连接数差移动了 ，其中 是结合的染料分子数。因此，对于给定的质粒，相对于扭转松弛状态的连接数差由下式给出
其中 是没有嵌入时质粒的连接数差。一般来说，多余的连接数将分配到扭曲和缠绕中(方程3)。对于质粒，已经表明这种分配与连接差的大小(38)和符号(84)无关，大约为20%的Tw和80%的Wr。我们假设在存在嵌入剂的情况下以及对于低力下有连接末端的分子，这种在扭曲和缠绕之间的分配也成立，使得
其中 由方程4给出。为了计算给定初始连接差 和给定嵌入分子数 时的扭转应变，我们通过考虑DNA的扭转刚度将多余的扭曲(方程5)转换为扭矩:
表1. 本工作中使用的所选嵌入剂的参数
| 数量 | 溴化乙锭(EtBr)(31) | SYBR Gold (19) | SYTOX Orange (49) | 三甲基补骨脂素(TMP) (106,107) |
| 结合位点大小 | 1.9 | 1.6 | 3.0 | 2 |
| 解离常数 | ||||
| 每个染料的伸长 (纳米) | 0.34 | 0.34 | 0.30 | 0.34 |
| 每个染料的解旋 (度) | 27 | 19.1 | 19.1 | 28 |
a我们在 中使用了(49)中的值，该值接近本工作中使用的离子强度。 的值是基于SYBR Gold的数据估算得出的。 参考文献(106)仅大致确定了解离常数。TMP的结合位点大小和每个染料的伸长率假定为表格中所示嵌入剂的平均值。
其中 是 中DNA的扭转刚度， 是轮廓长度，轮廓长度又取决于结合分子的数量，如 所示，其中 是未嵌入时的轮廓长度， 为每碱基对的长度。DNA的扭转刚度已通过单分子方法测量(75,87,88)，与离子强度无关(88)，报道的值在 纳米范围内(74 - 76)。然而，嵌入是否以及如何改变C尚不清楚。以前使用溴化乙锭在自由溶液中对DNA进行的测量(42,89,90)发现扭转刚度的值较低，在 范围内，我们将其作为溴化乙锭数据的起点。对于所有其他条件，我们使用 。
为了确定每个质粒中嵌入分子的数量与总配体浓度 和DNA浓度 (通常表示为碱基对浓度)的函数关系，我们使用迭代方法(材料与方法)对耦合方程1 - 6进行数值求解。模型的主要输出是 。假设嵌入分子的数量与荧光强度之间存在线性关系，我们之前发现这种关系在很大范围的染料浓度下都成立(19)，观察到的荧光强度 由下式给出
其中 是一个比例因子，它取决于染料的量子效率和实验细节，但对于给定的嵌入剂和仪器设置是恒定的。我们注意到，对于我们对闭环与开环拓扑结构相对结合的预测，比例因子 会相互抵消。
DNA超螺旋调节嵌入
相对于扭转松弛(或线性化)的质粒，嵌入拓扑封闭的DNA由于全局约束可能会增加或减少结合(26,27,33)。从负超螺旋质粒开始，这是体内通常发现的形式，在低配体浓度下，由于分子中的负扭转应变，与切口DNA相比，嵌入增加(图1F)。随着越来越多的分子嵌入，负连接差得到补偿，直到质粒变得扭转松弛，此时与拓扑封闭和开放形式的结合相同。最后，随着嵌入剂浓度进一步增加，闭环质粒变得过度缠绕，正扭转应变阻碍进一步嵌入。因此，在高嵌入剂浓度下，与开环质粒相比，闭环上结合的分子更少(图1F)。
为了通过实验验证上一节中概述的模型预测，我们使用了拓扑结构受限的负超螺旋形式以及开环和线性拓扑结构的质粒DNA(图1A - C；材料与方法)。我们制备了含有等量三种不同DNA拓扑结构的混合物，以便于在凝胶上进行直接比较。然后我们在凝胶上分离混合物(图2A)，对凝胶成像，并对条带强度进行定量，以监测嵌入量(补充图S3)。虽然开环和线性拓扑结构表现出相似的强度，但在高溴化乙锭浓度下，相比之下，拓扑结构受限的物种在凝胶上看起来较暗(补充图S4A)。相反，在最低溴化乙锭浓度下，超螺旋物种的强度高于其他两种物种(补充图S4B)。我们使用我们的模型来定量解释拓扑结构依赖的强度(图2B，补充图S5A)。我们发现，对于此处使用的实验参数，每个质粒上嵌入分子的数量大致与DNA浓度无关(补充图S5A)。因此，荧光强度随DNA浓度增加(图2B)。在最低溴化乙锭浓度下(图2B，黑色线条和符号)，与开环和线性相比，更多分子与超螺旋物种结合(图2B，红色突出显示的线条和符号)，而在最高浓度下(图2B，浅棕色线条和符号)，与其他物种相比，超螺旋的嵌入减少。在中等溴化乙锭浓度下(图2B，棕色线条和符号)，拓扑开放和封闭的物种结合溴化乙锭的情况类似。不同拓扑结构之间结合的差异是由于最低溴化乙锭浓度下的负扭转应变和最高浓度下的正应变所致(补充图S5B)。对不同DNA浓度进行平均，我们可以定量比较拓扑封闭物种与开环和线性物种相比相互作用的相对增强或降低(图2C)，并发现我们的模型与实验数据之间具有很好的一致性。我们注意到，对于低溴化乙锭浓度，误差条较大，我们模型的拟合看起来不如高浓度时好，这可能部分是由于(i)存在一些替代(非B型)DNA结构，(ii)负超螺旋DNA的拓扑异构体分布，以及(iii)低溴化乙锭浓度下较低的荧光信号。尽管如此，在所有测试条件下，我们在实验误差范围内实现了合理的一致性。
图2. 依赖于DNA拓扑结构的嵌入作用。(A) 用终浓度为 的溴化乙锭(EtBr)染色的琼脂糖凝胶。不同的DNA拓扑结构在凝胶上被分离。L:DNA大小标准品(1 kb基因尺，赛默飞世尔科技，5 μl)。第2 - 4泳道分别是负超螺旋、线性和开环DNA的储备溶液。第5 - 11泳道是三种拓扑结构的等摩尔混合物，处于不同的总DNA浓度。(B) 实验测定的超螺旋DNA(红色突出显示的圆圈)和线性DNA(正方形)的荧光强度，作为pBR322 DNA(4361 bp)的EtBr和DNA浓度的函数。不同颜色对应不同的EtBr浓度:从深到浅分别为0.05、0.5和 。细线表示拓扑结构开放的DNA(线性和开环)；带有红色突出显示的粗线表示拓扑结构封闭的DNA(超螺旋，这里超螺旋密度为 ，对应 圈)。符号表示至少两个凝胶的平均值和标准差。线是我们的结合模型的预测(与图B中的颜色代码相同)，比例因子 是唯一的拟合参数(方程7)。(C) 拓扑结构封闭的DNA相对于拓扑结构开放的构建体的相对荧光强度。数据点是通过在相同EtBr条件下平均不同DNA浓度获得的。三角形是至少两个独立凝胶的实验数据。品红色符号是我们模型的预测。(D) 与拓扑结构开放的构建体相比，具有不同初始超螺旋水平的拓扑结构封闭的DNA的相对结合作用随EtBr浓度的变化。彩色线是我们模型的预测。垂直灰色线表示EtBr的 。符号是图2E中的数据。进一步的分析见补充图S5。(E) SYBR Gold的情况与图D相同。所示数据来自三种不同的实验方式:使用96孔板读数仪、qPCR循环仪和凝胶电泳的荧光读数。由于SYBR Gold的 比EtBr低得多，在所研究的SYBR Gold条件下，结合几乎与拓扑结构无关。
依赖于拓扑结构的结合作用取决于初始拓扑结构和嵌入剂亲和力
我们已经证明，从负超螺旋质粒 开始，我们的模型可以定量解释DNA拓扑结构如何改变DNA结合，与开放拓扑结构相比，在低嵌入剂浓度下嵌入增加，在高浓度下受到抑制(图2C)，接下来我们转向初始扭转松弛的质粒。我们模型的一个明确预测是，如果DNA最初是扭转松弛的(甚至是正超螺旋的)，与开放拓扑结构相比，封闭拓扑结构的嵌入作用应该总是减少。我们通过再次制备和分离具有不同拓扑结构的DNA质粒来实验验证这一预测，但现在使用的样品是通过拓扑异构酶处理使其松弛的质粒(方法)，例如 (补充图S6和S7)。如预测的那样，我们发现封闭拓扑结构的EtBr嵌入减少(补充图S7A - C)，与我们的模型非常吻合。更广泛地说，DNA拓扑结构的相对影响既取决于初始连接数 ，也取决于嵌入剂浓度(图2D)。
我们的模型预测，在配体浓度低于 时，拓扑依赖性结合最为明显(图2D， 值以垂直线表示)。在浓度高于 时，结合达到饱和，预计与拓扑松弛形式相比，拓扑封闭质粒中的扭转应变引起的调节只会导致结合的微小或可忽略不计的变化。为了验证这一预测，我们使用嵌入剂SYBR Gold(19,47,48)进行了测量，与EtBr相比，SYBR Gold的 低得多(即亲和力更高)(表1，图2E和补充图S8)。在SYBR Gold的 及其以上的不同浓度下，对初始负超螺旋或松弛质粒进行测量，我们发现拓扑封闭和开放构建体确实结合了相似量的SYBR Gold，这与我们的模型定量一致(图2E)。为了展示广泛的应用，我们使用了三种不同的测定方法来获取SYBR Gold的荧光强度数据，即凝胶电泳、酶标仪和qPCR循环仪(详见方法)。此外，我们用不同的质粒进行了对照测量，特别是与4361 bp的pBR322质粒相比，一个较短(2.7 kb)和一个较长(7.2 kb)的构建体。在实验误差范围内，我们发现不同质粒的结果相似(补充图S9)，这表明结果并不强烈依赖于DNA序列或长度。我们注意到，我们的模型预测拓扑效应与DNA长度无关，这在研究的长度范围内通过实验得到了证实(补充图S9)。重要的是，DNA嵌入剂在其 以上几乎与拓扑无关的结合，对于旨在定量比较不同DNA拓扑结构的测定是有利的，例如监测整合或拓扑异构化反应的产物(61,65,91,92)。特别是，对于SYBR Gold，在1 - 的染料浓度范围内，DNA染色基本上不受拓扑结构的影响，这是我们之前确定的实现荧光信号与存在的DNA量之间线性关系的最佳浓度范围(19)。
基于补骨脂素的DNA交联检测DNA扭转张力
补骨脂素家族的嵌入剂在紫外线照射下可使DNA交联(图3A)。它们已广泛用于光疗(54)以及检测体内染色质结构和DNA超螺旋程度(8,55 - 58)。通常，作为一种简化假设，DNA交联的量与超螺旋密度 呈线性变化。我们的拓扑诱导全局约束下的嵌入模型准确地捕捉了补骨脂素化合物TMP与超螺旋DNA和切口DNA的相对结合，这是通过使用 H标记的TMP的放射性测定确定的(56)(图3B)。同样，我们的模型正确地预测了不同超螺旋密度下TMP诱导的交联程度(58)(图3C和补充图S10A)。重要的是，选择交联条件使得每个质粒最多诱导一个交联事件，这意味着只有一小部分嵌入的TMP分子发生反应。例如，在图3C的数据条件下，有>10个TMP分子结合(补充图S10B)，但平均<1个发生反应。然而，交联信号可以通过我们的结合模型使用类似于方程(7)的比例常数很好地近似，这表明交联与结合成正比。虽然在图3B和C研究的范围内，TMP结合与超螺旋密度至少近似呈线性，但线性关系只是对扭矩内在指数依赖性的近似(26,27,33)，其有效性仅限于相对较小的超螺旋密度(图3D)。
图3. 三甲基补骨脂素的拓扑依赖性DNA交联。(A) 4,5’,8-三甲基补骨脂素(TMP)插入DNA并在紫外线照射下导致DNA交联。DNA超螺旋依赖性交联被广泛用于探测体内DNA超螺旋和染色质构象。(B) TMP与相对于开环DNA具有不同初始超螺旋密度的超螺旋DNA质粒的结合。实验结合数据来自参考文献(56)，并使用 H标记的TMP的放射性测定。(C) TMP与超螺旋DNA质粒的结合。实验数据来自(58)，通过量化照射后DNA交联的量获得。实验数据相对于零超螺旋密度的数据点进行归一化。图B和C中的模型使用表1中的参数，并量化相对于拓扑开放DNA与超螺旋的结合。(D) 使用方程(2)-(6)(红色实线)，扭矩依赖性缔合常数(解离常数的倒数)对超螺旋密度的依赖性。黑色虚线显示方程(2)的线性化，即近似 ，其中 。
单分子检测实时监测超螺旋依赖性结合
为了在单分子水平上探索超螺旋依赖性结合的后果，我们通过单分子荧光成像研究了在拓扑约束下配体与DNA的结合。在我们的检测中，我们通过两端的多个生物素-链霉亲和素键将DNA连接到表面(图4A)，确保分子受到拓扑约束。虽然表面连接会拉伸分子，但有效拉伸力非常低，在我们的实验条件下估计为 pN(补充图S11)。
添加嵌入剂SYTOX Orange使我们既能在DNA中诱导超螺旋，又能使用荧光成像观察分子(50,53)。为了系统地研究拓扑的影响，我们进行了两种不同类型的实验(材料和方法)。在第一种情况下，我们通过首先用高浓度(250 nM)的嵌入染料SYTOX Orange染色，然后将DNA连接到表面以对其进行拓扑约束，随后在较低浓度(50 nM)下成像，制备负超螺旋DNA。随着SYTOX Orange浓度的降低，如先前观察到的那样(50,53,93,94)，螺旋超螺旋作为沿着DNA分子长度扩散的亮点清晰可见(图4B、C和补充电影S1-S4)。
在连续观察和激光照射期间，DNA分子可能会在某个点断裂，这可能是由于光化学过程产生的自由基(95,96)，这通常是一个不良特征。然而，在这里我们利用光照时的断裂来为我们所用，因为它使我们能够观察到同一个DNA分子的超螺旋(闭合)状态，随后是断裂(开放)状态，最后是扭转松弛状态。断裂时，荧光强度会突然显著降低(图4D)，表明螺旋超螺旋的亮点消失(图4B、C和补充电影S1)。这与我们之前的观察结果一致:负超螺旋有助于嵌入，因此，一旦分子断裂，结合的SYTOX Orange就会减少，荧光强度就会降低。
对于第二种类型的实验，我们通过在低浓度SYTOX Orange(25 nM；图4E)存在的情况下将DNA附着于表面来制备正超螺旋DNA。然后我们提高染料浓度(至 )，但由于正超螺旋会阻碍染料与DNA的嵌入结合，荧光强度仍相对较低。同样，麻花状超螺旋呈现为沿DNA分子扩散的亮点(图4F、G和补充视频S2)。在正超螺旋分子被切口后，我们观察到荧光强度增加(图4H)。重要的是，我们的检测方法使我们能够通过在切口前后对整个分子的强度进行积分来量化拓扑结构变化时荧光强度的变化(图4D和H)。我们发现，对于初始负超螺旋的 DNA(平均 标准差；超螺旋/切口比率)，切口后荧光强度降低；对于初始正超螺旋的 DNA(平均 标准差；超螺旋/切口比率)，切口后荧光强度增加(图4I)。
为了定量模拟原位观察到的切口时荧光的变化，我们使用了我们的模型，其参数采用了Biebricher等人(49)报道的结合位点大小 、每个染料的伸长量 以及在 中采用的结合常数 ，这大致对应于我们实验中的离子强度(40 mM Tris-HCl，2.5 mM )。SYTOX Orange的每次嵌入事件的解旋角度 未知。我们假设 ，这是SYBR Gold(19)的值，因为这两种染料相对相似，而且通常在约 范围内的值是典型的(19,31,97)。重要的是，该模型在此分两个阶段应用:我们首先计算相对于松弛的裸DNA且在不存在嵌入剂的情况下，在25和 SYTOX Orange存在时附着DNA所诱导的超螺旋密度，分别为 和 = 9.7%。然后我们计算在用于成像的新SYTOX Orange浓度(250和 ，我们发现其为 和 )下与DNA的结合以及超螺旋水平的重新调整，将第一步获得的超螺旋水平作为输入。为了进行比较，我们计算与拓扑开放DNA的结合，这使我们能够计算切口时荧光的变化(图4J、K)。在此，我们观察到我们计算模型的预测与我们单分子实验中扭转松弛时荧光强度的实验观察变化之间具有极好的一致性(图4J、K)。
图4. 用于量化拓扑依赖性结合的单分子荧光测定法。AI-D):负超螺旋DNA。(A)单分子荧光实验设置的示意图。经SYTOX Orange染色的DNA通过多个生物素-链霉亲和素键在其两端拴系到表面。顶部:负超螺旋DNA；底部:带切口的DNA。(B)DNA仍为负超螺旋时40.6秒以及DNA切口后76秒的荧光图像快照。(C)SYTOX-Orange染色DNA的动态光密度图。当DNA切口时，强度突然降低。(D)图C中动态光密度图的积分荧光强度。橙色虚线是对数据的双态隐马尔可夫模型拟合(109)。(E-H):正超螺旋DNA。(E)与图A中实验排列示意图相同，只是现在DNA在切口前为正超螺旋。(F)DNA仍为正超螺旋时19秒以及DNA切口后82秒的荧光图像快照。(G)SYTOX-Orange染色DNA的动态光密度图。当DNA切口时，强度突然增加。(H)图G中动态光密度图的荧光强度。橙色虚线是对数据的拟合(与图D相同)。(I)原始负超螺旋DNA(蓝色)和原始正超螺旋DNA(青绿色)切口前后的强度比。平均而言，原始负超螺旋DNA为1.25±0.18 ，原始正超螺旋DNA为 。(J)来自 个分子的原始负超螺旋DNA的实验强度比与理论建模值的比较。(K)来自 个分子的原始正超螺旋DNA的实验强度比与理论建模值的比较。
图5. 探究染料与超螺旋动力学的相互作用。(A-D):负超螺旋DNA。(A)SYTOX-Orange染色DNA的动态光密度图。当DNA切口时，强度突然降低。(B)图A中动态光密度图的积分荧光强度。橙色虚线是将方程8所示模型拟合到数据。(C)DNA仍为负超螺旋时7.2秒、切口发生时8.2秒以及DNA切口后9.2秒的荧光图像快照。时间点由图B中匹配的数字表示。(D)从方程8对来自 次独立测量的时间轨迹拟合中实验确定的荧光降低速率 。平均 标准误为 。(E-H):正超螺旋DNA。(E)SYTOX-Orange染色DNA的动态光密度图。当DNA切口时，强度突然增加。(F)图E中动态光密度图的积分荧光强度。橙色虚线是将方程8拟合到数据。(G)DNA仍为正超螺旋时 、切口发生时 以及DNA切口后8.7秒的荧光图像快照。时间点由图F中匹配的数字表示。(H)从 次独立测量中实验确定的切口后荧光增加速率 。平均 标准误为 。
高速荧光追踪揭示结合动力学
为了定量研究拓扑约束下DNA嵌入的动力学，我们以 帧速率进行了单分子荧光成像(图5)，比图4所示的数据快10倍。通过对超螺旋DNA和切口DNA转变过程中的荧光强度轨迹(图5A、B、E、F)拟合一个简单的动力学模型，我们能够确定SYTOX Orange的结合和解离速率。
我们针对初始超螺旋分子的总荧光强度建立的动力学模型如下:
其中，初始强度 、最终强度 、速率 以及强度开始变化的时间 为拟合参数。对于切口前负超螺旋的DNA分子，我们发现荧光强度以总速率 降低(32条轨迹的平均值 标准误；图5D)，这与Biebricher等人使用单分子拉伸试验(49)外推至零力时的解离速率 接近。相反，对于切口前正超螺旋的DNA分子，我们发现强度以总速率 增加(22条轨迹的平均值 标准误；图5H)。假设这种增加是由于以简单的双分子缔合速率结合所致，我们发现结合速率为 (因为在这种情况下SYTOX Orange浓度恒定为 )，同样与Biebricher等人报道的结合速率 (49)一致。我们拟合的总速率与先前发表的SYTOX Orange的结合和解离速率非常吻合，这表明染料的结合和解离而非扭转应变的松弛是观察到的荧光强度变化的速率限制因素。这与模拟估计一致，模拟表明对于~kbp的DNA片段，DNA中扭转应变的松弛发生在 秒的时间尺度上(98)。荧光斑点的消失(图OC和G)使我们能够估计切口时缠绕松弛的动力学，即螺旋超螺旋解开的时间尺度。我们观察到荧光斑点至少在3 - 4帧内消失(补充图S12)，这表明在我们的试验中缠绕松弛发生在 。观察到的螺旋消失的时间尺度与先前通过荧光成像检测到的“跳跃”事件之前螺旋的寿命非常相似(93)，这表明缠绕松弛是通过向切口的“跳跃”松弛发生的。相反，我们的测量表明缠绕松弛主要不是通过螺旋沿着DNA扩散到切口位点发生的，这将需要大约 的时间，其中 是扩散发生的长度 ， 是扩散系数，其为 。
##讨论
我们开发了一个定量模型来描述在超螺旋约束下的DNA结合，该模型整合了先前模型(26,27,33)的各个方面。重要的是，我们模型中的所有参数都有明确的物理解释，并且可以独立确定(例如见表1)，从而实现定量预测。有趣的是，在全局拓扑约束下超螺旋化DNA可以增加或减少结合，这取决于浓度和结合模式(27)(图1F和2C)。这与施加的拉伸力有重要区别，拉伸力同样可以以类似阿累尼乌斯指数依赖的方式调节结合(30,49)，但只会在一个方向上偏向结合。
使用特征明确且广泛使用的嵌入剂SYBR Gold和溴化乙锭，我们可以证明拓扑依赖性结合取决于初始拓扑和嵌入剂亲和力。特别是，我们证明DNA嵌入剂在其 以上的结合几乎与超螺旋无关。据此，我们可以为在拓扑约束下可视化DNA时最佳使用嵌入染料提供建议:为避免由于扭矩依赖性结合导致的偏差，应使用 低的染料，理想情况下浓度远高于 。具体而言，浓度为 的SYBR Gold满足此标准。重要的是，浓度为1 - 2 μM的SYBR Gold也是获得高信号以及DNA量与荧光强度之间线性关系的最佳浓度范围(19)。一般来说，嵌入剂类型和浓度范围的选择对于可靠的拓扑无偏DNA染色和定量以及与其他DNA定量方法获得一致结果至关重要。
此外，我们的模型可以定量解释使用广泛的嵌入剂补骨脂素进行紫外线诱导DNA交联的观察结果。重要的是，在使用嵌入来检测超螺旋的应用中，需要具有高 (即低亲和力)和大解旋角的染料。
我们提出了一种单分子测定法，以实时观察SYTOX Orange与DNA的超螺旋依赖性结合。我们发现我们模型的理论预测与实验观察到的扭转松弛时荧光强度变化之间有很好的一致性。高速跟踪使我们能够推断出SYTOX Orange与DNA结合动力学的信息。我们发现总体结合和解离速率与先前发表的SYTOX Orange速率非常一致，这表明染料的结合和解离，而不是扭转松弛，是观察到的荧光强度变化的速率限制因素。
综上所述，我们的工作展示了如何将理论建模与多种互补实验技术相结合，以在全局拓扑约束下提供对DNA - 配体相互作用的高度定量和全面的观点。作为未来的方向，我们的建模方法可以扩展以考虑拓扑异构体分布、非规范DNA结构(例如翻转碱基或解链泡)或序列依赖性(53,99 - 101)。我们预计我们的方法将广泛适用于其他DNA结合剂，并允许对DNA的不同拓扑状态进行可靠且无偏的检测和定量。此外，DNA结合与拓扑的相互作用对体内遗传信息的处理和调控具有重要意义。在细胞中，DNA形成拓扑结构域，例如前进的聚合酶会引入不同手性的扭转应变(1,2,102 - 105)。总之，这些因素预计也会在细胞环境中调节与DNA的结合，例如通过核小体和转录因子。我们的结果为未来定量研究这些复杂过程提供了一个基线。
数据可用性
本文所依据的数据可在文章及其在线补充材料中获取。用Matlab编写的实现拓扑依赖性结合模型的定制软件可在存储库YODA中免费获取，网址为https: //doi.org/10.24416/UU01 - YDNOBO。
补充数据
补充数据可在NAR在线获取。
致谢
我们感谢Thomas Nicolaus提供实验室协助，感谢Felix Brandner进行初始测量，感谢Patrick Kudella和Dieter Braun在qPCR循环仪测量方面提供帮助，以及感谢Tine Brouns和Thorben Cordes进行有益的讨论。
资金支持
德国研究基金会(DFG)通过SFB 863 [111166240 A11]；乌得勒支大学，由欧洲研究理事会巩固资助项目“ProForce”和高级资助项目[883684]；荷兰研究理事会(NWO)的OCENW.GROOT.2019.012。开放获取费用的资金:乌得勒支大学。
利益冲突声明
未声明。
参考文献
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