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水稻间期细胞核中染色质压缩和空间组织的洞察

发布时间：

2026-05-17 21:07

水稻间期细胞核中染色质压缩和空间组织的洞察

阿尔日贝塔·多莱扎洛娃、德尼萨·贝兰科娃、韦罗妮卡·科拉奇科娃和伊娃·赫里博娃*

捷克科学院实验植物研究所，植物结构与功能基因组学中心，奥洛穆茨，捷克

染色质组织及其相互作用对于DNA修复、转录和DNA复制等生物学过程至关重要。关于染色质构象以及间期细胞核中染色体区域的排列和相互定位的详细细胞遗传学数据在植物中仍然广泛缺失。在本研究中，分析了水稻(Oryza sativa)间期细胞核中染色质凝聚水平以及染色体区域(CTs)的分布。超分辨率受激发射损耗(STED)显微镜显示叶和根间期细胞核中染色质凝聚水平不同。使用针对第9号和第2号染色体的涂染探针进行了三维免疫荧光原位杂交(3D immuno-FISH)实验，以研究它们在根和叶细胞核中的空间分布。在根分生细胞核中观察到六种不同的染色体区域构型，包括它们的完全关联、弱关联和完全分离，在叶细胞核中观察到四种构型。CTs的体积及其关联频率在不同组织类型之间有所不同。包含核仁组织区(NOR)区域的第9号染色体特异性CTs的关联频率也受45S核糖体DNA(rDNA)位点活性的影响。我们的数据表明细胞核中染色体的排列与核仁的位置和大小有关。

关键词

三维免疫荧光原位杂交(3D immuno-FISH)、染色体涂染、染色体区域、水稻、空间组织、显微镜

检查更新

开放获取

编辑

莱奥诺尔·莫赖斯 - 塞西利奥，

葡萄牙里斯本大学

审阅

托马斯·克雷默，

德国慕尼黑路德维希 - 马克西米利安大学

保罗·弗兰兹，

荷兰瓦赫宁根大学及研究中心

通信

伊娃·赫里博娃

Ahribova@ueb.cas.cz

2023年12月20日收到

2024年5月13日接受

2024年5月28日发表

引用

多莱扎洛娃A、贝兰科娃D、科拉乔科娃V和赫里博娃E(2024年)对水稻间期细胞核中染色质压缩和空间组织的洞察。

《植物科学前沿》15:1358760。

doi: 10.3389/fpls.2024.1358760

版权

缩写:3D，三维；CenH3，组蛋白H3的着丝粒特异性变体；CT，染色体区域；FISH，荧光原位杂交；Hi-C，高通量染色体构象捕获；MIP，最大强度投影；NOR，核仁组织区；PAA，聚丙烯酰胺；rDNA，核糖体脱氧核糖核酸；ROI，感兴趣区域；RT，室温；STED，受激发射损耗；TADs，拓扑相关结构域。

引言

核DNA与结构蛋白一起浓缩成高阶染色质结构，这些结构是DNA复制、转录和基因组修复等重要生物过程的底物(米斯特利，2020年)。虽然染色质在有丝分裂期间被包装成可见的、高度浓缩的染色体结构，但细胞周期间期的染色质解聚使得无法识别单个染色体的边界。这引发了关于染色质如何包装成染色体、染色体在细胞周期间期如何组织以及染色质包装和染色体定位如何影响生物过程的基本问题。

间期染色质的组织可以通过两种方法进行分析:通过高通量染色体构象捕获(Hi-C)技术，随后进行聚合物建模(利伯曼 - 艾登等人，2009年；乔尔杰蒂等人，2014年；吉布斯等人，2018年)，以及通过三维荧光原位杂交(3D - FISH)和显微镜技术(巴斯等人，1997年；马尔卡基等人，2012年)。Hi-C方法结合了3C技术(德克尔等人，2002年)和下一代测序(利伯曼 - 艾登等人，2009年)来检查染色体区域之间的接触/相互作用频率。最近，Hi-C技术已被用于许多生物体，以比3D - FISH更高的分辨率(数十到数百千碱基)描述染色体接触模式、基因组包装和三维染色质结构(格罗布等人，2014年；董等人，2018年；杜穆尔等人，2019年；孔西亚等人，2020年；戈利茨等人，2020年)。然而，大多数关于植物物种的Hi-C研究是在混合组织上进行的，因此无法提供关于间期细胞核三维空间中单个染色体空间组织变异性的信息(王等人，2015年；董等人，2017年；孔西亚等人，2020年)。通过应用最近开发的细胞遗传学技术、寡核苷酸染色和3D - FISH可以获得此信息，这些技术能够在细胞核的三维空间中可视化单个基因组区域(豪等人，2013年；韩等人，2015年)。

后生动物和哺乳动物中的Hi-C研究揭示了存在包含活跃和开放染色质(A区室)或不活跃和封闭染色质(B区室)的兆碱基长染色质区室。Hi-C还能够描述动物间期核中染色体的组织成更小的、自我相互作用的拓扑相关结构域(TADs)、调控景观(例如Sexton和Cavalli，2015年；Ramírez等人，2018年；Szabo等人，2018年)。最后，研究表明属于相同TADs的基因表现出相似的表达动态，表明它们的物理关联在功能上与基因表达控制相关(de Graaf和van Steensel，2013年)。在植物中，三维染色质结构不同。例如，在拟南芥中未观察到TADs(Feng等人，2014年；Wang等人，2015年；Liu等人，2017年)，相反，它们的存在似乎与基因组较大的物种相关(Dong等人，2017年；Liu等人，2017年；Concia等人，2020年；Golicz等人，2020年)。由于并非在所有植物物种中都识别出TADs，它们在植物染色质动态中的作用仍不清楚。

在大量植物中，仍然缺少与Hi-C研究互补的细胞遗传学数据，其中只有少数在拟南芥中发表(Feng等人，2014年；Grob等人，2014年)。在植物研究中，通过使用针对功能染色体结构域(如着丝粒和端粒)的特异性探针进行荧光原位杂交(FISH)来研究间期核中的染色体分布(Avivi和Feldman，1980年；Anamthawat-Jónsson和Heslop-Harrison，1990年；Schwarzacher和Heslop-Harrison，1991年；Rawlins等人，1991年；Montijn等人，1994年；Hou等人，2018年；Liu等人，2020年)。这些研究证实了Carl Rabl的首次显微镜观察结果，他预测间期核中染色体的定位遵循它们在前一次有丝分裂中的方向(Rabl，1885年；Cremer等人，2006年综述)。所谓的Rabl构型，着丝粒和端粒位于核的相反两极，最初被认为是基因组较大的植物所具有的。在提出后不久，关于基因组较大的植物物种中类似Rabl组织以及中小基因组植物中间期染色体的非Rabl组织的概念就被否定了(Dong和Jiang，1998年；Fujimoto等人，2005年)。在水稻中，体细胞中的大多数核缺乏Rabl构型(Prieto等人，2004年；Santos和Shaw，2004年；Němečková等人，2020年)，然而，花药中减数分裂前细胞或木质部导管前体细胞的染色体似乎呈现Rabl构型(Prieto等人，2004年；Santos和Shaw，2004年)。与关于植物间期核中着丝粒 - 端粒组织的大量研究相比(Fujimoto等人，2005年；Idziak等人，2015年；Nemecková等人，2020年；Shan等人，2021年；Nowicka等人，2023年)，间期单个染色体空间定位的可视化仍然知之甚少。

通过基因组原位杂交(GISH)可视化亲本亚基因组，研究了种间和属间杂种中的相间染色体动态(Leitch等人，1990年)。然后，使用特定的细胞遗传学系(附加系、易位系)能够研究渗入染色体在细胞核三维空间中的定位，这些细胞核代表细胞周期的各个阶段以及减数分裂细胞(Aragón-Alcaide等人，1997年；Abranches等人，1998年；Koláčková等人，2019年；Perničková等人，2019年)。在拟南芥中，使用基于BAC文库的染色体涂染技术研究了相间单个染色体的相互位置，结果表明单个染色体倾向于占据分离的区域(Pecinka等人，2004年)。拟南芥极小的基因组具有特定的莲座状染色体构型(Fransz等人，2002年)，这在任何其他植物物种中都未观察到，因此我们不能期望在拟南芥中揭示的染色体组织和动态对其他植物物种具有普遍性。Robaszkiewicz等人(2016年)后来分析了具有Rabl组织的二穗短柄草细胞核三维空间中的染色体定位，并首次深入了解了相间染色体组织的高度变异性。然而，该研究中显示的相互染色体组织的高度变异性可能是由于使用了从汇集的根组织中分离的细胞核(Robaszkiewicz等人，2016年)。

先进的光学显微镜技术，即所谓的超分辨率显微镜，能够以高于光衍射极限所限制的分辨率研究物体(阿贝，1873年)。其中，荧光纳米显微镜方法扩展了光学成像，以达到纳米分辨率范围(Sahl等人，2017年)。在我们的研究中，我们使用了受激发射损耗(STED)纳米显微镜，其xy分辨率可小于，并能够获取三维图像(Dumur等人，2019年；Moors等人，2021年；Frolikova等人，2023年)。为了提供细胞周期相间染色质压缩的信息，对细胞核进行轻度甲醛固定，并将其进一步固定在聚丙烯酰胺凝胶中，以保留三维染色质结构，并避免在样品制备过程中染色质被破坏(Howe等人，2013年；Bass等人，2014年；Němečková等人，2020年)。

我们目前的研究首次深入了解了高度动态的根分生细胞和多样化的叶细胞核在细胞周期相间过程中染色质压缩和染色体域(CTs)空间组织的变异性。使用超分辨率STED显微镜揭示了根和叶细胞核中不同水平的染色质压缩。使用针对染色体的特异性涂染探针进行三维免疫荧光原位杂交(3D immuno-FISH)实验，观察到根和叶相间细胞核之间不同类型的CTs相互定位。

材料与方法

植物材料、种子萌发及样品制备

日本神户大学的大见户信子教授提供了水稻品种日本晴(Oryza sativa，2n = 2x = 24)的种子。种子在蒸馏水中浸泡并通气。之后，种子在生物培养箱中于，在培养皿中湿润的滤纸上发芽，直到初生根长3 - 4厘米。发芽10天后收集幼叶。完整细胞核的悬浮液根据Dolezel等人(1992年)的方法制备。简要地说，切下根尖或叶片(不包括叶基部)，并用2%(v/v)甲醛在Tris缓冲液(10 mM Tris，10 mM Na2EDTA，100 mM NaCl，0.1% Triton X - 100，2%甲醛，pH 7.5)中于固定30分钟，然后在用Tris缓冲液洗涤三次。从每个样品的70条根中切下根尖的分生组织部分。通过Polytron PT 1200匀浆器(Kinematica AG，Littua，瑞士)在500 μl LB01缓冲液(Dolezel等人，1989年)中以14500转/分钟匀浆根尖分生组织13秒。用剃须刀片切碎叶片。最后，将悬浮液通过20 µm尼龙网过滤，并使用FASCAria II SORP流式细胞仪和分选仪(BD Bioscience，美国圣何塞)进行分析。代表细胞周期G1期的细胞核被分选到减数分裂细胞缓冲液中(Bass等人，1997年；Howe等人，2013年)。

根切片及荧光原位杂交

用2%(v/v)甲醛在Tris中固定的根嵌入Cryo - Gel(徕卡生物系统公司，ID:39475237)，并使用低温恒温器(徕卡CM1950)切成厚的切片。将所得切片转移到超级防脱载玻片(赛默飞世尔科技)上，在室温下过夜干燥。在荧光原位杂交之前，将带有Cryo - Gel中根切片的载玻片在中洗涤10分钟，随后在乙醇系列(70%、85%、100%乙醇)中脱水，每次2分钟。将含有甲酰胺、硫酸葡聚糖在 SSC、剪切的鲑鱼精DNA(Invitrogen，AM9680)和探针的杂交混合物(50 μl)加到载玻片上，在变性，然后缓慢冷却过程( C 1分钟， )。然后将载玻片在 C过夜杂交。第二天，载玻片在4xSSC中洗涤三次，每次5分钟，根切片用VECTASHIELD抗淬灭封片剂(Vector Laboratories，美国加利福尼亚州伯林盖姆)中的DAPI复染。

荧光原位杂交探针

在水稻品种日本晴的参考基因组序列(版本7.0；http://rice.uga.edu/；Kawahara等人，2013年)中，使用Chorus v2程序管道(Zhang等人，2021年)鉴定了针对各个染色体的寡核苷酸。两组寡聚物由大赛璐芳樟生物科学公司(美国密歇根州安阿伯)合成。标记的寡聚物探针根据Han等人(2015年)的方法制备。针对2号染色体长臂和短臂的探针分别用生物素-16-dUTP和氨基烯丙基-dUTP-CY3标记，9号染色体用洋地黄毒苷-11-dUPT和氨基烯丙基-dUTP-CY5标记(德国耶拿耶拿生物科学公司)。较长的2号染色体的涂染探针包含40,000个独特的45聚体，较短的9号染色体的涂染探针包含20,000个独特的45聚体。使用特异性引物(Ohmido和Fukui，1995年)扩增针对45S核糖体DNA的探针，并直接用氨基烯丙基-dUTP-CY5标记(德国耶拿耶拿生物科学公司)。根据Dong等人(2018年)的先前研究选择2号和9号染色体，该研究基于Hi-C结果提出存在两组在关联水平上不同的染色体。长的近中着丝粒2号染色体(显示紧密关联的染色体组的成员)，以及短的近端着丝粒9号染色体，其包含NOR区域且属于未显示明显关联的染色体组(Dong等人，2018年)。制备的探针通过在根据(Hou等人，2018年)制备的标准染色体涂片上进行荧光原位杂交(FISH)来确认。

免疫染色和荧光原位杂交

根据Němečková等人(2020年)的方法，将流式分选的细胞核固定在聚丙烯酰胺凝胶中。为了可视化45S rDNA、2号染色体和9号染色体以及纤维蛋白，染色程序和洗涤按照Němečková等人(2020年)的方法进行。抗纤维蛋白原一抗以1:100稀释(ab4566，Abcam，英国剑桥)。FISH的杂交混合物包含400 ng的单个探针。

STED显微镜的样品制备

将流式分选的细胞核固定在聚丙烯酰胺凝胶上到硅烷覆盖的玻璃上。高精度盖玻片根据de Almeida Engler(2001年)制备并进行了一些修改。玻片在蒸馏水中洗涤，然后在乙醇中洗涤，并在室温(RT)下空气干燥。玻片放入培养皿中，在室温下通过振荡在新鲜制备的2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷(Sigma)的丙酮溶液中浸泡。然后玻片在蒸馏水中洗涤两次，在下干燥过夜，并在室温下储存。凝胶聚合后，聚丙烯酰胺垫在MBA缓冲液(Howe等人，2013年；Bass等人，2014年)中洗涤，并在室温下干燥。将含有SPY650-DNA(稀释1:1000)(Spirochrome AG，货号:SC501，瑞士莱茵河畔施泰因)的甘油封片剂AD-MOUNT S(ADVi，捷克共和国里卡尼)应用于垫上，并用显微镜玻片覆盖。

共聚焦和STED显微镜以及图像分析

使用配备了油浸平面消色差物镜和带有徕卡闪电模块的徕卡LAS-X软件的徕卡TCS SP8 STED 3X共聚焦显微镜(德国韦茨拉尔徕卡微系统公司)采集图像。使用以及用于激发的激光线和合适的发射滤光片，分别为每个染色体捕获图像堆栈。通常，采集具有间距的约50张载玻片的图像堆栈。通过Navigator模块使用63倍物镜采集根切片，并通过马赛克合并功能创建最终图像。使用 STED油浸物镜在STED模式下捕获叶和根细胞核的染色质结构。针孔设置为0.75 AU。根据半高宽标准(FWHM)，使用LAS-X软件估计分辨率。用螺旋铬(SPY650-DNA)标记的染色质信号以约52 nm的横向分辨率捕获。LAS-X软件还用于生成单个细胞核的彩色热图。在徕卡软件中测量染色质的大小。如图1和补充图1所示，对可见染色质纤维进行测量。通过随机测量根细胞核空间中的50个不同位置获得染色质纤维的大小，并在叶细胞核中测量100个位置(补充图1)。

使用Imaris 9.7软件(瑞士苏黎世牛津仪器公司Bitplane)对微观图像进行3D建模和体积计算。根据显微镜获得的荧光原始强度估计每个细胞核、核仁和染色体区域的体积(例如Koláčková等人，2019年；Perničková等人，2019年；Randal等人，2022年)。如果在3D-FISH后观察到对应于分析染色体的两个同源物的两个分离区域，Imaris软件计算各个区域的体积，并将染色体的平均体积计算为两个区域的总和。Imaris函数“Surface”用于对细胞核中的染色体排列以及45S rDNA、染色体和纤维蛋白进行建模。为了创建细胞核、核仁、染色体和 rDNA的体积模型，使用了表面细节，并将背景扣除设置为测量对象的直径(细胞核为，单个染色体为， rDNA为 )。创建细胞核的壳以显示为具有不同背景直径(DAPI)的细胞核表面。使用“通道调整”工具调整通道对比度，并使用“动画”功能创建视频。对每个选定变体分析约100个细胞核。

图1

幼叶和根分生组织G1期细胞核中染色质凝聚的STED分析。DNA用螺旋铬染色(白色)。(A) 在放大的图片和热图中，DNA结构的差异清晰可见。红色箭头指示染色质宽度测量区域。(B) 离散染色质纤维测量图。叶纤维测量显示了两组不同大小的染色质(灰色和粉色图)。比例尺:2 µm。

结果

染色质凝聚和细胞核特征的变化

为了分析和比较幼叶和根分生组织的G1间期细胞核中的染色质凝聚水平，我们应用了受激发射损耗(STED)显微镜技术。将来自叶片和根分生组织的轻度固定、流式分选的G1细胞核置于聚丙烯酰胺凝胶中，然后安装在硅烷涂层的高精度盖玻片上，以保留其三维结构。STED分析揭示了染色质的详细超微结构，并显示了从叶片和根分生组织分离的G1细胞核之间染色质压缩水平的差异。经历反复快速细胞分裂的根分生组织的G1细胞核，其染色质更为松散，超微结构明显(图1A)。相比之下，从分化的叶细胞中分离的G1细胞核中，染色质结构更为紧凑，染色质间区室的数量较少(图1A)。从这两种组织中分离的G1细胞核中的染色质凝聚情况也以彩色热图的形式呈现(例如Cremer等人，2017年；Cremer和Cremer，2019年)，这些热图显示了根分生组织和叶G1细胞核之间一般染色质组织的差异(图1A)。G1细胞核中可区分的染色质纤维宽度在根和叶组织中达到相同的值。在叶细胞核中，观察到直径为252 nm的更致密染色质结构(图1B)。

同样，从根分生组织区分离的G1细胞核的体积比叶细胞核高出三倍多 (表1)。核仁的情况也类似。在这里我们必须强调，核仁是通过用定位到核仁致密纤维成分(DFC)区域的核仁特异性蛋白纤维蛋白进行免疫检测来确定的，该区域占核仁的70%(Brown和Shaw，1998年；Dvořácková和Fajkus，2018年)。DFC区域的体积特异性平均占 (根细胞核的7.1%)，占叶细胞核的 (表1；图2A；补充视频2)。

对两种分析组织特有的近200个G1细胞核的进一步分析揭示了它们形状的差异(图2B)。大多数细胞核呈椭圆形( )，其余的G1细胞核在根分生组织细胞中呈纺锤形( )和平扁形( )。两种研究组织的G1细胞核形状比例几乎相同(表1；图2B)。

G1间期细胞核中染色体的相互位置

借助针对长亚中着丝粒染色体2和包含核仁组织区(NOR)区域的短近端着丝粒染色体9的两种特异性荧光原位杂交探针，分析了两条染色体的详细定位。通过对标准染色体铺片进行荧光原位杂交(FISH)(图3A - C)，并进一步对根分生组织(图3D - F)和叶组织(图3G)的流式分选G1细胞核进行FISH，证实了荧光原位杂交探针用于原位染色体鉴定的灵敏度和适用性。

使用染色体涂染探针在水稻G1细胞核上进行的3D-FISH显示，在所检查的两种组织类型中均存在特定区域，并证实了染色体领地(CTs)的存在，这是由Hi-C研究预测的(Dong等人，2018年)。涂染FISH显示CTs的构成存在差异，其在G1细胞核中要么表现为对应于两条同源染色体的两个分离领地(图3C、D、F)，要么表现为同源染色体紧密相连的一个大领地(图3E)。一般来说，与根分生组织相比，从叶片组织中分离出的G1细胞核中，较高比例的细胞核显示同源染色体紧密相连，表现为一个大的CT(9号染色体为63%；2号染色体为59%)，而根分生组织中主要含有具有两个分离CTs的G1细胞核(9号染色体为87%；2号染色体为59%)(图4A)。对应于同源染色体的两个领地的体积比较未显示出显著差异。2号染色体的染色体领地1和2在根分生细胞中分别占细胞核体积的8.23%和8.16%，在叶细胞中分别占8.76%和8.76%。两个同源CTs的相关领地的体积等于两个分离的同源CTs的体积之和(表2)。有趣的是，9号染色体的染色体领地1和2在叶中的覆盖体积(8.31%和7.72%)略高于根(5.39%和5.49%)(表2)。

在根分生组织的G1细胞核中观察到两种分析染色体相互排列的六种不同模式(图4B)。大约45.3%的检查根分生细胞核同时含有组织在两个分离CTs中的2号和9号染色体，另外27.4%的细胞核含有组织在两个分离CTs中的9号染色体和组织在一个大CT中的2号染色体。其余分析的细胞核(14.7%)含有两个核仁，在所有这些情况下，9号染色体的CTs是分离的。(图4B)。

表1 对两种分析组织特有的所有测试G1细胞核的分析

	细胞核体积 [立方微米]	核仁体积 [立方微米]	G1期细胞核数量	细胞核平均直径 [微米]			细胞核形状 [%]
	细胞核体积 [立方微米]	核仁体积 [立方微米]	G1期细胞核数量	✘	y	Z	椭圆形	纺锤形	扁平形
根	199.01±50.75	14.13 ± 4.67	189	7.14	6.62	8.95	66.67	20.63	12.70
叶	59.57 ± 23.85	0.74 ± 0.24	185	4.53	4.23	5.62	65.41	20.54	14.05

显示了细胞核和核仁形状及体积的变化。

图2

(A) 表示每个细胞平均核仁/细胞核比率的图表。(B) 分析的细胞核形状差异。用DAPI(蓝色)染色的核DNA的最大强度投影(MIP)。使用纤维蛋白原免疫标记(红色)观察核仁。

相比之下，在叶片G1细胞核中仅观察到染色体2和9的四种不同排列。不存在含有两个核仁的细胞核。36.7%的叶片细胞核含有对应于染色体2和9的两个大的染色体区带(CTs)，其他细胞核含有一个染色体9的大的CT和两个特定于染色体2的分开的CT(26.4%)。在相似数量的细胞核(22.2%)中，同源染色体2的CTs相关联，而染色体9的CTs是分开的。最后，14.4%的叶片G1细胞核包含两条排列在分开的CTs中的染色体(图4B)。

染色体2和9之间分开和相关联的CTs比例的差异可归因于染色体9短臂上存在核仁组织区(NOR)区域。NOR区域由构成核仁的45S rRNA基因组成。因此，染色体9在间期细胞核中的位置也取决于核仁/核仁的位置和性质(补充图2)。详细的三维分析揭示了根和叶片G1细胞核中45S rDNA位点数量不同。在根中，通常在核仁周边观察到两个主要位点，在核仁内部观察到2 - 4个小信号(补充图2；表3)。相比之下，在叶片中仅观察到1 - 2个位于核仁周边的45S rDNA位点，其中核仁占据的体积要小得多(补充图2；表3)。

对叶片G1细胞核的详细图像分析表明，与染色体9相比，染色体2的位置更随机。大的亚中着丝粒染色体2在大多数情况下，在z轴上贯穿整个细胞核体积排列，在核周边有一个大区域(图5)。尽管染色体2不包含rRNA基因且不直接与核仁相连，但其空间定位似乎受核仁性质(大小、数量和在细胞核内的位置)影响。

如我们上面所述，两种组织的G1细胞核在形状上也有所不同(表1；图2B)，因此，我们研究了染色体区带(CTs)排列与细胞核形状之间的关系。我们的数据表明，CTs的特定排列与不同形状的细胞核不相关。尽管纺锤形和平扁形细胞核的比例较低(表1；补充图3)，但所有CTs重排(两个分开的区域，以及特定于染色体2和9的同源染色体相关区域)都存在于所有检查的细胞核中(补充图3)。然而，由于纺锤形和平扁形细胞核的代表性不均衡(表1；图2B)，需要在更大的样本集上更详细地研究CTs的主导模式与细胞核形状之间的潜在联系。

最后，我们在通过冷冻切片机制备的超薄根切片上定位了着丝粒和端粒序列特异性探针。在水稻木质部导管细胞以及皮层细胞中观察到了拉布尔构型(图6A、B)。这两种细胞类型都较大，并且在Imaris软件中对其细胞核进行的体积测量表明存在核内复制。不幸的是，这些特定细胞类型在水稻根中的比例非常低，使得无法通过流式细胞术识别它们以估计其DNA含量，并确认核内复制的存在。

讨论

早期使用电子显微镜对染色质结构的研究表明，它呈螺旋状排列成核小体纤维(芬奇和克鲁格，1976年；伍德科克等人，1984年；博尔达斯等人，1986年)。然而，由于体内和体外条件下观察结果的差异，这种染色质折叠及其高阶组织模型存在争议(前岛等人，2019年；普列托和前岛，2019年)。超分辨率显微镜技术的最新发展，其分辨率可达约1 - 250纳米(瓦利等人，2021年综述)，使得能够描述高阶染色线纤维的存在(基列耶娃等人，2004年；贝尔蒙特，2014年)。对人类细胞中DNA复制位点的研究提出染色质呈球状折叠，直径约为 (杰克逊和庞博，1998年；阿尔比兹等人，2006年；切雷斯涅斯等人，2009年；马尔卡基等人，2012年)。

图3

对水稻根分生组织流式分选的G1期细胞核进行免疫荧光原位杂交定位后，对染色体和G1期细胞核进行共聚焦扫描的最大强度投影。(A)中期染色体上着丝粒(黄色)、2号染色体短臂(2S)(粉色)和长臂(2L)(绿色)的可视化。(B)通过寡核苷酸荧光原位杂交在早中期染色体上对2号染色体(粉色)和9号染色体(绿色)的可视化。(C)对应于两条同源染色体的两个独立染色体区域的可视化。2号染色体长臂为粉色，2号染色体短臂为黄色。(D、E)DNA用DAPI复染(蓝色)。比例尺:3微米。根分生组织(D、F、G)和叶组织(E)的G1期细胞核上特定探针的免疫荧光原位杂交定位。DNA用DAPI复染(蓝色)。比例尺:2微米。

在我们的研究中，我们分析了高度动态的根分生组织细胞间期细胞核以及从分化叶片细胞中分离的细胞核中的染色质压缩情况。观察到根和叶组织G1期细胞核中染色质压缩存在显著差异(图1)。在从根分生组织和幼叶组织分离的水稻G1期细胞核中发现了染色质纤维。在果蝇的中期染色体(松田等人，2010年)以及最近在大麦根分生组织的有丝分裂染色体中(库巴洛娃等人，2023年)观察到了类似宽度的染色质纤维。这些结果可能表明，有丝分裂染色体典型的较高水平染色质螺旋化在高度动态的分生组织细胞间期细胞核中得以维持。相反，在水稻叶细胞核中观察到更致密的染色质区域，直径达到。在人类和动物研究中，包括后生动物(汉森等人，2018年综述)，也观察到了染色质纤维的类似变异性。贝尔蒙特和布鲁斯(1994年)以及德哈尼等人(2005年)的研究表明，在G1早期和G1晚期/ S早期存在两类染色质纤维，直径分别为和。所描述的水稻高阶染色质结构直径与He - la细胞的高阶染色质结构直径相关(野崎等人，2017年)。

图4

根和叶染色体排列的比较。(A)总结(B)中显示的根和叶组织中染色体关联的图表。(B)基于共聚焦显微镜捕获的原始数据观察结果，使用BioRender.com创建的个体排列模型。

根分生组织和叶细胞核在体积和染色质紧密程度上也存在差异。根分生组织的G1期细胞核体积大三倍多，染色质更为松散，染色质间区比例更高(图1)。由于我们分析了高度动态的根分生组织细胞的G1期细胞核，我们可以推测，这些较大的细胞核和较高比例的染色质间区对于mRNA和蛋白质的合成是必需的，而mRNA和蛋白质是后续S期DNA合成所必需的。根分生组织G1期细胞核染色质较松散，也可能受根尖分生组织细胞分裂动态的影响(Kaduchová等人，2023年)。细胞的反复快速分裂使根分生组织染色质无法紧密凝聚，因此在整个细胞分裂过程中更具灵活性且易于接近。相比之下，叶组织的分化细胞含有较小的G1期细胞核，其染色质更为紧密，染色质间区比例较低，而转录发生在染色质间区，正如人类研究中所证明的那样(Hübner等人，2015年；Cremer和Cremer，2019年)。我们发现，根分生组织细胞的染色质包装比叶细胞大约松散两倍。染色质密度的这种差异可能表明排列的核小体表面之间的距离不同，正如Gelléri等人(2023年)之前所提出的那样。

表2 分析的G1期细胞核和染色体区域CTs的特征

	分析的G1期细胞核数量	细胞核平均体积 [um^3]	2号染色体分离的染色质区带平均体积 [um³]	2号染色体相关染色质区带平均体积lum3
根	95	198.94 ± 55.34 100%	16.38 ± 3.68 8.23%	16.23 ± 5.16 8.16%
叶	90	60.42 ± 22.23 100%	5.29 ± 0.90 8.76%	5.29 ± 2.09 8.76%
	分析的G1期细胞核数量	细胞核平均体积lum	9号染色体分离的染色质区带平均体积 ‘lum‘	9号染色体相关染色质区带平均体积lum
根	189	199.01 ± 50.75 100%	10.73 ± 2.07 5.39%	10.94 ± 2.69 5.49%
叶	185	59.57 ± 23.85 100%	8.31%	4.60 ± 1.87 7.72%

表3 G1细胞核和45S rDNA的分析。

	分析的G1期细胞核数量	细胞核平均体积[um3]	核仁平均体积[um3]	45S rDNA平均体积[um3]	45S rDNA位点的平均数量	45s rDNA位点的最大数量
根	94	199.35 ± 45.76 100%	14.41 ± 4.56 7.23%	2.51 ± 1.16 1.26%	3.53 ± 1.49	6
叶	95	100%	0.86±0.18 1.47%	0.93 ± 0.31 1.58%	1.54 ± 0.50	2

最近的研究表明，核结构、间期染色体的大小、形状和定位可能受到多种因素的影响，特别是特定染色体的大小、着丝粒位置和核仁形状。在保持拉布尔构型的植物物种短柄草中，在球形细胞核中发现了高水平的同源染色体关联，而在拉长的细胞核中则呈负相关(Robaszkiewicz等人，2016年)。在根和叶组织细胞核中具有莲座状染色体构象的植物中也描述了类似的结果(Pečinka等人，2004年)。然而，我们的研究没有证实两条形态不同的染色体的相互位置与核形状之间的相关性(补充图3)。另一方面，我们展示了根分生组织和叶G1细胞核之间染色体组织和相互位置的差异。在根分生组织细胞核中，携带核仁组织区的9号染色体的染色体纤维大多是分开的，而在叶G1细胞核中它们的关联占主导地位，无论细胞核的形状如何。我们的发现与之前在短柄草中的研究不一致，之前的研究证明了含有核仁组织区区域的染色体纤维的主要关联(Robaszkiewicz等人，2016年)。Robaszkiewicz等人(2016年)还表明，特定染色体的长度可能会影响其在细胞核内空间排列的主导模式，并表明最长染色体的染色体纤维通常是相关联的。然而，Robaszkiewicz等人(2016年)的研究中显示的染色体相互组织的高度变异性可能是由于对从合并的根组织中分离出的细胞核进行分析造成的。在拟南芥中观察到大多数染色体纤维的随机定位。唯一的例外是携带核仁组织区的染色体的位置，它似乎与核仁的位置有关(Lysák等人，2001年；Pečinka等人，2004年；Berr和Schubert，2007年)。

具有拉布尔构型的大型植物基因组中染色体纤维在三维空间中的空间组织和相互位置尚未通过原位技术进行分析。唯一的例外是在小麦-黑麦和小麦-大麦渗入系中外源染色体的可视化(Abranches等人，1998年；Koláčková等人，2019年；Perničková等人，2019年)。在这两种情况下，在大多数(83 - 89%)研究的根分生组织细胞中观察到对应于外源染色体的染色体纤维完全分离(Koláčková等人，2019年；Perničková等人，2019年)。我们的工作与之前的研究，特别是Robaszkiewicz等人(2016年)的研究在三维核空间中染色体纤维组织和定位上的差异，可以通过所研究物种中染色体构型(拉布尔和非拉布尔)的差异来解释。

图5

根和叶G1细胞核中染色体纤维定位的三维模型。(A)2号染色体(黄色)和9号染色体(绿色)特异性染色体纤维以及核仁(红色)的空间定位。(B)显示染色体纤维和核仁相对于细胞核中心和周边的空间排列的模型。等面积的壳描绘了细胞核区域，其中4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(白色)、2号染色体(黄色)和9号染色体(绿色)的信号定位在此处。

图6

在通过冷冻切片机制备的根超薄切片上进行寡核苷酸荧光原位杂交。应用了着丝粒探针(红色)、端粒探针(绿色)和2号染色体特异性探针(黄色)。图像显示了木质部(A)和皮层(B)细胞中拉布尔构型的证据。

如我们之前所述，核仁的形状和数量是另一个可能影响染色体 territories(CTs)定位的因素。Derenzini 等人(1998 年)表明，癌细胞分裂细胞产生的 rRNA 量增加，并且通常具有大的核仁，而 rRNA 基因转录的下调导致核仁大小减小。最近，Tiku 和 Antebi(2018 年)表明，核仁的大小与 rRNA 合成呈正相关。我们的研究发现，根细胞中较大的核仁体积以及 45S rDNA 位点的较大累积体积(补充图 2；表 1、3)，因此表明与叶细胞相比，根分生组织细胞中 rRNA 基因的活性更高。在根分生组织的 G1 细胞核中，9 号染色体的同源物被组织成分离的区域(在所有事件的 93% 中)，其中 rRNA 基因高度表达(Tulpová 等人，2022 年)。另一方面，在叶 G1 细胞核中，9 号染色体的 CTs 关联更多(59%)，叶 G1 细胞核由较小的核仁和少量 45s rDNA 簇组成。我们的研究表明，从两种植物组织分离的 G1 细胞核的三维空间中，相互染色体定位的高变异性可能反映了间期染色质动力学/运动。通过可视化活幼苗(Kato 和 Lam，2003 年)、酵母(例如 Heun 等人，2001 年；Bystricky 等人，2004 年；Hajjoul 等人，2013 年)以及动物和人类细胞(例如 Chubb 等人，2002 年；Levi 等人，2005 年；Germier 等人，2017 年；Nozaki 等人，2023 年)中的标记位点，描述了拟南芥间期细胞核中的染色质运动。

在不同组织中观察到的染色体定位异质性和染色质凝聚变异性解释了 Hi-C 和 3D-FISH 获得的接触频率和距离分布之间的差异(Fudenberg 和 Imakaev，2017 年)。在植物中，大多数 Hi-C 研究也可用于创建染色质凝聚和染色体定位模型，这些研究是在混合组织上进行的(Wang 等人，2015 年；Dong 等人，2017 年；Concia 等人，2020 年)。因此，三维建模是基于大量细胞的平均值进行的，并且不同细胞或细胞类型之间三维结构潜在变异性的信息丢失了。这可以通过单细胞 Hi-C(scHi-C)实验来克服(Nagano 等人，2013 年；Ramani 等人，2017 年；Tan 等人，2018 年)。然而，在植物研究中，scHi-C 实验并不多。例如，在水稻中，该技术用于研究卵、精子细胞、单细胞合子和茎中叶肉细胞中染色质组织的变异性。尽管仅对代表每种组织类型的四个细胞进行了分析，但染色体折叠及其相互组织的理论模型表明，分析的细胞核之间染色体区域定位存在变异性(Zhou 等人，一九九九年)。

总之，我们的研究突出了先进显微镜与最新细胞遗传学技术相结合在分析和比较细胞周期间期细胞核中相互染色体位置方面的强大作用。我们的实验支持了这样的假设，即染色质组织不是由细胞核的形状决定的。另一方面，似乎核仁的大小及其在细胞核中的位置会影响间期的染色体定位。对大量细胞核的分析证实了染色体组织成核区域的变异性以及它们在从不同组织类型分离的细胞核内和细胞核之间的相互定位。此外，超分辨率 STED 显微镜的使用证实了从两种研究的植物组织分离的间期细胞核中染色质折叠和组织的显著差异。

数据可用性声明

本研究分析了公开可用的数据集。此数据可在此处找到:http://rice.uga.edu/。

作者贡献

AD:概念化、调查、方法学、撰写 - 原始草案、撰写 - 审阅与编辑。DB:调查、方法学、撰写 - 审阅与编辑。VK:方法学、撰写 - 审阅与编辑。EH:概念化、调查、方法学、监督、撰写 - 原始草案、撰写 - 审阅与编辑。

资金

作者声明已获得该文章研究、撰写和/或发表的资金支持。计算工作得到了捷克共和国教育、青年和体育部支持的“e-Infrastruktura CZ”项目(e-INFRA CZ LM2018140)以及国际ELIXIR基础设施一部分的ELIXIR-CZ项目(LM2018131)的支持。本研究由欧洲区域发展基金项目“植物作为全球可持续发展的工具”(编号:CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827)资助。

致谢

我们衷心感谢Jitka Weiserová和Petr Cápal博士进行流式分选，感谢Zdeňka Dubská提供出色的技术协助，感谢Lucie Kobrlová使我们能够在低温切片机上进行样品制备并提供技术支持。我们还要感谢Jana Cížková博士提出的宝贵意见。

利益冲突

作者声明，该研究是在不存在任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

出版商说明

本文中表达的所有主张仅为作者的主张，不一定代表其所属组织、出版商、编辑和审稿人的主张。本文中可能评估的任何产品或其制造商可能提出的任何主张，均未得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充材料可在以下网址在线获取:https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2024.1358760/ full#supplementary-material

补充图1

G1期根(A)和叶细胞核(B)中染色质测量的示例。核DNA用螺旋色素(红色)复染。

补充图2

根和叶中9号染色体排列(绿色)和45S rDNA(黄色)活性的差异。基于原始数据观察，使用BioRender.com创建了个体排列模型。

补充图3

细胞核形状与染色体区域关联之间的相关性。

补充视频1

处于G1期的水稻根细胞核。使用寡核苷酸荧光原位杂交(oligo-painting FISH)观察到2号染色体(黄色)和9号染色体(绿色)。用抗核仁纤维蛋白免疫标记(红色)对核仁进行染色。用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，蓝色)对核DNA进行复染。

补充视频2

处于G1期的水稻叶细胞核。使用寡核苷酸荧光原位杂交(oligo-painting FISH)观察到2号染色体(黄色)和9号染色体(绿色)。用抗核仁纤维蛋白免疫标记(红色)对核仁进行染色。用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，蓝色)对核DNA进行复染。

参考文献

Abbe, E. (1873). Beitrage zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrmehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie (in German). 9, 413-420. doi: 10.1007/BF02956173

Abranches, R., Beven, A. F., Aragón-Aclade, L., and Shaw, P. (1998). Transcription sites are not correlated with chromosome territories in wheat nuclei. J. Cell Biol. 143, 5- 12. doi: 10.1083/jcb.143.1.5

Albiez, H., Creme, M., Tiberi, C., Vecchio, L., Schermelleh, L., Dittrich, S., et al. (2006). Chromatin domains and the interchromatin compartment form structurally defined and functionally interacting nuclear networks. Chromosome Res. 14, 707-733. doi: 10.1007/s10577-006-1086-x

Anamthawat-Jónsson, K., and Heslop-Harrison, J. S. (1990). Centromeres, telomeres and chromatin in the interphase nucleus of cereals. Caryologia 43, 205-213. doi: 10.1080/00087114.1990.10796999

Aragón-Alcaide, L., Reader, S., Beven, A., Shaw, P., Miller, T., and Moore, G. (1997). Association of homologous chromosomes during floral development. Curr. Biol. 7, 905-908 13. doi: 10.1016/S0960-9822(06)00383-6

Avivi, L., and Feldman, M. (1980). Arrangement of chromosomes in the interphase nucleus of plants. Hum. Genet. 55, 281-295. doi: 10.1007/BF00290206

Bass, H. W., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Agard, D. A., and Cande, W. Z. (1997). Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J. Cell Biol. 137, 5- 18. doi: 10.1083/jcb.137.1.5

Bass, H. W., Wear, E. E., Lee, T. J., Hoffman, G. G., Gumber, H. K., Allen, G. C., et al. (2014). A maize root tip system to study DNA replication programmes in somatic and endocycling nuclei during plant development. J. Exp. Bot. 65, 2747-2756. doi: 10.1093/ jxb/ert470

Belmont, A. S. (2014). Large-scale chromatin organization: the good, the surprising, and the still perplexing. Curr. Opin. Cell Biol. 26, 69-78. doi: 10.1016/j.ceb.2013.10.002

Belmont, A. S., and Bruce, K. (1994). Visualization of G1 chromosomes: a folded, twisted, supercoiled chromonema model of interphase chromatid structure. J. Cell Biol. 127, 287-302. doi: 10.1083/jcb.127.2.287

Berr, A., and Schubert, I. (2007). Interphase chromosome arrangement in Arabidopsis thaliana is similar in differentiated and meristematic tissues and shows a transient mirror symmetry after nuclear division. Genetics 176, 853-863. doi: 10.1534/ genetics.107.073270

Bordas, J., Perez-Grau, L., Koch, M. H. J., Vega, M. C., and Nave, C. (1986). The superstructure of chromatin and its condensation mechanism: II. Theoretical analysis of the x-ray scattering patterns and model calculations. Eur. Biophys. J. 13, 175-185. doi: 10.1007/BF00542561

Brown, W. S., and Shaw, P. J. (1998). Nucleolar RNAs and pre-rRNA processing in plants. Plant Cell 10, 649-657. doi: 10.1105/tpc.10.5.649

Bystricky, K., Heun, P., Gehlen, L., Langowski, J., and Gasser, S. M. (2004). Long range compaction and flexibility of interphase chromatin in budding yeast analysed by high-resolution imaging techniques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 16495-16500. doi: 10.1073/pnas.0402766101

Chubb, J. R., Boyle, S., Perry, P., and Bickmore, W. A. (2002). Chromatin motion is constrained by association with nuclear compartments in human cells. Curr. Biol. 12, 439-445. doi: 10.1016/S0960-9822(02)00695-4

Concia, L., Veluchamy, A., Ramirez-Prado, J. S., Martin-Ramirez, A., Huang, Y., Perez, M., et al. (2020). Wheat chromatin architecture is organized in genome territories and transcription factories. Genome Biol. 21, 1-20. doi: 10.1186/s13059- 020-01998-1

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