E3 SUMO连接酶PIASγ是调控糖尿病相关肝细胞核因子-1α活性的新型相互作用伴侣
发布时间：
2026-10-01 22:05
E3 SUMO连接酶PIASr 是调控糖尿病相关肝细胞核因子-1α活性的新型相互作用伴侣
Alba Kaci 、Magdalena Keindl 、Marie H. Solheim 、Pål R. Njølstad 、Lise Bjørkhaug 及Ingvild Aukrust
HNF-1A 参与胰腺发育。其罕见变异致单基因糖尿病，常见变异增2型糖尿病风险，但调控机制不明。本研究证实HNF-1A为SUMO化底物，K205和K273为位点。PIAS 过表达依赖双位点SUMO化抑制HNF-1A转录活性。PIAS 作为新互作伴侣诱导HNF-1A核周转位。综上，E3 SUMO连接酶PIAS 调控HNF-1A SUMO化及功能，为糖尿病诊疗提供新靶点。 HNF-1A由HNF1A基因编码，调控胰腺/肝脏特异性基因，参与器官发育与功能 。在胰腺 细胞中，HNF-1A与PDX-1、HNF-4A及HNF-1B等转录因子构成调控回路，对葡萄糖诱导的胰岛素分泌至关重要 。小鼠Hnf1a缺失导致代谢异常，包括胰腺 细胞葡萄糖感知缺陷、高胆固醇血症及胰岛发育相关基因表达异常 ，凸显其在控制胰岛 细胞功能中的作用 。尽管罕见HNF1A变异主要致青少年成年发病型糖尿病(MODY3；OMIM #600496) ，常见变异亦是2型糖尿病风险因素 。
HNF-1A以活性形式形成同源或异源(与HNF-1B)二聚体，均由二聚化辅因子 稳定。其他参与转录调控的辅因子包括CBP 、P/CAF 和HMGB1 ，均正向调节其反式激活功能。已知PTMs调控HNF-1A:ATM激酶磷酸化增强其转录活性 ，泛素介导的蛋白酶体降解是其清除机制 。然而，HNF-1A转录调控及PTMs相关的确切机制仍不明确。
SUMO化是一种高度动态且可逆的、依赖ATP的蛋白质翻译后修饰(PTM)过程，涉及一系列不同的蛋白质/酶，包括E1(激活酶)、E2(结合酶)、E3 SUMO连接酶，且可被SENP家族的SUMO特异性蛋白酶逆转 。在胰腺 细胞中，SUMO化调控胰岛素分泌相关关键蛋白的功能，包括MafA 、PDX-1 等转录因子、葡萄糖感受器葡萄糖激酶 以及电压依赖性 (Kv)通道 。因此，靶向SUMO化级联反应被认为是一种潜在的糖尿病治疗方法 。
收稿日期:2018年4月30日 接受日期:2018年7月9日 在线发表日期:2018年8月24日
卑尔根大学临床科学系，KG Jebsen糖尿病研究中心，5021 卑尔根，挪威。 豪克兰大学医院医学遗传学系，5021 卑尔根，挪威。 豪克兰大学医院儿科与青少年科，5021 卑尔根，挪威。 西挪威应用科技大学生物医学实验室科学与化学工程系，5063 卑尔根，挪威。 材料相关的通讯及索取请寄至P.R.N.(电子邮箱:Pal.Njolstad@uib.no)或
图1. HEK293细胞中，HNF-1A可被SUMO-3和PIAS 进行SUMO化修饰。(a) 在瞬时转染了V5标签HNF-1A或空载体，同时转染HA标签SUMO-1或SUMO-3、HA标签UBC9和/或Flag标签PIASγ的HEK293细胞中，分析HNF-1A的SUMO化情况。细胞在含N-乙基马来酰亚胺和蛋白酶抑制剂的条件下裂解，使用抗V5抗体进行免疫沉淀。沉淀物(上半部分)和10 µg输入样品(下半部分)经SDS-PAGE分离后，用抗HA、抗V5和抗Flag抗体进行免疫印迹分析。完整印迹图见补充图S3。该实验在3个独立实验日重复进行(n = 3)。(b) SENP-1介导HNF-1A的去SUMO化。在瞬时转染了V5标签HNF1A或空载体，同时转染HA标签SUMO3、Flag标签PIASγ，以及不同浓度Flag标签SENP-1(0.25-0.75μg)的HEK293细胞中，通过V5免疫沉淀分离的样品经SDS-PAGE分离后，按上述方法进行免疫印迹分析。完整印迹图见补充图S4。该实验在2个独立实验日重复进行 。
在此，我们首次报告证据表明，HNF-1A在细胞内可被SUMO-3修饰，且其SUMO化水平会因E3 SUMO连接酶——活化STAT的蛋白抑制剂(PIASγ)的作用而增强。尽管SUMO-3和PIAS 的存在不影响HNF-1A蛋白的核水平或其DNA结合能力，但PIAS 会抑制HNF-1A的转录活性。此外，已证实PIAS 可与HNF-1A相互作用，并将HNF-1A隔离在核周边，从而诱导其对HNF-1A靶基因Ace2和Slc2a2的转录抑制。本研究首次报告，SUMO-3介导的HNF-1A SUMO化及其与PIAS 的相互作用，是调控HNF-1A核定位及转录活性的新机制。
结果
HNF-1A 是 SUMO-3 修饰的靶点。为研究 HNF-1A 是否为 SUMO 化的靶点，我们在 HEK293 细胞中过表达 HNF-1A(带 V5 标签)、SUMO-1 或 SUMO-3(带 HA 标签)，并在存在或不存在 E2 酶 Ubc9(带 HA 标签)或 E3 SUMO 连接酶 PIASγ(带 Flag 标签)的条件下进行实验。通过 V5 标签免疫沉淀进一步分离 HNF-1A，经 SDS-PAGE 分离后，使用标签特异性抗体(HA 和 V5)进行免疫印迹分析(图 1a)。在经抗 HA 抗体分析的免疫沉淀样品中，在共转染 SUMO-3 的细胞中观察到多条分子量高于 的条带，对应 HA-SUMO 结合的 HNF-1A(图 1a)。值得注意的是，与 SUMO-1 相比，HNF-1A 似乎更倾向于被 SUMO-3 修饰，因为在 共转染 SUMO-1 的细胞中仅能观察到一条微弱的高分子量条带。此外，共转染体系中 PIAS 的存在进一步提高了 SUMO-3 结合至 HNF-1A 的效率，但似乎不影响 SUMO-1 的结合。在仅转染 HNF-1A 的对照样品，或转染空载体及 SUMO 化机制组分的样品中，均未观察到高分子量条带。此外，在输入样品(图 1a)中，我们还观察到 SUMO-1 与 SUMO-3 结合至蛋白质的总体水平存在明显差异，后者似乎更频繁地结合至 HEK293 细胞中的蛋白质。此外，PIAS 的存在进一步提高了 SUMO-3 结合蛋白的总水平(图 1a)，但似乎对 SUMO-1 的结合无影响。接下来，为进一步验证在 SUMO-3 和 PIAS 存在时观察到的高分子量条带确实对应 SUMO 化形式的 HNF-1A，我们在 SUMO 特异性蛋白酶 SENP-1 存在的条件下进行了类似的免疫沉淀实验。如图 1b 所示，过表达逐渐增加量的 SENP-1 会降低 SUMO-3 结合的 HNF-1A 条带水平，证实 HNF-1A 是 SUMO-3 修饰的靶点。我们的研究结果进一步支持了这些发现，即 MIN6 细胞中的内源性小鼠 Hnf-1a 可被外源性 SUMO-3 修饰，且 SUMO-3 修饰水平会因共转染 PIASγ 而升高，因 SENP-1 的存在而降低(补充图 S1)。
K205 和 K273 是 HNF-1A 中 SUMO-3 的靶残基。SUMO 化通常发生在特定的 SUMO 共有基序内，该基序被描述为 ，其中 为大的疏水残基， 为任意氨基酸， (赖氨酸)为 SUMO 结合位点 。然而，也有研究报道该基序外的赖氨酸残基可发生 SUMO 化 。利用体外预测程序 SUMOplot(Abgent)和 GPS-SUMO(The Cuckoo Workgroup)，预测出 HNF-1A 中多个赖氨酸残基(K46、K158、K205、K222、K273 和 K506)可能为 SUMO 结合候选位点，且得分各异(图 2a)。但所有预测的赖氨酸残基均不在 SUMO 共有基序内。构建了所有预测的赖氨酸突变体，并在 HEK293 细胞中检测其对 HNF-1A SUMO 化的影响。与野生型(WT)相比，K205R、K273R 和 K506R 的高分子量 SUMO 化 HNF-1A 条带强度显著降低(图 2b、c)，表明这三个残基是 HNF-1A 的 SUMO 化位点，因此被选作进一步研究。有趣的是，SUMO-3 和 PIAS 的过表达似乎会降低未修饰的野生型 HNF-1A 及所有突变体的蛋白水平，这在输入样品中可观察到(图 2b)，其中 K506R 突变体的未修饰条带降低最为显著，当与 SUMO-3 和 PIAS 共同过表达时，其未修饰条带几乎无法检测到。由于 K506R 突变体在 SUMO 化机制存在时不稳定，难以确定 K506 是否为真正的 SUMO 化位点。由于两个 SUMO 位点突变体 K205R 或 K273R 均显示出一定程度的 SUMO 化，我们在 HEK293 细胞中研究了双突变体(K205RK273R)和三突变体(K205RK273RK506R)的 SUMO 结合水平(补充图 S2)。与野生型 HNF-1A 相比，两个突变体的高分子量 SUMO 化 HNF-1A 条带水平均降低，但均保留一定程度的 SUMO 化。
在MIN6细胞中，PIAS 会抑制HNF-1A的反式激活，且该过程需要HNF-1A在K205和K273位点同时发生SUMOylation。已有研究表明，SUMOylation可影响多种转录因子的活性，在大多数情况下作为靶基因反式激活的抑制因子 发挥作用。我们首先评估了在转染的MIN6细胞中，过表达SUMO-3和PIAS 对HNF-1A反式激活萤火虫荧光素酶报告基因(通过调控大鼠白蛋白启动子实现)的存在情况及影响。与仅转染HNF-1A的细胞(活性设为100%)相比，共表达SUMO-3和PIAS 可将HNF-1A的活性显著降低至约60%(图3a)。单独共表达SUMO-3并不影响HNF-1A的转录活性，而单独转染PIAS 则表现出最强的抑制作用，其对HNF-1A反式激活的抑制效果甚至强于与SUMO-3共同过表达时(与仅HNF-1A组的100%相比，分别约为40%和60%)(图3a)。接下来，为探究潜在SUMO靶赖氨酸残基的缺失是否会消除PIASγ介导的抑制作用，我们评估了SUMO-3和/或PIASγ对单突变体(K205R、K273R和K506R)、双突变体(K205RK273R)及三突变体(K205RK273RK506R)转录活性的影响(图3b)。所有突变体的基础活性本身均显著低于野生型HNF-1A(补充图S3)。与野生型类似，在SUMO-3和PIASγ同时存在时，单突变体K205R、K273R和K506R的活性也显著降低(约60%-70%)(图3b)，这表明转录抑制并不依赖于HNF-1A在单个赖氨酸残基上发生SUMOylation。相比之下，双突变体K205RK273R和三突变体K205RK273K506R的反式激活活性，无论是在SUMO-3与PIASγ共同作用下，还是仅PIASγ单独作用时，均未受到抑制，这表明这些位点的SUMOylation缺失会抑制对HNF-1A反式激活的抑制作用(图3b)。
SUMO化不影响HNF-1A的DNA结合能力。功能研究表明，部分转录因子的转录活性会被SUMO化抑制，具体机制包括招募抑制性辅因子 、影响其稳定性 或改变其DNA结合能力 。此外，已有研究报道PIAS家族成员如PIAS1和PIAS3可抑制其蛋白靶点的DNA结合活性 。因此，我们旨在探究SUMO化机制介导的HNF-1A反式激活作用减弱是否归因于HNF-1A DNA结合能力的丧失。为此，我们将从过表达野生型HNF-1A的HeLa细胞中分离得到的等量核组分，在SUMO-3和PIAS 存在的条件下，与对应大鼠白蛋白启动子HNF-1结合位点的花青5标记探针共同孵育，并通过电泳迁移率变动分析(EMSA)进行分析。还通过使用递增量的未标记寡核苷酸的竞争试验验证了寡核苷酸结合的特异性(补充图S4)。在所有样本中(阴性对照除外)均观察到DNA-HNF-1A蛋白复合物，但条带强度不同，表明DNA结合亲和力发生改变(图4)。更具体地说，单独存在SUMO-3或与PIAS 联合存在时，似乎仅轻微削弱HNF-1A的DNA结合能力，表现为对应HNF-1A-DNA复合物的条带强度降低(图4a)。经定量分析，与单独表达的HNF-1A(设定为100%)相比，这些条带所代表的DNA结合能力约为70%(图4b)。相反，单独与PIASγ共表达并未降低HNF-1A的DNA结合能力，表现为条带强度与单独表达HNF-1A相似，据估计 (图4b)。
图 2. K205 和 K273 是 HNF-1A 的 SUMO 化位点。(a) HNF-1A 蛋白的示意图，突出显示通过 SUMOplot 和 GPS-SUMO 计算机预测程序预测为 SUMO 化位点的赖氨酸残基。共价 SUMO 附着的预测基序中，赖氨酸残基以红色下划线标出。(b) HNF-1A 的定点突变实验表明，在 HEK293 细胞中，当赖氨酸(K)被精氨酸(R)替换为 K205、K273 和 K506 残基时，SUMO 化会消失。将细胞与 V5 标签的 HNF-1A(野生型或突变体)、HA 标签的 SUMO-3 以及 Flag 标签的 PIASγ 共同转染。在含 NEM 和蛋白酶抑制剂的条件下收集裂解物，并使用抗 V5 抗体进行免疫沉淀。沉淀物经 SDS-PAGE 分离后，用抗 HA 和抗 V5 抗体进行免疫印迹。全长印迹图见补充图 S5。该实验在三个独立的实验日重复进行(n = 3)。(c) 通过光密度分析对高分子量 SUMO 化条带进行定量，结果表示为与单独野生型相比的相对倍数变化(设为 1)。每个条带代表三次独立实验的平均值 。
SUMO 化不会改变 HNF-1A 的总核水平。先前研究已将 SUMO 化与某些转录调节因子的核定位效应相关联 ，例如研究表明，SUMO 化通过控制这些转录调节因子的核可用性和亚核定位，对其转录产生负调控作用 。基于此，我们接下来旨在研究 SUMO 化是否会影响 HNF-1A 的核水平。SUMO-3 和 PIAS 的存在对 HNF-1A 的核组分水平无显著影响，表明 HNF-1A 的总核水平不受 SUMO 化机制的影响(图 5a、b)。另一方面，根据免疫印迹结果，在 SUMO 化机制存在时，胞质 HNF-1A 的水平似乎略有降低(图 5a)。
为进一步评估 SUMO 化对 HNF-1A 亚细胞定位的影响，我们对瞬时转染的 HEK293 细胞进行了免疫荧光和共聚焦显微镜观察。这些分析显示，单独的 HNF-1A 定位于整个细胞核(核仁除外)，与先前报道一致 。在 SUMO 化机制存在时，观察到相同的分布(图 5c)，并证实了图 5a、b 的结果。由于胞质染色信号较弱，与强核信号相比，通过免疫荧光难以确认胞质 HNF-1A 水平的轻微降低(图 5c)。
图3. SUMO-3和PIASγ可抑制HNF-1A对大鼠白蛋白启动子的反式激活。(a, b) 在存在或不存在编码SUMO-3和/或PIASγ的质粒的情况下，在MIN6细胞中瞬时转染野生型HNF-1A或突变体K205R、K273R、K506R、K205RK273R及K205RK273RK506R，同时与报告质粒pGL3-RA和pRL-SV40共转染，进行HNF-1A的反式激活分析。将萤火虫荧光素酶活性相对于海肾活性(对照报告基因)进行标准化，空载体用作阴性对照。每个条(a, b)代表九次读数的平均值 ；在三个实验日的每一天进行三次平行读数(n = 3)。测量值以相对于野生型的活性倍数表示。*表示 *表示 。EV 空载体。
a)
图4. PIAS 不影响HNF-1A的DNA结合能力。(a) 在瞬时转染野生型HNF-1A或空载体、并共转染SUMO-3和PIAS 的HeLa细胞中分离的核组分中评估HNF-1A的DNA结合能力。在HNF-1A与Cy5标记的DNA寡核苷酸(对应于大鼠白蛋白中HNF-1的结合位点)孵育后，通过电泳迁移率变动分析(EMSA)分析HNF-1A-DNA结合。结合的复合物在6% DNA retardation凝胶上分离，并在670 nm处检测荧光信号。完整凝胶见补充图S6。(b) 通过光密度分析对结合进行定量，相对于单独的野生型(设定为100%)表示。每个条代表三次独立实验的平均值 。
PIAS 与 HNF-1A 相互作用，并降低 HNF-1A 的蛋白水平。接下来，我们研究了
PIAS 对 HNF-1A 活性的抑制是否由 HNF-1A 与 PIAS 的相互作用介导。首先在 HEK293 细胞中过表达 HNF-1A 和 PIAS ，并进行免疫共沉淀
a) b) 实验已完成(图6)。在以Flag抗体分析的HNF-1A免疫沉淀样品中，观察到在 处有一条PIAS 特异性条带，该条带仅存在于同时转染WT HNF-1A和PIAS 的样品中，而在仅表达HNF-1A的对照样品中不存在(图6a)，表明PIAS 与HNF-1A存在相互作用。我们进一步在存在或不存在PIASγ的情况下过表达K205R、K273R和K506R突变体(图6b)以及三突变体K205RK273RK506R(补充图S5)，并进行了类似的免疫共沉淀实验。与野生型类似，所有突变体均能结合PIASγ(图6b和补充图S5)，表现为每个样品中均存在一条PIASγ特异性条带，表明PIASγ与HNF-1A的结合不依赖于这些SUMO靶向赖氨酸残基中的任何一个。有趣的是，我们还注意到，PIASγ的过表达导致未修饰的HNF-1A条带强度略有降低(图6a)。PIASγ对HNF-1A蛋白水平的这种影响也在我们最初的免疫沉淀实验中观察到(图2b)。因此，为了评估PIASγ是否影响HNF-1A的稳定性，我们在HEK293细胞中过表达HNF-1A的同时，加入了不同浓度的PIASγ质粒。PIAS 质粒的剂量依赖性增加显著降低了RIPA裂解后上清组分中检测到的HNF-1A蛋白水平(图7a, b)。综上所述，这些结果表明，PIAS 与HNF-1A存在直接或通过其他未知修饰因子的间接相互作用，且这种相互作用会导致HNF-1A总蛋白水平降低。
图 5. SUMO 化并非 HNF-1A 核定位所必需。(a) 将带有 V5 标签的野生型 HNF-1A 与表达 HA 标签的 SUMO-3 和/或 Flag 标签的 PIAS 的载体(如所示)共同瞬时转染 HeLa 细胞，通过细胞组分分离、SDS-PAGE 和免疫印迹分析评估 HNF-1A 的亚细胞定位。“N”表示核组分，“C”表示胞质组分。采用针对核标记蛋白(拓扑异构酶 IIα，上)和胞质特异性标记蛋白(GAPDH)的抗体验证组分纯度。全长印迹图见补充图 S7。(b) 将核组分中 HNF-1A 的水平相对于拓扑异构酶 IIα 进行标准化。结果以仅转染 HNF-1A 的细胞中 HNF-1A 的核水平为参照表示。每个柱代表三次独立实验的平均值 。(c) 将带有 V5 标签的野生型 HNF-1A(绿色)单独或与 HA 标签的 SUMO-3 和/或 Flag 标签的 PIAS 的载体共同瞬时转染 HEK293 细胞。采用抗 V5 抗体和共聚焦显微镜通过免疫荧光分析观察 HNF-1A 的定位。该实验在两个独立实验日重复(n=2)。用 DAPI(蓝色)对细胞核进行染色。比例尺: 。
图 6. PIAS 与 HNF-1A 相互作用。(a) 将带有 V5 标签的 HNF-1A 或空载体与 Flag 标签的 PIASγ 共同瞬时转染 HEK293 细胞，进行 HNF-1A 和 PIAS 的免疫共沉淀分析。裂解细胞后，采用抗 V5 抗体进行免疫沉淀。将沉淀物(左)和 输入样品(右)通过 SDS-PAGE 分离，并采用抗 Flag 和抗 V5 抗体进行免疫印迹分析。该实验在两个独立实验日重复(n = 2)。(b) HNF-1A 中 K205、K273 和 K506 的突变不影响 PIASγ 与 HNF-1A 的结合。将野生型 HNF1A、K205R、K273R 或 K506R 与 Flag 标签的 PIASγ 共同瞬时转染 HEK293 细胞。如 (a) 所述，采用抗 V5 抗体免疫沉淀、SDS-PAGE 分析和免疫印迹对裂解物进行类似分析。全长印迹图见补充图 S8。该实验在两个独立实验日重复 。
为了探究PIAS 介导的胞质HNF-1A蛋白减少是否可通过HNF-1A的蛋白酶体降解增加来解释，正如其他蛋白 所示，我们在存在或不存在SUMOylation机制的情况下，将HNF-1A过表达于HEK293细胞中，随后用蛋白酶体抑制剂MG132处理(图7c、d)。MG132处理和RIPA裂解后，从澄清裂解物中检测到HNF-1A蛋白增加，证实无论是否存在SUMO-3和PIAS ，HNF-1A均受蛋白酶体降解系统调控，这与之前的研究结果 一致。然而，抑制蛋白酶体降解系统后，HNF-1A蛋白的总水平未检测到差异，表明图7a、b中观察到的PIAS 介导的HNF-1A蛋白水平降低并非由蛋白酶体系统引起。
PIAS 将 HNF-1A 靶向至核周区域，并导致已知 HNF-1A 调控的靶基因被抑制
为探究HNF-1A蛋白水平降低的原因，在去除细胞碎片的
RIPA 裂解液中，当存在 PIAS 时，我们接下来分析了 RIPA 裂解后得到的沉淀组分，该组分包含细胞碎片、不溶性蛋白及膜组分。
碎片、不溶性蛋白和膜组分。有趣的是，我们注意到，与不含PIAS 的沉淀组分相比，在存在PIAS 时，沉淀样品中的HNF-1A蛋白显著增加(图8a, b)。这些结果表明，PIAS 促进HNF-1A向膜区室发生亚细胞转位，在该膜区室中，常规RIPA裂解无法释放HNF-1A。
图 7. PIAS 以剂量依赖性方式降低胞质 HNF-1A 蛋白水平。(a) 将 V5 标签的 HNF-1A 与递增剂量的 Flag 标签 PIAS 共同瞬时转染 HEK293 细胞，通过 SDS-PAGE 和免疫印迹法，使用指定抗体分析 PIAS 对去除细胞碎片的裂解液中 HNF-1A 蛋白的影响。完整印迹图见补充图 S9。(b) 将 HNF-1A 水平标准化为肌动蛋白水平，并以单独 HNF-1A 的水平为参照进行相对表达。结果显示为四次独立实验的平均值 。*表示 。(c) 将 V5 标签的 HNF-1A 在存在或不存在 HA-SUMO-3 和 Flag 标签 PIAS 的情况下瞬时转染 HEK293 细胞。转染后，用 MG132 或 DMSO 处理细胞 8 小时，通过 SDS-PAGE 和免疫印迹法，使用指定抗体分析去除细胞碎片的裂解液中的蛋白。完整印迹图见补充图 S10。(d) 通过光密度分析对 (c) 中所示蛋白进行定量。将 HNF-1A 水平标准化为上样对照(肌动蛋白)水平。每列代表 MG132 处理样品与 DMSO 处理对照在两个不同实验日的平均倍数变化 标准差 。
我们进一步通过免疫荧光实验和共聚焦显微镜，在瞬时转染的 HEK293 细胞中研究了 PIAS 对 HNF-1A 核分布的这种影响。有趣的是，HNF-1A 与 PIAS 共表达导致 HNF-1A 重新分布至核周区域，根据重叠的免疫荧光信号，观察到 HNF-1A 在该区域与 PIAS 共定位(图 8c)。因此，该观察结果表明 PIAS 将 HNF-1A 隔离在核周区域。为进一步探究 HNF-1A/PIAS 的相互作用以及 HNF-1A 向核膜的重新定位是否会导致 HNF-1A 调控的靶基因被抑制，我们对 MIN6 β 细胞中三个已知的 HNF-1A 靶基因进行了 qPCR 分析，即 Ace2 、Slc2a2 和 ，并比较了单独过表达 HNF1A 或同时过表达 HNF1A 和 PIASγ 的细胞中的 mRNA 水平(图 8d)。有趣的是，在存在 PIASγ 的情况下，Ace2 和 Slc2a2 的表达降低，而 Crp 的水平保持不变。
讨论
尽管HNF1A突变是最常见的遗传性糖尿病类型，但其基因产物HNF-1A的具体调控机制在很大程度上仍不明确。近期研究强调，产生胰岛素的 细胞中蛋白质翻译后修饰(PTM)的平衡对维持葡萄糖稳态至关重要，尤其是SUMO化 的作用。因此，本研究探讨SUMO化是否可能是正常调控HNF-1A的关键机制。
不同的SUMO亚型通过修饰单个蛋白 发挥不同的功能作用。例如，RanGAP1主要由SUMO-1修饰，较少由SUMO-3 修饰，SUMO-3和 )在过表达HNF1A的MIN6细胞中，在不存在或存在PIASy的情况下进行了研究，并通过qPCR测定。靶基因表达以参考基因Gapdh进行标准化，表示为仅HNF1A 相对于两个生物学重复 的平均倍数变化。主要修饰核肌动蛋白 。我们的数据支持，与SUMO-1相比，HNF-1A更倾向于被SUMO-3修饰(图1a)。此外，在分析的HEK293细胞中，SUMO-3似乎更频繁地与蛋白结合，这与之前的报道一致，即SUMO-3修饰细胞蛋白的潜力远高于SUMO-1 。
图8. PIAS 将HNF-1A转运至核周区域，并导致已知HNF-1A靶基因的表达降低。(a, b) 经RIPA裂解后，对瞬时转染了V5标签HNF-1A的HEK293细胞，在有无PIAS 的情况下，收集沉淀组分，通过SDS-PAGE和免疫印迹法，使用指定抗体进行分析。采用Image Lab v.6.0.0软件(BIO-RAD)通过光密度分析对HNF-1A的水平进行定量，并以α-微管蛋白进行标准化。完整的印迹图见补充图S11。定量结果以单独HNF-1A的水平为参照进行相对表示。结果显示为三次技术重复实验的平均值 。P表示平行。(c) 瞬时转染表达V5标签HNF-1A和/或Flag-PIASγ的构建体，或按图中所示组合转染至HEK293细胞。分别通过针对V5标签和Flag标签的免疫染色，对HNF-1A(绿色)和PIASγ(品红色)进行可视化，并通过共聚焦显微镜分析。细胞核用DAPI(蓝色)染色。转染的HNF-1A与PIAS 的共定位情况见下图。比例尺为10μm。(d) 三个已知HNF1A靶基因(Ace2、Slc2a2
此外，SUMO E3连接酶PIASγ提升了SUMO化HNF-1A水平，印证了此前关于其作为SUMO化催化剂的研究 。
SUMO化的HNF-1A呈现为多条高分子质量条带(图1)。已知SUMO-3可单独或作为SUMO链连接至同一靶残基 ，因此HNF-1A可能在一个靶赖氨酸位点被SUMO-3多SUMO化，和/或在多个位点被连续SUMO化。通过生物信息学预测工具及候选赖氨酸突变体的SUMO化水平评估分析，确定K205和K273是最重要的SUMO化位点残基(图2b、c)。K506的相关性较难确定，因为K506R突变体在存在或不存在SUMO化机制的情况下均表现出极不稳定性(图2b、补充图S3及未发表数据)。因此，K506R的可检测SUMO化形式减少可能是由于K506R蛋白水平降低，从而掩盖了K506是否为真正的SUMO化位点。由于双突变体(K205RK273R)和三突变体(K205RK273RK506R)均存在一定程度的SUMO化(补充图S2)，这提示要么i)HNF-1A中存在比K205和K273更多的SUMO化位点，要么ii)HNF-1A的SUMO位点特异性存在一定冗余，正如其他研究者针对不同SUMO靶标所提及的 。
功能效应显示，SUMO-3/PIAS 显著抑制HNF-1A转录活性(图3a)。该抑制不依赖K205和K273位点SUMO化，因SUMO化缺陷突变体(K205R/K273R)亦被PIASγ/SUMO3抑制。相反，双/三突变体K205RK273R(K506R)经PIASγ/SUMO-3或单独PIASγ处理后，其转录活性未降低(图3b)，表明这些赖氨酸同时SUMO化对PIASγ介导的抑制至关重要。
支持K205、K273和K506在HNF-1A蛋白结构中重要性的依据是，它们在不同物种间高度保守，且在旁系同源物HNF-1B中也保守。残基K205和K273位于DNA结合结构域，而K506位于转录激活结构域(图2a)。值得注意的是，所有SUMO位点赖氨酸 精氨酸突变体的基线转录活性均显著低于野生型HNF-1A的活性(补充图S3)。其活性降低的一种可能解释是，这些赖氨酸是维持HNF-1A正常结构和活性的重要残基。此前关于K205的研究表明，该赖氨酸残基对于结构域间相互作用、蛋白质的正确折叠/结构及HNF-1A的稳定性至关重要，而该赖氨酸的缺失(K205Q突变)会因不稳定性导致蛋白水平降低，进而使可检测的转录活性降低 。残基K506似乎对HNF-1A的稳定性和活性也至关重要，因为在本研究中，K506R突变体在所有单突变体中表现出最低的转录活性(补充图S3)，且我们的免疫荧光分析(未展示数据)也显示染色较弱提示蛋白水平降低。如前所述，HNF1A的功能缺失突变会导致最常见的单基因糖尿病(HNF-1A-MODY；MODY3)，该疾病的特征是葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少 。有趣的是，K205(K205Q)和K273(K273N)的错义变异与MODY3相关 。这进一步支持了这些赖氨酸残基对HNF-1A正常功能的重要性。因此，SUMO化对这些糖尿病相关变异体及SUMO化位点缺陷突变体的正常调控极有可能受损(图2b)。
靶蛋白SUMO结合的另一关键是SENPs的可逆作用。近期研究显示葡萄糖可激活SENP-1 。我们证实，SENP-1能有效去SUMO化HNF-1A(图1b)及Hnf-1a(补充图S1)。鉴于SUMO-3介导的修饰抑制HNF-1A转录活性，高糖可能通过激活SENP-1促进其去SUMO化，从而增强该蛋白在高糖环境下的活性。
在本研究中，E3连接酶PIAS 是HNF-1A的新相互作用伴侣(图6)，且在荧光素酶检测中，使用大鼠白蛋白启动子可显著降低HNF-1A的反式激活作用(图3a)。此外，我们发现，在MIN6细胞中，HNF1A/PIAS 共转染可降低已知HNF-1A靶基因(即Ace2和Slc2a2)的表达(图8d)。既往研究表明，PIAS 可通过招募转录共抑制因子 ，或通过在细胞核内重新定位转录因子来抑制转录 。本研究支持PIAS 介导的HNF-1A向核膜移位的观点，免疫荧光、共聚焦成像分析以及细胞沉淀组分分析(图8)均证实了这一点。既往已有研究报道，PIAS 可将CCAAT/增强子结合蛋白6从具有转录活性的核灶移位至核周边，从而抑制该蛋白 的转录能力。既往研究表明，核周边，尤其是内核膜，是参与基因表达调控的细胞区域 。更具体地说，当转录因子进入细胞核时，核内膜蛋白(如核纤层蛋白和emerins)可与多种转录因子发生物理相互作用。通过这种方式，它们限制了转录因子对核小体中靶基因的访问，而核小体正是转录发生的场所，因此可诱导转录抑制 。我们认为，PIAS 对 HNF-1A反式激活的抑制作用，可能是由于PIASγ介导的HNF-1A被隔离在核周边，进而限制了HNF-1A对其靶基因的访问，正如在PIAS 存在时观察到的Ace2和Slc2a2 mRNA表达降低所证实的那样(图8d)。一个有吸引力的假设是，PIAS 介导的HNF-1A活性抑制发生在低糖条件下以及 细胞静息状态中。
总之，本研究表明，HNF-1A的SUMO化是HNF-1A的一种新型翻译后调控机制。此外，我们已将PIAS 鉴定为可增强HNF-1A SUMO化的新型HNF-1A相互作用伴侣。此外，PIASγ与HNF-1A的相互作用会导致HNF-1A重新定位至核周边，从而限制其对靶基因的访问，进而降低HNF-1A的整体转录活性。这一新发现对糖尿病精准医学具有重要意义，因为它揭示了PIAS 调控HNF-1A的新机制以及功能改变，为HNF-1A相关糖尿病的药物开发提供了潜在新靶点。
方法
细胞系与转染。MIN6细胞培养于添加了15%热灭活胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(含4.5 g/L葡萄糖)中。HEK293和HeLa细胞培养于添加了10%热灭活FBS的DMEM培养基(含4.5 g/L葡萄糖)中。所有培养基均添加青霉素/链霉素。如无特殊说明，转染使用Lipofectamine-2000(Invitrogen)进行。
载体构建。使用Life Technologies的pcDNA3.1/V5-HisC载体，其中包含HNF1A cDNA(NCBI Entrez Gene BC104910.1)。所有HNF1A的赖氨酸→精氨酸突变体均使用QuikChange XL定点诱变试剂盒(Stratagene)构建。引物序列见补充表1。编码人HA标签SUMO-1和SUMO-3(位于pcDNA 3.1中)的质粒由Frauke Melchior教授(德国海德堡)惠赠。编码人HA标签UBC9(p3258 pCMV4)(#14438)、Flag标签PIASγ(pCMV)(#15208)和Flag标签SENP1(pCMV)(#17357)的质粒购自Addgene。在转录激活实验 中，使用了含大鼠白蛋白基因启动子(核苷酸-170至+5)的萤火虫荧光素酶报告载体pGL3-RA(Promega)，以及编码海肾荧光素酶基因的pRL-SV40报告载体(Promega)。
荧光素酶实验。将MIN6细胞瞬时共转染表达野生型或突变体HNF1A cDNA的质粒，以及HA-SUMO3、Flag-PIASγ和表达萤火虫与海肾荧光素酶的报告质粒。转染后，使用双荧光素酶检测系统(Promega)在Chameleon发光仪(Hidex)中测定转录激活情况。荧光素酶活性通过海肾荧光素酶的表达进行标准化。
免疫共沉淀。将HEK293细胞瞬时转染指定质粒后，使用含 N-乙基马来酰亚胺和蛋白酶抑制剂混合物的冰浴IP裂解/洗涤缓冲液(Thermo-Fisher)收集。蛋白质浓度使用Direct Detect光谱仪(Merck Millipore)测定。免疫共沉淀(Co-IP)使用V5抗体(Thermo-Fisher；#R960-25)和Pierce Co-IP试剂盒(Thermo-Fisher)进行。样品经SDS-PAGE分离后进行免疫印迹，使用的抗体包括小鼠抗V5(Thermo-Fisher)、兔抗HA(Cell Signaling；#3724)、兔抗Flag(Cell Signaling；#2368)以及辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
内源性SUMO化HNF-1A。瞬时转染指定质粒的内源性表达Hnf-1a的MIN6细胞，使用添加了NEM和蛋白酶抑制剂(Cytoskeleton)的冰浴BlastR裂解缓冲液收集。根据制造商方案，使用Signal-Seeker SUMOylation 2/3检测试剂盒(Cytoskeleton)通过免疫沉淀分离内源性SUMO化Hnf-1a蛋白。洗脱样品经SDS-PAGE分离后进行免疫印迹，使用的抗体包括兔抗HNF-1A(Cell Signaling；# 89670 S)、兔抗Flag(Cell Signaling；#2368)和小鼠HRP标记抗SUMO2/3(Cytoskeleton)。
蛋白表达分析。将HEK293细胞瞬时共转染表达HNF1A cDNA和递增剂量Flag-PIAS 的质粒。转染后，使用含20 mM NEM和蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液(Thermo-Fisher)收集细胞。蛋白质浓度使用Pierce™ BCA蛋白检测试剂盒(Thermo-Fisher)测定。沉淀样品进一步用Benzonase(Sigma-Aldrich)处理 。样品经SDS-PAGE分离后进行免疫印迹，使用的抗体包括小鼠抗V5(Thermo-Fisher)、兔抗Flag(Cell Signaling)、山羊抗肌动蛋白(Santa Cruz；sc-1615)和抗α微管蛋白-HRP(Abcam；Ab40742)抗体。
电泳迁移率变动分析(EMSA)。使用了 Sigma-Aldrich 公司的花青 5 标记寡核苷酸，该寡核苷酸为包含大鼠白蛋白序列(-63/-41)的 PE56 双链 DNA 片段(5’-TGTGGTTAATGATCTACAGTTA-3’)。DNA 结合反应使用了来自瞬时转染 HeLa 细胞的 核组分，以及 Odyssey EMSA 缓冲液试剂盒(LI-COR Biosciences)。
细胞组分分离。转染指定质粒的HeLa细胞在转染后用PBS收集。通过将细胞沉淀重悬于缓冲液A(10 mM Hepes pH 7.8、1.5 mM MgCl₂、10 mM KCl、0.1% IGEPAL、0.5 mM DTT、无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物)中，随后在冰上孵育30分钟，并以 、 、 的条件离心，收集胞质组分。接下来，用缓冲液A洗涤核沉淀两次，并重悬于缓冲液B(20 mM Hepes pH 7.8、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl、0.2 mM EDTA、0.5 mM DTT、无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物)中，随后在冰上孵育30分钟，期间每分钟涡旋一次。通过以 、 的条件离心进一步收集核组分。使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒(赛默飞世尔科技)测定蛋白浓度。各组分经SDS-PAGE分离后，采用兔抗HNF1A抗体(细胞信号技术公司；货号#89670)进行免疫印迹，分别使用针对核和胞质特异性标记蛋白拓扑异构酶IIα(细胞信号技术公司；货号#12286)和GAPDH(圣克鲁兹生物技术公司；货号sc-47724)的抗体验证各组分的纯度。
免疫荧光与共聚焦显微镜观察。将 HEK293 细胞接种至盖玻片上，使用 JetPrime 转染试剂(PolyPlus)进行瞬时转染。转染后，用 3% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟，然后在含 0.1% Tween 20(PBS-T)、0.1% Triton X-100 的 1× PBS 中于室温下透化 20 分钟，再在室温下用 PBS-T 稀释的 5% 山羊血清孵育 30 分钟。随后，细胞与小鼠抗 V5 抗体(1:500；Thermo Fisher)和/或兔抗 Flag 标签抗体(1:200；Thermo Fisher；货号:PA1-984B)孵育。二抗使用抗小鼠 IgG-Alexa Fluor 488(Thermo Fisher；货号:A11017)和/或抗兔 IgG-Alexa Fluor 594(Thermo Fisher；货号:A11037)，稀释比例为 1:200。细胞在 4°C 下用 PBS-T 洗涤过夜，盖玻片用含 DAPI 的 ProLong Gold(Thermo Fisher)封片，然后使用 TCS SP5 AOBS 共聚焦显微镜(Leica Microsystems)成像。
RNA分离及基因表达分析采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)。使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)从瞬时转染了表达人HNF1A cDNA和/或人PIASγ的质粒的MIN6细胞中分离总RNA。在RNA分离过程中，还使用无RNase的DNase套装(QIAGEN)进行柱上DNase消化步骤，以消除基因组DNA污染。随后，使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher)从每个样品的总RNA(500 ng)中合成cDNA，并在无RNase水中进一步稀释5倍。qPCR分析使用TaqMan通用PCR master mix(Applied Biosystems)及以下TaqMan FAM探针(Applied Biosystems):人HNF1A(Hs00167041_m1)、人PIASγ(Hs00249203_m1)、小鼠Ace2(Mm01159003_m1)、小鼠Crp(Mm00432680_g1)、小鼠Slc2a2(Mm00446229_m1)和小鼠Gapdh(Mm99999915_g1)。扩增反应在ABI Prism 7500(Thermo-Fisher)中进行。每次反应设置三个复孔，采用比较CT法对每个样品中mRNA的量进行相对定量，以Gapdh转录本水平进行标准化。
统计分析。所有数据以平均值 标准差(STD)表示，除非另有说明，实验均至少独立进行3次。统计分析采用双尾Student’s t检验，当p值 时认为具有统计学意义。
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糖尿病,转录因子,SUMO化,HNF‑1A,PIASγ
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