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纤维蛋白降解产物通过肌动蛋白细胞骨架调控创伤性脑损伤中的内皮屏障功能

发布时间：

2026-10-01 22:45

纤维蛋白降解产物通过肌动蛋白细胞骨架调控创伤性脑损伤中的内皮屏障功能

Ayhan Atmanli, Aidan Michael Collier, Scott Douglas Olson, 与 Charles Samuel Cox,

摘要

创伤性脑损伤相关凝血病(TBI-C)较无凝血病TBI致更重残疾及更高死亡率。纤维蛋白降解产物(FDPs)虽在纤溶亢进中产生，但其致内皮病变及血脑屏障(BBB)功能障碍机制未明。本研究对经分离人FDPs(D-二聚体、片段D/E [FragD、FragE])处理的人原代内皮细胞(ECs)，以及经高FDP重度TBI患者或健康者血浆处理的ECs-星形胶质细胞共培养物，进行结构、功能及转录分析。FragD和FragE暴露增加EC屏障通透性；尽管VE-钙黏蛋白和ZO-1表达及膜定位维持，超分辨率成像显示其囊泡内定位增加。二者还促进肌动蛋白应力纤维形成及F/G-肌动蛋白比值升高。转录上，影响黏附、迁移及血管生成基因。TBI血浆处理的共培养物显示应力纤维增加、F/G比值升高及300+差异基因，含调控细胞间相互作用及机械转导基因。表明FDPs通过破坏肌动蛋白骨架及连接蛋白互作介导内皮屏障障碍。FDPs在纤溶亢进与内皮病变间的分子联系使其成为TBI-C治疗靶点，需进一步研究阐明机制框架。

关键词:血脑屏障；凝血病；内皮病变；纤维蛋白降解产物；创伤性脑损伤

引言

创伤性脑损伤(TBI)是发病率和死亡率的主要诱因，在美国每年约造成万人次前往急诊室(ED)就诊，并导致5.6万人死亡。尽管TBI初始为急性病症，但其影响可能是慢性的、致残性的，且会严重改变

us.sagepub.com/en-us/nam/open-access-at-sage). 受影响者。脑外伤(TBI)复杂病理生理学中的核心角色是血脑屏障(BBB)，它是循环系统与神经组织之间的界面，由包括内皮细胞(ECs)、周细胞、星形胶质细胞和细胞外基质(ECM)在内的多细胞结构组成。血脑屏障作为将神经组织与循环系统分隔开的半透性屏障，其结构和功能完整性对于维持神经保护性微环境至关重要；若该微环境遭到破坏，便会引发或加重多种神经系统疾病中出现的病理生理学变化，例如中风、脑出血、中枢神经系统感染以及神经退行性疾病。原发性脑损伤后内皮功能失调与星形胶质细胞激活是血脑屏障破坏及后续继发性脑损伤与脑水肿病理生理学过程中的关键步骤。

美国得克萨斯大学休斯顿健康科学中心麦戈文医学院儿科外科系，得克萨斯州休斯顿，美国。

贝勒医学院得克萨斯儿童医院儿科系急诊医学科，得克萨斯州休斯顿，美国。

摘要:纤维蛋白降解产物通过调控肌动蛋白细胞骨架相关的分子通路紊乱，导致TBI中的内皮屏障破坏。

*通讯作者:Ayhan Atmanli 医学博士、哲学博士，美国得克萨斯大学休斯顿健康科学中心麦戈文医学院儿科外科系(邮编77030)；邮箱:ayhan.atmanli@uth.tmc.edu

TBI合并的凝血病(TBI相关性凝血病；TBI-C)是TBI常见的并发症，根据损伤严重程度，影响超过三分之一的TBI患者。与未合并凝血病的TBI患者相比，TBI-C患者的长期残疾率和死亡率显著更高。 TBI-C的病理生理过程复杂且多因素，涉及多种机制，包括BBB机械性破坏、内皮病变、炎症、内皮糖萼脱落、血小板功能障碍以及凝血级联激活，进而导致因子耗竭和凝血病的发生。初始原发性脑损伤会在损伤部位机械性破坏BBB，使组织因子等脑源性物质渗漏进入体循环，进而激活凝血级联。组织因子也存在于血小板源性和内皮源性微粒中，可延续凝血效应。内皮病变的发生不仅源于微血管的直接损伤，还可因灌注不足和休克导致内皮细胞(EC)表型向通透性内皮屏障转变及自身肝素化。有趣的是，创伤和TBI可在无失血性休克的情况下诱发纤溶亢进状态，类似弥散性血管内凝血，其本身可能独立导致局部内皮病变和BBB破坏，以及损伤部位局部及远处颅内出血的延迟发生。事实上，已证实纤溶过程中产生的纤维蛋白降解产物(FDP)与创伤患者大量输血需求、凝血病及出血相关死亡相关。此外，FDP水平升高与TBI患者预后不良相关。尽管已证实FDP在细胞培养中可直接改变内皮细胞功能和通透性模型，但在TBI合并纤溶亢进的情况下，FDP诱导的内皮病变和BBB功能障碍的潜在分子机制仍未得到充分研究。

对于单纯创伤性脑损伤(TBI)患者，在未合并出血性休克的情况下，早期使用血液制品纠正凝血病是否能降低发病率或死亡率，目前尚无定论。目前仍不清楚在急诊室应如何最佳处理TBI-C，因此迫切需要针对TBI-C的分子机制以逆转该病症的新型疗法。因此，在TBI-C的急性治疗窗口内，针对TBI-C病理生理学的分子机制进行靶向治疗可能是一种更有效的方法。本文中，我们在人血脑屏障(BBB)体外模型中，探究了纤维蛋白降解产物(FDPs)——D-二聚体、片段D和片段E——对内皮细胞(ECs)的功能、结构及转录特征的分子效应。我们发现，FDPs可通过肌动蛋白细胞骨架的失调直接破坏内皮屏障活性。我们进一步发现，这些变化与内皮转录谱的广泛改变相关，尤其涉及与细胞黏附、细胞迁移和血管生成相关的基因。最后，我们使用临床相关的转化型体外疾病模型证实，将人BBB培养物暴露于重度TBI且FDP水平高的患者血浆中，会导致BBB通透性破坏、肌动蛋白细胞骨架失调以及基因的转录失调，其中许多基因调控细胞黏附、细胞连接组织和细胞机械转导。本文所述的研究结果加深了我们对TBI-C病理生理学的理解，并提供了可延伸至其他发生纤溶亢进的创伤临床表现的机制见解。

方法

内皮细胞培养

原代人脑微血管内皮细胞(HBMECs)购自Cell Systems(货号:ACBRI 376)，按照制造商的方案扩增至P5代，然后制备冻存株。所有实验均在包被了减少生长因子的Matrigel(货号:356231，Corning)的表面上培养HBMECs。细胞培养维持阶段，HBMECs在添加了5%胎牛血清(FBS，Lonza)的EGM2-MV微血管内皮细胞生长培养基中培养。当细胞汇合度达到90%-100%时进行传代使用TrypLE Express(Thermo Fisher)，在从冻存株开始培养后最多再传2代。接种用于终点实验时，HBMECs在添加了视黄酸(R2625，Sigma Aldrich)的EGM2-MV培养基中培养，直至达到汇合度。已有研究表明，视黄酸是内皮细胞(ECs)血脑屏障(BBB)特性的关键调节因子。

BBB培养

针对图4A-B、4D-E和图5所示实验，我们采用了由内皮细胞(EC)和星形胶质细胞组成的人血脑屏障(BBB)体外模型。原代人星形胶质细胞(HA；货号1800，ScienCell公司)在星形胶质细胞培养基(货号1801，ScienCell公司)中扩增，并制备了冻存株。启动BBB培养时，接种人脑微血管内皮细胞(HBMEC)，两天后在其上方接种星形胶质细胞。共培养物在EGM2-MV培养基中培养至汇合。

患者血浆

本研究使用了3例单纯TBI患者的血浆，这些患者D-二聚体水平高，无出血或多发伤证据。以3例单纯骨科损伤患者作为对照，这些患者无TBI或创伤，D-二聚体水平低。本研究使用的血浆样本为患者首次就诊于急诊时采集。血浆D-二聚体和纤维蛋白原水平通过标准ELISA定量检测。补充表S1提供了本研究使用血浆的患者的更多信息。

生物样本和临床数据收集是德克萨斯大学休斯顿健康科学中心(UTHealth Houston)正在进行的一项研究的一部分，该研究旨在建立一个去标识化的生物样本库和注册系统，用于探索性观察和研究。原始方案已获得UTHealth Houston(HSC-GEN-12-0059)和纪念赫尔曼医疗系统的人类受试者保护委员会(机构审查委员会)批准。入院内获得患者或其法定授权代表的书面知情同意。对于死亡患者、入院内出院的患者，以及至少尝试三次在内获取同意但仍无决策能力且无代理决策者的患者，豁免同意要求。

暴露于纤维蛋白降解产物(FDPs)与患者血浆

当人脑微血管内皮细胞(HBMECs)达到汇合状态时，将培养基更换为添加了2%胎牛血清(FBS)和视黄酸的EGM2-MV培养基，培养1天。之后，人脑微血管内皮细胞单层用纤维蛋白降解产物(FDPs)人D-二聚体、人纤维蛋白原D片段(FragD)或人纤维蛋白原E片段(FragE；Prolytix)，或溶媒对照进行处理，处理时所用的FDPs浓度范围为1至，溶媒对照则使用添加了2%胎牛血清(FBS)和的EGM2-MV培养基。FDP剂量的选择依据为已报道的创伤性脑损伤合并患者的FDP血清浓度，以及已发表的关于FDP X片段对内皮细胞(ECs)影响的文献。本研究中，我们使用标准磷酸盐缓冲液(PBS)作为溶媒对照。

对于图4和图5所示的实验，我们按照上述方法将人脑微血管内皮细胞(HBMECs)与人星形胶质细胞共培养至汇合状态，然后将培养基更换为添加了2%胎牛血清(FBS)和视黄酸的EGM2-MV培养基，培养1天。随后，用添加了10%患者血浆的EGM2-MV培养基处理共培养物，处理时长为。

HBMEC 与 HBMEC/星形胶质细胞共培养的功能分析

为量化 BBB 通透性，我们开展了 FITC-葡聚糖通透性检测。将 HBMEC 接种于覆盖有不透光 PET 膜(Corning)的 FluoroBlock 24 孔细胞培养插入式小室中，下室加入培养基。当 HBMEC 汇合后，将上、下室的细胞培养基替换为不含酚红的 Leibovitz’s L-15 培养基，该培养基补充了与 EGM2-MV 培养基相同的因子、2% FBS 以及视黄酸，并置于 BioTek Cytation 5 细胞成像读数仪(Agilent)中，在条件下孵育 1 天。Leibovitz’s L-15 培养基是一种非依赖性培养基，之所以选择它，是因为用于连续测量荧光强度的设备无法将注入细胞培养板中。经过 1 天的平衡期后，下室加入补充了 2% FBS 的 Leibovitz’s L-15 培养基，上室的培养基替换为补充了 2% FBS、浓度范围为 1 至的 FDP 或溶媒对照的 Leibovitz’s L-15 培养基，以及 70 kDa FITC-葡聚糖(FD70，Sigma Aldrich)。随后将培养板移回 Biotek Cytation 5 设备，下室的荧光强度每测量一次，共测量次，使用激发滤光片和发射滤光片 528/20 nm。采用 GraphPad Prism 10 软件(GraphPad Software)量化每种条件下的曲线下面积(AUC)。

对于图 4B 所示的实验，我们按照上述 HBMEC 的方法，在 FluoroBlock 细胞培养插入式小室中共培养 HBMEC 和人星形胶质细胞。1 天平衡期结束后，下室加入补充了 2% FBS 的 Leibovitz’s L-15 培养基，上室的培养基替换为补充了 10% 患者血浆和 FITC-葡聚糖的 Leibovitz’s L-15 培养基。荧光强度的测量和 AUC 的量化方法与上述相同。

免疫荧光显微镜检查

为进行免疫荧光染色，将人脑微血管内皮细胞(HBMEC)或HBMEC与人星形胶质细胞的共培养物接种于玻璃表面，按上述方法培养。在固定前，将培养物置于纤维蛋白降解产物(FDP)、溶媒对照或10%患者血浆中处理，固定采用4%多聚甲醛，处理时间为。随后，用5%山羊血清/0.1%吐温-20(Sigma-Aldrich)封闭细胞，封闭时间为。一抗和二抗分别加入含封闭液的细胞中，孵育时间分别为和。用DAPI对细胞核进行复染。F-肌动蛋白用Alexa Fluor Plus 647标记的鬼笔环肽(A30107，Thermo Fisher)染色。本文使用的抗体如下:VE-钙黏蛋白(VE-Cadherin，货号36-1900，Thermo Fisher，稀释比例1:400)、紧密连接蛋白-1(ZO-1，货号33-9100，Thermo Fisher，稀释比例1:200)。染色完成后，使用ProLong Gold抗淬灭封片剂(P10144，Thermo Fisher)对玻璃片进行封片。使用以下Alexa Fluor偶联的二抗(Thermo Fisher，稀释比例1:500):山羊抗兔Alexa 546(A11035)、山羊抗小鼠Alexa 488(A11001)。仅用二抗染色的HBMEC作为阴性对照，以区分特异性染色与背景信号，并调整成像参数。采用Fiji软件从VE-钙黏蛋白染色图像中量化细胞面积。采用Imaris 10.2软件对细胞内VE-钙黏蛋白和ZO-1颗粒进行量化。使用尼康A1R+共聚焦系统或蔡司Airyscan超分辨率成像系统对细胞进行成像(图1E)。

F/G肌动蛋白分离

采用G-肌动蛋白/F-肌动蛋白体内检测生化试剂盒(Cytoskeleton公司产品)，按照制造商方案分离球状(G)和丝状(F)肌动蛋白。按照上述方法培养人脑微血管内皮细胞(HBMEC)，并分别用纤维蛋白降解产物(FDPs)或溶媒对照处理24小时。按照上述方法培养由HBMEC和星形胶质细胞(HA)组成的血脑屏障(BBB)共培养物，并加入患者血浆处理。随后，使用添加了ATP和蛋白酶抑制剂的裂解液及F-肌动蛋白稳定缓冲液裂解细胞，在条件下处理，之后以离心，使未破碎细胞及细胞碎片沉淀。将上清液转移至超速离心管中，在条件下以离心。离心完成后，将含有可溶性G-肌动蛋白的上清液转移至新管中。向含有F-肌动蛋白的沉淀不溶级分中加入F-肌动蛋白解聚缓冲液，在冰上孵育以使F-肌动蛋白解聚。随后，取等量的上清液(G-肌动蛋白)和沉淀(F-肌动蛋白)样品，使用试剂盒提供的小鼠抗肌动蛋白抗体进行蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析。

蛋白质免疫印迹

按照之前描述的方法进行了蛋白质免疫印迹实验。按照上述方法培养人脑微血管内皮细胞(HBMEC)，并将其暴露于纤维蛋白降解产物(FDP)或溶媒对照中，持续24小时。随后，使用添加了蛋白酶抑制剂的标准RIPA缓冲液裂解细胞，并将总蛋白上样至4-20%的凝胶中。凝胶在条件下运行，然后更换为条件运行，接着在条件下转印至聚偏二氟乙烯膜，持续，转印电压为。将膜用5%牛奶封闭，随后在条件下与兔抗VE-钙粘蛋白(货号36-1900，赛默飞世尔科技，稀释比例1:500)、小鼠ZO-1(货号33-9100，赛默飞世尔科技，稀释比例1:2000)和小鼠抗GAPDH(货号MA5-15738，赛默飞世尔科技，稀释比例1:4000)抗体孵育过夜。使用山羊抗小鼠HRP抗体(货号1706516，伯乐实验室，稀释比例1:5000)和山羊抗兔HRP抗体(货号1706515，伯乐实验室，稀释比例1:5000)作为二抗。使用Clarity Western ECL底物(货号1705061，伯乐实验室)显影印迹。GAPDH用作上样对照。使用Fiji软件进行光密度分析。

图1. FDP通过下调连接蛋白VE-钙黏蛋白(VE-Cadherin)引发内皮病变。(A) 经不同浓度D-二聚体(D-dimer)、片段D(FragD)、片段E(FragE)或溶媒对照处理的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)单层中，FITC-葡聚糖(FITC-dextran)的荧光强度曲线下面积(AUC)，于 (每组 )检测。(B) 采用VE-钙黏蛋白免疫荧光染色，对经 D-二聚体、片段D、片段E或溶媒对照处理的HBMECs进行细胞面积定量(溶媒对照组个细胞，D-二聚体组个细胞，片段D组个细胞，片段E组个细胞)。(C) 经溶媒对照或 D-二聚体、片段D、片段E处理并进行VE-钙黏蛋白、ZO-1及DNA染色的HBMECs代表性免疫荧光图像。比例尺。(D) 经溶媒对照或100 μg/mL D-二聚体、片段D、片段E处理的HBMECs，其VE-钙黏蛋白和ZO-1的蛋白质印迹(Western blot)代表性图像及光密度分析。GAPDH作为上样对照(每组 )。(E) 采用蔡司Airyscan系统获取的HBMECs代表性超分辨率图像。细胞经溶媒对照或 D-二聚体、片段D、片段E处理，并进行VE-钙黏蛋白、ZO-1及DNA染色。使用Imaris软件计数VE-钙黏蛋白和ZO-1通道中的单个颗粒数量，按每个细胞及每个细胞面积进行定量(溶媒对照组个细胞，D-二聚体组个细胞，片段D组个细胞，片段E组个细胞)。比例尺。定量数据以均值标准误(SEM)表示，来自三次独立实验。，**** 。HBMECs，人脑微血管内皮细胞。

划痕愈合迁移实验

采用定量迁移实验评估HBMEC暴露于FDP后的迁移能力与划痕愈合能力。按照上述方法培养HBMEC，并用无菌移液枪头在细胞单层上制造划痕。用PBS和EGM2-MV培养基洗涤细胞，向细胞中加入补充了 FDP的培养基或溶媒对照。使用台式显微镜在FDP暴露后0小时和小时拍摄各孔图像。采用Fiji软件定量分析细胞迁移覆盖划痕的面积。

mRNA测序

将冷冻细胞沉淀送至休斯顿德克萨斯大学健康科学中心癌症基因组中心(CPRIT RP240610)。使用RNeasy Mini Kit(74104，Qiagen)和无RNase的DNase Set(79254，Qiagen)从细胞沉淀中分离总RNA。使用RNA 6000 Pico Kit(5067-1513，Agilent Technologies)和Agilent Bioanalyzer 2100评估总RNA的质量。完整性数值＞7的RNA用于文库制备。按照制造商的说明，使用NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module(E7490L，New England Biolabs)、NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina(E7760L，New England Biolabs)和NEBNext Multiplex Oligos for Illumina(E6609S，New England Biolabs)制备文库。使用High Sensitive DNA Kit(5067-4626，Agilent Technologies)和Agilent Bioanalyzer 2100检测最终文库的质量，并使用Collibri Library Quantification Kit(A38524500，Thermo Fisher)通过qPCR测定文库浓度。将文库均匀混合后，在Illumina NovaSeq System(Illumina)上进行150循环的双端测序。

mRNA测序数据分析使用开源网络平台Galaxy(https://usegalaxy.org)完成。RNA测序数据的质量控制使用MultiQC工具完成。使用默认设置的HiSAT2将测序读段与人类GRCh38.p13(hg38)参考基因组比对，并使用QualiMap BAMQC工具进行质量控制。使用featurecounts工具对比对后的读段进行计数，并使用edgeR工具进行差异基因表达分析。多重性校正通过将Benjamini-Hochberg方法应用于p值来完成，作为edgeR算法的一部分控制假发现率。使用绝对倍数变化和假发现率的临界值来定义差异表达基因。基因本体分析使用Metascape 3.5(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)完成。mRNA测序数据已提交至NIH序列读取档案(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)，登录号为PRJNA1430220。

数据与统计分析

通过选择最能代表量化平均值的图像(用于量化数据的呈现)，或选择与其余数据集最相似的图像(用于非量化数据的呈现)，来选取代表性图像。所有数据均使用 GraphPad Prism 软件(GraphPad Software)进行分析，并以文本和图注中所示细胞数量的均值标准误形式呈现。通过目视检查每个数据集的分位数-分位数(Q-Q)图和频率分布，以及进行 D’Agostino-Pearson 检验(显著性水平为 0.05)来检验正态性。符合正态分布的数据采用常规单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析，随后进行 Tukey 事后检验；不符合正态分布的数据则采用 Kruskal-Wallis 检验，随后进行 Dunn 检验校正。统计学显著性定义为。

结果

FDPs 通过以下机制破坏内皮屏障功能

下调连接蛋白VE-钙粘蛋白

我们首先探究 FDPs 是否会破坏内皮屏障功能。我们将人脑微血管内皮细胞(HBMECs)培养至汇合状态，然后用浓度递增的 FDPs 处理。我们对 24 小时内跨内皮屏障转运的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-dextran)荧光强度的曲线下面积(AUC)进行了定量分析。我们发现，片段 D(FragD)和片段 E(FragE) 会导致 HBMECs 的内皮屏障出现显著渗漏，与对照组相比分别增加了 1.90 倍和 2.6 倍(图 1A)。随后，我们探究 FDPs 是否会导致 HBMECs 出现形态学异常。我们用 FDPs 处理汇合状态的 HBMECs 层，然后对 VE-钙粘蛋白和紧密连接蛋白-1(ZO-1)进行染色。免疫荧光染色显示，与用溶媒对照处理的 HBMECs 相比，经片段 E 处理的 HBMECs 细胞表面积更大，且细胞肥大程度最为显著 (图 1B)，同时 HBMECs 仍维持着连接蛋白 VE-钙粘蛋白和 ZO-1 的定位(图 1C)。

连接蛋白 VE-钙粘蛋白和 ZO-1 是血脑屏障(BBB)的关键组成部分，已有研究表明，连接蛋白的表达或内化发生改变会导致血脑屏障破坏。我们将 HBMECs 培养至汇合状态，用 FDPs 处理后，对 VE-钙粘蛋白和 ZO-1 的蛋白水平进行了定量分析。我们发现，片段 D 和片段 E(而非 D-二聚体)会在蛋白水平上导致 VE-钙粘蛋白下调，而 ZO-1 的蛋白水平保持不变(图 1D 及补充图 S1、S2、S3)。我们最后探究 FDPs 是否会导致连接蛋白解聚和重分布，这与先前报道的卒中后血脑屏障破坏的情况类似。我们利用超分辨率荧光成像，分别对含有 VE-钙粘蛋白和 ZO-1 的细胞内颗粒数量进行了可视化和定量分析。我们发现，尽管用片段 D 和片段 E(而非 D-二聚体)处理的 HBMECs 中，含有 VE-钙粘蛋白和 ZO-1 的细胞内颗粒数量显著更多，但当将颗粒数量按细胞表面积进行标准化后，这种差异便消失了(图 1E)。综上，我们的研究结果表明，FDPs 通过细胞肥大以及关键连接蛋白 VE-钙粘蛋白的下调，导致内皮功能和结构损伤。

FDPs 会导致 ECs 发生转录失调

我们接下来尝试探究暴露于 FDPs 的 HBMECs 的转录状态。我们从经 FDPs 或溶媒对照处理的汇合层 HBMECs 中分离 RNA，并进行 mRNA 测序。主成分分析显示，经 FDP 处理的 HBMECs 在转录组层面与对照 HBMECs 存在差异(补充图 S4)。差异基因表达分析鉴定出，与溶媒处理的对照组相比，暴露于 D-二聚体、FragD 和 FragE 的 HBMECs 中，分别有 38 个、86 个和 416 个基因上调，15 个、16 个和 35 个基因下调(图 2A-C)。对所有差异调控基因的分析显示，三种 FDP 之间存在部分重叠，并鉴定出分别有 23 个、43 个和 387 个基因在暴露于 D-二聚体、FragD 和 FragE 的 HBMECs 中呈现出独特的差异调控(图 2B)。补充图 S5 显示了每个 FDP 组中排名前 50 的差异调控基因的热图。对差异调控基因的分析显示，暴露于 D-二聚体的 HBMECs 与对照 HBMECs 之间的差异基因映射到细胞代谢，而暴露于 FragD 和 FragE 的 HBMECs 与对照 HBMECs 之间的差异基因则映射到细胞黏附、细胞迁移和血管生成(图 2C)。最后，我们发现所有组中 VE-钙黏蛋白和 ZO-1 的转录水平相似(补充图 S6)，这表明 FDPs 是在蛋白水平而非转录水平调控 VE-钙黏蛋白的表达。综上，我们的转录组分析显示，FDPs 会导致内皮功能关键分子通路发生广泛的转录失调。

FDPs 通过肌动蛋白应力纤维形成调控内皮功能

基于我们的发现——纤维蛋白降解产物(FDPs)会破坏内皮屏障功能，并上调与细胞黏附、细胞连接组织及细胞迁移相关的分子通路，我们探究肌动蛋白细胞骨架是否会受到FDPs的调控失调。脑微血管的内皮肌动蛋白细胞骨架在将细胞外生物力学刺激转化为细胞内分子过程(如细胞收缩和基因表达调控)中处于核心地位，且已被证实可在多种神经系统疾病中调控内皮屏障功能，例如脑缺血/再灌注损伤、脑出血、多发性硬化症和阿尔茨海默病。对暴露于 FDPs或溶媒对照的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)单层进行免疫荧光成像，结果显示肌动蛋白应力纤维(F-肌动蛋白；图3A)的形成增加。通过蛋白质印迹法将球状肌动蛋白(G-肌动蛋白)与丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)分离，结果显示经FragD和FragE处理的HBMECs中，F-肌动蛋白分别增加了3倍和4倍(图3B)。随后我们探究，暴露于FDPs的HBMECs中应力纤维形成的增加是否会干扰内皮细胞的关键功能，例如其用于伤口愈合的迁移能力。我们将HBMECs培养至完全汇合，然后在生长区域的中线上制造划痕伤口。接着用FDPs处理HBMECs 24小时。在造伤后0小时(FDP处理前)和24小时(FDP处理后)分别采集HBMECs的图像。对跨越伤口线迁移的细胞覆盖区域进行定量分析，结果显示，暴露于FragD和FragE的HBMECs在应对损伤时的迁移能力出现了下降。溶媒对照或D-二聚体处理的HBMECs之间未观察到显著差异(图3C)。综上，我们的数据表明，FDPs通过增加肌动蛋白应力纤维的形成，干扰内皮肌动蛋白细胞骨架与迁移过程。

图 2. FDPs 导致 HBMEC 的转录失调。(A) 热图显示用溶媒对照或 D-二聚体、FragD 或 FragE 处理的 HBMEC 中差异表达基因的表达情况。(B) 维恩图显示分别暴露于 D-二聚体、FragD 和 FragE 的 HBMEC 中独特差异表达基因的重叠情况及数量。(C) 与溶媒对照处理的 HBMEC 相比，用 D-二聚体、FragD 或 FragE 处理的 HBMEC 的火山图。(D) 与溶媒对照处理的 HBMEC 相比，用 D-二聚体、FragD 或 FragE 处理的 HBMEC 中差异表达基因的 GO 术语。

体外实验中，TBI 血浆可导致 BBB 功能障碍及转录失调

在确定纤维蛋白降解产物(FDP)可引发内皮病变后，我们最终探究富含FDP的创伤性脑损伤(TBI)患者血浆是否会在体外对血脑屏障(BBB)功能障碍产生类似影响。高纤溶亢进被认为是TBI患者BBB破坏的关键因素，且FDP水平与患者预后直接相关。我们从纪念赫尔曼医院创伤急救中心收治的单纯TBI患者中获取血浆，这些患者的D-二聚体水平较高(TBI血浆)；同时从无TBI且D-二聚体水平正常的单纯骨科损伤患者中获取血浆作为对照(对照血浆)。本研究中，我们以D-二聚体水平作为总FDP水平的替代指标。血浆D-二聚体水平定量分析显示，TBI患者的D-二聚体水平较骨科对照组升高了400倍(图4A)。TBI患者血浆中的纤维蛋白原水平较低，但未达到统计学意义(补充图S7)。我们随后探究暴露于TBI血浆是否会在人源体外BBB模型中破坏BBB通透性。我们将人脑微血管内皮细胞(HBMECs)与星形胶质细胞(HA)共培养，然后用TBI或对照血浆处理。我们对24小时内跨BBB转运的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-dextran)荧光强度的曲线下面积(AUC)进行定量，发现与对照血浆相比，TBI血浆使BBB通透性增加了一倍(图4B)。对暴露于TBI或对照血浆的HBMECs进行定性免疫荧光分析显示，细胞肥大且含血管内皮钙黏蛋白(VE-Cadherin)的细胞内颗粒数量增加，同时VE-Cadherin和紧密连接蛋白-1(ZO-1)的表达及定位保持正常(图4C)。在共培养的HBMECs与HA中，与对照血浆相比，TBI血浆诱导肌动蛋白应力纤维形成(图4D)。通过蛋白质印迹法分离G-肌动蛋白(G)与F-肌动蛋白(F)，结果显示，与对照血浆处理组相比，TBI血浆处理的BBB共培养物中F-肌动蛋白增加了4倍(图4E)。

图 3. FDP 可增加 HBMEC 中应力纤维的形成并干扰细胞迁移。(A) 用溶媒对照或 D-二聚体、FragD 或 FragE 处理 HBMEC，对 F-肌动蛋白和 DNA 进行染色后的代表性免疫荧光图像。比例尺为 40 。(B) 用溶媒对照或 D-二聚体、FragD 或 FragE 处理 HBMEC 后，G-肌动蛋白和 F-肌动蛋白的蛋白质印迹代表性图像及光密度分析(每组 )。(C) 用溶媒对照或 D-二聚体、FragD 或 FragE 处理 HBMEC，在单层细胞上划痕造成损伤后，于 0 和时间点拍摄的代表性图像。划痕单层的边界用红色虚线标示。24 小时后评估细胞迁移反应，并对穿过划痕线迁移的细胞覆盖区域进行定量。比例尺。定量数据以三次独立实验的平均值标准误表示。。

我们最后探究了与对照血浆相比，TBI 血浆是否会导致 BBB 共培养物发生转录变化，以及变化程度如何。我们从暴露于 TBI 血浆或对照血浆的 BBB 共培养物中分离 RNA，并进行 mRNA 测序。主成分分析显示，暴露于 TBI 血浆的 BBB 共培养物在转录组层面与暴露于对照血浆的 BBB 共培养物存在差异(补充图 S8)。差异基因表达分析确定

图4. 创伤性脑损伤患者血浆在人体外血脑屏障细胞模型中可诱导血脑屏障功能障碍，并增加肌动蛋白应力纤维的形成。(A) 定量检测骨科损伤患者(对照组)和创伤性脑损伤患者血浆中的D-二聚体水平(每组例患者)。(B) 检测经对照组血浆或创伤性脑损伤患者血浆处理的内皮细胞(ECs)和人星形胶质细胞(HA)共培养体系中FITC-葡聚糖的荧光强度曲线下面积(AUC)，检测时长为 (每组例患者)。(C) 经对照组血浆或创伤性脑损伤患者血浆处理的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)的代表性免疫荧光图像，VE-钙黏蛋白(VE-Cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)和DNA染色。比例尺。(D) 经对照组血浆或创伤性脑损伤患者血浆处理的血脑屏障共培养体系的代表性免疫荧光图像，F-肌动蛋白(F-Actin)和DNA染色。比例尺。(E) 经对照组血浆或创伤性脑损伤患者血浆处理的血脑屏障共培养体系中G-肌动蛋白(G-actin)和F-肌动蛋白的蛋白质印迹(Western blot)代表性图像及光密度分析(每组例)。定量数据以三次独立实验的平均值标准误(SEM)表示。* ，** 。BBB，血脑屏障；ECs，内皮细胞；HA，人星形胶质细胞；TBI，创伤性脑损伤。

与对照组相比，创伤性脑损伤患者血浆处理的共培养体系中73个基因上调、234个基因下调(图5A-C)。图5B展示了表达变化最大的前50个差异调控基因的热图。GO分析显示，这些基因主要涉及细胞黏附、肌动蛋白细胞骨架、细胞运动性及细胞连接组装。 (图5D)。事实上，我们发现与对照组血浆相比，暴露于创伤性脑损伤患者血浆的血脑屏障共培养体系中，与核心GO术语相关的转录本有12至27个存在差异调控(补充表S2和补充图S9)。综上，我们的转录组学数据表明，创伤性脑损伤患者血浆可导致血脑屏障生物学和功能中起关键作用的基因发生转录失调。

图5. 创伤性脑损伤患者血浆在人体外血脑屏障细胞模型中可诱导转录失调。(A) 显示经对照组血浆或创伤性脑损伤患者血浆处理的血脑屏障共培养体系中差异调控基因表达的热图。(B) 显示经对照组血浆或创伤性脑损伤患者血浆处理的血脑屏障共培养体系中表达量变化最大的前50个差异调控基因的热图。(C) 经对照组血浆或创伤性脑损伤患者血浆处理的血脑屏障共培养体系的火山图。(D) 经创伤性脑损伤患者血浆处理的血脑屏障共培养体系与经对照组血浆处理的血脑屏障共培养体系相比，差异调控基因的GO术语。

讨论

本研究的总体目标是评估纤维蛋白降解产物(FDP)对内皮生物学及血脑屏障(BBB)的分子、细胞和功能影响。我们旨在表征内皮细胞(EC)暴露于分离的FDP后通透性及转录调控的变化。随后，我们旨在鉴定并研究驱动FDP对内皮生物学作用的新型分子通路。最后，本研究的一个主要目标是评估创伤性脑损伤(TBI)患者血浆在临床相关的转化型体外血脑屏障模型中诱导血脑屏障功能障碍的潜力。我们的数据显示，FDP对内皮生物学具有显著作用，包括通过下调连接蛋白VE-钙粘蛋白(VE-Cadherin)增加内皮通透性，以及广泛失调参与内皮机械转导和迁移的关键蛋白的转录。随后，我们证实，分离的FDP的这些显著分子和细胞作用可延伸至高FDP水平的TBI患者血浆，表明TBI期间的纤溶亢进可能是TBI患者血脑屏障功能障碍的驱动因素，而受损的细胞机械转导可能在该过程中发挥关键作用。

TBI是美国成人和儿童发病及死亡的主要原因。尽管凝血障碍已知会加剧TBI的临床影响、病情进展及死亡率，但临床上可干预的分子机制尚未明确。本研究提供了新的机理性认识，阐明了TBI期间纤溶亢进产生的FDP如何导致或持续存在TBI患者的血脑屏障功能障碍，FDP是已知的成人及儿童TBI预后结局因素。此前研究FDP诱导血脑屏障功能障碍的分子机制较少，本研究满足了阐明FDP作用于血脑屏障的新型分子通路的未竟需求。

我们的初步研究结果显示，FragD和FragE会导致内皮细胞肥大，这可能是内皮细胞试图填补因内皮损伤而产生的单层细胞间隙、以维持内皮屏障的一种代偿机制。我们的分析进一步表明，FragD和FragE会在蛋白质层面显著下调黏着连接蛋白VE-钙黏蛋白，而在RNA层面则无此作用，同时紧密连接蛋白ZO-1的表达水平保持不变。这与之前的一项研究部分一致，该研究显示FDP片段X在蛋白质层面下调了VE-钙黏蛋白内皮细胞(ECs)中的蛋白质和RNA水平。 VE-钙粘蛋白是内皮生物学的关键结构成分，也是血脑屏障(BBB)功能的核心调节因子，已知VE-钙粘蛋白的解聚会削弱内皮细胞间连接并增加血管通透性。本研究的一个有趣发现是，暴露于纤维蛋白降解产物(FDPs)的内皮细胞中，含VE-钙粘蛋白和紧密连接蛋白1(ZO-1)的细胞内颗粒数量增加。FDPs诱导的含VE-钙粘蛋白的细胞内颗粒数量增加，可能代表蛋白酶体介导的降解过程中内吞作用增强，而非VE-钙粘蛋白的从头合成代偿性增加，因为本研究中未发现VE-钙粘蛋白转录本数量存在差异。有趣的是，尽管ZO-1在FDPs作用下同样大量存在于细胞内颗粒中，但各组间ZO-1的蛋白质水平并无差异，这引发了关于细胞内ZO-1生物学意义的疑问。已知FragE能够直接结合VE-钙粘蛋白，这种相互作用可能引发细胞反应，促使VE-钙粘蛋白被蛋白酶体降解。这种可能的机制是否也适用于FragD，尚待研究。

我们的转录组数据显示，FragD和FragE会导致细胞间黏附、细胞连接组装、肌动蛋白细胞骨架生物学以及细胞与细胞外基质(ECM)黏附相关基因的表达失调——所有这些过程均在内皮机械转导中发挥重要作用，且研究表明，若这些过程失调，会影响血脑屏障(BBB)的完整性。肌动蛋白细胞骨架被证实是机械转导的核心，它将ECM与细胞间连接相连，并动态调节力的产生与传递。我们的研究结果进一步证实了现有文献的结论，即肌动蛋白细胞骨架在多种神经系统疾病中对BBB功能的调控起着关键作用。已知应力纤维的形成会通过增加肌动球蛋白收缩性以及与连接蛋白的相互作用失调，导致内皮细胞高通透性，这可能是本研究中观察到的FragD和FragE作用的潜在分子机制。事实上，已证实片段D和纤维蛋白原的C端片段链可增加内皮应力纤维的形成并增强肌动球蛋白收缩装置。然而，肌动球蛋白网络中受FDPs影响和调控失调的具体分子机制仍不明确。我们未来的研究将聚焦于阐明FDPs在神经创伤中对肌动球蛋白收缩性和内皮机械转导的分子调控机制。

我们的转录组数据中有一项有趣的发现，即FragE可调控白介素(IL)-10信号通路和炎症相关基因。研究表明，IL-10信号通路在TBI及其他神经退行性疾病中兼具神经保护和神经功能恶化的潜力，提示其调控着一条需要精细调节的敏感信号通路。我们观察到FragE可能控制内皮细胞的炎症反应，这与之前的研究结果一致，即FragE可刺激单核细胞、巨噬细胞和脂肪细胞产生IL-1和IL-6等炎症因子。事实上，IL-1和IL-6是FragE组中差异表达最显著的基因之一，提示FragE可能以与其他细胞类型类似的方式诱导内皮细胞(ECs)发生炎症。尽管目前关于FragE调控内皮炎症的文献较少，但本研究提供了FragE可能作用于内皮细胞的新型潜在炎症调控通路。需要进一步研究以充分了解FragE在神经创伤中调控内皮炎症的方式和程度。

本研究的一个新方向是在临床相关的体外共培养模型中使用TBI且FDP水平高的患者血浆，该模型由人内皮细胞(ECs)和星形胶质细胞(HA)组成——这两种细胞是构成BBB的主要细胞类型。尽管近期有多项体内研究探讨了TBI后中枢神经系统(CNS)多种细胞的转录调控，但关于血浆成分如何独立于原发性损伤调控BBB的研究仍较为缺乏。因此，本研究为原发性损伤后BBB的病理生理学提供了新的见解，这是血浆成分生物活性的直接结果。该组实验产生的数据重现了我们之前观察到的分离FDPs对内皮细胞的影响，提示FDPs可能介导TBI中的内皮病变。我们的实验方法具有创新性，因为目前关于血浆成分对神经创伤中BBB的分子效应的研究较为匮乏。近期一项研究检测了TBI患者血浆的蛋白质组学和代谢组学特征，发现TBI患者血浆中血管细胞黏附分子1(一种已知的内皮机械转导介质)表达上调。另一项研究发现，用创伤和休克患者的血浆处理人脐静脉内皮细胞后，内皮通透性增加、内皮连接破坏，且RhoA(在肌动球蛋白收缩性中起关键作用)的激活增强。本研究的结果与已发表的文献一致。

本研究的范围聚焦于创伤性脑损伤(TBI)背景下，纤溶功能亢进对血脑屏障(BBB)的下游效应，但需注意，纤溶功能亢进也可能发生于未患TBI的创伤患者中，且是创伤性凝血病(TIC)早期出血表型的驱动因素，该表型可能因出血导致早期死亡。相反，TIC也可能在无纤溶功能亢进的情况下发生，表现为血栓形成表型，该表型可能因脑损伤和多器官衰竭导致晚期死亡。 TIC与TBI相关凝血病(TBI-C)具有某些共同的病理生理特征，可独立发生或在多发伤背景下共存。因此，尽管本实验所用血浆(如图4、5所示)来源于无出血或多发伤证据的单纯TBI患者，但本研究关于纤溶功能亢进对血脑屏障的分子效应(如图1-3所示)，可能对表现出纤溶功能亢进的非TBI创伤患者具有参考意义。

本研究存在若干局限性。首先，本研究的体外细胞模型基于内皮细胞(ECs)的单一培养或内皮细胞与星形胶质细胞的共培养，因此无法完全体现构成血脑屏障的各类细胞之间复杂相互作用的全貌。不过，本研究的优势在于使用了从人脑微血管分离得到的内皮细胞，而其他研究FDP对内皮细胞生物学效应的研究大多使用肺内皮细胞。众所周知，不同器官血管床中的内皮细胞存在显著异质性，且不同器官的内皮屏障功能存在显著差异，其中中枢神经系统形成的内皮屏障最为紧密。其次，本研究因商业可得性，仅检测了FDP中的D-二聚体、FragD和FragE。不过，纤溶过程中还会形成其他已知的FDP，且本研究关于D-二聚体、FragD和FragE分子机制的研究结果可能无法推广至其他FDP。第三，本研究使用的FDP剂量基于已发表的TBI患者总FDP水平。基于现有文献，我们无法确定本研究中所检测的各片段的血浆水平，因此本研究使用的剂量可能不具有临床代表性。第四，图4和图5中的数据仅包含3名对照者和3名TBI患者的血浆。因此，该组实验得出的数据具有高度初步性，需在未来研究中加以验证和扩展。最后，我们仅在人体外血脑屏障模型中检测了富含FDP的TBI血浆和对照血浆。无纤溶功能亢进证据的TBI患者血浆，或无TBI的纤溶功能亢进患者血浆对血脑屏障功能的影响，是否存在及影响程度如何，超出了本研究的范围，属于我们未来研究的一部分。

结论

本研究显示，FDP在体外通过失调内皮肌动蛋白细胞骨架、其与邻近细胞及ECM的相互作用，介导内皮屏障的结构和功能损伤。本研究提示，细胞机械转导受损是创伤性脑损伤(TBI)期间纤溶亢进时内皮屏障功能障碍病理生理过程中的关键因素，并为TBI的临床治疗提供了新的潜在治疗途径。本团队未来的研究重点是阐明神经创伤中血脑屏障(BBB)内皮收缩性及机械转导的分子调控机制。

透明度、严谨性与可重复性

本研究的设计与分析计划未进行预注册。实验动物采用分层随机分组。本研究使用了原代人脑微血管内皮细胞(HBMEC)和原代人星形胶质细胞。所有试剂和抗体均为商业采购。每项实验至少进行3次独立重复。样本量基于可行性及类器官研究的既往成功经验确定。数据分析由对分组情况设盲的人员完成。统计分析按上述方法进行。所有方案和数据将在发表后应要求提供给通讯作者，符合学术数据共享标准。

致谢

作者感谢德克萨斯州癌症预防与研究所(CPRIT RP240610)提供的 mRNA分离与测序的技术支持。作者感谢MD安德森癌症中心高级显微成像核心设施的Collene Jeter博士，感谢其在Airyscan显微成像方面提供的帮助。显微成像数据是通过使用亚细胞成像显微成像资源(SIMR)生成的，该资源部分由美国国家癌症研究所资助，资助项目为UT MD安德森的P30CA016672，同时也获得了CPRIT核心设施资助项目RP170628和NIH S10 RR029552仪器资助项目的资金支持。本出版物所报道的研究并非直接通过UT MD安德森的P30CA016672资助项目获得资金，且不属于该项目的研究范围。我们感谢休斯顿健康大学(UT Health Houston)转化损伤研究中心(CeTIR)的Erin Fox博士，以及科罗拉多大学的Jessica Cardenas博士，感谢他们对我们的研究提供了宝贵且关键的反馈。我们感谢CeTIR生物样本库对我们研究的支持。

作者贡献

A.A.、S.D.O. 和 C.S.C.Jr. 设计了实验及整体研究。A.A. 和 A.M.C. 开展了实验并分析了数据。所有作者均讨论了结果，并参与了文章的准备与编辑工作。

作者披露声明

不存在竞争性经济利益。

资助信息

本研究得到美国国防部 FPA 奖 #HT94252311033(创伤诱发凝血病与血脑屏障:复苏的影响，授予小查尔斯·塞缪尔·考克斯)以及创伤研究与战斗伤员护理合作组织(TRC4)早期职业导师研究奖 #TRC4-2025-0000000312(创伤性脑损伤诱发凝血病中血脑屏障的机械生物学，授予艾汉·阿特曼利)的资助。

补充材料

补充数据

参考文献

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2. Obermeier B, Daneman R, Ransohoff RM. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med 2013;19(12):1584-1596.

3. Hu Y, Tao W. Microenvironmental variations after blood-brain barrier breakdown in traumatic brain injury. Front Mol Neurosci 2021;14:750810.

纤维蛋白,凝血病,囊泡,肌动蛋白,内皮细胞,血浆,FDP,TBI‑C

无

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无

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表观信息

纤维蛋白降解产物通过肌动蛋白细胞骨架调控创伤性脑损伤中的内皮屏障功能

2026-10-01

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