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层流诱导的 CHK1-SENP2 活性通过不同于内皮-间质细胞转化的机制，抑制内皮细胞活化及纤维化改变

发布时间：

2026-10-01 21:31

层流诱导的 CHK1-SENP2 活性通过不同于内皮-间质细胞转化的机制，抑制内皮细胞活化及纤维化改变

Minh T. H. Nguyen 、Masaki Imanishi 、Shengyu Li 、Khanh Chau 、Priyanka Banerjee 、Loka reddy Velatooru 、Kyung Ae 、Venkata S. K. Samanthapudi 、Young J. Gi 、Ling-Ling Lee 、Rei J. Abe 、Elena McBeath 、Anita Deswal 、Steven H. Lin 、Nicolas L. Palaskas 、Robert Dantzer 、Keigi Fujiwara 、Mae K. Borchrdt 、Estefani Berrios Turcios’、Elizabeth A. Olmsted-Davis’、Sivareddy Kotla’、John P. Cooke’、Guangyu Wang 、Jun-ichi Abe 和 Nhat-Tu Le

美国休斯敦，卫理公会研究所心血管再生中心；越南河内，越南科学技术研究院河内科技大学生命科学系；美国休斯敦，MD安德森癌症中心心脏病学及症状研究系

背景:去 SUMO 化酶 Sentrin 特异性异肽酶 2(SENP2)在动脉粥样硬化保护中发挥关键作用。然而，在紊乱流(D-flow)条件下，SENP2 在 T368 位的磷酸化会阻碍其核功能，并促进内皮细胞(EC)活化。SUMO 化与紊乱流诱导的内皮-间质转化(endoMT)相关，但 SENP2 在对抗该过程中的确切作用仍不清楚。

方法:我们开发了一种针对磷酸化的 SENP2 S344 抗体，并利用 CRISPR/Cas9 技术构建了携带 SENP2 S344A 磷酸化位点突变的敲入(KI)小鼠。随后，我们研究了两种不同血流模式及高胆固醇血症(HC)介导的内皮细胞(EC)活化过程中 SENP2 S344 磷酸化的作用。结果:我们的研究结果表明，层流(L-flow)通过检查点激酶 1(CHK1)的活化诱导 SENP2 在 S344 位点发生磷酸化，进而抑制 ERK5 和 p53 的 SUMO 化，最终抑制内皮细胞活化。我们观察到，在雌性高胆固醇血症 SENP2 S344A KI 小鼠的主动脉弓(处于 D-flow 下)和降主动脉(处于 L-flow 下)中，脂质沉积病灶均显著增加。在雄性高胆固醇血症 SENP2 S344A KI 小鼠中，仅在主动脉弓区域观察到较大的脂质沉积病灶，这表明与雌性小鼠相比，雄性小鼠中 HC 介导的动脉粥样硬化形成作用较弱。电离辐射(IR)可降低 CHK1 的表达及 SENP2 S344 的磷酸化，减弱骨髓移植(BMT)后雌性 SENP2 S344A KI 小鼠中观察到的促动脉粥样硬化作用，尤其在 L-flow 区域。磷酸化位点突变 SENP2 S344A 会上调与内皮细胞活化相关的过程，包括炎症、迁移和增殖。此外，还观察到纤维化变化及内皮细胞标记基因的表达上调。源自 SENP2 S344A KI 小鼠肺的内皮细胞中，细胞凋亡增加，主要是通过抑制 ERK5 介导的 DNA 损伤诱导凋亡抑制因子(DDIAS)表达实现的。结论:本研究揭示了一种潜在的新型抑制

缩写

AAV，腺相关病毒；ATR，ATM和Rad3相关激酶；ATM，ATM激酶；BMT，骨髓移植；CHK1，检查点激酶1；CRISPR/Cas9，Cas9核酸内切酶；DAPI，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚；DEG，差异表达基因；DDR，DNA损伤应答；DDIAS，DNA损伤诱导凋亡抑制因子；D-flow，紊乱流；EC，内皮细胞；endoMT，内皮-间质转化；Gy，戈瑞；GO，基因本体论；GSEA，基因集富集分析；γH2AX，磷酸化S139组蛋白H2A；H&E，苏木精-伊红；HDL，高密度脂蛋白；HFD，高脂饮食；HUVEC，人脐静脉内皮细胞；IPA，Ingenuity通路分析；ICAM1，细胞间黏附分子1；IR，电离辐射；KI，敲入；L-flow，层流；LDL，低密度脂蛋白；MS，质谱；PBS，磷酸盐缓冲液；qRT-PCR，定量逆转录PCR；RNA-seq，RNA测序；SMA，α-平滑肌肌动蛋白；SENP2，sentrin特异性异肽酶2；TWIST1，twist相关蛋白1；siRNA，小干扰RNA；SUMO，小泛素相关修饰物；TGF-β，转化生长因子-β；VCAM1，血管细胞黏附分子1；VE-cad，血管内皮钙黏蛋白；WT，野生型。

L-flow 对 EC 炎症、迁移、增殖、凋亡和纤维化变化的抑制作用，是通过促进 CHK1 诱导的 SENP2 S344 磷酸化实现的。磷酸位点突变 SENP2 S344A 通过一种独特的机制对 L-flow 作出反应，该机制涉及间充质和 EC 标记基因的上调。

关键词

动脉粥样硬化、内皮活化、层流、CHK1、SENP2、SUMO化、纤维化

引言

血流模式对体内疾病进展有显著影响，但其潜在生物学机制尚未完全明确。研究发现，血管内皮细胞(ECs)区域的D流(而非L流 )会促进动脉粥样硬化的发生。去SUMO化酶SENP2含有核定位信号和核输出信号，具备核质穿梭活性，在调控多种参与重要细胞过程的蛋白质的SUMO化修饰中发挥关键作用。这些蛋白质包括细胞外信号调节激酶5(ERK5)、肿瘤抑制蛋白p53、黏着斑激酶(FAK)以及含WW和PDZ结构域的膜相关鸟苷酸激酶1(MAGI1)(3-9)。我们此前的研究表明，D流可激活氧化还原敏感的核糖体S6激酶p90RSK，导致SENP2在T368位点发生磷酸化。该磷酸化事件随后会触发ERK5和p53的SUMO化修饰，进而促进内皮细胞炎症和凋亡。最终导致内皮细胞功能障碍，推动动脉粥样硬化的发展(3-5, 9-12)。相反，我们还观察到，L流可抑制ERK5和p53的SUMO化修饰，且不影响SENP2 T368位点的磷酸化。这提示L流的动脉粥样硬化保护作用独立于SENP2 T368位点的磷酸化。

动脉粥样硬化与血管壁细胞的DNA损伤密切相关，进而激活DNA损伤应答(DDR)通路(14-16)。DDR在维持受DNA损伤剂(如癌症治疗中常用的放疗和化疗)作用的细胞的遗传稳定性和完整性方面发挥关键作用(17)。DDR通过启动细胞周期阻滞以进行DNA修复，并促进细胞凋亡和衰老，从而阻止受损DNA的复制。主要的DDR通路由毛细血管扩张性共济失调突变(ATM)激酶和毛细血管扩张性共济失调及Rad3相关(ATR)激酶调控，这两种激酶可在DNA损伤位点使蛋白质发生磷酸化。例如，组蛋白变体H2AX的139位丝氨酸残基磷酸化会形成，并激活检查点激酶(CHK)(18)。CHK1由ATR激活，在调控DDR以阻止DNA损伤扩散的过程中发挥关键作用。它诱导细胞周期阻滞、衰老和凋亡，从而阻止携带受损DNA的细胞继续增殖(18, 19)。CHK1激活在阻止因p53突变而常见的G1检查点缺陷细胞进入有丝分裂方面尤为重要。此外，CHK1还通过抑制过度的复制起点激活来抑制复制压力，尤其是在携带激活癌基因的细胞中。

内皮细胞(EC)激活是动脉粥样硬化的重要促成因素。多种机制参与内皮细胞激活，包括黏附分子和趋化因子的生成(炎症反应)、迁移、增殖和凋亡。L流可抑制这些过程，而D流则促进它们(20)。内皮细胞可通过内皮间质转化(endoMT)过程转分化为间充质表型(21, 22)。在内皮间质转化过程中，内皮细胞特异性基因(如分化簇31[CD31或血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM1)]、血管内皮钙黏蛋白(VE-钙黏蛋白或CDH5)、血管性血友病因子(vWF)、含免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶1(TIE1)以及TEK受体酪氨酸激酶(TIE2))的表达会下调，而间充质细胞特异性基因(如 -平滑肌肌动蛋白(αSMA)、纤连蛋白的额外结构域A(EDA)、N-钙黏蛋白、波形蛋白、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)以及Twist相关蛋白1(TWIST1)表达上调(23, 24)。尽管内皮-间质转化(endoMT)最初是在胚胎心脏发育过程中发现的，但近期研究表明其与动脉粥样硬化有关(25-30)。重要的是，血流在调控内皮-间质转化(endoMT)中发挥关键作用。Moonen及其同事证实，层流(L-flow)诱导的ERK5激活可抑制内皮-间质转化(endoMT)(31)。现已明确，层流(L-flow)与湍流(D-flow)这两种不同的血流模式，对内皮细胞(EC)激活和内皮-间质转化(endoMT)的调控方式不同，但二者协同作用。尽管多项研究聚焦于血流如何调控单个生物学反应，但据我们所知，血流如何调控与内皮细胞(EC)激活和内皮-间质转化(endoMT)相关的所有过程，以及这些过程对动脉粥样硬化的影响，目前仍不清楚。

放疗诱导的心血管疾病是癌症幸存者发病和死亡的重要原因，尤其在乳腺癌(32)、淋巴瘤(33, 34)和肺癌(35, 36)患者中更为突出。Darby及其同事的研究显示，每接受1戈瑞(Gy)的平均心脏剂量，主要冠脉事件的发生风险就会增加；在放疗开始后的前4年内，每接受1戈瑞的平均心脏剂量，主要冠脉事件的发生风险则会增加16.3%。与未接受心脏剂量的患者相比，即使是微小的平均心脏剂量增加，也与主要冠脉事件的风险升高相关(接受2戈瑞:10%；2-4戈瑞:30%；5-9戈瑞:40%；≥10戈瑞:116%)(37)。放疗会通过造成内皮细胞(EC)损伤、激活心脏单核细胞和巨噬细胞，引发急性大血管和微血管损伤。然而，这些效应背后的调控机制仍不明确，目前也没有有效的治疗方法可预防放疗诱导的心血管疾病。

在本研究中，我们利用公开可用的数据集探究了SENP2的其他磷酸化位点，因为层流(L-flow)的动脉粥样硬化保护效应似乎与SENP2 T368磷酸化无关。我们的分析显示，CHK1可在S344位点发生磷酸化(38, 39)，该激酶是通过化学与遗传学方法结合高分辨率质谱鉴定得到的(19, 38, 39)。此外，我们发现暴露于层流(L-flow)会增强内皮细胞(EC)中CHK1在S280位点的磷酸化，以及SENP2在S344位点的磷酸化。有趣的是，我们观察到放疗会通过降低CHK1的表达来破坏这一通路。然而，CHK1介导的SENP2 S344磷酸化在内皮细胞(EC)激活、内皮-间质转化(endoMT)和动脉粥样硬化中的功能作用、调控机制及贡献仍知之甚少。因此，本研究旨在探究层流(L-flow)诱导的CHK1介导SENP2 S344磷酸化的功能作用与调控机制，以及其对动脉粥样硬化的后续影响。

方法

支持本研究结果的数据可在合理请求下从通讯作者处获取。

质粒、腺相关病毒(AAV)与腺病毒

含有人 SENP2 WT 的质粒购自 Addgene(编号:18047)(40)。为生成磷酸位点突变体 SENP2 S344A，按照制造商说明书使用 Quik Change 定点诱变试剂盒(Agilent Technologies)。表达人 SENP2 WT 和 S344A 的腺病毒(Ad SENP2 WT、Ad SENP2 S344A)通过将 pCMV 载体中对应的插入片段克隆至 pENTR1A 载体(Life Technologies，编号:A10462)的 EcoRI 和 SalI 限制性内切酶识别位点生成。按照制造商说明书，使用 Invitrogen Gateway LR Clonase II 酶混合物(编号:11791100)进行重组酶反应，获得基于 pDEST 的载体。为作对照，使用含 β-半乳糖苷酶的腺病毒(Ad-LacZ)(9)。含人 DDIAS(C11orf82，编号:RC206347)和带 C 端 Myc-DDK 标签的 pCMV6-Entry(编号:PS100001)的质粒购自 OriGene Technologies, Inc.。此外，编码 mPCSK9 的质粒购自 Addgene(编号:58376)(41)。由北卡罗来纳大学载体核心(查珀尔希尔，北卡罗来纳州)生产了在肝特异性启动子调控区-载脂蛋白增强子/α1-抗胰蛋白酶(rAAV8-HCRApoE/hAAT)控制下表达 mPCSK9 的重组腺相关病毒血清型 8(rAAV8)。

抗体与试剂

磷酸化特异性 SENP2 S344 抗体由 Pierce Biotechnology Inc. 定制生产。以对应人 SENP2 序列 334-354 位氨基酸的合成肽(Ac-GSNGLLRRKVS*IIETKEKNCS)免疫兔。免疫过程中监测不良反应，包括病灶形成、食欲减退及无应答情况。兔通过初步评估后，剩余免疫方案按制造商规程实施。免疫完成后，对兔实施安乐死，所得血清经亲和纯化。以下抗体购自 Cell Signaling Technology(美国马萨诸塞州贝弗利):ERK5(货号 #3372)、切割型 caspase 3(货号 #9661)、ICAM1(货号 #4915、#67836)、p53(货号 #9282)、VCAM1(货号 #13662)、磷酸化 CHK1 S280(货号 #2347S)、磷酸化 CHK1 S345(货号 #2348S)及磷酸化 CHK1 S317(货号 #12302S)。以下抗体购自 Abcam(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆):SENP2(货号 #58418)、VCAM1(货号 #13407)、α-SMA(货号 #ab5694)。CHK1(sc-8408)购自 Santa Cruz biotechnology(美国得克萨斯州达拉斯)。SENP2 抗体(NBP1-31217)及 β-actin 抗体(NB600-532)购自 Novus Biologicals(美国科罗拉多州布里亚伍德大道)。以下抗体及试剂购自 Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯):DDIAS(HPA038541)、TWIST1(ABD29)、蛋白酶抑制剂混合物(P8340)、PMSF(货号 #36978)、NEM(E3876)及氯化二亚苯基碘鎓(D2926)。SUMO2/3 抗体(AP1224a)购自 Abcepta, Inc (美国加利福尼亚州圣地亚哥)。Quick ChangeII 定点诱变试剂盒(货号 #200523)购自 Agilent Technology(美国加利福尼亚州圣克拉拉)。Lipofectamine 2000 转染试剂(货号 #11668027)购自 Thermo Fisher Scientific(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)。CHK1 抑制剂(GDC 0575)及 ERK5 抑制剂(XMD8-92，货号 #S7525)购自 Selleck Chemicals LLC(美国得克萨斯州休斯敦)，溶于 DMSO，按图中所示剂量在流体暴露前预处理 ECs。

动物研究

小鼠相关程序严格遵循德克萨斯农工大学生物科学与技术研究所机构动物护理和使用委员会(IACUC)(2014-0231、2017-0154)及德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心(UTMDACC；00001652、00001109)制定的指南和规定，并符合《实验动物护理和使用指南》(DHHS 出版物，NIH 85-23 Rev.1985)中概述的美国国立卫生研究院(NIH)标准。小鼠喂食适当的辐照饲料和超纯水，饲养于 UTMDACC 的设施内，该设施获得 AAALAC 认证，环境温度维持在，采用光照黑暗循环(42)。小鼠饲养于笼级屏障系统中，使用热处理木屑垫料及丰容材料(垫料)。笼具和水每周更换一次。为研究人 SENP2 S344 的小鼠同源物(S343，为保持一致性称为“小鼠 SENP2 S344”)，我们利用 CRISPR/Cas9 技术构建了 SENP2 S344A 敲入(KI)小鼠。靶向 SENP2 S344 的 gRNA 是通过脱靶程序(http://crispr.mit.edu/)选择的，以尽量减少脱靶切割，其体内切割效率则通过效率切割程序(http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)评估。我们选择了三个最接近 S344 密码子且符合脱靶和效率标准的 gRNA 进行进一步测试。按照 Clontech Cas9 Guide-it 筛选试剂盒的说明，将这些 gRNA 与无关 gRNA 一同与 SENP2 质粒和 Cas9 孵育。凝胶电泳证实，三个 SENP2 S344 gRNA 对靶序列的切割准确率达 100%，而对照 gRNA 未显示任何切割活性(数据未显示)。包含 S344A 突变及 PAM 序列沉默突变(产生相同氨基酸但密码子不同)的 110 bp 供体 DNA 由 Sigma-Aldrich 合成。过量的单链供体 DNA 用于不对称 PCR 和 PCR 纯化。最终产物随后送至 UTMDACC 的基因工程小鼠设施。将每个供体 DNA 与其对应的 gRNA 和 Cas9 一同显微注射到 C57BL/6 小鼠受精卵的原核中，并移植至代孕小鼠体内。

为测定HDL和LDL胆固醇水平，使用小鼠胆固醇检测试剂盒(#EHDL-100，Bioassay System，Hayward，CA)进行检测(43)。

组织制备、组织学评估及病变大小定量

我们向八周龄小鼠的尾静脉单次注射rAAV8-mPCSK9 ，随后给小鼠喂食高脂饮食(HFD)，该饮食含21%脂肪、0.15%胆固醇、19.5%酪蛋白(#TD.88137；Envigo，新泽西州)(44)，持续16周。在喂食高脂饮食前后记录小鼠体重。实验结束时，使用吸入法对小鼠实施安乐死，采集血液样本用于低密度脂蛋白胆固醇检测(45)。通过左心室灌注含肝素的生理盐水(40 USP U/ml)对动脉树进行灌流，随后用PBS配制的10%中性缓冲福尔马林处理10分钟。将主动脉从心脏解剖至髂动脉分叉处，沿腹中线剖开。将制备好的主动脉标本置于PBS中清洗，浸入60%异丙醇，再用含0.3%油红O(ORO)的60%异丙醇染色。使用安装在Nikon SMZ1000体视显微镜上的数码相机采集图像，并采用ImageJ软件进行图像分析(5, 46)，实验采用双盲法。

骨髓移植(BMT)

为进行BMT，将取自8至9周龄SENP2 S344A KI或WT小鼠的、经致死剂量照射的骨髓细胞，替换为取自WT小鼠的骨髓细胞(47)。恢复6周后，给受体小鼠单次施用rAAV8-mPCSK9，并饲喂高脂饮食(HFD)22周(45)。为确认BMT成功，对取自受体小鼠外周血的基因组DNA进行PCR，使用针对WT的特异性引物(正向:CAC GTA TTC ACT ACC CAA TGT GGA GTT C；反向:AAG TTC TTT TCC TTT ATC TCA AGC ACT GA)和针对SENP2 S344A KI的特异性引物(正向:CAC GTA TTC ACT ACC CAA TGT GGA GTT C；反向:GTT CTT TTC CTT AAT CTC AAG CAC TGC)。通过对整体标本进行油红O染色，鉴定小鼠主动脉内富含脂质的病变。主动脉瓣小叶在游离缘与瓣环附着点之间的中心区域切片，使用Masson三色染色试剂盒(ab150686；abcam)进行染色。对BMT受体小鼠的主动脉瓣变化进行组织学评估。

人脐静脉 ECs(HUVECs)的分离与培养

通过对取自人脐静脉的内皮进行胶原酶消化来分离 HUVECs。随后，我们将细胞接种于包被了 0.2% A 型明胶(货号#901771；MP Biomedicals，美国加利福尼亚州圣安娜)的培养皿或培养瓶中，使用 EC 培养基 [ECM，货号#1001，Science Cell，美国加利福尼亚州圣迭戈] 进行培养。本研究已获得休斯顿卫理公会机构审查委员会(IRB Pro00020559)的批准研究所(HMRI)及 UTMDACC(IRB RM00000535-RN01)的批准。本特定研究无需知情同意。

小鼠肺内皮细胞的分离与培养

从小鼠肺中分离内皮细胞的操作已获得HMRI的IACUC批准(IS00006725)，该流程遵循先前描述的方法。将6至8周龄小鼠的肺用预冷的PBS仔细冲洗，用剪刀切碎，然后用胶原酶消化。为捕获小鼠肺中的内皮细胞，我们使用了偶联羊抗大鼠PECAM-1的Dynabeads(#11035，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen公司)。随后，将捕获的细胞培养于DMEM(#SH30243.0，美国犹他州洛根的Hyclone公司)中，该培养基添加了10%胎牛血清(#F2442，密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司)、1%内皮细胞生长添加剂(Promo Cell，德国海德堡)、25 mM HEPES(#25-060-CI，弗吉尼亚州马纳萨斯的Corning公司)、1%非必需氨基酸溶液(#25-025-CI，弗吉尼亚州马纳萨斯的Corning公司)、肝素(#67457037399，伊利诺伊州罗克福德的Mylan Institutional公司)以及1%青霉素/链霉素(#30-002-CI，弗吉尼亚州马纳萨斯的Corning公司)。

siRNA 和质粒转染

为降解人 CHK1，我们使用了靶向编码序列 281-301(AAGCGUGCCGUAGACUGUCCA)的 siRNA，以及非靶向对照序列，这些均购自美国马萨诸塞州伯灵顿的 Sigma-Aldrich 公司。siRNA 和质粒转染步骤按照我们之前描述的方法(5, 44)进行。转染过程中使用了 Life Technologies 公司的 GIBCO Opti-MEM 减血清培养基(货号:#31985070；Thermo Fisher Scientific)，并添加了 Plus(货号:#11514015)和 Lipofectamine(货号:#18324020)。转染后，让细胞恢复时间再进行后续处理。

基于RNA测序的全基因组基因表达研究

在对SENP2 S344A KI小鼠和WT小鼠进行L-流暴露后，从其肺部分离出的ECs中提取总RNA。使用RNeasy Plus Micro Kit(货号:74034，QIAGEN，Germantown，MD)进行RNA提取。随后，我们将RNA样本送至中国深圳的华大基因(BGI)，使用BGISEQ-500平台进行mRNA制备、文库构建和测序。将测序得到的干净标签比对到小鼠基因组注释项目2提供的参考基因组和基因，允许最多一个错配。原始测序数据已存入基因表达数据库(GEO)，登录号为GSE222511，令牌为snyjiikwrdwntcz。使用Kallisto(v0.46.0)及默认参数将双端RNA测序读段比对到小鼠基因组(gencode.vM27)。使用DESeq2(v2.0.12)进行基因表达水平计算和差异表达基因(DEGs)鉴定。基因表达以每百万转录本(TPM)衡量，DEGs的定义基于值作为阈值。使用DAVID(https://david-d.ncifcrf.gov)进行通路富集分析，通过改良Fisher精确检验计算每个基因本体论(GO)术语的值。以值作为阈值筛选显著富集的GO术语，并使用R(v3.5.1)构建维恩图以鉴定样本间共表达的DEGs。分析KI组和WT组的转录谱，并使用MORPHEUS https://software.broadinstitute.org/morpheus/生成热图。

免疫印迹与SUMO化

采用放射免疫沉淀法(RIPA)缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、乙二胺四乙酸、1% Nonidet P-40、0.1%十二烷基硫酸钠、0.25%脱氧胆酸钠)进行蛋白质提取，或使用购自密理博公司(货号:20-118，美国马萨诸塞州比勒里卡)的缓冲液，该缓冲液添加了哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物(货号:p8340；德国曼海姆，Sigma-Roche)、苯甲基磺酰氟 (货号:36978；美国赛默飞世尔科技)以及N-乙基马来酰亚胺 (货号:E3876；德国曼海姆，Sigma-Roche)(5)。将裂解物离心以去除碎片，使用蛋白质检测试剂盒I(货号:5000111；美国加利福尼亚州赫库勒斯，Bio-Rad)测定蛋白质浓度。将等量蛋白质上样至十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，随后转印至Immobilon-P转移膜(货号:IPVH00010；爱尔兰塔拉格林，默克密理博)。将膜置于3% BSA/TBST溶液(10 mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、0.1% Tween 20，pH 8.0)中，于室温孵育，用TBST洗涤后，与特异性抗体(稀释比例为500-1000)在下温和振荡孵育过夜。洗涤三次(每次 )后，将膜与HRP标记的二抗(稀释比例为4500-5500)孵育，再次洗涤后，使用ECL底物(货号:NEL105001EA；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，珀金埃尔默公司)检测化学发光。使用ImageJ软件对免疫印迹膜的信号强度进行定量。对于SUMO化，用特异性识别SUMO2/3的抗体(Signal-Seeker SUMO化2/3检测试剂盒，货号:BK162；美国Cytoskeleton公司)对裂解物进行免疫沉淀，随后用ERK5或p53抗体进行免疫印迹，以检测SUMO化的ERK5或p53。相同的下拉样品也用SUMO2/3抗体进行免疫印迹，以确认下拉的SUMO2/3量相等。使用对照珠作为参照。

自动化毛细管电泳蛋白质印迹分析(Wes；proteinSimple，美国加利福尼亚州圣何塞)

将裂解物与含 DTT的荧光预混液混合，在下加热，然后取蛋白，使用12-230 kDa分离模块(货号:SM-W003)，搭配兔源(货号:DM-001)或鼠源(货号:DM-002)检测模块上样至Wes板(货号:004-600)。将裂解物、封闭缓冲液、一抗、HRP标记二抗及鲁米诺-过氧化物加入Wes板。 -肌动蛋白抗体作为上样对照，与所有样品的一抗进行多重检测。采用仪器默认设置进行毛细管电泳:分离时间为，分离电压为，封闭时间为，一抗和二抗孵育时间为。对自动检测的标准品和峰进行手动检查，使用内置的Compass软件(ProteinSimple)分析数据(48、49)。

用于体外研究不同血流模式的锥板装置

在本研究中，我们利用锥板装置在体外探究了不同血流模式对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的影响(50)。锥板法的原理已在其他文献中详细描述(51)。为产生D-流，我们使用带有深径向凹槽的锥板，该装置可诱导细胞呈现鹅卵石样形态，模拟体内D-流条件(50)。需要特别注意的是，D-流呈现湍流模式，与振荡流不同，这使得剪切应力计算无法进行。对于L-流实验，我们使用了平锥(光滑锥)，观察到人脐静脉内皮细胞呈细长形态，与体内L-流条件下观察到的形态相似(50)。此外，我们通过检测ERK5在T-E-Y残基处的磷酸化，确认了L-流的成功生成(50, 52)。由于L-流抑制内皮细胞(EC)炎症，而D-流促进炎症，因此解释内皮细胞炎症基因表达的增加变得具有挑战性。目前尚不清楚这种增加是由于D-流促炎效应增强，还是由于L-流抗炎效应减弱。为了分离每种血流模式的影响，我们纳入了无血流(静态条件)的对照组。

体外内皮细胞迁移实验

将亚汇合状态的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用Ad-SENP2野生型(WT)或S344A进行转导。次日，用无菌移液枪头在HUVEC层中央划出一条垂直区域。随后吸出培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞三次，以去除所有脱落细胞。向孔中加入新鲜细胞外基质(ECM)。在暴露于层流(L-flow) 后，在显微镜下拍摄细胞照片，并使用Image J软件分析图像。细胞迁移率计算如下:(初始无细胞垂直划痕长度 - 层流暴露后剩余无细胞区域长度)/ 初始无细胞垂直划痕长度。

统计分析

为评估实验组间差异的统计学意义，我们首先进行 Shapiro-Wilk 检验以评估各组的正态性。对于符合正态分布的数据，我们采用常规单因素方差分析(ANOVA)，后续进行 Fisher 最小显著性差异(LSD)检验以开展多组比较，或采用未配对的 Student 检验进行两组比较。对于 2×2 实验，我们采用双因素方差分析(ANOVA)而非单因素方差分析。若数据不符合正态性假设，我们使用 Prism 软件(GraphPad Software)进行 Brown-Forsythe 和 Welch 方差分析，或采用经 Welch 校正的未配对检验。我们将值小于 0.05 视为具有统计学意义。

数据可用性

本研究生成的RNA测序数据已存入NCBI的基因表达综合数据库，登录号为GSE95066。SENP2序列已存入GenBank，登录号为KY651081。支持本研究结果的所有其他数据、分析方法和研究材料均包含在数据补充材料中，或可应合理要求从通讯作者处获取。

结果

CHK1 调控 L-流诱导的 SENP2 在 S344 残基处的磷酸化，随后抑制 ERK5 和 p53 的 SUMO 化

基于公开的基于质谱的磷酸蛋白质组学数据集，这些数据集揭示了 SENP2 在丝氨酸 344(S344)残基处发生磷酸化，我们旨在探究这种磷酸化是否在 ECs 中响应 L-流而发生。为解决这一问题，我们制备了磷酸特异性 SENP2 S344 抗体，并转导 HUVECs，使其表达磷酸位点突变体 SENP2 S344A 或野生型形式(Ad-SENP2 S344A 或 Ad-SENP2 WT)。随后，将这些 HUVECs 暴露于 L-流中。L-流处理后，我们观察到 SENP2 S344 磷酸化水平升高，而转导 Ad-SENP2 S344A 可有效消除这种升高(图 1A、C、D)。相比之下，响应 D-流时，SENP2 S344 磷酸化水平无显著升高(图 1B、D)。

另一项公开可用的基于质谱的数据集显示，CHK1可在S344残基处使SENP2磷酸化。然而，这种磷酸化的功能后果尚未得到表征 (19)。为研究CHK1是否参与L-流介导的SENP2 S344磷酸化，我们在暴露于L-流前，用CHK1抑制剂GDC 0575 (53) 预处理HUVEC。值得注意的是，用GDC 0575预处理后，SENP2 S344磷酸化显著降低(图1C、E)。这些发现表明，CHK1在L-流介导的SENP2 S344磷酸化中发挥作用。

图 1

CHK1 调控 L-流诱导的 SENP2 S344 磷酸化，随后抑制 ERK5 和 p53 的 SUMO 化:(A) 转导了 Ad-SENP2 WT 或 Ad-SENP2 S344A 的 HUVECs 暴露于 L-流 0 分钟和 30 分钟，采用 Wes 检测 SENP2(p-S344 和总蛋白)、ERK5(p-T-E-Y 和总蛋白)以及肌动蛋白(上样对照)的水平。p-ERK5-T-E-Y 的升高表明 L-流成功生成，同时细胞形态伸长(50, 52)。(B) HUVECs 暴露于 D-流 0 分钟、20 分钟、40 分钟和 60 分钟，采用免疫印迹法检测 SENP2(p-S344 和总蛋白)的水平。(C) 用 250 nM GDC 0575 预处理的 HUVECs 暴露于 L-流 0 分钟、20 分钟、40 分钟和 60 分钟，采用 Wes 检测 SENP2(p-S344 和总蛋白)、CHK1(p-S280、p-S345 和总蛋白)以及肌动蛋白的水平。(D, 上图) 该图呈现了 (C) 中 3 次独立实验的量化数据(n = 3)(*p < 0.05，**p < 0.01，双因素方差分析)。(D, 下图) 该图呈现了 (B) 中 3 次独立实验的量化数据(n = 3)，N.S. 表示无显著性差异。(E-G) 该图呈现了 (C) 中 3 次独立实验的量化数据(n = 3)(*p < 0.05，**p < 0.01，双因素方差分析)。(H) 将 WT 小鼠肺 ECs(WT MLECs)和 SENP2 S344A KI MLECs 暴露于 L-流 0 分钟和 30 分钟，通过免疫印迹法检测 SENP2(p-S344 和总蛋白)的水平。(I) 将 WT MLECs 和 SENP2 S344A KI MLECs 暴露于 L-流 0 分钟和 30 分钟。裂解物用 SUMO2/3 抗体(Signal-Seeker™ SUMO 化 2/3 检测试剂盒，货号 #BK162；Cytoskeleton, Inc.)进行免疫沉淀，分别用 ERK5 或 p53 抗体通过 Wes 检测 SUMO 化的 ERK5 或 p53。SUMO2/3 抗体也用于确认各样本间免疫沉淀的均等性。对照珠用作阴性对照。ERK5、SENP2 和 p53 抗体用于通过 Wes 检测它们在总细胞裂解物中的表达。(J) 该图呈现了 4 次(上图)和 5 次(下图)独立实验的量化数据(*p < 0.05，双因素方差分析)。

此外，已知CHK1的激活受CHK1介导的磷酸酶2A回路调控(54)，因此我们评估了GDC 0575对CHK1激活的影响。有趣的是，用GDC 0575处理导致CHK1 S345磷酸化增加，这表明由于磷酸酶2A活性受到抑制，CHK1的激活得到了有效抑制(图1C、G)。值得注意的是，我们观察到，在经溶媒处理的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中，层流处理后CHK1在S280位点的磷酸化增加，但S345位点的磷酸化未增加，而GDC 0575可消除这种现象(图1C、F、G)。值得注意的是，CHK1在S280位点而非S345位点的磷酸化会促进CHK1的核转位。因此，层流后CHK1介导的SENP2 S344磷酸化，可能是由CHK1 S280磷酸化驱动的CHK1核转位调控，而非CHK1 S345磷酸化依赖的激酶激活调控。

为研究SENP2 S344磷酸化的功能及调控机制，我们利用CRISPR/Cas9技术构建了SENP2 S344位点磷酸突变的小鼠(SENP2 S344A KI小鼠)(47)。我们从SENP2 S344A KI小鼠的肺中分离出内皮细胞(ECs)(SENP2 S344A KI小鼠肺内皮细胞，SENP2 S344A KI MLECs)，并检测了层流对SENP2 S344磷酸化的影响。值得注意的是，我们观察到，在SENP2 S344A KI MLECs中，层流诱导的SENP2 S344磷酸化受到显著抑制(图1H)。此外，我们研究了SENP2 S344磷酸化对ERK5和p53 SUMO化的影响。有趣的是，我们观察到，在层流刺激后，SENP2 S344A KI MLECs中ERK5和p53的SUMO化增加，而在静态条件下，与野生型小鼠肺内皮细胞(WT MLECs)相比，未观察到显著变化(图1I、J)。这些发现强烈表明，层流诱导的SENP2 S344磷酸化通过调控SENP2的去SUMO化活性，在抑制ERK5和p53的SUMO化中发挥关键作用。

SENP2 S344 磷酸化可在体内抑制内皮细胞炎症与凋亡

我们此前曾报道，SENP2 通过抑制 ERK5 和 p53 的 SUMO 化，在抑制内皮细胞炎症与凋亡中发挥关键作用(10, 57)。虽然我们在体外暴露于 D 流的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中未观察到 SENP2 S344 磷酸化水平升高(图 1B、D)，但我们此前的研究已证实，在 SENP2 基因敲除小鼠中，无论处于 L 流还是 D 流条件，敲低 SENP2 都会导致黏附分子表达增加和细胞凋亡(9)。为进一步研究 SENP2 S344 磷酸化对内皮细胞炎症与凋亡的影响，我们使用携带磷酸化位点突变 SENP2 S344A KI 的小鼠，在 L 流和 D 流两种条件下检测了相关效应。免疫荧光染色结果显示，在磷酸化位点突变 SENP2 S344A KI 小鼠的 D 流条件下，内皮细胞炎症标志物 VCAM1 的表达升高(图 2A)。此外，TUNEL 染色显示，在磷酸化位点突变 SENP2 S344A KI 小鼠的 D 流条件下，TUNEL- 阳性细胞数量增加，表明细胞凋亡，(图 2B)。这些发现进一步证明，在体内环境中，SENP2 S344 磷酸化通过维持 SENP2 的去 SUMO 化活性，发挥抑制内皮细胞炎症与凋亡的作用。

磷酸位点突变 SENP2 S344a KI 小鼠会出现更大的脂质沉积病灶

为评估SENP2 S344磷酸化在动脉粥样硬化发生中的作用，我们给野生型(WT)对照小鼠和磷酸化位点突变SENP2 S344A敲入(KI)小鼠单次注射rAAV8-mPCSK9，并让它们喂食高脂饮食(HFD)16周。WT小鼠与磷酸化位点突变SENP2 S344A KI小鼠之间的体重和胆固醇水平无差异(补充图S1A、B)。然而，小鼠主动脉的油红O整体染色显示，雌性高胆固醇血症(HC)磷酸化位点突变SENP2 S344A KI小鼠的主动脉弓(D-流)和降主动脉(L-流)中，脂质沉积病变更为显著(图3A、B，下图)。在雄性HC磷酸化位点突变SENP2 S344A KI小鼠中，仅在主动脉弓区域(D-流，图3B，上图)观察到显著更大的脂质沉积病变，这表明HC介导的内皮细胞(EC)激活和动脉粥样硬化发生在雄性中比雌性更弱。由于血管壁细胞(即ECs (14-16))中DNA损伤诱导的激活与动脉粥样硬化发生相关，我们确定磷酸化位点突变SENP2 S344A KI的促动脉粥样硬化特性是否是由于血管壁细胞中SENP2 S344磷酸化不足所致。通过致死性照射清除8-9周龄SENP2 S344A KI或WT小鼠的骨髓细胞，然后移植同年龄WT供体的骨髓细胞(图3C)。骨髓移植(BMT)后恢复6周 (58)，WT WT和WT SENP2 S344A KI小鼠(图3C)均单次注射rAAV8-mPCSK9并喂食HFD (42)(图3C)。喂食HFD 22周后，从外周血中提取基因组DNA，用于PCR验证BMT是否成功(图3D)。在雄性和雌性小鼠中，WT WT与WT SENP2 S344A KI之间的体重和胆固醇水平无差异(补充图S1C、D)。尽管全身SENP2 S344A KI雄性小鼠中HC介导的脂质沉积病变形成比雌性小鼠弱，但雄性WT→SENP2 S344A KI小鼠在D-流区域显示出更大的脂质沉积病变(图3E、F)。与雄性WT WT小鼠相比，WT SENP2 S344A KI雄性小鼠的主动脉瓣横截面区域斑块病变更大，这表明血管壁中的SENP2 S344磷酸化在抑制动脉粥样硬化形成中起关键作用，尤其是在D-流区域(图3G、H)。尽管雄性WT SENP2 S344A KI与雄性WT WT小鼠之间，坏死核心占总脂质沉积区域的百分比几乎相同(图3I)，但雄性WT SENP2 S344A KI小鼠中覆盖坏死核心的纤维帽更薄(图3J)，这表明血管细胞中的SENP2 S344磷酸化可预防易损斑块形成(图3I、J)。

图 2

SENP2 S344A KI 小鼠中 EC 炎症与凋亡增加:(A) 野生型与 SENP2 S344A KI 小鼠主动脉的整体标本制备，经免疫荧光染色检测 VCAM1(红色，EC 炎症)和 VE-Cad(绿色，EC 标志物)。(B) 主动脉切片经 TUNEL(绿色，EC 凋亡 (106))和 DAPI(蓝色，细胞核 (9))染色。计数 TUNEL 阳性的凋亡细胞核，以指示 TUNEL 信号(代表碎片化 DNA)与 DAPI 信号(代表细胞核)的共定位(28)。图表呈现 5 个独立样本(n=5)的量化数据(* ，** ，(A) 采用双因素方差分析；(B) 采用非配对检验)。

辐射通过下调CHK1表达加速内皮细胞(EC)激活

尽管正面油红O染色显示，雌性SENP2 S344A KI小鼠的脂质沉积病灶大于雌性野生型(WT)小鼠(图3A、B)，但当这些雌性小鼠接受骨髓移植(BMT)以构建血管特异性模型时，雌性WT SENP2 S344A KI小鼠的脂质沉积病灶与雌性WT→WT小鼠几乎无差异(图4A)。由于BMT过程中会对小鼠进行辐射处理，因此我们推测辐射可能会改变CHK1和/或SENP2的活性。为验证这一假设，我们对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行辐射处理，观察到SENP2 S344磷酸化和CHK1表达均呈剂量依赖性降低，同时血管细胞黏附分子1(VCAM1)和细胞间黏附分子1(ICAM1)的表达升高。VCAM1和ICAM1的表达变化与CHK1表达及SENP2 S344磷酸化的变化呈负相关(图4B、C)。此外，CHK1耗竭会加速ERK5的类泛素化修饰(SUMOylation)(图4D)及层流紊乱(D-flow)诱导的ICAM1表达(图4E)，同时抵消层流(L-flow)的抗炎作用 (图4F、G)。这些数据表明，辐射通过抑制CHK1-SENP2 S344磷酸化轴诱导内皮细胞(EC)激活。因此，与未接受辐射的磷酸化位点突变SENP2 S344A KI小鼠(图3A、B下图)相比，接受BMT后磷酸化位点突变SENP2 S344A KI小鼠对动脉粥样硬化斑块形成的影响变得不明确，尤其是在雌性小鼠中(图4A)。

SENP2 S344 磷酸化可抑制多种促成内皮细胞(EC)激活的过程

为阐明层流诱导的SENP2 S344磷酸化的功能作用，将SENP2 S344A基因敲入小鼠肺微血管内皮细胞(KI MLECs)和野生型小鼠肺微血管内皮细胞(WT MLECs)暴露于层流中，并进行RNA测序。我们鉴定出SENP2 S344A KI MLECs与WT MLECs相比有427个差异表达基因(DEGs)(图5A)。在这些DEGs中，427个DEGs中有259个受层流调控(图5B)。基因本体论(GO)分析显示，这427个DEGs与迁移、上皮细胞增殖的正调控、多细胞生物发育、血管生成的正调控以及细胞黏附相关，所有这些过程均已知会促进内皮细胞(EC)激活(图5D、E)。GO Circle分析显示，SENP2 S344A KI MLECs中所有这些过程均呈正评分(表明激活)(图5E)。此外，一项体外研究表明，层流可促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的迁移，而Ad-SENP2 S344A磷酸位点突变的转导可进一步增强该效应(图5F、G)。ERK5转录活性的激活可抑制内皮细胞迁移(59)，我们之前的研究已证明，ERK5的SUMO化可抑制其转录活性(49)。因此，Ad-SENP2 S344A转导驱动的HUVEC迁移增加可归因于ERK5 SUMO化的增强。综上，我们的研究结果表明，SENP2 S344磷酸化参与调控多种促进内皮细胞激活的过程，包括内皮细胞迁移。

图 3

SENP2 S344A KI 小鼠中脂质沉积病灶与纤维帽增加:向 SENP2 S344A KI 小鼠和 WT 小鼠单次注射重组腺相关病毒 8 型(rAAV8)-小鼠前蛋白转化酶枯草溶菌素 9(mPCSK9)，并喂食高脂饮食(HFD)16 周(42)。(A)进行整体 Oil Red O 染色以量化脂质的丰度与分布。(C)实施骨髓移植(BMT)程序(58)。(D)代表性聚合酶链反应(PCR)数据证实骨髓移植成功。(E)对骨髓移植构建的模型进行整体 Oil Red O 染色。(G)对主动脉瓣叶切片进行 Masson 三色染色，以评估主动脉瓣的变化。(B、F、H-K)图表呈现样本的量化数据(n = 7-10)(*p<0.05，**p<0.01，非配对 t 检验)。N.S. 表示无统计学意义。

图 4

CHK1 下调介导辐射诱导的内皮细胞(EC)激活:(A)雌性 WT WT 小鼠与 WTT SENP2 S344A KI 小鼠之间的脂质沉积病灶无显著差异(n = 3-4)。(B)在接受 0、2、4、6、8 戈瑞(Gy)电离辐射(IR)24 小时的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中，检测 CHK1、SENP2(磷酸化 S344 及总蛋白)、血管细胞黏附分子 1(VCAM1)、细胞间黏附分子 1(ICAM1)及肌动蛋白的表达水平。(C)图表呈现 3 次独立实验的量化数据(**p<0.01，双因素方差分析(two-way ANOVA))。(D，左图)在小干扰 RNA(siRNA)处理的 HUVECs 中评估 SUMO 化的细胞外调节蛋白激酶 5(ERK5)，并按图 1 所述对裂解物进行免疫沉淀。(D，右图)图表呈现 3 次独立实验的量化数据(**p<0.1，t 检验)。(E，左图)将 siRNA 处理的 HUVECs 暴露于湍流(D-flow)24 小时，采用免疫印迹法检测细胞间黏附分子 1(ICAM1)、CHK1 及肌动蛋白的表达。(E，右图)图表呈现 3 次独立实验的量化数据(*p<0.05，双因素方差分析)。(F)在接受层流(L-flow)24 小时的 siRNA 处理的 HUVECs 中，采用免疫印迹法检测细胞间黏附分子 1(ICAM1)、血管细胞黏附分子 1(VCAM1)、CHK1 及肌动蛋白的表达水平。(G)图表呈现 3 或 4 次独立实验的量化数据(* ，** ，双因素方差分析)。

图 5

SENP2 S344A 基因敲入小鼠肺内皮细胞(KI MLECs)中内皮细胞(EC)病理应激反应增强:(A) 火山图展示了层流(L-flow)处理后野生型小鼠肺内皮细胞(WT MLECs)与 SENP2 S344A KI MLECs 之间的差异表达基因(DEGs)；“红色”点代表上调的差异表达基因，“蓝色”点代表下调的差异表达基因。(B) 热图展示了层流处理 24 小时后 WT MLECs 与 SENP2 S344A KI MLECs 之间差异表达基因的层次聚类情况。(C) 维恩图显示了 WT MLECs 和 SENP2 S344A KI MLECs 中差异表达基因的总数。(D) 对 WT MLECs 与 SENP2 S344A KI MLECs 经四次重复实验鉴定出的内皮细胞激活相关基因本体论(GO)通路进行注释。(E) 分子功能弦图展示了 SENP2 S344A KI MLECs 转录本中与内皮细胞激活相关的富集 GO 生物过程术语，以及按表达水平排列的相应基因。(F) 用携带野生型 SENP2(Ad-SENP2 WT)或 SENP2 S344A(Ad-SENP2 S344A)的腺病毒转导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，进行划痕实验并暴露于层流 6 小时。显示细胞迁移的代表性图像，虚线代表初始或最终迁移区域。(G) 图表呈现了 6 次独立实验的量化数据(* ，** ，采用双因素方差分析)。

SENP2 S344 磷酸化可抑制纤维化改变，同时上调内皮细胞特异性基因表达

基于Inguity通路分析(IPA)的知识数据库，我们将特发性肺纤维化信号通路确定为排名最高的富集IPA经典通路。此外，IPA得出的评分(激活程度的衡量指标)表明，与WT MLECs相比，层流处理后SENP2 S344A KI MLECs中，特发性肺纤维化信号通路和肝纤维化信号通路中与纤维化变化相关的过程呈正上调(图6A；补充表S1)。即使在静态条件下，特发性肺纤维化信号通路的评分仍为正，进一步表明SENP2 S344A KI MLECs的磷酸位点突变具有促纤维化作用(图6B)。重要的是，在静态条件下，SENP2 S344A KI MLECs中所有促进内皮细胞激活的过程(如细胞黏附、血管生成、上皮细胞增殖的正调控以及细胞外基质组装)的评分也均为正。这些数据强烈表明，SENP2 S344磷酸化有助于内皮细胞激活(图6C、D)。与这些发现一致，我们观察到SENP2 S344A KI MLECs的DNA合成较WT MLECs增加(图6E)。为评估SENP2 S344磷酸化在纤维化变化中的作用，我们测定了纤维化标志物和间充质标志物的表达水平，发现SENP2 S344A KI MLECs中，TWIST1(纤维化标志物)和αSMA(间充质标志物)的表达均升高(图6F)。由于紊乱流(d-flow)可激活内皮-间质转化(endoMT)，我们还评估了间充质基因和内皮细胞特异性基因的表达。我们发现，层流处理后，SENP2 S344A KI MLECs中间充质基因和内皮细胞特异性基因的表达均上调(图6G、H)。这些数据表明，SENP2 S344A KI MLECs的磷酸位点突变表现出独特的表达模式，在维持内皮细胞表型且不诱导内皮-间质转化的同时，促进纤维化变化。这种独特的表达模式可能解释了SENP2 S344A KI小鼠中纤维化帽面积减少但胶原蛋白组成不变的现象(图3K)，因为纤维化帽面积的减少并未导致胶原蛋白组成相应降低。

图 6

SENP2 S344A KI MLECs 中 EC 激活相关纤维化增加，且 EC 标志物表达上调:(A) 层流处理后，经 IPA 分析确定，SENP2 S344A KI MLECs 中纤维化相关过程的 Z 评分呈正上调；(B) 静态条件下，特发性肺纤维化信号通路的 Z 评分在 SENP2 S344A KI MLECs 中仍为正值；(C、D) 静态条件下，EC 激活相关过程(包括细胞黏附、血管生成、上皮细胞增殖的正向调控及细胞外基质组装)的 Z 评分在 SENP2 S344A KI MLECs 中为正值；(E) 与转染 Ad-SENP2 WT 的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)相比，转染 Ad-SENP2 S344A 的 HUVECs 中 DNA 合成增加，这一结果来自 3 次独立实验；(F，左图) 间充质标志物(TWIST1、 SMA)的表达在 SENP2 S344A KI MLECs 中增加；(F，右图) 图中为 3 次独立实验的量化数据(* ，检验)；(G、H) 间充质标志物(G)和内皮标志物(H)的表达在 SENP2 S344A KI MLECs 中均增加

通过 SENP2 S344 磷酸化及 ERK5 激活，层流上调 DDIAS 的表达，而 DDIAS 可抑制 EC 凋亡

维恩图分析显示，野生型小鼠肺内皮细胞(WT MLECs)在层流处理后存在 117 个差异表达基因(DEGs)。在这些差异表达基因中，有 14 个受 SENP2 S344 磷酸化调控(图 7A)。值得注意的是，Ddias、II6st、Kif18b、Pdgfrl、Podn、Ptpn18、Stc10a6、Slc7ab 和 Tgfb3 被确定为受层流诱导的 SENP2 S344 磷酸化调控的 9 个核心基因(图 7A、B)。如图 6C、D 所示，这 9 个核心基因可能在多种与 EC 激活相关的过程中发挥关键作用。有趣的是，我们观察到纤维化变化的调控因子转化生长因子 β3(Tgfb3)的表达受层流抑制，且该抑制作用在 SENP2 S344A 基因敲入小鼠肺内皮细胞(KI MLECs)中消失(图 7B)。这些结果表明，Tgfb3 参与了 SENP2 S344 磷酸化介导的抗纤维化作用。此外，对这 9 个核心基因的热图分析显示，Ddias 是上调最为显著的基因之一(图 7B)。由于 Ddias 的表达受 ERK5 激活调控，且已有研究表明其可抑制细胞死亡(61、62)，我们探究层流诱导的 ERK5 激活是否调控 DDIAS 的表达。在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中，我们发现用 ERK5 特异性抑制剂 XMD8-92 处理后，层流诱导的 DDIAS 表达上调被消除(图 7C)。此前，我们已证实 ERK5 的转录活性参与电离辐射(IR)诱导的 EC 凋亡(63)。为评估 DDIAS 表达在 EC 凋亡中的作用，我们将表达 DDIAS 的人脐静脉内皮细胞暴露于 2 Gy 的电离辐射下，观察到电离辐射诱导的切割型半胱天冬酶 3 表达增加被减弱(图 7D)。这些结果共同表明，DDIAS 在层流介导的抗凋亡作用中发挥关键作用。

讨论

CHK1可在S344位点磷酸化SENP2(19)，该位点是通过基于质谱的磷酸蛋白质组学发现的新残基，但其功能尚未明确(38, 39)。本研究中，我们提供证据描述了该功能作用以及层流(L-flow)后内皮细胞(EC)中SENP2 S344磷酸化的调控机制。层流可增强CHK1 S280和SENP2 S344的磷酸化，进而提升SENP2的去SUMO化活性。ERK5和p53的SUMO化受到抑制，且EC炎症与凋亡也被阻断，这一结果支持了上述结论。与野生型(WT)小鼠相比，经高胆固醇(HC)诱导动脉粥样硬化的雌性和雄性小鼠中，磷酸化位点突变SENP2 S344A敲入(KI)小鼠的黏附分子表达和凋亡增加，且脂质沉积病变更为严重，不过雄性小鼠中HC诱导的动脉粥样硬化程度较轻。然而，当这些小鼠接受骨髓移植(BMT)后，雌性野生型 SENP2 S344A KI小鼠的脂质沉积病变与雌性野生型 WT小鼠几乎无差异。我们发现，辐射可通过下调CHK1的表达改变SENP2 S344磷酸化的抗动脉粥样硬化作用。因此，在骨髓移植后动脉粥样硬化模型中解读CHK1-SENP2 S344磷酸化的抗动脉粥样硬化作用颇具挑战性。重要的是，我们发现CHK1-SENP2 S344磷酸化轴可协同抑制与EC激活同时发生的多种纤维化相关过程，例如炎症、迁移、增殖和凋亡。SENP2 S344磷酸化缺陷会引发多种纤维化相关过程，同时EC特异性基因的表达上调，这表明层流诱导的CHK1-SENP2 S344磷酸化通过不同于内皮间质转化(endoMT)的机制促进纤维化变化。最后，我们发现层流可通过激活ERK5上调DDIAS的表达，随后通过磷酸化SENP2 S344抑制EC凋亡。综上，我们的数据表明，CHK1-SENP2 S344磷酸化轴在协同调控EC激活和纤维化变化的多种过程中发挥关键作用。该过程由DNA损伤应答(DDR，CHK1)激活启动，并通过诱导SENP2去SUMO化活性抑制EC激活和纤维化变化。我们的研究结果表明，CHK1-SENP2 S344磷酸化轴可能在多种病理生理应激后抑制EC过度激活和纤维化变化，以维持EC屏障功能，尤其是在层流条件下。

本研究中，我们发现层流(L-flow)可诱导CHK1-SENP2 S344磷酸化轴，该轴可抑制内皮细胞(EC)炎症(包括黏附分子表达)、迁移、增殖、凋亡及纤维化改变。这些组分在内皮细胞对病理生理应激的反应中至关重要。众所周知，层流可抑制这些过程，而湍流(D-flow)则会激活这些过程(20)。我们的研究结果表明，层流诱导的CHK1-SENP2 S344磷酸化可增强SENP2的去SUMO化活性，进而抑制ERK5和p53的SUMO化。相比之下，我们之前的研究显示，湍流诱导的p90RSK-SENP2 T368磷酸化会抑制细胞核内SENP2的功能，导致ERK5和p53的SUMO化增加(9)。综上，这些发现凸显了SENP2去SUMO化活性在协同调节内皮细胞对病理生理应激反应相关的多种过程(包括炎症、迁移、增殖、凋亡及纤维化改变)中的关键作用。这些过程在两种不同的血流模式下发生，分别利用SENP2的两个不同磷酸化位点:p90RSK介导的T368位点和CHK1介导的S344位点。这些磷酸化位点在决定SENP2去SUMO化功能及后续内皮细胞促激活与抗激活的平衡中发挥重要作用(图7E)。此外，我们之前已报道电离辐射(IR)可增强p90RSK的激活，而激活的p90RSK可使SENP2 T368磷酸化(63,64)。因此，电离辐射可通过下调CHK1表达和激活p90RSK的双重作用，诱导内皮细胞对病理生理应激产生强烈反应，尤其是在体内血流条件下(图7E)。不过，仍需进一步研究以阐明这些可能性。

图7

层流(L-flow)通过 SENP2 S344 磷酸化及 ERK5 激活上调 DDIAS 表达，以抑制内皮细胞(EC)凋亡:(A) 维恩图展示各组间显著差异表达基因(DEGs)。(B) 热图呈现包括 DDIAS 在内的 9 个核心基因。(C，左图) 采用 ERK5 特异性抑制剂 XMD8-92(5 μM)处理，24 小时后可抑制 HUVEC 中 L-flow 介导的 DDIAS 表达上调。(C，右图) 图表展示 3 次独立实验的量化数据(**p<0.1，双因素方差分析(two-way ANOVA))。(D，左图) 用 DDIAS 质粒或对照质粒在 HUVEC 中过表达 DDIAS，随后暴露于 R 24 小时。电离辐射(IR)诱导的切割型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)表达上调可被 DDIAS 过表达逆转。(D，右图) 图表展示 3 次独立实验的量化数据(*p<0.05，双因素方差分析)。“pCont”指对照质粒，“pDDIAS”指 DDIAS 质粒。(E) 示意图展示 L-flow 诱导 SENP2 S344 磷酸化以抑制 EC 病理生理应激反应的机制。

EC 暴露于多种刺激，包括血流、炎症及代谢物，这些因素可影响其表型与功能。EC 的可塑性与异质性使其能够适应这些变化(65)，但某些刺激可引发疾病。例如，伴随转化生长因子β(TGFβ)表达升高的炎症可触发内皮间质转化(endoMT)的重新激活(65、66)，进而导致纤维化疾病与心脏纤维化(29、67-72)。此外，湍流(D-flow)可激活 endoMT，促进动脉粥样硬化的发展(31、73-75)。我们的 RNA 测序(RNA-seq)分析显示，SENP2 S344 磷酸化在特发性肺纤维化信号通路及肝纤维化/肝星状细胞激活通路中发挥负调控作用，提示其参与纤维化变化的调控。然而，与 endoMT 不同，我们观察到，在层流处理后，与野生型(WT)小鼠肺内皮细胞(MLECs)相比，SENP2 S344A 基因敲入(KI)型 MLECs 中间质细胞标志物与 EC 特异性标志物均上调。这种模式在青光眼患者施莱姆管的 EC 中也有报道(76)。我们认为，在无明显 endoMT 表型的情况下，SENP2 S344 KI MLECs 中观察到的纤维化变化代表了 EC 对病理生理应激的一种独特反应类型。

DNA 损伤应答(DDR)在血流调控 EC 功能中的作用尚未明确。ATR 通过磷酸化 CHK1 S345 激活 DNA 损伤检查点，响应单链 DNA 断裂，且该过程可由机械敏感性离子通道 Piezo 和一氧化氮(NO)信号在不依赖 DNA 损伤的情况下激活(77)。在本研究中，我们发现层流与湍流均未增加 CHK1 S345 磷酸化，但层流确实增加了 CHK1 S280 磷酸化，该磷酸化可促进 CHK1 从细胞质向细胞核转运，并在血清刺激下激活下游 CHK1 信号(55)。这些发现提示 ATR 激活可能不参与 CHK1 的功能。由于层流诱导 SENP2 S344 磷酸化且不影响 CHK1 S345 磷酸化，层流诱导的 CHK1 核转运可能在促进核内 SENP2 S344 磷酸化中发挥关键作用。层流诱导 CHK1 S280 磷酸化的潜在机制仍未知，需进一步研究。

我们意外发现，辐射可下调内皮细胞(EC)中 CHK1 的表达。据我们所知，这是首个证实辐射暴露后 CHK1 蛋白表达降低的研究。已知 p53 和 RB1/E2F1 可上调 CHK1 启动子活性(78)，且已有研究报道 CHK1 的泛素化(79)，但辐射抑制 EC 中 CHK1 表达的具体机制仍不清楚。鉴于我们已明确 CHK1 介导的 SENP2 S344 磷酸化在 EC 纤维化改变中的作用，而非内皮间质转化(endoMT)，辐射可能诱导 EC 纤维化改变而不触发 endoMT，从而促进易损斑块的形成。尽管已有研究报道辐射诱导的 endoMT 与癌症放疗耐药相关(80)，但 EC 纤维化改变在放疗耐药中的作用尚未被探讨。因此，至关重要的是研究 CHK1-SENP2 S344 磷酸化轴，以明确辐射诱导的心血管事件及对肿瘤发生的耐药性。我们的研究结果揭示了 CHK1 生物学的一个新方面，及其在血流影响动脉粥样硬化形成方面的潜在意义。该研究成果为当前 CHK1 抑制剂在临床前及临床中的应用提供了依据。

尽管流行病学和实验研究已证实高剂量电离辐射(IR)对心血管具有有害影响，但低剂量电离辐射的影响仍不明确 (81, 82)。Schöllnberger 等人 (83, 84) 的研究并未明确确定暴露于低于剂量的个体存在心脏病风险，而 Azizova 等人 (85) 则指出，累积外照射剂量高于时，缺血性心脏病的发生风险会升高。然而，目前缺乏关于低至中等剂量辐射暴露对心血管疾病影响的流行病学数据，尤其是低于的情况 (86-93)。多项实验研究聚焦于使用动脉粥样硬化小鼠模型研究低剂量辐射的影响，具体为喂食普通饲料的基因修饰 ApoE 基因敲除(KO)小鼠。这些研究强调了考虑辐射暴露剂量率的重要性 (94)。Mitchel 等人 (95, 96) 证实，暴露于低剂量电离辐射，尤其是低剂量率时，可减缓小鼠的斑块进展。相反，Mancuso 等人 (97) 指出，中等剂量的急性照射可能对动脉粥样硬化产生有害影响，而长期暴露于相同剂量的影响则较小。此外，Le Gallic 等人 (98) 和 Ebrahimian 等人 (99) 均发现，长期内源性低剂量电离辐射可增强 ApoE 基因敲除小鼠的斑块稳定性。这些研究 (98, 99) 还显示，低剂量电离辐射暴露后炎症指标会降低，例如斑块内 CD68+ 泡沫细胞含量减少，且主动脉 mRNA 表达向抗炎细胞因子而非促炎细胞因子的方向转变 (98, 99)。这些发现支持以下观点:电离辐射会影响免疫系统，高剂量会促进炎症 (100) 和促炎巨噬细胞 (101)，而较低剂量则会减轻炎症 (102)。Rey 等人的一项研究探讨了不同剂量低剂量电离辐射的免疫调节反应。该研究使用 ApoE 基因敲除小鼠，检测了 50 至的累积剂量，其中射线的剂量率设定为极低或低水平。结果显示，在所有累积剂量下，暴露于低剂量率辐射时，促炎 Ly6CHi 单核细胞显著减少。然而，在极低剂量率下，仅在 50、100 和剂量时观察到 Ly6CHi 细胞减少。相反，Ly6CLo 单核细胞的比例不受低剂量电离辐射的影响。此外，脾脏中 CD4+ T 细胞亚群的比例在受辐射小鼠与未受辐射对照组之间无差异，无论评估的是 CD25+FoxP3+ 调节性淋巴细胞还是 CD69+ 活化淋巴细胞。在主动脉中，细胞因子(如 IL-1 和 TGF- )以及黏附分子(包括 E-选择素、ICAM-1 和 VCAM-1)的基因表达在的中等剂量下有所降低。这些发现表明，低剂量电离辐射可能会减少通过选择性减少血液中的促炎单核细胞，并抑制血管壁中黏附分子的表达及炎症过程，从而作用于动脉粥样硬化斑块。相比之下，低剂量电离辐射(IR)对脾T淋巴细胞无显著影响。值得注意的是，部分辐射反应呈现非线性特征:主动脉基因表达的降低在中等剂量时具有统计学意义，但在最高或最低剂量时则无统计学意义。本研究有助于阐明不同剂量率的低剂量IR如何影响动脉粥样硬化背景下的免疫系统反应(103)。此外，在ApoE基因敲除(KO)背景的平滑肌细胞谱系示踪小鼠(Myh11-ERT2Cre ROSA-STOP-eYFP)中，对进行全身照射后实施骨髓重建，可导致18周西方饮食诱导的病变中平滑肌细胞浸润减少。该效应可见于头臂动脉、颈动脉及主动脉弓，但在主动脉根部或腹主动脉中未观察到(104)。Ikeda等人报道称，IR可通过抑制内膜中低密度脂蛋白(LDL)的积累，对主动脉弓动脉粥样硬化的起始产生抑制作用。然而，随着时间推移，病变的进展受内膜中中性脂质与髓样细胞延迟积累，以及小型泡沫细胞簇融合为较大病变能力降低的影响。值得注意的是，以病变轮廓面积衡量的病变侧向扩展似乎受影响极小。这提示病变的侧向扩展可能主要依赖于层流(d-flow)或其他不受辐射影响的因素。此外，其他机制可能对骨髓移植(BMT)后观察到的表型有贡献，尤其在病变高度显著降低的后期阶段。单细胞转录组分析显示，IR可将内皮细胞(EC)对LDL的摄取转向溶酶体降解及胆固醇逆向转运途径。这种转向可减少内膜脂质积累，并在不影响细胞旁渗漏的情况下影响病变的起始与进展(105)。这些发现表明，辐射与动脉粥样硬化之间的关系十分复杂，可能取决于多种因素，包括辐射暴露的剂量与时长、受影响的特定组织或器官，以及个体易感性。尽管部分研究提示辐射暴露可能促进动脉粥样硬化的发生或进展，但其他研究结果尚无定论，甚至表明可能具有潜在保护作用。必须承认，辐射被用于放射治疗等医疗手段，其兼具治疗益处与潜在副作用。辐射对动脉粥样硬化的影响可能因应用场景而异，例如治疗性辐射与意外暴露的区别。因此，需要进一步研究以全面阐明辐射与动脉粥样硬化之间的关联。然而，Ikeda等人的研究结果提供了引人关注的见解。根据他们的研究，我们的BMT模型中观察到的病变似乎依赖于血流动力学而非

辐射(105)。这些发现与我们的研究目标完全一致

我们观察到，辐射暴露后内皮细胞(EC)中CHK1蛋白表达下调；然而，具体机制仍不明确，需进一步研究。我们的发现提示，辐射诱导的EC纤维化改变与易损斑块形成之间可能存在关联，但仍需全面研究辐射、内皮-间质转化(endoMT)与动脉粥样硬化之间的关系。此外，必须承认，体外实验与动物模型可能无法完全反映人体生理与疾病的复杂性。因此，需要开展更多利用人类样本的研究及临床研究，以验证这些发现并确定其与人类心血管健康的相关性。此外，应当注意，本研究未聚焦于辐射诱导的心血管事件或肿瘤发生抗性的临床意义或长期结局，因为这些内容超出了本研究的范围。因此，未来研究应致力于解决这些方面的问题，以更全面地阐明CHK1-SENP2 S344磷酸化轴与辐射暴露对人类健康的潜在影响。

数据可用性声明

本研究中使用的数据集可在在线数据库中获取。数据库名称及登录号如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/，GSE222511。

伦理声明

本动物研究已获德克萨斯农工大学生物科学与技术研究所审查并批准。

作者贡献

MN、MI、SI、KC 开展实验、解读数据并撰写手稿。PB、LV、KK、RA、EM 开展实验并分析数据。VS、YG、L-LL、ET 维持小鼠种群。AD、JH、NP、RD、KF、MB、EO、SK、JC、GW 和 JA 参与解读数据。GW、JA 和 N-TL 规划并制定研究设计、获取资金、解读数据并撰写手稿。所有作者均为本文作出贡献并核准提交版本。