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氧化应激诱导PIAS1/PIAS4介导的TDP-43 SUMO化

发布时间：

2026-10-01 20:45

氧化应激诱导PIAS1/PIAS4介导的TDP-43 SUMO化

Devon F. Pendlebury 、Khloe Truong 、Marie Heath 、Jack C. Reidling 、Partha Sarkar 、Leslie M. Thompson

美国欧文，加州大学欧文分校神经生物学与行为学系

美国欧文，加州大学欧文分校Sue和Bill Gross干细胞中心

美国加州大学欧文分校记忆障碍与神经疾病研究所

美国得克萨斯州加尔维斯顿，得克萨斯大学医学分部神经生物学系。美国欧文，加州大学欧文分校精神病学与人类行为学系 *通讯作者邮箱:Imthomps@hs.uci.edu

摘要/总结

TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)是一种保守的RNA和DNA结合蛋白，具有转录抑制、pre-mRNA剪接及mRNA稳定功能。在多种神经退行性疾病的病理状态下，TDP-43会出现异常的核定位错误，发生胞质积累与聚集。TDP-43似乎还在DNA损伤修复中发挥作用，尤其在非同源末端连接(NHEJ)过程中，这提示TDP-43的核缺失可能与TDP-43蛋白病中观察到的DNA损伤积累有关。这些TDP-43病理包涵体带有翻译后修饰，其中最显著的是磷酸化修饰。SUMO化(Small Ubiquitin-like Modifier，即类泛素修饰蛋白)是一种动态的翻译后修饰，可调控多种蛋白特性，且与神经退行性疾病的病理过程相关。DNA损伤修复蛋白通常通过SUMO化进行调控，而SUMO E3连接酶PIAS1和PIAS4是双链DNA断裂高效修复所必需的。基于这些发现，我们研究了TDP-43的SUMO化，以及SUMO修饰是否会影响TDP-43的DNA损伤修复功能。研究结果显示，TDP-43可被SUMO1和SUMO2/3修饰，并证实其SUMO化可响应氧化应激。我们还确定了TDP-43中发生SUMO化的区域，结果表明该修饰由SUMO E3连接酶PIAS1和PIAS4介导。依托泊苷诱导的DNA损伤并不会促进TDP-43的SUMO化；目前正在开展研究以明确TDP-43 SUMO化对DNA修复的影响。

引言

TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)是一种保守的RNA和DNA结合蛋白，参与RNA代谢调控，包括作为转录抑制因子、剪接调控及mRNA稳定过程(1-3)。TDP-43通常定位于细胞核，但在病理状态下会从细胞核中缺失，并在细胞质中积累和聚集。这些聚集体富含翻译后修饰，尤其是磷酸化和泛素化修饰。TDP-43病理包涵体见于多种神经疾病，包括肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病(HD)以及边缘系统为主的年龄相关性脑病(LATE)(4-7)。

SUMO化(小泛素样修饰)是一种动态的翻译后修饰，是与神经退行性疾病病理相关的蛋白质的共同特征。SUMO化可调控多种神经元特性，包括突触传递、离子通道调节及神经元发育(8)。人类有5种SUMO亚型(9-11)，其中应激诱导型SUMO2和SUMO3仅相差3个氨基酸，合称为SUMO2/3。SUMO通过类似泛素化的酶促级联反应结合到靶蛋白的赖氨酸残基上(12)。SUMO蛋白最初翻译为无活性前体，经sentrin/SUMO特异性蛋白酶(SENP)家族切割激活，暴露C端双甘氨酸基序。成熟的SUMO以ATP依赖的方式被单一的SUMO E1激活酶(SAE1和SAE2的异二聚体)激活，随后转移至唯一的E2结合酶UBC9。SUMO与靶蛋白的结合由E3 SUMO连接酶促进。已鉴定出多种SUMO E3连接酶，包括活化STAT蛋白抑制剂(PIAS)家族和RANBP2(13,14)。E3连接酶还赋予靶蛋白特异性(12)。随后，SUMO可通过SENP的作用从蛋白质上移除。SUMO结合与去SUMO化的平衡影响靶蛋白的特性(12)。

已有研究报道TDP-43的SUMO化，研究表明TDP-43主要在亚砷酸钠诱导的应激下被SUMO2修饰(15,16)，且TDP-43的SUMO化具有以下特点:a)对调控应激颗粒动态至关重要；b)可能防止其聚集。已鉴定出可促进TDP-43 SUMO化的SUMO E3连接酶，但不同研究的报道并不一致(15-17)。

多项研究表明TDP-43在DNA损伤修复中发挥作用，包括非同源末端连接(NHEJ)介导的双链断裂修复及R环的解旋(18-21)，提示TDP-43在细胞核内的缺失可能导致TDP-43蛋白病中观察到的DNA损伤积累 (22-29)。DNA损伤修复蛋白也通常通过SUMO化进行调控。例如，复制蛋白A的SUMO化对于同源重组介导的修复至关重要(30)，XRCC4的SUMO化可促进其在DNA损伤后定位于细胞核(31)(19)。此外，SUMO E3连接酶PIAS1和PIAS4对于双链DNA断裂的高效DNA修复是必需的(32)。基于这些数据，我们研究了TDP-43是否因DNA损伤而发生SUMO化、哪些区域会被SUMO化，以及TDP-43的SUMO修饰是否会调控其DNA损伤修复功能。本研究表明，在基础状态和氧化应激下，TDP-43可被SUMO1和SUMO2/3修饰，但在依托泊苷诱导的DNA损伤(主要造成双链断裂)下则不会。我们鉴定出了可被SUMO修饰的位点，且该修饰由SUMO E3连接酶PIAS1和PIAS4促进。

方法与材料

永生化细胞培养

HeLa细胞在添加了10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中于条件下培养，汇合度达95%时传代。SH-SY5Y细胞在按1:1比例混合的最低必需培养基和Ham’s F12营养混合物中培养，添加了10% FBS。对于需要转染的实验，HeLa细胞使用Lipofectamine 2000(Invitrogen 11668027)进行转染，SH-SY5Y细胞使用Lipofectamine 3000(Invitrogen L3000008)进行转染。

iPSC 培养与神经元分化

带有 19CAG 重复序列的 KOLF2.1 iPSCs 按照 Smith-Geater 等人(33)所述方法进行分化与鉴定。

质粒

pCMV-Myc-TDP-43 质粒由德克萨斯大学医学分部(UTMB)的 Partha Sarkar 博士馈赠。TDP-43 结构域的 cDNA 构建体购自金斯瑞生物科技公司，并亚克隆至 pCDNA 3.1(+)N-Myc 载体中。His-SUMO1 和 His-SUMO2 质粒由英国邓迪大学的 Ron Hay 博士馈赠。人源 PIAS 构建体的描述见文献 (34)。

HeLa SUMOylation 检测

将 HeLa 细胞与带 Myc 标签的目标蛋白及以下任一物质转染: 空载体、his-SUMO1 或 his-SUMO2。48 小时后收集细胞，在变性条件(6M 盐酸胍、和 Tris-HCl，pH 值 7.8)下裂解。裂解物超声处理 3 次，每次 10 秒，取 2.5% 的裂解物留作上样样品，通过 TCA 沉淀纯化。为分离 his-SUMO 标签蛋白，裂解物与磁性钴珠悬液(Dynabeads His-Tag 分离及 Pulldown，赛默飞世尔科技，目录号 10104D)在室温下孵育 1 小时。磁珠用洗涤缓冲液 1(8M 尿素、100 mM NaH Tris-HCl，pH 值 8)洗涤两次，用洗涤缓冲液 2(8M 尿素、100 mM NaH₂PO₄、10 mM Tris-HCl，pH 值 6.3)洗涤一次，再用 PBS 洗涤一次。将磁珠重悬于 1X LDS 上样缓冲液中洗脱 SUMO 结合蛋白，煮沸 10 分钟后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合蛋白质印迹法进行分析。

内源性SUMO化分析

SH-SY5Y或iPSC衍生的纹状体神经元分别进行未处理、用亚砷酸钠处理，或用依托泊苷处理1小时。随后收集细胞蛋白并使用Cytoskeleton公司的Signal-Seeker SUMOylation 1或2/3检测试剂盒(BK165和BK162)进行处理。按照试剂盒说明书使用蛋白进行操作。

蛋白质印迹法

蛋白样品使用Invitrogen NuPAGE Bis-Tris蛋白凝胶(4-12%)，搭配NuPAGE MOPS运行缓冲液，通过SDS-PAGE进行分离。将蛋白转印至0.45 μm硝酸纤维素膜(Bio-Rad货号#1620115)。使用Odyssey LICOR DLx检测免疫标记蛋白的近红外荧光。蛋白定量采用Empiria Studio v2.0计算。所用一抗如下:

• Myc标签小鼠单克隆抗体克隆号9E10 默克密理博，货号05419，稀释比例1:1000，
• 6X-His标签多克隆抗体，Inv
• itrogen，货号PA1983B，稀释比例1:1000
• TDP-43 多克隆抗体，Proteintech，货号10782-2-AP，稀释比例1:1000
• 磷酸化组蛋白H2A.X(Ser139)(20E3)，Cell Signaling，货号9718S，稀释比1:1000
• 抗SUMO-2/3抗体，克隆号8A2，默克密理博，货号MABS2039，稀释比例1:1000
• SUMO1抗体小鼠单克隆抗体(克隆号5D8B16)，Cytoskeleton，货号ASM01-S，稀释比例1:1000

SH-SY5Y细胞的免疫荧光染色

将细胞用4%多聚甲醛在室温下固定10分钟，然后用PBS洗涤三次。将细胞用含0.1% Triton-X的PBS处理5分钟进行透化，随后用含5%山羊血清、1% BSA和0.1% Triton-X的PBS在室温下封闭1小时。将盖玻片置于用封闭缓冲液稀释的一抗中，于 (抗myc标签9E10，1:1000，MilliporeSigma)下孵育过夜。去除一抗后，用PBS洗涤细胞三次，然后用封闭缓冲液以1:1000稀释的二抗在室温下孵育1小时(Alexa Fluor 555)。用PBS洗涤细胞三次，然后置于含DAPI的PBS中孵育10分钟。将盖玻片用Fluoromount-G封片，使其干燥。在Keyence BZ-X810宽场显微镜下采集40倍图像。每个盖玻片采集5张随机图像。

结果

TDP-43可被SUMO1和SUMO2进行SUMO修饰。

预测TDP-43具有多个SUMO共有位点(图1A)(SUMOplot 分析程序和DeepSUMO(35))，且此前已有研究表明其可发生SUMO化修饰(15, 16, 36, 37)。为了首先确认TDP-43可在翻译后被SUMO修饰，我们利用变性SUMO化检测法，选用HeLa细胞是因为其SUMO化活性水平高(34, 38)。将myc-TDP-43与his-SUMO1或2的构建体转染至HeLa细胞，48小时后，在变性条件下用his亲和珠分离his-SUMO结合蛋白，以仅保留共价SUMO修饰。通过his亲和珠分离SUMO1和SUMO2/3时，均观察到TDP-43的分子量增加(图1 B、C)。因此，在基础条件下，无论添加外源性SUMO1还是SUMO2/3，TDP-43都会发生SUMO化修饰。

为了更好地理解SUMO化修饰如何影响TDP-43的特性和功能，我们研究了TDP-43的哪些特定区域会发生SUMO化修饰。我们用三种myc-TDP-43构建体重复了变性SUMO化检测(图1A):包含N端结构域和核定位信号(NLS)的TDP-43NTD(氨基酸1-106)、包含RNA识别基序(RRMs)的TDP-43RRMs(氨基酸107-262)，以及带有非结构化富甘氨酸结构域的TDP-43 (氨基酸263-末端)C端结构域(CTD)，该结构域在疾病中会驱动聚集，且包含大多数致病突变(39)。通过his亲和珠分离SUMO1和SUMO2时，三种构建体均显示出分子量偏移(图1 D、E、F)，表明SUMO化修饰发生在该蛋白的所有区域。这些数据表明，SUMO化修饰可能会调节TDP-43的多种特性。考虑到NLS中赖氨酸的集中分布，TDP-43NTD中的SUMO化修饰可能会影响其入核过程。RRM结构域包含多个对RNA结合和整体结构至关重要的赖氨酸(40)，该结构域的修饰可能会影响转录和剪接调控。最后，TDP-43CTD的SUMO化修饰可能会调节TDP-43的聚集倾向。

PIAS1 和 PIAS4 可特异性促进 TDP-43 的 SUMO 化。

接下来，我们试图鉴定负责 TDP-43 SUMO 化的 SUMO E3 连接酶，首先从 PIAS 家族的 E3 连接酶入手，因为它们通常负责 DNA 损伤修复相关蛋白的 SUMO 化(32、41、42)，且一项全局蛋白质组学研究显示 PIAS4 可能使 TDP-43 发生 SUMO 化(17)。我们在 HeLa 细胞中开展了相同的变性 SUMO 化实验，使用限量转染的 his-SUMO2/3 以降低 TDP-43 SUMO 化的基础水平，同时分别转染 PIAS1、PIASxα、PIASxβ、PIAS3 或 PIAS4。PIAS1 和 PIAS4 的过表达均导致 TDP-43 的 SUMO2/3 修饰增加(图 2)，表明 TDP-43 是这两种蛋白的特异性底物，这与近期研究结果一致(15、16)。所有 PIAS 蛋白均未促进 TDP-43 与 SUMO1 的修饰(未展示)。已知 PIAS1 和 PIAS4 是 DNA 损伤应答的关键组分(32、42)，在转录调控(43、44)和应激应答(45、46)中均发挥作用，支持其在 TDP-43 动态变化中具有功能作用。

TDP-43 会因氧化应激发生 SUMO 化，但不会因 DNA 损伤发生 SUMO 化。

为确定 TDP-43 是否会在不过表达 SUMO 或 SUMO E3 连接酶的情况下发生内源性 SUMO 化，我们在 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞中使用了 Cytoskeleton 公司的 Signal-Seeker™ SUMO 化检测试剂盒。在基础条件下，两种细胞系中均未检测到 TDP-43 发生 SUMO1 或 SUMO 2/3 的 SUMO 化(图 3A 和 B)。由于 SUMO 2/3 的 SUMO 化常发生于细胞应激缓解过程中(47)，我们用亚砷酸钠处理两种细胞系以诱导氧化应激(48)。亚砷酸钠刺激后可观察到 SUMO 化(图 3A 和 B)，这与近期报道一致，即 TDP-43 的 SUMO 化对于应激颗粒中 TDP-43 的移动性是必需的(15, 16)。考虑到 TDP-43 在 DNA 损伤修复中的作用，我们研究了依托泊苷诱导 DNA 损伤后 TDP-43 是否会发生 SUMO 化。依托泊苷主要诱导 DNA 双链断裂(49)，据报道 TDP-43 参与这类 DNA 损伤的修复(18-20)。经依托泊苷处理(50)后，可通过 γH2AX(磷酸化 H2AX，一种可作为 DNA 双链断裂敏感标志物的组蛋白)的表达确认，两种细胞均未出现 TDP-43 的 SUMO 化(图 3A 和 B)，提示 TDP-43 不会因这类 DNA 损伤发生 SUMO 化。其他类型的 DNA 损伤(如紫外线辐射、单链 DNA 损伤化学试剂及活性氧)是否会诱导 TDP-43 发生 SUMO 化，尚需进一步实验验证。

由于 TDP-43 病理改变是多种影响神经元亚型的神经退行性疾病的共同特征，我们确认 TDP-43 在神经元中也会发生 SUMO 化。我们使用 KOLF2.1J 细胞系的诱导多能干细胞(iPSC)衍生纹状体神经元，分化方法如前所述(33)。结果与 SH-SY5Y 细胞一致，仅在亚砷酸钠处理后检测到 TDP-43 的 SUMO 化(图 3C)。仅测试了 SUMO2/3 修饰，因为 TDP-43-SUMO2/3 结合在 SH-SY5Y 细胞中水平更高。

TDP-43 SUMO位点的突变会降低SUMO化，但不影响其亚细胞定位。

K136是TDP-43中置信度最高的共有SUMO化位点，其突变体已在之前的研究中得到评估(36、37)，不过尚未直接验证 K136R突变是否会降低SUMO化。此外，K408是TDP- 构建体中唯一位于预测SUMO化位点内的赖氨酸。因此，我们构建了TDP-43K136/408R突变体(图4A)，发现其SUMO2的SUMO化水平降低(图4B)。为确定SUMO化水平降低的构建体中TDP-43的定位是否发生改变，我们将myc标记的TDP-43野生型、TDP-43K136R、TDP-43K408R和TDP-43K136/408R转染至HeLa细胞中，因为该细胞易于转染，随后采用免疫荧光法确定各构建体的定位。所有构建体均主要定位于细胞核，与野生型TDP-43类似。K136R突变使染色从弥散的核信号变为核内的点状聚集(图4C)。这与之前一项研究K136乙酰化的结果一致，该研究发现该残基的突变会形成核点状聚集/液滴(51)。K136可与核酸相互作用(40)，该残基的突变可能会破坏这种结合，导致未结合的TDP-43发生聚集或相分离。在其他旨在破坏TDP-43核酸结合的TDP-43突变体中也观察到了这一现象(52-54)。这些数据表明，K136处的SUMO化可能会阻断其与RNA的结合，并调节TDP-43调控基因表达和剪接的能力。

为确定SUMO化是否会改变TDP-43的亚细胞定位，我们在HeLa细胞中过表达PIAS1或PIAS4，并通过免疫荧光监测TDP-43的定位。在所有条件下，TDP-43均保留在细胞核中，提示过量的SUMO化不会驱动TDP-43从细胞核转移至细胞质(数据未显示)。

讨论

在肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、亨廷顿舞蹈症(HD)和阿尔茨海默病(AD)等多种神经退行性疾病中，TDP-43会从细胞核中缺失并在细胞质包涵体中积累(4-7)。这些包涵体存在翻译后修饰，尤其是磷酸化和泛素化修饰，但也存在其他研究较少的TDP-43修饰，包括SUMO化、乙酰化和瓜氨酸化(15, 16, 36, 37, 51, 55-57)。本研究表明，TDP-43可被外源性SUMO1和SUMO2/3进行SUMO修饰。我们还发现，在永生化癌细胞系和诱导多能干细胞(iPSC)衍生的神经元中，氧化应激会通过SUMO E3连接酶PIAS1和PIAS4增强TDP-43的SUMO化，而依托泊苷诱导的双链DNA损伤则无此作用。鉴于神经退行性疾病及衰老神经元中细胞应激会增加，这些群体中TDP-43的SUMO化很可能也会增加。TDP-43的SUMO化可能是防止其在细胞质中聚集的一种反应。未来需要研究患者组织中的TDP-43聚集体是否发生SUMO化，还需更深入探究疾病中TDP-43的SUMO化是具有保护作用还是致病作用，以及这种翻译后修饰(PTM)可能调控的TDP-43功能。近期研究结果显示，运动神经元中细胞质PIAS4水平降低与TDP-43包涵体存在相关性(15)，提示SUMO化在预防聚集方面具有益处。致病蛋白的SUMO化是神经疾病的共同特征(58)。在亨廷顿舞蹈症中，野生型和突变型亨廷顿蛋白(HTT)均可被SUMO化，且该过程会被PIAS1增强，导致细胞培养中不溶性突变型HTT积累(34)。在人HD死后纹状体中，除HTT外，还观察到不溶性SUMO结合蛋白增加(34, 59, 60)。敲低PIAS1可改善HD小鼠的多种表型，包括行为和运动表型、减少HTT包涵体、增加基因组完整性、纠正转录失调以及挽救神经元活性(42, 59, 60)。此外，帕金森病中聚集的α-突触核蛋白也可被SUMO修饰，但关于这是促进还是抑制聚集体形成的报道不一(61-63)。阿尔茨海默病中积累的Tau蛋白同样可被SUMO化，且该修饰会增加其聚集性(64, 65)。其他参与ALS发病机制的蛋白，包括超氧化物歧化酶1(SOD1)和肉瘤融合/易位在脂肪肉瘤蛋白(FUS/TLS)，也有报道称可被SUMO化(66-69)。SUMO化对FUS病理的作用尚未明确，但SOD1的SUMO化会促进其聚集。综上，这些数据支持SUMO化在神经退行性疾病中发挥关键作用。鉴于TDP-43蛋白病的数量众多，进一步研究TDP-43的SUMO化至关重要。总体而言，这些数据表明，调控SUMO通路是多种神经退行性疾病的潜在治疗途径。

本研究结果与之前一项研究一致，该研究报道PIAS4可介导氧化应激响应下的TDP-43 SUMO化，且该特性对应激颗粒中TDP-43的流动性和可溶性至关重要(15)。同样，另一项研究表明，K408突变会损害神经元的细胞应激反应(16)，进一步凸显了TDP-43 SUMO化在氧化应激响应和应激颗粒形成中的重要性。

依托泊苷诱导DNA损伤，通过γH2AX进行监测，我们未观察到TDP-43的SUMO化状态发生任何变化，这表明TDP-43的SUMO化并非由DNA损伤诱导，尽管它可能仍在DNA修复中发挥作用。考虑到TDP-43的核定位，可能无需修饰即可将其招募至DNA损伤位点，或者可能通过其预测的SUMO相互作用基序(DeepSUMO(35))与其他SUMO化的DNA修复蛋白相互作用而被招募。确定胞质错位是否会改变对SUMO修饰的反应，进而影响DNA损伤反应，这将是很有意义的。还有一种可能是，TDP-43可能在依托泊苷诱导的DNA损伤修复中不发挥作用，需要测试其他DNA损伤诱导方法。此外，即使在我们的实验中，TDP-43并未因DNA损伤而发生直接的SUMO化，也可能只是细胞中仅有一小部分TDP-43参与DNA损伤修复，其余部分仍参与RNA调控。由于DNA损伤修复复合物通常通过SUMO与SUMO相互作用基序之间的相互作用结合，因此

值得关注这些突变体是否会影响TDP-43与其他DNA修复蛋白的相互作用。

我们的数据表明，无论是通过减少SUMO化的突变体，还是过表达PIAS1和PIAS4以促进SUMO化，调节SUMO化都不会改变永生化细胞中TDP-43的亚细胞定位。还需要进一步研究以确定当TDP-43已处于细胞质中(例如在ALS中)时，SUMO化是否会影响其聚集和活性，以及在神经元中评估时是否存在不同的效应。尽管我们的TDP-43K136/408R构建体显示SUMO化减少，但在解释这些结果时必须谨慎，因为赖氨酸经常可被多种翻译后修饰所修饰。TDP-43中的K136也可被乙酰化(51)，且泛素常可与SUMO竞争相同的残基。我们的K136R突变体显示核定位的分散性降低，并形成核灶，这与之前研究该残基(51)及其他破坏核酸结合的突变(52-54)的文献一致。我们的实验依赖于使用质粒进行的蛋白质过表达，这可能不代表内源性表型。

总之，我们表明，与之前的研究一致，TDP-43的SUMO化可被E3连接酶PIAS1和PIAS4响应氧化应激而增强，但响应DNA损伤时则不然。K136/408R突变减少了SUMO化，但对TDP-43的亚细胞定位没有影响。E3连接酶的过表达也不会改变其亚细胞定位，不过我们目前尚不清楚SUMO化如何影响细胞质中TDP-43的定位。还需要进一步研究以确定体内TDP-43蛋白病中TDP-43的SUMO化是否发生改变，以及调节SUMO化是否具有治疗益处。

致谢

我们谨向Thompson实验室致以谢意，感谢他们提供的重要反馈。本研究获得以下基金资助:美国国立卫生研究院(NIH)基金R35NS116872(L.M.T.)、F32NS136263(D.F.P.)，以及亨廷顿病基金会奖学金(D.F.P.)。

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