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动态ParB-DNA相互作用启动并维持细菌染色体分离的分区凝聚物

发布时间：

2026-05-19 21:12

动态ParB-DNA相互作用启动并维持细菌染色体分离的分区凝聚物

米洛什·蒂什马，理查德·贾尼森，哈马姆·安塔尔，亚历杭德罗·马丁-冈萨雷斯，罗曼·巴特，特万·贝克曼，雅科·范德托雷，达维德·米切莱托，斯蒂芬·格鲁伯 2和塞斯·德克尔

荷兰代尔夫特理工大学卡夫利纳米科学研究所生物纳米科学系，代尔夫特；瑞士洛桑大学医学院生物学与医学系基础微生物学教研室，洛桑；英国爱丁堡大学物理与天文学院，爱丁堡

英国爱丁堡大学遗传学与癌症研究所医学研究理事会人类遗传学组，爱丁堡

*通信作者。电话:+31 15 2786094；电子邮箱:C.Dekker@tudelft.nl

摘要

在大多数细菌中，染色体分离由ParABS系统驱动，其中CTP酶蛋白ParB在parS位点加载，以触发大型分区复合物形成。在此，我们使用单分子荧光显微镜和原子力显微镜成像对枯草芽孢杆菌ParB的分区复合物进行体外研究，结果表明瞬时ParB-ParB桥对于形成DNA凝聚物至关重要。分子动力学模拟证实，在ParB的临界浓度下会突然发生凝聚，并表明多聚化是形成分区复合物的先决条件。对突变型ParB蛋白进行磁镊力谱分析表明，N端结构域的CTP水解对于DNA凝聚至关重要。最后，我们表明转录RNA聚合酶可以稳定地穿过ParB-DNA分区复合物。这些发现揭示了ParB如何形成一个稳定而动态的用于染色体分离的分区复合物，该复合物诱导DNA凝聚和分离，同时允许复制和转录。

图形摘要

引言

在每个细胞周期中精确的染色体分离对于所有生命形式的稳定繁殖都很重要。在大多数细菌中，ParABS系统是确保染色体如此忠实分离的主要组件(1)。该系统由一种ATP水解酶分区蛋白A(ParA)、一种CTP水解酶分区蛋白B(ParB)和一个16碱基对的着丝粒序列parS组成，parS通常位于基因组上的复制起点附近(2-5)。ParB蛋白可以在parS序列上加载，随后组装成一个更高阶的核蛋白复合物，即“分区复合物”(6-9)。复制后，两个分区复合物沿着圆柱形细胞轴与ParA梯度相互作用，以分离细菌染色体的新生起点(10,11)。细菌SMC蛋白被招募到分区复合物中(12-14)，以进一步提高分离过程的保真度(14-18)。功能性分区复合物的形成对于确保细胞分裂期间染色体正确分布至关重要。

已经提出了几种关于分配复合物分子结构的模型(Jalal和Le(19)进行了详细综述)，包括“桥接和凝聚”(8,20,21)、“成核和笼化”(22,23)，以及最近表明液-液相分离液滴的研究(24,25)。本质上，所有这些模型都依赖于ParB蛋白在parS位点的初始成核，随后ParB蛋白通过一些“自身-自身”相互作用将远端DNA元件聚集在一起形成分配复合物。许多依赖体外见解的旧模型在发现ParB蛋白利用CTP在parS位点加载并能够扩散到多个千碱基后需要修订(3,4,26)。研究表明ParB蛋白在CTP存在下会凝聚DNA，并且提出了一种结合一维滑动和ParB-ParB桥接的新模型，其中ParB二聚体在加载到parS位点时形成一个结合两个CTP分子的夹子，随后它们失去对parS的亲和力并沿着DNA滑动以扩散到相邻的DNA区域(4,27,28)。一段时间后，假设ParB夹子在C端或N端打开，这使得能够通过反式桥接相互作用使两个远距离的DNA片段靠近(29)。该模型将CTP存在下的DNA“夹紧和滑动”假设与先前考虑ParB蛋白“笼化”或“桥接”的模型相结合(8,9,20,21,30)。

收到:2023年7月10日。修订:2023年9月5日。编辑决定:2023年9月22日。接受:2023年9月26日

然而，关于分区复合体的形成和维持仍有许多问题。例如，分区复合体的结构和动态是怎样的？复合体的凝聚是如何启动的？CTP水解如何调节DNA结合和钳位，以及桥形成所需的自身相互作用？哪些蛋白质结构域参与桥的形成？虽然C端和N端结构域的必要性是明确的(20,31)，但在桥形成和DNA凝聚之前需要发生哪些构象变化仍有待确定(4,27,28)。此外，通过DNA凝聚形成分区复合体从未在体外使用单个parS位点进行过重构，而发现单个parS位点对于体内分区复合体功能就足够了(18,32)。

为了解决这些问题，我们使用纯化的枯草芽孢杆菌ParB蛋白，在原子力显微镜(AFM)、磁镊(MT)下，通过全内反射荧光显微镜(TIRF)在DNA拉伸试验中进行单分子水平的体外研究，以探究ParB-DNA复合物形成的机制(33)。此外，我们使用粗粒度DNA聚合物和ParB模型进行了分子动力学(MD)模拟。最后，我们使用体外转录来澄清关于ParB:DNA簇是否影响转录的争论，并且我们观察到，值得注意的是，细菌DNA依赖性RNA聚合酶(RNAP)的转录不受ParB或浓缩的ParB:DNA簇的影响。

材料与方法

ParB蛋白纯化及荧光标记

我们通过金门克隆法，使用源自pET-28a的质粒制备了枯草芽孢杆菌ParB表达构建体。我们在ZYM-5052自诱导培养基中于为时，在大肠杆菌BL21-Gold (DE3)中表达了无标签重组蛋白。如前所述(27)，对用于荧光标记的ParB和ParB 变体进行了纯化。简而言之，我们通过离心使细胞沉淀，并在缓冲液A( Tris-HCl pH 7.5、1 mM EDTA pH 8、500 mM NaCl、5 mM β-巯基乙醇、5% (v/v)甘油、蛋白酶抑制剂混合物(SigmaAldrich))中通过超声裂解细胞。然后我们向上清液中加入硫酸铵至饱和度，并在持续搅拌30分钟。我们离心样品并收集上清液，随后加入硫酸铵至50% (w/v)饱和度，并在持续搅拌。我们收集沉淀(包含提取的ParB蛋白)并将其溶解在缓冲液B(50 mM Tris-HCl pH 7.5、1 mM EDTA pH 8和2 mM β-巯基乙醇)中。在上样到肝素柱(GE Healthcare)之前，将样品用缓冲液B稀释以达到的电导率。我们使用含有1 M NaCl的缓冲液B线性梯度洗脱蛋白质。收集峰馏分后，我们在缓冲液B中重复稀释至电导率，并将其加载到HiTrap SP柱(GE Healthcare)上。对于洗脱，我们使用含有1 M NaCl的缓冲液B线性梯度。收集的峰馏分直接加载到预先在50 mM Tris-HCl pH 7.5、300 mM NaCl和1 mM TCEP中平衡过的Superdex 200-16/600 pg柱(GE Healthcare)上。对于荧光标记，我们将纯化的ParBL5C变体与TMR-马来酰亚胺以1:2的摩尔比(蛋白质:染料)孵育。我们将混合物在冰上孵育，离心10分钟，然后从旋转脱盐柱(Zeba)上洗脱并在液氮中速冻。我们使用Nanodrop上的内置功能，利用的消光系数估计ParBTMR单体的荧光团标记效率为70%(90%的二聚体被标记)。

ParB的储存和处理

我们观察到，在荧光成像之前，ParB蛋白对处理和储存高度敏感，因此，处理纯化的ParB蛋白溶液对于高质量实验至关重要。在干冰上进行实验室间(从SG实验室到CD实验室)的蛋白质运输后，将蛋白质溶液在冰上解冻10分钟。同时，我们制备了新鲜的储存缓冲溶液 Tris-HCl(pH 7.5)和1 mM TCEP，并将其保存在冰上。我们使用冷储存缓冲液将初始蛋白质溶液( ParB)以连续1:1稀释的步骤稀释至，将溶液分成份体积，并用液氮速冻。在实验当天，我们在荧光实验(40 mM Tris-HCl、65 mM KCl、2.5 mM MgCl2、1 mM CTP、2 mM Trolox、1 mM TCEP、10 nM过氧化氢酶、18.75 nM葡萄糖氧化酶、30 mM葡萄糖、0.25 μg/ml BSA、25 nM SYTOX Green(SxG，赛默飞世尔科技))中，将蛋白质以所需浓度加入成像缓冲液之前，或在MT实验(40 mM Tris-HCl、65 mM KCl、2.5 mM MgCl2、1 mM CTP、0.25 μg/ml BSA、1 mM TCEP)中加入孵育缓冲液之前，再次使用新鲜的储存缓冲液以1:1的比例稀释蛋白质。省略1:1稀释或使用不同温度的缓冲液会导致我们视野中出现大量蛋白质聚集体，以及大量蛋白质聚集体与DNA 结合。

ParB交联分析

由于以下原理，对和进行了不同条件下的交联实验:ParBS278C在溶液中会二聚化，因此不受parS结合的影响，所以交联实验在与接触之前进行并淬灭，而ParBT22C需要在N端关闭并在靠近C22处结合以进行交联之前与相互作用，所以实验在存在的情况下进行。交联实验的设置尽可能模仿MT方案，但在缺乏洗涤步骤方面存在明显限制。我们在储存缓冲液 (Tris-HCl pH 7.5，300 mM NaCl)中以的终浓度制备了ParBS278C储备液，并保存在冰上。随后，我们向该储备液中加入BMOE至终浓度为，在冰上孵育5分钟，然后在室温下孵育。将该蛋白质:BMOE混合物在含有淬灭剂(50 mM Tris-HCl pH 7.5，65 mM KCl，2.5 mM MgCl CTP和1 mM DTT)的成像缓冲液中1:10稀释，并在室温下孵育10分钟(相当于MT中的孵育/加载步骤)。我们通过在室温下在成像缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.5，65 mM KCl，2.5 mM MgCl ，1 mM CTP)中将ParB 与含有parS位点的 bp片段孵育来制备初始加载反应。这代表了ParB 在流动池中的初始加载。接下来，我们以1:1的比例加入交联缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.5，65 mM KCl，2.5 mM MgCl2，1 mM CTP，2 mM BMOE)，并在室温下孵育15分钟。这代表了在流动池中通过缓慢洗涤进行的交联。然后我们加入DTT至终浓度为以淬灭反应。在我们的MT实验中，我们进行了两次这样的加载和洗涤，但在这里我们无法洗去任何残留成分，因此最终缓冲液中含有(65 mM KCl，50 mM Tris-HCl，2.5 mM MgCl ，1 mM CTP，2 mM DTT，0.5 mM剩余的BMOE)。我们在补充图S5A中提到的多种条件下进行了这些实验，并且对方案(省略成分)进行了这样的改变，使得最终体积保持不变，其他成分的浓度保持不变。所有条件都在12% SDS-PAGE凝胶(SurePAGE™/Bis-Tris，M00668，GenScript)上运行，并使用SeeBlue™ Plus2预染蛋白标准品(LC5925，Invitrogen)估算分子量。交联效率通过使用凝胶分析仪(版本19.1)的重复实验(补充图S5B)来确定。

生物层干涉测定法(BLI)

我们按照Antar等人(27)先前描述的方法进行了生物层干涉(BLI)测定(补充图S5C、D)。简而言之，我们在含有 Tris-HCl(pH 7.5)和2.5 mM 的缓冲液中，使用BLItz仪器(ForteBio Sartorius)。我们首先将169 bp生物素标记的的加载到生物传感器上并孵育5分钟(补充图S5C、D)。在这个加载阶段之后，我们用反应缓冲液短暂冲洗生物传感器一次，并用含有 CTP的反应缓冲液冲洗一次。接下来，我们将 ParB溶液和 CTP溶液按1:1比例混合(最终浓度为 ParB和 CTP，两者均在相同缓冲液中[150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl(pH 7.5)和2.5 mM ])，然后立即将4 μl混合物加载到生物传感器上进行。在BMOE交联测试中，对于野生型ParB和ParB ，我们使用含有 BMOE [150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl(pH 7.5)，2.5 mM CTP，1 mM BMOE]且不含蛋白质的缓冲液进行2分钟的冲洗。然后在无CTP核苷酸的无蛋白质反应缓冲液的中进行的解离阶段。我们在BLItz分析软件上分析所有测量值，并在GraphPad Prism上重新绘制以进行可视化。

用于荧光实验的构建体和38 kb T7A1 + parS的构建与纯化

为构建一个长线性，我们使用了先前报道的一个大的42 kb黏粒-i95(34)和一个包含parS位点的合成构建体(Integrated DNA Technologies，表S1，下划线序列)。首先，我们使用PsiI-v2限制性内切酶(New England Biolabs)将i95黏粒线性化。接下来，我们使用小牛肠碱性磷酸酶在对剩余的5’-磷酸基团进行去磷酸化处理以用于，随后在进行的热失活处理(Quick CIP，New England Biolabs)。我们通过在添加T4激酶用于并在于补充有 ATP的 PNK缓冲液中对进行热失活，在合成的parS片段上添加 -磷酸基团(T4 PNK，New England Biolabs)。接下来，我们使用T4 DNA连接酶在含有1 mM ATP的T4连接酶缓冲液(New England Biolabs)中将两个片段连接在一起，在16°C下过夜。最终的黏粒构建体被转化到大肠杆菌NEB10beta细胞(New England Biolabs)中，我们使用JT138和JT139通过测序验证了插入片段的存在(补充表S1)。最终的38kb T7A1 + parS构建体由质粒189-pBS-T7A1-parS(补充表S1)制备。该质粒使用BsaI-HFv2金门反应混合物(NEB E1601)由质粒179、66、67、69、163和71生成。中间载体使用传统克隆技术制备(详细描述见补充表S1)。为制备适用于流动池实验的线性片段，我们使用Qiafilater质粒中提试剂盒(Qiagen)通过中提分离黏粒-i95或pBS-T7A1-parS。我们使用SpeI-HF限制性内切酶(New England Biolabs)在对黏粒-i95进行的酶切，并在进行20分钟的热失活。pBS-T7A1-parS在相同条件下用NotI-HF和XhoI进行酶切，并使用相同程序进行热失活。接下来，我们使用5’-生物素引物JT337和JT338(补充表S1)从pBluescript SK+(Stratagene)通过PCR构建5’-生物素手柄，以获得最终的1246 bp片段。我们使用与黏粒-i95相同的程序对PCR片段进行酶切，得到 bp的 -生物素手柄。38 kb T7A1-parS构建体的手柄使用相同的引物，但以模板质粒186(补充表S1 - S3)制备，得到最终514 bp的片段。我们进一步使用NotI-HF或XhoI在对这些PCR片段进行的酶切。这产生了长度为的手柄。

最后，我们将消化后的构建体和手柄以1:10的摩尔比混合，并在T4连接酶缓冲液(New England Biolabs)中使用T4 DNA连接酶在下过夜连接在一起，随后在下热失活10分钟。随后，使用SrfI限制酶(New England Biolabs)在下对38 kb的T7A1-parS +手柄构建体进行消化，并在下热失活20分钟。

我们使用ÄKTA Start(Cytiva)从接入手柄中清理得到的线性或构建体，该仪器配有一个自制的凝胶过滤柱，柱中含有46 ml的Sephacryl S-1000 SF凝胶过滤介质，在下用TE + 150 mM NaCl缓冲液运行。收集的馏分在通过浸入液氮快速冷冻后，以等分试样形式储存。

单分子可视化分析

成像盖玻片的表面如先前所述制备(35)，添加的表面进行了聚乙二醇化。为了固定，我们以的流速引入的的 -生物素化-DNA 分子，具体流速取决于实验中所需的端到端长度，在T20缓冲液(40 mM Tris-HCl(pH 7.5)，20 mM NaCl，25 nM SxG)中。流动后，我们立即以相同流速进一步流动的洗涤缓冲液(40 mM Tris-HCl，pH 7.5，20 mM NaCl，65 mM KCl，25 nM SxG)，以确保DNA的另一端拉伸并系留在表面。通过调整流速，我们获得了约为DNA轮廓长度15 - 40%的拉伸长度。接下来，我们以低流速流入不含ParB蛋白的成像缓冲液(40 mM Tris-HCl，2 mM Trolox，1 mM TCEP，10 nM过氧化氢酶，18.75 nM葡萄糖氧化酶，30 mM葡萄糖，2.5 mM BSA， SxG)，以便在添加蛋白质前后对DNA分子的干扰最小。除了在提及的地方用替换 CTP外，实验在相同条件下进行。通过在成像缓冲液中引入ParB(5 - 25 nM)进行ParB扩散的实时观察。

对于RNA聚合酶转录实验，我们按照Janissen等人(36,37)之前描述的方法制备了RNA聚合酶三元复合物。RNA聚合酶全酶在T7A1启动子序列后的A29位置停滞在构建体上。为此，我们将3 nM的RNA聚合酶全酶添加到线性模板中，模板存在于 Tris、吐温20(SigmaAldrich)和40 mg/mL牛血清白蛋白(New England Biolabs)中，pH值为7.9，并在孵育10分钟。之后，我们向溶液中添加 ATP、CTP、GTP(GE Healthcare Europe)和 ApU(IBA Lifesciences GmbH)，并在下孵育。为确保我们测量的是单个RNA聚合酶三元复合物的转录动力学，我们通过添加肝素并在下孵育来隔离游离的RNA聚合酶和与DNA弱结合的RNA聚合酶。然后将三元复合物溶液稀释至RNA聚合酶:DNA 复合物最终浓度为。将复合物以的速度冲入流动池，随后在含有 Tris-HCl、2 mM Trolox、30 mM葡萄糖、4 mM MgCl2、70 mM KCl、0.25 μg/ml牛血清白蛋白、1 mM CTP、25 nM SxG的缓冲液中冲洗所有未结合的分子。在冲洗未结合的RNA聚合酶:DNA 复合物后，我们首先将缓冲液置于不含ParB蛋白且缺乏所有NTP的成像缓冲液中(40 mM Tris-HCl、2 mM Trolox、1 mM TCEP、10 nM过氧化氢酶、18.75 nM葡萄糖氧化酶、30 mM葡萄糖、4 mM MgCl2、70 mM KCl、0.25 μg/ml牛血清白蛋白、1 mM CTP、25 nM SxG)，持续3分钟。接着加入含有 ParB蛋白(10 nM ParBTMR和15 nM野生型ParB)的相同缓冲液，孵育5分钟，以便在RNA聚合酶转录之前开始DNA凝聚。在此孵育之后，我们加入允许DNA凝聚和RNA聚合酶转录的最终成像缓冲液(40 mM Tris-HCl、2 mM Trolox、1 mM TCEP、10 nM过氧化氢酶、18.75 nM葡萄糖氧化酶、30 mM葡萄糖、4 mM 牛血清白蛋白、 NTP和 GreB)并开始成像。在这些实验中。通过交替激发获得信号，DNA-SxG(488 nm激光)、ParBTMR(561 nm激光)和RNAPAlexa647(647 nm激光)的曝光时间为100 ms，然后在下一帧之前暂停2700 ms。我们观察到在没有ParB分子的情况下，40%的RNAPAlexa647分子进行了转录，补充图S9B显示了一个示例轨迹。

我们使用自制的物镜全内反射荧光显微镜进行荧光成像。在高倾斜层叠光学片(HiLo)显微镜模式下，我们交替使用488 和激光器进行激发，分别对SxG染色的DNA、TMR标记的ParB和Alexa647标记的RNA聚合酶进行成像。所有图像均使用PrimeBSI sCMOS相机在曝光时间为时采集，使用油浸、物镜(CFI APO TIRF，尼康)。

光漂白后荧光恢复实验

我们的荧光恢复实验使用了上述相同的42 kb DNA 。在这些实验中，我们使用Alexa647标记的ParB蛋白和SxG标记的DNA，采用上述相同的实验步骤和缓冲液。DNA最初与ParB孵育，以确保DNA分子被ParB二聚体充分覆盖，并且大部分已经凝聚。最终的ParBAlexa647浓度为，以确保在我们的荧光测定中DNA有强烈的凝聚。初始孵育后，我们开始对DNA-SxG和ParB 进行共成像，持续最初的，然后对整个DNA分子上的ParB蛋白进行光漂白。

在这些实验中，通过交替激发获得信号，DNA-SxG(488 nm激光)和ParBAlexa647(647 nm激光)的曝光时间均为200 ms。使用激光功率进行100次脉冲的光漂白。我们使用自制的物镜全内反射荧光显微镜进行荧光成像。在HiLo显微镜模式下，我们交替使用和激光器进行激发，对SxG染色的DNA和TMR标记的ParB进行成像。所有图像均使用iXon Ultra 897 EM-CCD(X-7105)相机和100×油浸物镜(X-Apo，1.45NA，奥林巴斯™)采集。

图像处理与分析

从原始图像序列中裁剪出单个DNA分子的区域，并使用自定义编写的交互式Python软件(38)进行单独分析。使用窗口大小为10像素的中值滤波器对图像进行平滑处理，并使用scipy Python模块中提供的“white_tophat”操作减去背景。仅为了可视化目的(即图2)手动进一步调整图像的对比度。手动标记DNA的末端。DNA末端之间的距离就是DNA分子的端到端长度。在每个时间点获取沿DNA轴的11个像素的总荧光强度，并将其堆叠以获得动态光密度图(即图2)。选择相同的图像区域以获得ParB荧光通道的动态光密度图。

与沿DNA的周围荧光信号相比，DNA凝聚物表现为荧光信号增加的斑点(即图1D、2A)。使用trackpy Python模块(v0.4.2；10.5281/zenodo.7670439)识别并跟踪斑点的位置。凝聚物中包含的DNA量如Davidson等人(39)先前广泛描述的那样进行计算。简而言之，凝聚物大小表示为凝聚物位置处的强度分数，相对于整个DNA分子的总强度I和DNA长度

作用于DNA的张力以凝聚物外部DNA的轮廓长度(以碱基对为单位)表示，，其为，考虑到和的碱基对之间的距离，是一个校正因子，用于考虑在存在嵌入染料的情况下双链DNA轮廓长度的延长(对于，使用了(39))。凝聚物外部DNA的相对伸长率用于通过经验确定且成熟的力-伸长关系(40)来计算作用于DNA的瞬时张力:

其中，是DNA在 SxG时的持久长度， 16.07497， -14.17718。

用于原子力显微镜实验的构建体的构建

为构建用于原子力显微镜实验的环状DNA，我们使用了市售的pGGA质粒骨架(新英格兰生物实验室)。我们使用MT032和MT033引物(补充表S2)将质粒线性化。与此同时，我们通过使用引物MT039和MT040(补充表S2)的菌落PCR从枯草芽孢杆菌基因组中提取了metS基因下游包含parS位点的区域。我们通过在混合物(新英格兰生物实验室)中以1:3的摩尔比混合将质粒骨架与菌落PCR插入片段合并。我们将反应在下孵育，并冷却至保持。然后我们将该反应的转化到大肠杆菌NEB5alpha细胞(新英格兰生物实验室)中，并且我们在第二天通过使用MT030和MT031进行测序(补充表S2)来验证生长菌落中插入片段的存在。我们在存在选择性抗生素氯霉素( )的情况下于过夜培养用于质粒提取的序列阳性克隆，并在第二天使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)分离最终的质粒。利用metS基因中预先存在的识别位点，使用Nb. BbvCI切口酶的标准方案(新英格兰生物实验室)对质粒进行切口。这样做是为了从分离的质粒中去除任何超螺旋，超螺旋会通过促进不同质粒结构域之间的反式相互作用来改变实验条件和结论。我们在含有1 mM ATP的T4连接酶缓冲液(新英格兰生物实验室)中使用T4 DNA连接酶在下将切口质粒连接过夜。第二天，我们使用相同的QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)再进行三轮质粒纯化，以去除所有可能破坏原子力显微镜图像的残留酶。

原子力显微镜实验与成像

我们在干燥条件下使用来自布鲁克公司(美国马萨诸塞州)的原子力显微镜(AFM)和布鲁克公司的Scanassyst-Air-HR探针获取了图像。AFM采用峰值力敲击模式操作。我们在AFM实验中使用WSxM(41)软件对所有原始数据进行图像处理和数据提取。

我们将不同摩尔比的DNA、CTP和ParB样品在艾本德管中于缓冲溶液(40 mM Tris，pH 7.5，65 mM KCl，7.5 mM )中孵育2至。然后，我们将溶液滴加到新劈开的云母上。之后，我们用的超纯水彻底冲洗表面，并在氮气流下干燥直至明显干燥。

我们在水性条件下使用来自日本理化学研究所(筑波)的高速原子力显微镜(AFM)和来自Nanotools的PRE-USC-F1.2-k0.15探针获取图像。在此，我们使用敲击模式操作AFM。含有DNA、CTP和ParB的样品在缓冲溶液(40 mM Tris，pH 7.5，65 mM )中制备，然后滴加到新劈开并预先用聚-L-赖氨酸孵育的云母上。然后，我们用的相同缓冲液将表面彻底冲洗3次。

用于磁镊实验的构建体的构建

为构建用于磁镊实验的14 kb长线性，我们使用了#126-pSC-T7A1反向-parS质粒(补充表S1)。由于质粒大小，我们使用引物MT234/MT237、MT235/MT238和MT236/MT239(补充表S2)通过 PCR反应将其线性化。与用于线性化同时，MT237引物包含一个内部parS位点 - TGTTCCACGTGTAACA(补充表S2)。我们使用溴化乙锭 - 琼脂糖凝胶(1× TAE缓冲液(赛默飞世尔科技，J63931.K2)，0.8%琼脂糖(普洛麦格，V3125)，0.5 μg/ml溴化乙锭(西格玛奥德里奇，1239 - 45 - 8))可视化得到的三个大小分别为7783、7638和5594 bp的片段以校正大小，并使用PCR纯化试剂盒(普洛麦格，A9282)的标准方案从凝胶中提取每个片段。然后，我们将这三个片段以摩尔比1:2:1分别混合在中，并添加到的 HiFi混合物(新英格兰生物实验室)中。我们将反应在孵育，然后冷却至保持。我们将该反应的转化到大肠杆菌NEB5alpha细胞(新英格兰生物实验室)中，并使用MT240和MT241(补充表S2)通过测序验证所需插入片段(parS位点)的存在。我们在存在选择性抗生素氨苄青霉素(100μg/ml)的情况下于过夜培养序列阳性克隆以进行质粒提取，并在第二天使用Qiafilater质粒中提试剂盒(Qiagen)通过中提方法分离最终质粒。

为了制备适用于磁镊实验的线性片段，我们用SpeI-HF和BamHI-HF在下消化#126-pSC-T7A1reverse-parS 1小时，并在下热失活20分钟(新英格兰生物实验室)。随后，我们在1%的TAE琼脂糖凝胶上运行消化后的片段，并使用凝胶纯化试剂盒(普洛麦格公司，A9282)从琼脂糖凝胶中分离出所需的 DNA片段。

我们制备了两种不同的构建体，因此制作了三种不同的手柄。对于DNA凝聚实验(例如图1A-C、4)，我们使用了具有两个附着点的DNA分子；表面一侧为地高辛配基手柄，朝向磁珠的一侧为生物素手柄。我们使用引物CD21和CD22(补充表S2)在pBlueScriptSKII SK+(Stratagene)上进行PCR制备了这两种手柄。这是在1/5生物素-16-dUTP/dTTP或地高辛配基-11-dUTP/dTTP存在的情况下进行的(两个单独的反应)，得到了一个1246 bp的片段，其两端分别带有生物素或地高辛配基(耶拿生物科学公司，NU-803-DIGXS，NU-803-BIO16-L)。我们用BamHI-HF消化生物素PCR片段，用地高辛配基PCR片段用SpeI-HF消化，均在下于进行。这产生了长度为的手柄，其中存在多个生物素或多个地高辛配基核苷酸。随后，对于凝聚磁镊实验，通过使用T4 DNA连接酶(NEB)以1:10的比例将14 kb的DNA片段与多个生物素和多个地高辛配基手柄连接，制备了一个扭转受限的构建体。

对于使用RNA聚合酶的实验，我们使用了一种单链连接的DNA构建体，其一端仅含有地高辛配基手柄(附着于表面)，而第二个附着点在RNA聚合酶上(图6A)。因此，第二个手柄是一个钝端手柄，不附着任何东西(图6A)。在这里，我们使用与之前相同的引物CD21和CD22在pBlueScriptSKII SK+(Stratagene)上进行PCR制备手柄，要么如前所述在存在地高辛配基-11-dUTP/dTTP的情况下，要么不使用修饰的核苷酸(用于钝端一侧)。这产生了相同的1246 bp片段，一端带有地高辛配基，另一端为钝端。我们用BamHI-HF消化未修饰的PCR片段，用地高辛配基PCR片段用SpeI-HF消化，均在下进行2小时。这产生了与之前相同长度的手柄( )，一侧为钝端，另一侧存在多个地高辛配基核苷酸。对于RNA聚合酶镊子实验，通过以1:10的比例将14 kb的DNA片段与多个地高辛配基和未修饰的手柄连接，制备了一种一侧带有多个地高辛配基的构建体。

对于这两种构建体，我们通过在1%的琼脂糖凝胶上运行所得的镊子构建体(14 + 1.2 kb)，从接入手柄中清理出来，并用凝胶纯化试剂盒(普洛麦格公司，A9282)凝胶纯化正确的DNA片段。

大肠杆菌RNA聚合酶-生物素、GreB和的纯化

野生型大肠杆菌RNA聚合酶(RNAP)全酶与转录起始因子如前所述进行表达和纯化(42)。RNAP在B’-亚基上含有生物素修饰(43)，用作附着链霉亲和素包被磁珠的锚定物。GreB因子按照先前建立的方案获得并纯化(44)。所有纯化蛋白质的活性通过标准的批量转录测定法进行确认。

磁镊仪器与实验

本研究中使用的MT实现方法已在之前描述过(36,37)。简而言之，透过样品的光由一个油浸物镜(CFI Plan 50XH，消色差物镜；，尼康)收集，并以50 的采样频率投射到一个400万像素的CMOS相机(#4M60，Falcon2；Teledyne Dalsa)上。施加的磁场由一对垂直对齐的钕铁硼永久磁铁(德国Supermagnete GmbH公司)产生，它们之间的距离为，并悬浮在流动池上方的电动平台(#M-126.PD2，Physik Instrumente)上。此外，磁体对可以通过一个施加直流伺服步进电机(C-150.PD；Physik Instrumente)绕照明轴旋转。对收集到的光进行图像处理可以随时间在三维空间中跟踪表面附着的参考珠和与或RNA聚合酶偶联的超顺磁珠的实时位置。珠子位置跟踪是使用在LabView(2011，美国国家仪器公司)中用自定义编写的软件实现的互相关算法来完成的(45)。该软件通过光谱校正确定珠子位置，以校正相机模糊和混叠。

本研究中用于MT实验的流动池制备方法已由Janissen等人详细描述(36,37)。简要地说，将直径为的聚苯乙烯参考珠(欧洲Polysciences公司)在PBS缓冲液(pH 7.4)中按1:1500稀释，并粘附到流动池通道经KOH处理的表面上。接下来，将地高辛抗体Fab片段(罗氏诊断公司)在流动池通道内孵育，然后在含有 Tris-HCl pH 7.9、吐温20(SigmaAldrich公司)和牛血清白蛋白(新英格兰生物实验室)的缓冲液A中稀释10 mg/ml牛血清白蛋白(新英格兰生物实验室)孵育。

对于力-伸长实验，将线性的在流动池通道中于PBS缓冲液中孵育。用 PBS缓冲液洗涤后，加入直径为1 的链霉亲和素包被的超顺磁性珠子(在PBS缓冲液中按1:400稀释；MyOne #65601 Dynabeads，Invitrogen/Life Technologies)，孵育，使珠子附着于生物素化的；然后用PBS缓冲液洗去未附着的珠子。在进行力-伸长实验之前，通过对每个方向施加高力( )并旋转30次来评估系链。仅将单链结合且端到端长度正确的DNA系链用于单分子实验。在力-伸长实验中，将ParB蛋白(或ParB变体；见正文)引入流动池通道，同时对系链施加。对于野生型ParB、ParB 和ParB ，我们首先在流动池中以如此高的力将蛋白质孵育，然后直接将力从逐步降低(见图1B)至，在内记录珠子的z位置。对于变体，我们首先在不存在BMOE(65mM KCl、50mM Tris-HCl、2.5mM MgCl 、1mM CTP)的情况下将蛋白质孵育，然后使用含有1mM BMOE的缓冲液进行交联，但不包括ParB ，进行10分钟的缓慢洗涤(65mM Tris-HCl、 BMOE)。我们重复此步骤两次，以确保在上的高存在率。在对ParBT22C进行这两轮加载和交联之后，我们在不含ParBT22C蛋白和淬灭剂(65mM KCl、50mM Tris-HCl、2.5mM MgCl CTP、2mM DTT)的缓冲液中进行洗涤步骤，以确保任何残留的BMOE被淬灭，同时在力-伸长实验开始前洗去任何未交联的蛋白质。在此之后，如上述所述，逐渐降低力并记录珠子的z位置。

对于RNA聚合酶转录实验，RNA聚合酶三元复合物的制备如前所述进行(36,37)。简而言之，RNA聚合酶全酶在T7A1启动子序列后的A29位置停滞在DNA 构建体上。为此，将3 nM的RNA聚合酶全酶添加到3 nM线性DNA 模板中，置于缓冲液A中，并在孵育10分钟。之后，将 ATP、CTP、GTP(通用电气医疗欧洲公司)和 (IBA生命科学有限公司)添加到溶液中，并在孵育。为确保我们测量的是单个RNA聚合酶三元复合物的转录动力学，我们通过添加肝素并在孵育，来隔离游离的RNA聚合酶和与DNA弱结合的RNA聚合酶。然后将三元复合物溶液稀释至RNA聚合酶:DNA 复合物最终浓度为。将复合物冲洗到流动池中，并在室温下孵育。随后添加直径为的链霉亲和素包被的超顺磁性珠子(在缓冲液A中稀释至1:400；MyOne #65601 Dynabeads，英杰公司/生命技术公司)，导致珠子附着到停滞的生物素化RNA聚合酶上。随着不同浓度的ParB蛋白的引入(见正文使用的浓度)，通过添加等摩尔浓度为的ATP、CTP、GTP和UTP(通用电气医疗欧洲公司)重新启动转录，并立即开始单分子测量。实验在的恒定力下进行。

所有MT数据集均使用基于Igor v6.37编写的自定义脚本进行处理和分析(37)。从我们的原始数据中，我们使用先前描述的方法(46)，在力-伸长实验中去除了显示表面附着磁珠以及DNA-磁珠附着点远离磁珠磁赤道的系链的轨迹。在测量过程中从表面脱离的系链也被排除在进一步分析之外。将在相同条件下进行的实验产生的所有轨迹汇总在一起。使用可扩展蠕虫状链模型(47)确定的端到端长度，将转录过程中RNA聚合酶的绝对z位置转换为作为时间函数的转录RNA产物。在没有ParB的情况下，可扩展蠕虫状链模型也用于拟合力-伸长DNA 端到端长度数据。

通过对转录延伸和转录暂停的统计分析，对大肠杆菌RNA聚合酶(RNAP)的转录动力学进行了定量评估。使用无偏停留时间分析(37)评估暂停分布。对于所有RNAP轨迹，计算RNAP转录通过五个碱基对的连续停留时间窗口(定义为“停留时间”)所需的时间，并用于构建停留时间概率分布函数。对数据进行 (移动平均值)滤波，以分析所有数据集。通过对数据进行100次自抽样(37)，估计构建分布中的预期误差(标准差)。为了表征停留时间分布，我们将其分为三个单独的时间范围，如先前详细描述的(37):无暂停转录延伸区域(0.1 - 1秒)，其中包含延伸峰值；短元素暂停区域；以及长回溯暂停区域。延伸速率由给出，其中是中的停留时间窗口大小，表示伽马拟合分布的峰值位置。为了计算短暂停和长暂停的概率，我们在相应的停留时间区域上对停留时间分布进行积分。

建模与分子动力学模拟

我们将DNA建模为由1000个大小为的球形珠子组成的半柔性聚合物。我们将parS放置在链的中间，ParB珠子在此处加载并扩散，如下所述。珠子之间纯粹通过遵循移位和截断的 Lennard-Jones(LJ)力场的排除体积相互作用

其中表示任意两个珠子之间的距离，是截止值。我们通过将LJ势与有限可延伸非线性弹性(FENE)势相加，来设置沿DNA轮廓的两个单体之间的键

其中是弹簧常数，是键的最大长度。我们引入DNA链的持久长度，作为由下式给出的三个连续珠子之间的弯曲势能:

其中是两个键之间的角度，是弯曲刚度常数，对应于约10个珠子或的持久长度。

我们在具有隐式溶剂的恒容恒温(NVT)系综中进行模拟，使用局部阻尼常数设置为的朗之万热浴，使得惯性时间等于 Lennard-Jones时间，是每个珠子的质量。在开启ParB加载、募集和扩散之前，我们使链平衡足够长的时间以达到恒定的回转半径。我们在LAMMPS(40)中使用速度 Verlet积分方案和时间步长来求解朗之万方程。

我们通过使用布朗时间进行到实时和长度单位的映射。利用水的粘度，我们得到。我们通常每 5毫秒转储一次珠子的位置。在这个阶段还需要注意的是，通过粗粒化(1个珠子 )映射到。

我们通过在LAMMPS引擎中调用一个外部程序，在系统中对ParB进行建模，该程序修改DNA珠子的类型，以考虑ParB在DNA上的加载和扩散；换句话说，ParB是隐式建模的。在时，我们将单个ParB蛋白加载到parS位点上，并使其以恒定的进行扩散。请注意，这比ParB的实际扩散速率快，实际扩散速率约为，我们选择这个值是为了加快模拟速度。扩散是通过每个时间步以0.125的概率尝试将加载的ParB向左或向右移动来实现的(回想一下，在一维系统中MSD = 2 Dt，因此跳跃概率是扩散系数D的两倍)。如果尝试使ParB蛋白位于另一个ParB之上或超出DNA末端，则扩散不会发生(移动被拒绝)。

除了扩散，我们以可变速率在ParS位点添加ParB的加载尝试，并以固定速率进行卸载过程，即在时间尺度上进行。这个时间尺度比实验中观察到的要快，但我们认为系统的整体行为由加载和卸载时间尺度的比率控制，如下文和文本中所述。与我们之前关于ParB蛋白招募机制的工作一致，我们以与在ParS处加载相同的速率实施随机招募，不同之处在于招募概率与每个加载的ParB相关联，可以顺式发生(概率为 )或反式发生(概率为 )，使得反式招募比顺式招募大11倍。如果选择顺式招募，则随机选择与ParB相邻的两个一维珠子之一，如果未被占据，则在链上添加一个新的ParB。否则，如果选择后者的“反式”机制，我们计算3D近端邻居列表，这些邻居必须(i)在欧几里得截止距离内，并且(ii)在一维上比第二近邻更远(即不能选择第一和第二近邻)。一旦编译了3D邻居列表，我们从列表中随机选择一个(如果不为空)，加载一个新的ParB蛋白，并恢复朗之万模拟。

二聚体二聚体和二聚体多聚体桥接的实现

为了精确调节ParB之间的结合机制并控制相互作用的价态，我们在球形珠子的对映位置用两个斑块装饰每个聚合物珠子。中心珠子和斑块作为一个刚体旋转，并且对斑块的旋转没有约束，例如不施加二面角势。仅当聚合物珠子被ParB蛋白占据时，斑块之间的相互作用才会开启，并且我们决定开启一个还是两个。前一种情况导致一对一桥接(二聚体二聚体)的形成，而后一种情况导致二聚体多聚体的形成。斑块之间的相互作用由以下形式的莫尔斯势调节

对于为真，否则为0。是我们在模拟中改变的一个参数，用于探索相图，而用于确保短程相互作用。我们注意到截止值是特意设置的，以确保它对于成对的ParB相互作用是现实的。运行此模拟的代码可在https://git.ecdf.ed.ac.uk/taplab/parbcondensation找到。

结果

ParB蛋白通过单个parS位点凝聚DNA

最近发现ParB蛋白需要CTP核苷酸才能特异性地加载到带有parS位点的DNA(DNA )上并执行其细胞功能，这对许多已建立的ParB功能模型提出了挑战(3,4,48)。以前的大多数凝聚研究使用非常高的蛋白质浓度来显示ParB凝聚或DNA结合的发生，并且在DNA底物上存在或不存在parS位点时通常没有发现差异。然而，最近关于染色体和质粒ParB蛋白的研究(29,49)表明，在CTP核苷酸存在的情况下，ParB蛋白可以在纳摩尔浓度下诱导 DNA的凝聚，这与ParB的有效加载一致。这项研究报告说，DNA上至少需要7个parS位点才能发生凝聚(29)，鉴于携带单个parS位点的枯草芽孢杆菌突变体在体内生长或ParB加载方面没有显示出缺陷表型(18,32)，这是出乎意料的。

为了量化ParB驱动凝聚的能力，我们首先使用磁镊来研究枯草芽孢杆菌ParB蛋白与长DNA底物的相互作用，该底物在构建体中间仅包含一个parS位点。附着在该相对两端的化学基团用于将DNA的一端拴系到链霉亲和素包被的磁珠上(通过生物素基团)，另一端拴系到抗地高辛抗体包被的表面上(通过地高辛基团)(图1A、S1A，见材料与方法)。我们将施加到磁珠上的力从7逐渐降低到 (图1B - 蓝线)，并记录附着的DNA分子的端到端长度的变化。

引人注目的是，在存在ParB和CTP的情况下，发现DNA上的单个parS位点足以导致DNA凝聚，当将力降低到以下时，DNA端到端长度的突然缩短(即磁珠高度的快速降低)证明了这一点(图1B - 红线)。当不存在ParB蛋白时未观察到这种情况(图1B - 黑线)。同样，在不存在CTP或不存在parS位点的情况下，我们没有观察到任何DNA凝聚(补充图S1B、C)。我们对不同浓度的ParB的力 - 伸长曲线进行了量化，并观察到在5到之间的临界浓度处有一个突然转变，在该临界值以上才观察到凝聚(图1C)。在广泛的ParB浓度(20 - 200 nM)范围内都观察到了凝聚，并且无论ParB浓度如何，总是产生相同程度的DNA凝聚。

接下来，我们在基于荧光的DNA拉伸试验(50)中，使用TMR标记的枯草芽孢杆菌ParB蛋白和SYTOXGreen(SxG)嵌入剂对DNA分子进行标记，以光学方式可视化DNA凝聚。在此，DNA 长度为，通过生物素-链霉亲和素相互作用在DNA两端松散地 tethered 到表面，并且在DNA 的中间包含一个单一的parS位点(50)(详细信息见材料与方法，补充图S1D)。与 ParB孵育后，我们观察到随着时间的推移，DNA 上出现了强烈的荧光DNA位点，这些位点与荧光ParB信号共定位(图1D，图S1E)。根据ParB:DNA凝聚物的荧光强度，我们量化了凝聚物内的DNA量以及凝聚对凝聚物外DNA片段施加的力(51,52)。令人惊讶的是，我们观察到DNA凝聚物大小达到，即它可以包含超过60%的总DNA含量(见补充图S1F)。此外，我们观察到随着 tethered DNA的端到端长度在DNA轮廓长度的20%至50%之间变化(最大轮廓长度为；图1E)，凝聚物大小变化超过2倍。虽然凝聚物大小因此可能有显著变化，但相比之下，我们发现它对DNA施加的拉力相当恒定，值为 pN(平均值标准差，图1F)。

最后，我们使用原子力显微镜(AFM)以单分子分辨率对ParB:DNA凝聚物进行成像。AFM图像显示了蛋白质结合的DNA结构，这些结构局部桥接和缠结，其中更高的局部结构表明DNA上存在ParB分子(图1G，H)。相比之下，在没有ParB、DNA上的parS位点或CTP分子的情况下，我们没有观察到这种高阶DNA:ParB结构(补充图S1G - I)。

ParB蛋白介导的DNA凝聚是动态且可逆的

先前关于ParB蛋白的研究暗示了蛋白质与的动态交换。在此，使用我们的DNA拉伸试验和光漂白后荧光恢复(FRAP)，我们测试了ParB在凝聚的ParB:DNA簇中的结合和解离。在与先前描述的类似设置(图1D)(53)中，我们在表面拉伸DNA ，并在高浓度的ParB蛋白存在下孵育，直到大多数DNA分子凝聚(15分钟)。在此之后，大多数分子在加载和解离ParB蛋白之间达到稳定平衡。为了研究ParB:DNA复合物的恢复动力学，在用强激光功率进行光漂白后，我们随时间对凝聚物内的DNA和ParB蛋白进行共成像(图2A，B，见材料与方法)。漂白后，FRAP实验显示凝聚物内ParB荧光信号快速恢复 (图2B)。恢复时间和动力学与先前获得的质粒和染色体ParB蛋白的数据一致(2,28,54)，这表明ParB蛋白与缓冲液中可溶性ParB池快速交换，同时保持凝聚的ParB:DNA结构。

图1. 在单个parS位点存在的情况下，ParB蛋白能有效地使DNA凝聚。(A) 实验性磁镊测定法的示意图，在DNA 分子上使用单个parS位点(见材料与方法)。(B) 在不同力作用于磁珠(蓝色)时，随着时间推移，在不存在(黑色)和存在50 nM PaRB蛋白(红色)的情况下DNA的延伸情况。(C) 在不同ParB浓度存在时，降低力(每个ParB浓度下N )时的平均DNA 延伸(平均值标准差)。黑线表示对0 nM ParB对照数据的WLC拟合。(D) 与 ParB孵育15分钟前后DNA 分子的荧光快照图像。(E) DNA拴系长度对最终凝聚物大小的影响(平均值标准差； )，以其包含的DNA千碱基对表示。 (皮尔逊相关系数)。(F) 不同大小的ParB簇对簇外DNA片段施加的张力。N = 153。(G) 在不存在ParB蛋白的情况下4.2 kb环状DNA 分子的干燥原子力显微镜图像。(H) 与(G)相同，但存在5 nM ParB蛋白。(I) 与(G)相同，但同时存在1 mM CTP和5 nM ParB。另见图S1。

有趣的是，凝聚物中的ParB信号并未呈现稳定的平台期，而是在分钟时间尺度上其强度出现了高达40%的显著且持续的动态波动(补充图S2A)。我们对单个凝聚物内的DNA总量以及随时间在DNA上的总ParB蛋白量进行了量化，观察到DNA和ParB的强度都显示出大幅波动(图S2B - G)。DNA和ParB信号没有很强的相关性，这表明在稳态下，DNA可以动态重组，而ParB蛋白的量变化不大。我们还观察到ParB:DNA凝聚物的大小随时间变化，尽管凝聚物在整个时间内都稳定维持(图2A、B和图S2B - G)。我们记录了凝聚初始步骤的延时图像，以监测从ParB加载到在上扩散以及凝聚的整个过程的开始。如图2C、D所示，我们观察到ParB的加载，随后其扩散导致在注入蛋白质后几分钟内基本上覆盖了整个DNA，之后通过形成局部簇建立了DNA凝聚(图2D，补充图S3A、C)。所得ParB:DNA凝聚物内的在分钟内表现出约量级的显著波动(补充图S3B、D)。在互补的磁镊实验中也观察到了ParB:DNA凝聚物类似的高波动(补充图S3E、G、H)。如果ParB分子形成永久性的蛋白质 - 蛋白质桥将DNA的远距离部分连接在一起，就会发生持续增加凝聚形成单个静态ParB:DNA凝聚物的情况。相反，我们的数据表明ParB - ParB桥是短暂的，不断重新形成和断裂，从而形成一个其成分快速周转的凝聚物。

图2. DNA凝聚是动态的。(A) 在光漂白前和荧光恢复期间的不同时间点，用SxG(灰度)和ParBAlexa647信号(青色)染色的DNA信号的快照。 s表示在15分钟的蛋白质孵育步骤(25 nM)后的成像开始时间。(B) 在光漂白前和凝聚物荧光恢复期间，ParB:DNA凝聚物的荧光强度，在DNA分子的全长上积分(完整轨迹见补充图S2A)。(C) 用于探测DNA凝聚的单分子荧光DNA拉伸测定的示意图。(D) 用SxG(顶部)和ParB™R(底部，25 nM)染色的DNA 的动态图像。白色箭头表示ParB加载到DNA上。(E) 与(C)相同，但用于洗涤实验。(F) 与(D)相同，但用于洗涤实验。另见补充图S2和S3。

通过洗涤实验证实了ParB:DNA凝聚物的动态性质，在该实验中，我们用不含ParB蛋白的缓冲液洗涤凝聚物(图2E)。我们的数据表明，大多数ParB:DNA凝聚物在的时间内缓慢被洗出，其中DNA分子恢复到其初始的非凝聚状态(图2F，补充图S4A、B)。无论是否存在CTP分子，情况都是如此(分别见补充图S4A和C)。

总之，FRAP实验显示了ParB蛋白与DNA凝聚物的动态交换，洗涤实验表明ParB-ParB桥的短暂性，这使得蛋白质能够被洗去并使DNA解凝聚。我们的数据表明，ParB:DNA凝聚物是动态实体，不断重新排列，这与ParB-ParB桥的短暂性一致，它们不断断裂和重新形成，同时保持整体凝聚物的完整。

DNA凝聚始于环的形成

为了探索ParB-DNA凝聚物形成的最初阶段，我们将ParB蛋白的浓度大幅降低到，并实时在单分子水平观察它们的行为。使用我们的荧光DNA拉伸测定，我们观察到加载在上的两个ParB二聚体可以自发相遇并连接，在它们之间形成一个DNA环。通过跟踪DNA的高强度区域(环)，我们观察到它的位置是动态的(因为它沿着DNA扩散)且是短暂的(因为它在一段时间后会中断)(图3A、B)。由于我们将蛋白质浓度保持得非常低，DNA上通常只有少数ParB蛋白，这种环的形成很少见。

图3. DNA凝聚通过ParB-ParB桥和短暂的环形成启动。(A) 用SxG(顶部)和ParB™(底部，0.3 nM)染色的DNA 的动态图像。橙色虚线显示由ParB连接点保持的DNA环的起始和断裂点。(B) ParB-ParB桥接诱导的DNA环形成的示意图。(C) ParB-ParB桥接诱导的短暂环形成的高速AFM形貌图像(见视频S1)。(D) 在不存在(黑色；平均值±标准差5.6±3.3秒；N = 15)和存在(红色；平均值标准差50 25秒； )1 nM ParB的情况下DNA环寿命的箱线图。双尾、非配对t检验的显著性值: 。另见图S4。

为了更准确地观察ParB蛋白形成初始环的过程，我们采用了高速原子力显微镜(见材料与方法)，在该实验中我们研究了一个较短的环状DNA 分子(4.2 kb)。我们观察到，结合在DNA不同位点上的ParB二聚体可以通过将这些远距离的片段连接在一起，形成一个短暂的DNA环(图3C，补充图S4D - G)。我们对环的停留时间进行了量化，发现与没有ParB的对照相比，在有ParB蛋白存在的情况下，环持续的时间要长得多(图3D，补充图S4H)。平均而言，DNA环在断裂前持续存在 (平均值标准差)。我们推断，观察到的环形成是更伸展的DNA:ParB结构凝聚的前奏，正如最近针对F - 质粒的ParB蛋白所提出的那样(49)。具体来说，在较高的ParB浓度下，结合的ParB量变得大于由其解离速率所设定的值，从而引发非线性协同结合并在DNA底物上扩散，导致凝聚。

ParB N端的CTP水解是形成分配复合物所必需的

先前的工作假设ParB二聚体诱导的DNA桥接涉及不同ParB二聚体的两个单体之间的相互作用。然而，目前的模型无法区分ParB蛋白在DNA凝聚之前(图4A)是否需要在N端或C端结构域打开(29)。Balaguer等人(29)发现CTP结合至关重要，但CTP水解对于DNA凝聚不是必需的(29)，这表明存在第三种可能性，即ParB二聚体在DNA加载后且在ParB - ParB桥形成之前无需任何打开就可凝聚DNA(图4A)。

为了区分这些模型并确定ParB在加载到后是否需要打开以进行DNA凝聚，我们研究了多种ParB变体，这些变体被强制形成N端或C端结构域的封闭状态。在扩散之前，ParB二聚体以“开放夹钳”的形式结合到parS位点，并在N端界面夹着两个CTP核苷酸，随后这些界面会关闭，形成一个“封闭夹钳” 。为了迫使蛋白质在结合DNA后保持N端封闭，我们使用了先前描述的ParB变体，即ParB ，它可以通过双马来酰亚胺乙烷(BMOE)在其封闭(而非开放)形式下通过半胱氨酸化学方法进行有效交联(27)(补充图S5A，B)。在将我们的15 kb 与不同浓度的ParB 变体孵育后，我们收集了表征凝聚程度的MT力 - 距离曲线(图4B - D)。请注意，这与图1中描述的实验过程略有不同，因为我们只需要在ParB 蛋白变体加载到之后对其进行交联:我们首先加载ParB 蛋白5分钟，然后在其与DNA结合时使用含有BMOE和CTP但不含蛋白质的缓冲液交联 (见方法，补充图S5A)。类似的实验过程增加了ParB 在生物层干涉(BLI)测定中的DNA停留时间，推测是通过半胱氨酸交联将ParB夹钳锁定在DNA上(26 - 28)(补充图S5C，D)。在将ParB 二聚体加载到DNA上后，我们开始进行力 - 伸长实验(如图1C所示)，并观察到与野生型ParB相比有两个关键差异(图4B)。

图4. DNA 凝聚需要在ParB蛋白的N端进行CTP水解。(A) 通过不同蛋白质结构域导致ParB-ParB桥接的潜在情况。(B) 在存在突变体且添加(紫色； )或不添加(黄色； ) BMOE交联剂的情况下降低力时，MT中DNA 的平均延伸(平均值标准差)。黑线表示拟合到 ParB数据的WLC模型。(C) C端ParB 突变体(N；0 nM:32 200 nM:13 200 nM + BMOE:13)的情况与(B)相同。(D) 在施加力为和所有ParB变体的浓度下，不同条件下的相对DNA延伸。统计分析采用不成对双尾t检验(P:*** < 0.001；n.s. = 无显著性)。另见图S5。

首先，在没有BMOE交联的情况下，观察到明显的凝聚现象，从将黄色曲线(有ParB )与黑色曲线(裸DNA)比较可以看出，尽管ParB 变体使DNA凝聚的程度低于野生型ParB(图4D)。其次，更有趣的是，在存在BMOE的情况下，ParBT22C变体凝聚DNA的能力受到阻碍。为了与C端结构域的突变体交联进行比较(29)，我们随后使用了ParBS278C变体，它可以在其C端被BMOE有效交联，同时仍然允许CTP与parS位点结合(27)。ParB 突变体在实验前进行了交联，确保它们与接触时，其C端已经交联。在MT实验中，我们观察到交联和未交联变体之间没有差异(图4C)。在存在BMOE(因此在C端有共价键)的情况下，ParB 蛋白能够像野生型一样有效地加载和凝聚DNA (图4D)。我们通过变性SDS-PAGE确认了ParB 和ParB 变体的交联(补充图S5A、B)。

此外，我们研究了CTP水解对ParB介导的DNA凝聚的影响。首先，我们测量了之前描述的ParB 突变体，该突变体缺乏CTP水解能力，但不影响DNA 加载(27)。在与图1C实验相同的条件下进行的MT力-伸长实验中，该变体未显示出任何明显的DNA凝聚(图4D，补充图S5E)。这与之前的研究一致，之前的研究表明，催化无活性的EQ突变体在枯草芽孢杆菌中不会形成功能性分区复合物特有的荧光焦点(27)。最后，我们进行了MT实验，用其不可水解的版本CTP 替代CTP，这将迫使ParB在加载到后处于钳位状态。首先，我们在荧光测定中证实了在CTP 存在下ParB的结合和无凝聚现象(补充图S5E，F)。与我们之前的结果一致，我们在MT中未观察到分子的凝聚，即使在高蛋白浓度(200 nM)下也是如此(图4D，补充图S5G，H)。

综上所述，我们可以得出结论，我们的研究结果表明N端结构域的CTP水解对于DNA凝聚至关重要。很可能，这涉及N端打开，而C端打开则不需要。

ParB多聚体的协同作用驱动ParB:DNA凝聚

然后，我们质疑ParB蛋白之间的相互作用是否仅涉及二聚体-二聚体对或更大的寡聚体。在“二聚体的二聚体”(DoD)情况下，ParB二聚体表现为单个二价桥(图5A)。相比之下，“二聚体的多聚体”(MoD)可以发生寡聚化(图5A)形成更大的复合物。我们在分子动力学(MD)模拟中测试了这两种情况(图5B)，在模拟中我们对ParB二聚体在parS处加载、在DNA底物上扩散以及进行顺式/反式募集进行了建模。这些计算模型基于模拟蛋白质沿DNA移动的成熟框架(55 - 57)。我们扩展了我们之前发表的模型，该模型包括实验确定的ParB加载速率、ParB在DNA上的停留时间以及顺式/反式募集速率(更多细节见方法和Tišma等人(50))，以测试不同ParB价态值的影响。通过改变加载与卸载速率的比率，我们考虑了本体中不同的ParB浓度。

对于所有参数，我们观察到DoD和MoD模型之间DNA聚合物结构存在巨大差异。当ParB二聚体只能以DoD形式相互作用(价态为1)时，DNA分子保持线性延伸的非凝聚构象(图5C；视频S2，S3)。然而，当我们考虑价态为2的MoD模式时，我们观察到形成了一个密集簇(图5D；视频S4)，这与我们的荧光数据(图1)相似。因此，在所有其他参数相同的情况下，DoD模式保持完全延伸的构象，而MoD模式则将DNA动态折叠成凝聚状态。值得注意的是，最近关于新月柄杆菌中ParB:DNA凝聚的一个模型表明，DoD模式可以将DNA带入凝聚簇(54)。在这个模型中，蛋白质-蛋白质连接断裂后ParB-ParB桥的快速重新形成促进了这一过程，此时两种蛋白质都保持与DNA结合。在我们的模型中，由于其速率，ParB蛋白在形成瞬态桥后从DNA上解离。因此，MoD模式由于确保了寡聚化，在将DNA折叠成簇或凝聚物方面更有效。未来，结构数据和计算建模的结合可能会更清楚地揭示ParB-ParB桥内ParB二聚体的确切构象。

图5. DNA簇的形成取决于桥连强度和ParB加载速率。(A) 通过N端进行ParB-ParB桥连的两种可能情况。(B) 由1000个珠子组成的具有非束缚末端的DNA聚合物的分子动力学模拟快照。(C) ParB-ParB相互作用的DoD(价态 = 1)模式下的“开放”DNA聚合物构象。(D) ParB-ParB相互作用的MoD(价态 = 2)模式下的塌陷DNA聚合物构象。(E) MoD模型的相图，显示了具有不同的PaFB-ParB相互作用强度和加载/卸载比率的三种不同构象。白色区域:ParB的局部分布和开放的DNA构象；青色区域:ParB的扩散分布和开放的DNA构象，橙色区域:塌陷的ParB:DNA构象。(F) 不同加载/卸载比率下的DNA塌陷(固定，见材料与方法)。表示聚合物的均方回转半径。阴影区域是具有不同初始配置和随机种子的同一系统的10个复制品中的标准差。(G) 在不同的ParB-ParB结合强度下，固定加载/卸载比率(k = 10)时DNA塌陷/凝聚的分子动力学模拟。阴影区域:与(F)相同。(H) 在5 nM时用SxG(上)和ParB (下)标记的DNA 的荧光强度随时间变化图。(I) 顶部:在处ParB分布的模拟荧光强度随时间变化图，未观察到DNA聚合物塌陷。底部:上述荧光强度随时间变化图中选定时间点的DNA聚合物构象快照。(J) 与(H)相同，但ParB浓度为25 nM。(K) 与DNA结合的ParB总数作为的函数。黑线表示拟合的希尔系数为，表明具有协同的、开关样行为。(L) 分子动力学模拟中ParB:DNA簇凝聚后的不同时间点。左:显示ParB:DNA簇构象。右:显示簇内的ParB蛋白。三个用粉色阴影标记的ParB蛋白表明它们在整体DNA结构保持塌陷的同时动态重排。另见补充图S6、S7。

然后，我们扩展了分子动力学模拟，以测试在MoD模型中ParB蛋白之间不同相互作用强度值下的DNA凝聚情况(即莫尔斯势的深度，见方法):我们观察到三种定性不同的结果(见图5E中的相图):(i) 具有局部ParB二聚体的伸展DNA(图5E，白色区域)，(ii) ParB蛋白扩散到整个DNA底物但未导致压缩的伸展DNA(图5E，青色区域)，以及(iii) ParB蛋白沿DNA扩散的凝聚DNA:ParB结构(图5E，橙色区域)。在我们的分子动力学模拟中，我们没有观察到没有扩散的凝聚，而我们确实观察到了没有凝聚的扩散，例如DNA分子显示ParB蛋白分布在DNA聚合物的全长上但聚合物没有塌陷(补充图S6A、B；视频S5)。这取决于加载/卸载速率和相互作用强度 (补充图S6C - E)。对于足够大量的ParB蛋白(图5F)和ParB-ParB桥连强度(图5G)，簇会出现(补充图S6F、G)并且DNA分子会塌陷(图5F、G；视频S4)。这与我们在荧光成像实验中观察到的行为一致:在时，我们观察到DNA分子显示ParB均匀覆盖但没有凝聚的证据(图5H)，就像在分子动力学模拟中一样(图5I)。相反，在较高的蛋白质浓度(25 nM)下，DNA分子在ParB蛋白扩散到整个DNA分子后不久就塌陷了(图5J)。

这种行为可归因于ParB二聚体在DNA上的动态性质。如果加载和招募速率(与可溶性池中ParB的浓度成正比)与由CTP水解速率设定的解离时间相比很慢，那么就不可能在DNA上达到驱动凝聚所需的关键数量的ParB蛋白。因此，在我们的分子动力学模拟中，我们将结合到DNA上的ParB数量量化为ParB浓度的函数(在我们的模拟中为，补充图S7A、B)。我们获得了一个陡峭的希尔系数，表明具有高度协同性。这种协同性是由于ParB介导的其他ParB的招募，即使它们远离ParS位点。例如，在时，我们在DNA聚合物上观察到个驱动凝聚的分子(补充图S7C)。还观察到DNA的回转半径随的变化出现突然转变(图5G)。在我们的荧光实验(图5J)和微管实验(图1C)中也看到了这种类似开关的塌缩行为，即在浓度的ParB下，DNA分子要么伸展要么凝聚，但不会处于中间状态，这表明这种协同的、类似一级反应的凝聚具有双稳态性质。

最后，通过直观检查我们的模拟结果，我们可以看出ParB:DNA凝聚物是由数量波动的ParB蛋白维持的。图5L显示了示例时间快照，其中ParB蛋白与池中蛋白进行交换，而DNA支架保持凝聚状态。这种高周转率与我们的荧光恢复后光漂白实验(图2)一致。

RNA聚合酶的转录可在动态的ParB:DNA簇存在的情况下发生

据报道，在parS位点附近基因表达可能会下调(58 - 64)。为了解决长期存在的问题，即ParB是否通过空间位阻阻碍RNA聚合酶(RNAP)而作为转录抑制因子，我们在单分子实验中用DNA:ParB凝聚物检测了体外转录。我们在具有单个parS位点的16.5 kb DNAparS构建体中包含一个单一的T7A1启动子(图6A)，以及来自大肠杆菌的单个生物素标记的细菌RNAP，它能有效结合到T7A1启动子并能够转录个核苷酸长的RNA构建体(图6B、D)。在将RNAP在上的T7A1启动子后的A29位置停滞，并通过DIG:抗DIG相互作用将 tether到表面(见方法)后，我们用结合到上停滞的生物素 - RNAP的链霉亲和素包被磁珠孵育流动池。为确保正在转录的RNAP向ParB簇移动，T7A1启动子位于parS上游1 kb处。我们首先将暴露于高浓度的ParB蛋白(50 nM)，这确保了如我们之前实验(例如图1)中那样的有效加载和DNA凝聚。与表面系留点和RNAP之间的DNA部分保持在的恒定力不同，的剩余经历力，确保高浓度的ParB有效凝聚DNA。我们还通过在20 nM ParB存在下在荧光实验中测试相同的DNA构建体，确认了单链系留的DNA可以在这种取向下有效地凝聚(补充图S8A - C)。在DNA 被ParB凝聚后，我们通过添加1 mM的所有四种核糖核苷三磷酸启动RNA转录(图6C)。

引人注目的是，我们观察到尽管存在parS和ParB，RNA聚合酶(RNAP)分子仍能够沿着DNA高效转运，对平均持续合成能力或无停顿延伸速率几乎没有影响(分别见图6D和图S8D)。即使在 ParB的情况下，持续合成能力也未受影响(图6D)，这表明ParB:DNA簇不会充当转录障碍。仅在 ParB时可检测到平均转录速度降低 (从降至，平均标准误，图6E)。值得注意的是，平均速度的降低是由于停顿概率增加，而延伸速率保持不变(分别见补充图S8E、D)。更具体地说，转录停顿的概率停留时间分析(补充图S8F)表明，长停顿的概率增加，而短基本停顿保持不变(补充图S8F、G)(36,37)，并且表明ParB:DNA凝聚物导致(可逆的)RNAP回溯增加(37)。

虽然RNA转录明显不受ParB存在的影响，但可以设想相反的情况，即DNA凝聚在转录过程中分解，因为RNAP可能会破坏ParB-ParB桥或使ParB蛋白从DNA上脱离。为了研究这一点，我们使用荧光DNA拉伸测定法实时观察转录对ParB:DNA簇的影响(图6F)。为此，我们构建了一个38 kb DNA ，其在parS位点下游1 kb处包含一个T7A1启动子(见材料与方法；补充图S9A)。我们使用TMR标记的ParB(ParBTMR)和Alexa647标记的RNAP(RNAP Alexa647，补充图S9B)进行观察。我们观察到在无转录的RNAP存在下，25 nM ParB能有效使DNA凝聚(补充图S9C、D)。当我们随后在ParB存在下启动RNAPAlexa647转录时，我们同时观察到了高效转录和DNA凝聚(图6G)，这与单分子磁镊实验结果一致。在端到端连接长度较长和较短时，RNAP似乎都能转运，与簇的存在无关(图6G，补充图S9E-H)。因此，发现RNAP转录和ParB凝聚在其相应功能上均未受影响，它们可以同时发挥作用。在我们的数据中，我们偶尔会在RNAP初始转运后观察到离散跳跃(图6G，补充图S9H)，这可能归因于动态的ParB凝聚，其可诱导凝聚区域在DNA上的大幅移动(如图2D所示)，也可能归因于RNAP引入ParB簇的超螺旋。

图6. 转录不受凝聚的ParB:DNA簇影响。(A) 单分子磁镊RNAP转录测定法。(B, C) 在不存在(B； )和存在(C； )50 nM ParB的情况下单个RNAP转录轨迹。(D) 随着ParB浓度增加的RNAP持续合成能力(平均标准误)。(E) 随着ParB浓度增加的平均RNAP速度(平均标准误)(0 nM: nM: nM: ，200 nM: )。统计分析采用不成对双尾t检验(* ；n.s. = 无显著性)。(F) 共可视化单分子荧光DNA拉伸测定法。(G) 用SxG(顶部；灰色)、ParB™R(中间；青色，25 nM)和RNAPAlexa647(底部；红色)染色的DNA 的动态图像。黄色虚线表示转录开始时RNAP的初始位置。另见图S9。

讨论

ParB分区复合物是维持细菌染色体完整性的关键组成部分。在此，我们研究了分区复合物形成起始及其维持的动力学和分子基础。我们的结果广泛描述了分区复合物形成的动力学、参与其中的ParB结构域，以及分区复合物对转录等关键生物学功能的影响。我们的研究扩展了早期的工作，早期工作在没有CTP 的情况下常常无意中聚焦于非特异性相互作用。

通过三种单分子检测方法，我们表明长DNA分子上的单个parS位点能够有效促进ParB蛋白介导的DNA凝聚。虽然先前使用较短DNA分子的研究表明需要多个parS位点(29)，但我们使用长DNA分子的MT实验和荧光DNA拉伸检测表明，单个parS位点足以实现高效的ParB加载和强大的DNA凝聚(图1)。我们推测这是由于DNA分子的长度，较长的DNA(>10 kb)比较短的DNA分子更频繁地通过聚合物的热涨落实现自发自环化。通过单个parS位点形成分区复合物与体内数据一致，体内数据表明单个parS位点在具有多个功能性ParB分区复合物特征(即荧光焦点、SMC加载、高保真染色体分离)的细菌中仍表现出未改变的表型(18,32,65,66)。

我们的单分子荧光和MT实验结果表明，ParB和DNA形成了一种非常动态的结构，其凝聚物中ParB分子数量和DNA量会发生变化，波动幅度高达 (图1，补充图S3、S4)。ParB:DNA分区的这种动态重排与凝聚物中观察到的高蛋白周转率以及DNA凝聚基础的ParB-ParB桥形成的短暂性高度吻合(图2、3)。我们的FRAP恢复数据还表明ParB蛋白在DNA分子上的周转率很高，而我们的hsAFM实验直接观察到两个ParB二聚体之间可以形成瞬时键，使远端DNA片段靠近(图3B、C、S6)。有趣的是，这些DNA环的存活时间与ParB在DNA上的停留时间大致相似(图3D以及Tišma等人的参考文献(50))。

在分子尺度上，我们的数据表明N端的CTP水解是DNA凝聚所必需的。这与之前的一项研究(29)形成对比，该研究报告称DNA凝聚不需要CTP水解和夹子打开，这可能是由于该研究中存在多个parS位点，在多个加载parS位点上成核的ParB蛋白可能会桥接并凝聚DNA，或者是由于最近报道的ParB多聚体(67)可以从不同的parS位点桥接。我们使用三种不同的N端封闭策略(非水解蛋白突变体、不可水解核苷酸和交联蛋白)的实验表明ParB在N端打开是必要的。N端的CTP水解(图4)在体内似乎也是DNA凝聚所必需的(27,28)，因为水解缺陷型ParB突变体即使有效地加载到染色体上也不能在细胞中有效地形成明亮的焦点(27)。我们的MD模拟进一步表明，这些桥的形成方式允许ParB蛋白进行局部寡聚化(图5A-D)。

瞬时性是维持ParB:DNA分配复合物的一个基本特征，这在我们的实验以及之前对质粒编码的ParB蛋白的体内研究中都得到了很好的说明(25)。我们的分子动力学模拟揭示了ParB:DNA簇的协同和高度动态性质。与通用DNA桥接可切换蛋白的计算模型一致，我们假设高瞬时性产生的凝聚物在大小上是自我限制的，并优先驱动短程接触(68,69)。这可能有助于形成不包含可能阻碍其他细胞机制的刚性结构的分配复合物。先前的研究表明，在存在或不存在CTP的情况下进行缓冲液洗涤后，ParB在DNA上的停留时间存在相当大的差异，这表明可能存在CTP交换(27,28)。正如我们之前的工作表明ParB可以处于一种开放状态，在此状态下二聚体-二聚体相互作用可以发生，(50)在此期间N端将可自由进行潜在的CTP交换。我们假设CTP分子可以在桥形成之前在ParB蛋白内进行交换，这允许ParB-ParB募集(50)和DNA凝聚(29)。

值得注意的是，我们获得的凝聚物生长的停滞力非常低，即的力，这比诸如RNA聚合酶和解旋酶等DNA加工运动蛋白的停滞力低两个数量级以上(70 - 74)，这些蛋白分别可以施加高达25 pN(72)和35 pN(70)的大力。由于在如此高的力作用下DNA机制会将任何ParB夹子从DNA上剥离，一个具有高周转率的动态蛋白质网络确保维持ParB:DNA分配复合物。事实上，我们的数据表明RNAP和ParB可以同时分别执行它们各自的功能，即转录和DNA凝聚(图6)。我们推测这两个过程之间动力学的差异对于使它们能够共同发挥功能很重要。虽然RNAP转录很慢(体外 (本工作以及Janissen等人(36))，体内约70 nt/s(75))，但ParB蛋白在数分钟内表现出快速且动态的加载、扩散以及长达数十千碱基的DNA凝聚。ParB-DNA分配复合物的持续动态重塑可能是维持被困在分配复合物中的基因组部分中基因的不间断RNA转录所必需的。在复制周期中，复制机制可能也是如此。

先前关于质粒编码的ParB蛋白的报道显示parS位点附近的基因表达受到抑制(58,60,62)，而最近的报道表明parS位点周围的基因表达不受影响(30,58,76)。基于我们的单分子RNAP结果，我们假设所报道的转录抑制(58,60 - 64)可能是由于在RNA聚合酶需要进入启动子的起始阶段，RNA聚合酶被限制过多地接触紧密堆积的ParB:DNA复合物。

根据我们的研究结果，我们提出了一个模型，其中DNA-ParB分配复合物由DNA-ParB和ParB-ParB相互作用引发(图7):ParB二聚体通过结合两个CTP分子加载到parS位点上，随后它们作为夹子从parS位点扩散离开(图7B)(4,27,28)。在扩散过程中，ParB通过其C末端通过非特异性相互作用与DNA结合(图7C)。当两个CTP分子水解后，ParB二聚体在N末端打开(图7D)，此时(28)它能够连接到远端DNA片段上的另一个ParB二聚体，从而形成一个瞬时DNA环(图7E)。随后，ParB可以形成寡聚体，导致形成更大的簇(图7F)，即使在最初的桥破坏后(图7G)，这些簇随着时间的推移也是稳定的。之前关于枯草芽孢杆菌ParB扩散的研究表明，水解后在解离发生之前可能存在一个与DNA残余结合的时期(50)，因此水解后的开放夹子ParB可能仍会在DNA上停留一段时间并连接到第二个二聚体(Taylor等人(21)和Fisher等人(20)也提出了这一点)。在分配复合物中存在大量ParB蛋白的情况下(Lim等人(10)和Guilhas等人(25)报道约有400 - 800个分子)；ParB-ParB桥的持续出现将允许维持亚稳态分配复合物。这种桥的内在瞬时性将允许细胞机制在其各自的功能中不受影响。对ParB:DNA复合物与DNA复制/RNA转录机制之间相互作用的进一步体内研究可以进一步阐明ParB-DNA分配复合物的动态结构及其在染色体分离中的重要作用。

图7. 通过N末端结构域的动态ParB-ParB桥接模型。(A)ParB:DNA簇的示意图，其中少数ParB-ParB桥维持DNA凝聚物。(B-F)ParB蛋白(蓝色)经历的假设事件时间线。(B)ParB蛋白在parS位点加载并通过N末端二聚化形成DNA夹子(4,48)。(C)ParB失去对parS位点的亲和力并沿DNA扩散(26 - 28)。(D)CTP水解后，ParB夹子在N末端打开(48)，但(E)通过其C末端结构域仍与DNA结合(50)，与另一个开放夹子形成ParB-ParB桥。这个桥通过它们可及的N末端形成。(F)这种相互作用允许通过二聚体的多聚体模式进行寡聚化，随着时间的推移可以稳定凝聚物。(G)一段时间后，桥可以破坏，允许ParB从DNA上解离或连接到新打开的ParB夹子，从而维持图A中所示的流体ParB:DNA凝聚物。

数据可用性

所有数据都可在正文或补充材料中获取。分子动力学模拟中使用的代码是开放获取的，并存储在https://git.ecdf.ed.ac.uk/taplab/ parbcondensation。所有实验的原始数据可根据相应作者的要求提供。

补充数据

补充数据可在NAR在线获取。

致谢

我们感谢Brian T. Analikwu进行的有益讨论。

作者贡献:概念构思:M.T., S.G., C.D.；荧光实验:M.T., T.B.；形式分析:M.T., R.B.；磁镊实验与分析:R.J.；原子力显微镜实验与分析:A.M.G.；蛋白质纯化:H.A.；DNA构建体与克隆:M.T., J.vd.T.；分子动力学模拟:D.M.；可视化:M.T., D.M.；资金获取:D.M., S.G., C.D.；监督:D.M., S.G., C.D.；撰写 - 原始草案:M.T., C.D.；撰写 - 审阅与编辑:所有作者。