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作为治疗乙酰胆碱受体抗体阳性重症肌无力的新策略，选择性清除自身反应性浆细胞

发布时间：

2026-05-21 21:26

作为治疗乙酰胆碱受体抗体阳性重症肌无力的新策略，选择性清除自身反应性浆细胞

德国柏林自由大学和柏林洪堡大学的企业成员，柏林夏里特大学医学中心风湿病与临床免疫学系 | 德国莱布尼茨研究所德国风湿病研究中心(DRFZ)，柏林，德国 | 赛诺菲研发部，免疫与炎症治疗研究领域，法国维特里 - 苏尔塞纳德国柏林自由大学和柏林洪堡大学的企业成员，柏林夏里特大学医学中心神经学与实验神经学系，柏林，德国德国比伯拉赫萨纳诊所神经学系，比伯拉赫，德国 | 希腊雅典希腊巴斯德研究所免疫学系 I 德国柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心，MDCell亥姆霍兹创新实验室，柏林，德国 I 8德国柏林自由大学和柏林洪堡大学的企业成员，柏林夏里特大学医学中心神经科学临床研究中心，柏林，德国 | 9德国柏林自由大学和柏林洪堡大学的企业成员，柏林夏里特大学医学中心柏林中风研究中心，柏林，德国

通信作者:拉莱·霍达达迪(Laleh.khodadadi@drfz.de) | 安德烈亚斯·迈泽尔(andreas.meisel@charite.de) | 法尔克·希佩(falk.hiepe@charite.de)

收到日期:2025年9月8日 | 修订日期:2026年2月18日 | 接受日期:2026年2月23日

关键词:自身反应性浆细胞；自身免疫；重症肌无力；选择性清除

摘要

重症肌无力(MG)是一种慢性自身免疫性疾病，由针对神经肌肉接头的自身抗体介导，导致肌肉无力。尽管存在不同特异性的自身抗体，但大多数MG患者具有针对烟碱型乙酰胆碱受体(AChR)的自身抗体，特别是针对亚基的细胞外结构域(αECD)，其包含主要免疫原性区域(MIR)。在此，我们展示了一种选择性清除分泌针对 ECD自身抗体的浆细胞的原创方法。一种由与hAChR αECD(αECD)偶联的抗hCD38抗体组成的抗体介导细胞毒性衔接器(ACE)被用于在体内选择性清除hAChR αECD特异性细胞。致病细胞的减少伴随着抗体滴度降低、MG疾病评分降低、握力保护和体重维持。值得注意的是，对hAChR αECD无特异性的抗体分泌细胞未受影响。ACE治疗动物中MG病理的改善突出了αECD抗体在MG发病机制中的决定性作用以及这种新治疗策略的临床相关性。

缩写: ECD，乙酰胆碱受体亚基的胞外域； ECD，乙酰胆碱受体亚基的胞外域；AChR，乙酰胆碱受体；抗hCD38/ ECD-ACE，抗hCD38/ ECD抗体介导的细胞毒性衔接子；ASC，抗体分泌细胞；B，生物素；hCD38-B3/2，转染到人抗人AChR ECD分泌性B3/2(GFP+)杂交瘤细胞中的人CD38；hCD38-D6，转染到人抗人AChR aCED分泌性D6(GFP-)杂交瘤细胞中的人CD38；IgG，免疫球蛋白G；LLPC，长寿浆细胞；MIR，主要免疫原性区域；MG，重症肌无力；NSG-Hc1，NOD.Cg-Hc Prkd

拉莱·霍达达迪和黛博拉·普佩为共同第一作者。

本文是一篇根据知识共享署名许可协议条款发布的开放获取文章，允许在任何媒介中使用、分发和复制，前提是对原始作品进行适当引用。

1 | 引言

重症肌无力(MG)是一种典型的抗体介导的自身免疫性疾病，影响神经肌肉接头(NMJ)处的信号传递，其特征为骨骼肌易疲劳和无力[1]。在大约85%的患者中，自身抗体的主要靶标是乙酰胆碱受体(AChR)。不太常见的自身抗原包括肌肉特异性激酶(MuSK)和低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)[2]。AChR是一种五聚体跨膜蛋白，在成年人中化学计量比为 [3]。抗体与胞外域结合会导致亚基和之间配体结合位点的空间位阻抑制、抗原调制以及肌肉终板的补体依赖性降解[2]。亚基的胞外域( ECD)在MG发病机制中起主要作用，因为它在氨基酸残基67 - 76处包含主要免疫原性区域(MIR)[4]，并且被三分之二的AChR特异性抗体识别[5]。其朝向突触间隙的可及位置以及每个受体存在两个MIR使得该亚基易于与抗体有效结合并随后进行抗原调制，这解释了α亚基的免疫原性潜力[6]。最近的一项荟萃分析指出MG患者中自身抗体水平与疾病活动之间存在正相关[7]。然而，抗体滴度是否能指导治疗决策仍存在争议。抗MIR抗体滴度已被认为是疾病严重程度的预测指标[8]。这些数据表明AChR αECD抗体在MG发病机制中起关键作用，使其以及分泌它们的细胞成为潜在治疗靶点。

传统上，MG被认为是一种需要终身免疫抑制治疗的慢性疾病。目前，MG患者通过胸腺切除术、乙酰胆碱酯酶抑制剂、皮质类固醇、免疫抑制剂和血浆置换进行治疗，所有这些疗法都是对症治疗[1]。针对补体、新生儿Fc受体以及一般所有B细胞和浆细胞的疗法是更先进的治疗策略[9]。例如，用抗CD38抗体(如达雷妥尤单抗)靶向浆细胞在抗体介导的风湿性和神经疾病中已显示出有前景的结果[10]。然而，这种对浆细胞的一般性清除也会清除保护性浆细胞，导致体液免疫记忆丧失和免疫缺陷[10]。最近，针对CD19的CAR-T细胞疗法已在难治性MG患者中诱导出持续缓解[11]。

本文描述了一种根据浆细胞分泌的(致病)抗体的特异性来选择性消融浆细胞的新策略。我们使用抗体介导的细胞毒性衔接器(ACEs)在体内用感兴趣的抗原标记浆细胞。分泌特定抗体的浆细胞将被补体介导的和由其自身抗体靶向它们的细胞毒性所消融，这些抗体在分泌后重新定位到它们的表面[12, 13]。

在此，我们在人源化MG小鼠模型中证明了这一概念用于治疗MG的可行性，该ACE由与AChR的偶联的CD38特异性抗体组成。在该模型中，选择性消融分泌αECD特异性抗体的细胞足以显著改善MG症状。

2 | 结果

2.1 | 转移产生抗 ECD抗体的细胞在NSG-Hc1小鼠中诱导出类似MG的症状

为建立人源化MG小鼠模型，我们将分泌抗hAChR ECD抗体的 (hD6)杂交瘤细胞或分泌抗hAChR ECD抗体的hCD38-B3/2(hB3/2)杂交瘤细胞静脉注射到免疫缺陷的NSG-Hc1小鼠体内(图1A)。NSG-Hc1是NSG(NOD-scid IL2r )小鼠的免疫缺陷衍生物，但其补体系统仍然完整[14]。

根据受体小鼠中抗 ECD或抗 ECD IgG抗体的表达来确定转移细胞的植入情况，随着时间的推移，受体小鼠中总IgG抗体的滴度不断增加，这些抗体来自各自的杂交瘤细胞系(图1B)。在注射分泌抗hAChR ECD抗体的hCD38-D6细胞的小鼠中，但在注射hB3/2细胞的小鼠中未出现这种情况，这种增加伴随着在转移后第21天至28天之间体重和握力的显著下降以及疾病评分和死亡率的增加(图1C - F)。由于接受hD6细胞的小鼠疾病发展严重，一些小鼠死亡或不得不被处死(图1F)。这些结果证实了hD6和hB3/2杂交瘤细胞成功植入小鼠体内，以及hD6分泌的抗抗体的致病作用，这些抗体显然足以在小鼠中诱导出类似MG的症状。

2.2 | 抗hCD38/αECD-ACE对细胞的体外和体内标记

为了选择性地靶向分泌抗抗体的细胞，我们设计了一种抗hCD38/ 抗体介导的细胞毒性衔接器(抗hCD38/αECD-ACE)(图2A)，用 ECD抗原展示表达hCD38的细胞，以便通过 ECD特异性抗体介导的细胞毒性进行消融。通过ELISA确认抗hCD38/ ECD-ACE分子的完整性。用人类αECD特异性D6抗体包被平板，以捕获抗hCD38/ ECD-ACE的 ECD结构域。用抗人IgG抗体检测结合的抗hCD38。单独的各个组分，抗hCD38/SA和αECD/生物素，在ELISA中未显示信号。用人类βECD特异性B3/2抗体作为包被不能结合抗hCD38/ ECD-ACE(图2B)。在使用亲本NSG品系的第二个独立实验中证实了疾病诱导(图S3)。

抗人CD38/ 胞外区-ACE能够在体外标记人CD38阳性的D6细胞。在用终浓度为的抗人CD38/ -ACE对细胞进行体外标记后，人CD38特异性抗体、链霉亲和素(SA)、α胞外区结构域和生物素等所有成分在表达人CD38的细胞表面均可检测到(图2C)。在用抗人CD38/ ACE对细胞进行体内标记的实验中，将其注射到移植了杂交瘤细胞的小鼠体内，15天后进行检测。在静脉注射抗人CD38/α胞外区-ACE后分离细胞，并对ACE的成分进行染色(图2D)。从小鼠骨髓或脾脏中分离出的GFP hB3/2细胞上，可检测到与体外标记水平相当的抗人CD38和抗原(图2E)，这证实了抗人CD38/ 胞外区-ACE在体内的完整性和结合能力。

图1 | 抗乙酰胆碱受体抗体阳性全身型重症肌无力的人源化小鼠模型(NSG-Hc1 MG小鼠)。(A) 动物实验设计。免疫缺陷的NSG-Hc1小鼠分为两组，静脉注射或hCD38-B3/2 杂交瘤细胞。通过(B)杂交瘤细胞分泌的抗IgG抗体浓度体重握力疾病评分以及每组的存活率来评估NSG-Hc1 MG小鼠的诱导情况。数值以平均值表示，仅包括在各个时间点存活的动物。使用Mann-Whitney 检验(D)、限制最大似然分析或对数秩检验进行统计分析。如生存曲线所示，几只hCD38-D6小鼠达到预定终点，并根据LAGeSo批准的终点方案在第天天天天天和天实施安乐死。因此，所示数值仅代表在每个相应时间点存活的动物。hCD38-D6，转染人CD38的分泌抗人AChR αECD的D6(GFP )杂交瘤细胞；hCD38-B3/2，转染人CD38的分泌抗人AChR ECD的B3/2(GFP+)杂交瘤细胞。

为了评估作为ACE一部分注射 ECD是否会导致人源化NSG-Hc1 MG小鼠的滴度降低，小鼠静脉注射50、100或自身抗原(图S4A)。在注射100和后观察到抗体浓度短期降低；然而，滴度在内完全恢复(图4B)。

2.3 | 体内选择性清除分泌 ECD特异性抗体的细胞可预防MG样症状的发展

在两项独立的体内实验(图3和图4)中评估了抗人CD38/ ECD-ACE的治疗效果，实验按照德国动物福利法规和3R原则进行。两项实验的总体研究设计一致，在第二项实验中进行了一些细微改进，以满足终点要求并通过分离和细胞来优化注射程序。在第一项实验中，将hB3/2 和hD6 杂交瘤细胞静脉内共移植到NSG-Hc1小鼠中。两种细胞类型显示出相当的抗体分泌率和CD38表达(图S1A，B)。移植后6天，小鼠每周两次接受PBS中的抗人CD38/ ECD-ACE( ，静脉注射)，持续2周，然后在研究终止前2天给予最终剂量(4mg/kg，静脉注射)(图3A)。在ACE治疗组和对照组中随时间监测 ECD和 ECD特异性抗体的血清浓度。抗 ECD抗体滴度在各组之间没有显著差异(图3D)。相反，ACE治疗显著抑制了抗 ECD抗体滴度的发展(图3B，C)。这些发现表明，抗体分泌细胞消融对hD6细胞具有选择性，而hB3/2细胞未受影响。hD6细胞的消融还与补体激活有关，血清C3显著降低和C5a水平升高表明C5激活(图3E，F)。

为了直接评估hD6细胞与hB3/2细胞的选择性消融，在转移后第23天(最后一次治疗后2天)分离脾细胞并进行体外分析。两种细胞类型(hD6和hB3/2)基于人CD38表达进行门控，hB3/2细胞通过GFP表达与hD6进一步区分(图S2)。ACE治疗导致脾脏中hD6细胞的耗竭，而hB3/2细胞数量没有受到显著影响(图3G)。

图2 | SA/生物素偶联的抗人CD38/αECD-ACE的完整性评估。(A) SA/生物素偶联的抗人CD38/αECD-ACE的示意图结构。抗人CD38/αECD-ACE的完整性分析通过以下方式确认:(B) 通过用抗αECD(D6)和抗βECD(B3/2)抗体包被并用人抗IgG检测的ELISA，以及(C) 用5μg抗人CD38/αECD-ACE以最终浓度对细胞进行体外标记，并通过流式细胞术检测抗体(抗人CD38和SA)和抗原(αECD和生物素)的两种成分。(D) 通过静脉注射抗人CD38/αECD-ACE证明hCD38-B3/2(GFP+)细胞体内标记的实验设计。(E) 直方图表示移植到NSG- 小鼠(每组 )中的hCD38-B3/2(GFP )在脾脏和骨髓中的细胞体内标记以及抗体和抗原部分的检测。抗人CD38/αECD-ACE，抗人CD38/αECD-抗体介导的细胞毒性衔接子；hCD38-B3/2，转染人CD38的分泌小鼠抗人AChR ECD的B3/2(GFP+)杂交瘤细胞。

在骨髓中，hD6细胞数量减少了66%，但这并不代表显著的耗竭，可能反映出与脾脏相比其植入率高十倍。此外，在最后一次注射后2天内细胞快速增殖导致抗hCD38/ ECD - ACE标记不足，这也可能是一个因素(图3H)。

与ACE处理的小鼠中抗抗体滴度显著降低一致，这些小鼠保留了握力，没有明显的疾病表现，并且与未处理的对照组相比体重增加(图3I - K)。总之，这些发现表明， ECD - ACE对 ECD特异性抗体分泌细胞的选择性消融有效地消除了MG病理的致病驱动因素。

在第二个独立实验中重复了该处理，该实验旨在解决杂交瘤聚集和旁观者耗竭的问题；hB3/2和hD6细胞分别注射(图4A)。用抗hCD38/ ECD - ACE(8 mg/kg，静脉注射，每周两次)处理小鼠，并在最后一剂后1天处死。与初始试验相比，这种改良方法改善了脾脏和骨髓中细胞的耗竭(图4B，C)。然而，在该实验中更高比例的 D6细胞植入(图S1B，C)，呈指数级扩增并逃脱靶向，尽管进行了处理，但仍导致低但可检测到的抗 ECD抗体滴度(图4D，E)，而抗 ECD不受影响(图4F)。ACE处理改善了疾病评分和体重(图4G，H)，但残留的抗 ECD滴度与轻度病理相关，包括体重减轻和握力降低(图4I)，这与hCD38 D6细胞诱导的疾病一致。

3 | 讨论

在本研究中，我们首次能够证明，作为自身抗体介导疾病的一种新型治疗策略，使用MG的人源化小鼠模型以抗原特异性方式选择性清除致病浆细胞的疗效。长寿浆细胞(LLPCs)持续分泌致病自身抗体并抵抗传统免疫抑制药物和B细胞靶向疗法[15]，已成为抗体介导疾病治疗干预的主要焦点。已经探索了几种策略，包括用抗胸腺细胞球蛋白进行免疫消融，然后进行自体干细胞移植[1]，蛋白酶体抑制剂如硼替佐米[9]，或T细胞衔接器[16]。用抗CD38单克隆抗体对浆细胞进行通用靶向在包括MG在内的神经自身免疫疾病中也显示出有效性[1, 10]。最近，针对BCMA的CAR - T细胞已在MG患者中进行测试，导致致病自身抗体持续耗竭并临床改善[17]。然而，这些方法缺乏自身反应性浆细胞的选择性，并且存在体液免疫缺陷的风险，需要进行免疫球蛋白替代。其他靶向疗法，如补体C5抑制剂和新生儿Fc受体抑制剂，已用于MG患者[9]，但其特异性仍然不足。一种使用工程化识别自身抗原特异性B细胞的CAR - T细胞的替代方法在自身免疫疾病如NMDAR脑炎的小鼠模型中显示出有希望的结果[18]。尽管这种方法特异性靶向特定B细胞，但它没有解决LLPCs的问题。

图3 | 在人源化NSG-Hc MG小鼠中使用抗hCD38/aECD-ACE选择性清除aCEO特异性杂交瘤细胞。(A)动物实验设计:免疫缺陷的NSG-Hc1小鼠静脉注射的hCD38-B3/2(绿色荧光蛋白阳性)和的hCD38-D6(绿色荧光蛋白阴性 )细胞。小鼠分为两组:载体组和治疗组，治疗组每周静脉注射抗hCD38/aCED-ACE两次，共2周，然后在最后一次治疗前进行分析前的最后一次治疗将剂量降至4 mg/kg，分析在最后一次治疗后2天进行。通过血清水平评估治疗效果:(B)抗 ECD抗体的IgG、(C)抗 ECD抗体的IgG2b、(D)抗 ECD抗体的IgG、(E)补体C3和(F)补体C5a。在第23天进行流式细胞术分析，以分析ACE处理组和载体处理组小鼠的(G)脾脏和(H)骨髓中hCD38 绿色荧光蛋白 (βECD特异性B3/2细胞)和hCD38 绿色荧光蛋白 (aCED特异性D6细胞)的细胞数量。通过(I)疾病评分、(J)握力测试(以克为单位)和(K)体重(%)评估疾病结果。统计学分析:(B - G)、(I - K)(第14天分析)采用双向方差分析，(G)和(H)采用曼-惠特尼检验，数值为平均值标准差。hCD38-D6；转染人CD38的分泌抗人AChR aCED的小鼠D6(绿色荧光蛋白 )杂交瘤细胞，hCD38-B3/2；转染人CD38的分泌抗人AChR βECD的小鼠B3/2(绿色荧光蛋白 )杂交瘤细胞，抗hCD38/αECD-ACE:抗hCD38/αECD抗体介导的细胞毒性衔接子。

为了克服这一局限性并能够靶向自身反应性长寿浆细胞而不广泛消融浆细胞，我们开发了一种治疗策略，该策略能够以(自身)抗原特异性方式清除分泌致病性自身抗体的浆细胞[12, 13]。为了验证这一概念，我们构建了MG的人源化小鼠模型，并证明了这种创新治疗方法的可行性。将工程改造为表达hCD38的、对AChR的和特异的杂交瘤细胞共移植到免疫缺陷的NSG-Hc1小鼠中。单克隆抗体D6与人的65 - 78位残基结合，该区域位于主要免疫原性区域(MIR)内[19]，并在体内与小鼠AChR发生交叉反应[20]，导致受体丧失和疾病症状。过继转移分泌抗 ECD的细胞会诱发MG样症状，包括体重减轻、握力下降、血清抗体滴度升高和疾病评分升高。相比之下，尽管针对的抗体滴度升高，但转移βECD特异性细胞(克隆B3/2)并未诱发症状。这种效应可能不仅仅归因于抗抗体的亲和力还归因于其IgG2b亚型，该亚型在小鼠中强烈激活补体，而特异性抗体是补体固定作用较弱的IgG1亚型。

用抗人CD38/ ECD抗体介导的细胞毒性衔接子进行治疗可有效预防NSG-Hc1-MG小鼠发病，使治疗组动物保持无症状状态，而用赋形剂处理的小鼠体重显著减轻，疾病评分恶化。抗人CD38/ ECD-ACE治疗显著降低了抗 ECD抗体滴度，而抗 ECD滴度未受影响，表明抗 ECD分泌性杂交瘤细胞被选择性清除。到第23天时抗 ECD滴度略有上升，可能反映了hCD38杂交瘤细胞的持续存在或给药剂量降低后残余hCD38+细胞的再生。流式细胞术分析证实hD6细胞被选择性清除，而对hB3/2细胞影响最小，这可能是由于这些杂交瘤细胞的聚集。残余的hD6细胞以非分泌变体形式存在或hCD38下调后持续存在，使其对hCD38/αECD-ACE不敏感，并能够诱发轻度疾病。这种效应在重复实验中尤为明显，在该实验中注射的D6细胞中CD38-细胞比例更高，突出了基于杂交瘤的诱导模型的局限性。相比之下，天然存在的浆细胞稳定表达CD38，在骨髓中仅形成松散聚集体[21]，降低了持续性自身反应性长寿浆细胞对保护性免疫产生脱靶效应的风险。

图4 | 在人源化NSG-Hc MG小鼠中使用抗人CD38/αECD-ACE重复选择性清除αECD特异性杂交瘤细胞。(A)动物实验设计:免疫缺陷的NSG-Hc1小鼠静脉注射1.5 hCD38-D6(GFP )，然后在接下来的第天静脉注射hCD38-B3/2(GFP+)细胞。小鼠分为两组:赋形剂组(n = 5)和治疗组(n = 6)，治疗组每周两次静脉注射8 mg/kg抗人CD38/αECD-ACE，共两周半。在第22天进行流式细胞术分析，以分析ACE处理组和赋形剂处理组小鼠的(B)脾脏和(C)骨髓中hCD38+GFP+( 特异性B3/2细胞)和hCD38*GFP( αECD特异性D6细胞)的细胞数量。通过(D)抗αECD抗体的血清IgG水平、(E)抗αECD抗体的IgG2b水平、(F)抗βECD抗体的IgG水平、(G)疾病评分、(H)体重(%)和(I)握力测试(以克为单位)评估治疗效果。统计学分析:(B)和(C)采用Mann-Whitney U检验，(D-I)采用双向方差分析，数值为平均值标准差。抗人CD38/αECD-ACE；抗人CD38/αECD抗体介导的细胞毒性衔接子；hCD38-D6；转染人CD38的分泌抗人AChRαECD的小鼠D6(GFP )杂交瘤细胞，hCD38-B3/2；转染人CD38的分泌抗人AChRβECD的小鼠杂交瘤细胞。

在重症肌无力(MG)中，短寿命和长寿命浆细胞分泌的针对乙酰胆碱受体(AChR)的自身抗体在导致信号转导受损以及随后的肌肉无力和疲劳方面起着核心作用[1,2]。尽管抗AChR抗体水平并不总是与疾病严重程度相关，但临床改善通常与抗体水平降低有关[22]。针对人AChR的胞外结构域(ECD)的抗体在动物模型中诱导MG的能力特别强[23]。这种效应可能是由于该结构域的高免疫原性，尤其是主要免疫原区域(MIR)[4,24]。还表明，单独静脉注射可溶性形式的可通过诱导耐受有效抑制大鼠正在进行的实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)[25]。在这种情况下，可以想象，抗hCD38/ ECD-ACE不仅可以通过已证明的自身反应性浆细胞(ASC)耗竭，而且在有限程度上通过其抗原部分中和循环抗体，从而有助于降低测得的自身抗体滴度。然而，此处进行的短期抗原注射实验表明，仅进行掩盖只会导致血清自身抗体水平短暂且最小程度的降低，并且无法重现靶向浆细胞所观察到的持续临床益处。总之，这些结果强调了 ECD靶向疗法通过特异性解决致病性浆细胞并降低抗体介导的细胞毒性可及的致病性抗体水平来治疗自身免疫性疾病的潜力。

与现有的针对浆细胞的治疗策略相比，本方法在靶标特异性和浆细胞耗竭广度方面均有很大不同。已证明，针对CD19的疗法可消除约的浆细胞，主要是那些来自滤泡外和慢性二次免疫反应的浆细胞，同时保留生发中心反应期间产生的长寿命CD19-浆细胞[26]。相比之下，此处描述的自身抗原导向策略能够耗竭CD19+和CD19-致病性浆细胞。靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的策略，如双特异性抗体teclistamab，可诱导快速且深度的浆细胞耗竭。然而，它们也会导致B细胞谱系和浆细胞区室的广泛消融，经常导致体液免疫缺陷，因此需要进行免疫球蛋白替代疗法[16,27]。相比之下，本方法旨在选择性消除自身抗原特异性浆细胞，同时保留非致病性浆细胞和保护性体液免疫，支持了该策略作为全谱系浆细胞消融的精准替代方法的潜力。

由于每个模型只能涵盖人类疾病的某些方面，我们承认该研究存在几个局限性。首先，值得注意的是，我们治疗的疗效可能受自身抗体亚类的影响。因此，使用来自杂交瘤细胞的单克隆抗体可能无法完全代表MG患者的多克隆抗体反应。然而，在MG中，抗AChR抗体主要是IgG1和IgG3，它们是人类补体系统的有效激活剂，这就是为什么C5补体抑制非常有效的原因[9]。因此，这种治疗方法在AChR-MG中可被认为相当有效。其次，由于杂交瘤细胞快速且呈指数增殖，治疗在早期(第6天)开始，这可能无法准确反映患者疾病进展。由于我们的小鼠模型不能完全复制人类自身免疫过程，小鼠中杂交瘤细胞的快速生长与人类中自身免疫细胞生成较慢相比，可能会影响治疗时机和频率。

由于我们的治疗方法仅限于浆细胞，而不靶向其祖B细胞，当自身反应性B细胞重新激活时，存在新的自身反应性浆细胞复发的潜在风险。为防止这种情况，靶向自身抗原特异性B细胞的联合方法可能具有互补性。我们在本研究中使用了链霉亲和素-生物素偶联系统；然而，需要使用替代系统来开发与临床应用兼容的抗体介导的细胞毒性衔接子。

总之，我们的研究表明，在MG人源化小鼠模型中，通过抗hCD38/ ECD-ACE实现抗 ECD抗体分泌细胞的选择性耗竭，可有效控制MG症状，同时保留抗hAChR ECD对照细胞。因此，这种方法代表了一种针对以抗体介导病理为特征的自身免疫性疾病的有前景的治疗策略，因为它特异性地靶向介导疾病的产生自身抗体的hCD38+细胞。重要的是，它不仅耗尽炎症组织中的短命浆细胞，还靶向骨髓中对治疗有抗性的长寿浆细胞，可能降低疾病复发率。此外，该治疗维持了保护性免疫，表明与广泛的免疫抑制相比副作用风险降低。因此，这种新型治疗方法正引领着自身免疫性疾病安全且针对自身抗原的治疗方向。

4 | 数据局限性与展望

本研究的一个局限性在于聚焦于小鼠模型，该模型无法完全重现人类自身免疫性疾病重症肌无力的复杂性和异质性。特别是，分泌抗体的杂交瘤细胞的增殖导致治疗窗口狭窄，并限制了对治疗持久性和致病浆细胞从前体区室再生的长期评估。另一个局限性是，由于hCD38阴性杂交瘤细胞的作用，可能会低估治疗效果，而抗hCD38/ ECD-ACE并未针对这些细胞。

在NSG-Hc1小鼠中进行了体内实验，以克服亲代NSG小鼠已知的C5补体缺陷。虽然NSG-Hc1小鼠保留了功能性补体活性，但它们缺乏适应性免疫，且免疫效应功能严重受损[14]，使得自然杀伤(NK)细胞和T细胞介导的机制不太可能发挥作用。因此，本研究中观察到的清除效率可能低估了该方法的全部治疗潜力，因为在这些条件下抗体依赖性细胞毒性(ADCC)无法发挥作用。相应地，补体依赖性细胞毒性被认为是浆细胞清除的主要机制，这与体外证实的补体介导的细胞毒性活性一致[12]。

虽然在讨论中提供了与已确立的靶向CD19和B细胞成熟抗原(BCMA)的疗法的详细比较，但本策略是在免疫受限的环境中评估得出的，因此需要在具有免疫活性的临床相关模型中进行验证，以充分评估其转化潜力。所有动物实验均按照德国动物福利法规和3R原则进行。伦理限制限制了动物数量和实验范围，可能会降低统计效力，同时确保符合严格的伦理标准。

5 | 材料与方法

5.1 | 蛋白质、细胞系及抗人CD38/抗AChR αECD-ACE

5.1.1 | 重组 1-ECD(人乙酰胆碱受体 ECD； ECD)的生产

人乙酰胆碱受体亚基的细胞外结构域(ECD)发生突变，其半胱氨酸环被来自椎实螺的乙酰胆碱结合蛋白的半胱氨酸环所取代，该结构域在毕赤酵母中作为可溶性分泌多肽表达。如前所述[28]，使用C端6xHis标签通过金属亲和色谱法进行纯化，随后进行尺寸排阻色谱法。

5.1.2 | 抗人CD38抗体(抗hCD38)的制备

抗人CD38抗体的可变区(VH和VL)源自赛诺菲的专有序列。抗人CD38抗体中使用了包含NNAS突变[29]的恒定Fc结构域序列来中和Fc介导的细胞毒性活性。具有无活性NNAS IgG1 Fc的抗人CD38抗体已在CHO细胞(瑞士Evitria)中产生。为确保抗体无活性，我们进行了体外细胞毒性测定，并将其与达雷妥尤单抗(杨森公司)进行比较。我们的结果显示，含有无活性Fc区域的抗人CD38抗体无补体活性，而达雷妥尤单抗表现出显著的细胞毒性(未发表)。

5.1.3 | 抗人CD38/ 胞外区抗体介导的细胞毒性衔接子(抗人CD38/ 胞外区-ACE)的制备

抗人CD38/ ECD-ACE被设计为一种由两个组件组成的构建体:(a)一种抗人CD38抗体，可标记所有浆细胞，包括保护性和自身反应性细胞；(b) ECD抗原，用于仅选择抗 ECD特异性浆细胞。在本研究中，采用链霉亲和素-生物素偶联进行蛋白质偶联。使用LYNX链霉亲和素抗体偶联试剂盒(Bio-Rad)将具有无活性NNAS IgG1 Fc序列的抗人CD38抗体与链霉亲和素(SA)偶联。按照制造商的方案，使用LYNX Rapid Plus生物素抗体偶联试剂盒(Bio-Rad)将人乙酰胆碱受体 ECD抗原与生物素连接。为了将抗体与抗原偶联，将抗人CD38-SA和αECD-生物素以1:6的摩尔比混合，并在室温下孵育至少15分钟后使用。通过ELISA和流式细胞术评估抗人CD38/ ECD-ACE的完整性。

5.2 | 细胞系和hCD38转染

分泌小鼠抗人乙酰胆碱受体 ECD的杂交瘤细胞(克隆D6)和分泌小鼠抗人乙酰胆碱受体 ECD的杂交瘤细胞(克隆B3/2)由柏林重症肌无力社区慷慨捐赠。本研究中进行的同型鉴定确定抗抗体(D6)为IgG2b，抗 ECD抗体(B3/2)为IgG1。

为了生成人源化模型，我们使用两种不同的方法将hCD38转染到小鼠杂交瘤细胞中，其中一种含有绿色荧光蛋白(GFP)。通过用携带hCD38序列(ENA|BAA18964|BAA18964.1智人(人类)CD38)的载体进行电穿孔，侧翼为pT4序列[30](在计算机上设计并由BioCat生产)和SB100X RNA[31]，生成表达hCD38的D6细胞系。使用HighYield T7 RNA合成试剂盒(耶拿生物科学公司)，使用含有侧翼为5’HBB UTR、3’HBB UTR和90 nt聚腺苷酸尾的SB100X序列的载体进行SB100X RNA生产，该载体通过Spel和Bbsl限制酶(NEB)线性化，并在RNA合成前用Mag-Bind Total Pure NGS磁珠(Omega Biotek)纯化。使用相同的磁珠纯化生成的RNA，并保存在。使用Lonza 4D Nucleofector和P3原代细胞试剂盒(Lonza)以及程序CA-158对细胞进行电穿孔。通过用抗人CD38-AF488(Biolegend，克隆HIT2)染色并使用FITC阳性选择试剂盒(Stemcell)进行选择，然后使用MAQSQuant Tyto细胞分选仪(Miltenyi)对hCD38h 细胞进行分选，富集转染细胞。对细胞进行有限稀释以生成单克隆亚细胞系。该程序由柏林MDCell(马克斯·德尔布吕克中心，Boost创新实验室)执行。

使用Neon(赛默飞世尔科技)电穿孔系统(1300 V，1脉冲，20 ms)，用线性化的pCDH-MSCV-hCD38-EF1α-GFP+Puro质粒(由赵建军馈赠(Addgene质粒#134936；http://n2t.net/addgene:134936；RRID:Addgene_134936)，编码hCD38)转染B3/2杂交瘤细胞系。转染后，细胞在下于RPMI-1640、10% FCS、P/S中孵育过夜。第二天，向培养物中加入嘌呤霉素(10 μg/mL)。七天后，通过有限稀释对转染细胞进行克隆，并使用流式细胞术分析GFP和hCD38的表达。

6 | 小鼠实验

6.1 | 小鼠

雌性NSG-Hc1(NOD.Cg-Hc Prkdc Il2rg SzJ)小鼠购自杰克逊实验室(JAX库存编号#030511)，并饲养于柏林德国风湿病研究中心的动物设施中，处于特定病原体-free条件下。所有实验均按照德国动物保护法进行，并获得当地当局的批准。在每个实验中，小鼠的年龄是匹配的。

所有动物数量均在与统计学家协商后确定，以确保有足够的统计效力，同时遵守动物保护法和3R原则。一旦获得稳健且一致的结果，就避免进一步重复实验，以防止不必要的动物使用。

6.2 | 小鼠的临床评分

握力丧失、活动能力下降和驼背姿势是在MG诱导的小鼠中观察到的主要MG样症状。在本研究中，我们使用握力计(法国Bioseb)在重复抓握运动一分钟前后，测量小鼠在被拉过网格时的握力(前爪的最大肌肉力量)。

MG样临床评分根据以下标准分为四个MG等级:评分0，无症状；评分1，小鼠休息时无体征，但运动后握力丧失；评分2，轻度驼背姿势，休息时活动能力下降，运动前后握力丧失；评分3，严重驼背姿势和瘫痪。当动物达到评分1(即当它们表现出运动改变)时，被认为生病[32, 33]。根据动物福利规定，体重减轻超过初始体重的小鼠在处死前最多再饲养7天。诊断后MG评分为2的动物最多饲养10天。MG评分为3或体重减轻超过20%被视为立即终止标准。

6.3 | 酶联免疫吸附测定(ELISA)评估

6.3.1 | 抗hCD38/ ECD-ACE完整性分析

ELISA板(Sarstedt)用小鼠抗hAChR 或小鼠抗hAChR (5μg/mL；克隆B3/2，DRFZ)包被，用PBS/3% BSA封闭，并与样品在孵育。为了检测，我们使用山羊抗人IgG-AP抗体( ；Southern Biotech)在孵育。用对硝基苯磷酸酯(PNPP)底物(Thermo Scientific)孵育板。用SpectraMax i3x ELISA读数仪(Molecular Devices)在测量信号。

6.3.2 | 小鼠血清中抗体水平的检测

ELISA板用山羊抗小鼠IgG( ；Southern Biotech)、hAChR 或hAChR ECD(5 ；MyBiosource MBS717559)包被。为了检测，使用山羊抗小鼠IgG-AP抗体( ；Southern Biotech)。为了通过其亚类检测 ECD特异性抗体，使用山羊抗小鼠IgG2b-HRP抗体(0.1μg/mL；Southern Biotech)。小鼠抗hAChRαECD或小鼠抗hAChR ECD抗体用作计算各自抗体水平的标准。

7 | 小鼠血清中C3和C5a补体蛋白的定量分析

收集小鼠血清，并按照制造商的方案使用ELISA试剂盒(加拿大Biomatik公司)对C3和C5a进行检测。

7.1 | 流式细胞术分析

7.1.1 | 用抗hCD38/αECD-ACE对hCD38转染的杂交瘤细胞进行体外和体内标记

用抗人Ig轻链和 (分别为克隆MHK-49和MHL-38)以及抗SA(克隆3A20.2)检测与抗hCD38/ ECD-ACE的SA偶联的抗hCD38。抗hCD38/αECD-ACE的生物素化hAChRαECD通过SA(Biolegend)和抗hAChRαECD(克隆D6，DRFZ)进行检测。

7.1.2 | 在NSG-Hc1小鼠中检测植入的杂交瘤细胞

骨髓和脾脏的单细胞悬液用抗FcγR(克隆2.4G2/75，DRFZ)封闭。用hCD38和mCD138的细胞外染色检测hCD38 以及hCD38+转染的D6(GFP-)和B3/2(GFP+)杂交瘤细胞。

用DAPI(Sigma Aldrich)检测活细胞。除非另有说明，抗体均购自BioLegend。样品在FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)上采集，数据用FlowJo软件版本10.2.1(Tree Star Inc.)进行分析。

7.2 | 统计分析

所有分析均使用GraphPad Prism软件版本10.2.1进行。使用非参数双尾Mann-Whitney 检验比较治疗组与对照组的数据。对于治疗组和载体组之间抗体滴度、疾病评分和体重的比较，如果数据集存在缺失值，则进行双向方差分析或采用Geisser-Greenhouse校正的受限最大似然模型。通过对数秩检验比较生存曲线。被视为具有统计学意义，、** 和*** 。

作者贡献

Laleh Khodadadi生成、分析和验证数据，监督项目，构思研究，制定方案，制作图表并撰写稿件。Deborah Puppe生成、分析和验证数据，构思研究，制定方案，制作图表并撰写稿件。Dilara S. Cirillo生成、分析和验证数据。Carolina Martinez-Cingolani、Andreas Pelz、Siegfried Kohler、Qingyu Cheng、Tobias Alexander和Andreas Radbruch构思研究。Jens Klotsche参与统计分析。Konstantinos Lazaridis提供ECD蛋白。Michael Fichtner、Jan Pille、Andrey Kruglov和Marina Bondareva转染细胞系。Andreas Meisel和Falk Hiepe监督项目并构思研究。所有其他作者阅读、编辑并批准了稿件。

乙酰胆碱,抗原特异性,免疫病

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