橙皮苷和酪蛋白激酶2抑制剂DRB对AB1-42 诱导的分化型SH-SY5Y细胞神经毒性的神经保护作用
发布时间：
2026-06-14 22:50
橙皮苷和酪蛋白激酶2抑制剂DRB对AB1-42 诱导的分化型SH-SY5Y细胞神经毒性的神经保护作用
Hamiyet Eciroglu-Sarban D. Pinar Altin-Celik D. Pelin Kelicen-Ugur D. Hamiyet Donmez-Altuntas D
收稿日期:2024年12月28日 / 接受日期:2025年5月16日
© 作者 2025
摘要
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退行性疾病，其特征为淀粉样斑块、神经原纤维缠结和突触功能障碍，目前仍没有获批的治疗方法。在体外AD模型中，本研究旨在比较评估柑橘类黄酮橙皮苷和酪蛋白激酶2(CK2)抑制剂5,6-二氯-1- -D-核糖基苯并咪唑(DRB)作为AD潜在治疗靶点的神经保护作用。首先，使用全反式维甲酸(RA)和脑源性神经营养因子(BDNF)将SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞分化为胆碱能神经元样细胞。然后，为建立体外AD模型，将 应用于分化的SH-SY5Y细胞以诱导神经毒性。使用MTT、RT-qPCR和ELISA方法评估CK2抑制剂DRB和橙皮苷对体外AD模型的神经保护作用。高浓度的橙皮苷和DRB在24小时和 时均降低了分化的SH-SY5Y细胞的活力。与 处理组 相比，在25和 浓度下用橙皮苷预处理以及在0.25和 浓度下用DRB预处理 可增加ADAM10基因表达并降低BACE1基因表达，这两者均与AD标志物相关。与 处理组 相比，在0.25和 浓度下用DRB预处理 可降低体外AD模型中CK2α基因表达，而橙皮苷则无此作用 。橙皮苷和DRB预处理均显著降低A 水平( )、p-Tau(T181)水平( )和Bax/Bcl-2比值( )。结果，我们的研究表明，橙皮苷和DRB均通过抑制淀粉样蛋白生成途径和激活非淀粉样蛋白生成途径来抑制Aβ产生，同时对神经元凋亡也具有抑制作用。CK2可能是一个潜在的治疗靶点，可能与AD的病理生理学有关。然而，这些发现应通过进一步研究进行验证。
关键词 阿尔茨海默病 橙皮苷 神经元分化 神经母细胞瘤细胞
引言
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退行性疾病，其特征为认知障碍和功能能力丧失[1]。根据世界卫生组织(WHO)的数据，AD是痴呆最常见的原因，由于老年人口的增加，它对全球健康构成了日益严峻的挑战[2]。
阿尔茨海默病的关键病理特征包括细胞外淀粉样斑块、神经元内神经原纤维缠结(NFTs)、突触功能退化、胆碱能系统功能障碍以及神经元萎缩[1, 3]。淀粉样斑块主要是由于淀粉样前体蛋白(APP)在淀粉样生成途径中被 -分泌酶和 -分泌酶蛋白水解，导致具有高纤维化潜力的毒性蛋白形式积聚，如淀粉样β蛋白 。然而，如果APP蛋白在非淀粉样生成途径中被 -分泌酶切割，则会产生该蛋白的可溶性形式，且与疾病无关。因此，根据目前的数据，APP蛋白水解相关基因表达的一些变化——如APP、ADAM10(编码 -分泌酶)、BACE1(编码β-分泌酶)、早老素1(PSEN1)和PSEN2(调节 -分泌酶催化功能的基因)——对该疾病的发病机制有显著影响[6, 7]。tau蛋白的过度磷酸化是重要的病理发现之一，它会触发不溶性神经元内NFTs的形成。这个过程会破坏微管的稳定性，损害神经元运输系统，并损害细胞结构[8, 9]。阿尔茨海默病病理进展的关键观点之一是tau蛋白和 协同作用，放大彼此的毒性作用[9]。尽管有强有力的证据表明A 在神经元萎缩和阿尔茨海默病中诱导严重的细胞凋亡，但阿尔茨海默病的分子机制尚未完全阐明[5, 10]。
M 哈米耶特·唐梅兹-阿尔通塔斯 donmezh@erciyes.edu.tr
哈米耶特·埃西罗格鲁-萨班
hamiyeteciroglu@gmail.com
皮纳尔·阿尔廷-切利克
pnar.altnclk@gmail.com
佩林·凯利森-乌古尔
pkelicen@hacettepe.edu.tr
1 土耳其安塔利亚07425阿拉尼亚阿拉丁·凯库巴特大学卫生服务职业学校
2埃尔西耶斯大学健康科学研究所，土耳其开塞利38030
埃尔西耶斯大学医学院医学生物学系，土耳其开塞利38030
土耳其安卡拉市06410区哈杰泰佩大学药学院药理学系4
美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗阿尔茨海默病(AD)的药物数量有限，仅能缓解症状。因此，了解AD的发病机制并制定有效的治疗策略仍然至关重要[7, 11]。蛋白激酶在细胞过程中非常重要，被认为在大脑和许多组织中起关键作用，使其成为AD有吸引力的治疗靶点[12]。
蛋白激酶2(CK2，以前称为酪蛋白激酶II)及其底物与大脑的发育、神经发生、突触可塑性、突触传递和信息存储有关[13 - 15]。CK2是一种异源四聚体丝氨酸/苏氨酸激酶，由两个催化 亚基和两个调节 亚基组成，有超过300种底物[15, 16]。值得注意的是，研究发现人类大脑的前额叶皮层和海马体中组成型活性催化亚基CK2α的表达水平较高[16]。有限的动物研究表明，CK2与阿尔茨海默病相关，促进神经纤维缠结的形成，在致病性A 寡聚体存在的情况下其活性增加，这表明CK2活性升高与阿尔茨海默病有关[14, 17, 18]。相反，其他观点认为CK2活性可能会减少 肽的产生[19, 20]。这些相互矛盾的发现凸显了进一步研究CK2在阿尔茨海默病病理学中作用的必要性[12, 21]。
CK2抑制剂，如5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑(DRB)和4,5,6,7-四溴-1H-苯并三唑(TBB)，被用于研究CK2的功能。此外，这些抑制剂在专注于阐明神经退行性疾病(如阿尔茨海默病和帕金森病(PD))发病过程的研究中越来越受到关注。DRB与ATP结合位点和CK2α位点都有相互作用，并且被认为比CK2抑制剂(如2-二甲基氨基-4,5,6,7-四溴-1H-苯并咪唑(DMAT)和TBB)具有更高的选择性[14, 15, 22, 23]。除了现有的CK2抑制剂外，新发现的治疗药物的影响也将在这一研究领域中发挥关键作用[14, 23]。
近年来，天然生物活性化合物作为治疗神经退行性疾病的潜在治疗剂引起了人们的关注。橙皮苷是一种存在于柑橘类水果中的黄酮类化合物，特别是在橙子和柠檬的果皮中。一些研究其神经保护特性的研究表明，橙皮苷可能对大脑健康产生积极影响，并有助于预防或管理像阿尔茨海默病这样的神经退行性疾病[24, 25]。虽然橙皮苷主要在阿尔茨海默病的体内模型中进行了评估，但关于其在体外环境中的作用的文献研究有限[24 - 27]。然而，其对阿尔茨海默病中CK2表达的影响此前尚未评估。
鉴于此背景，本研究旨在评估和比较选择性CK2抑制剂DRB和柑橘类黄酮橙皮苷对通过在分化的SH-SY5Y细胞中用 诱导神经毒性建立的体外阿尔茨海默病模型的神经保护作用。这种方法可能为阿尔茨海默病中CK2信号传导、APP加工和潜在神经保护策略之间的分子相互作用提供新的见解。
材料与方法
化学试剂的制备
本研究中使用的化学试剂均购自商业渠道，并按照制造商的说明进行制备。全反式维甲酸(RA；中国Bldpharm)在二甲基亚砜(DMSO；美国Sigma-Aldrich)中配制成 储备溶液，并在使用前立即用培养基稀释。在溶液的制备和使用过程中考虑到了RA对光、热和空气的敏感性。脑源性神经营养因子(BDNF；以色列Prospec)储备溶液在含有0.1%牛血清白蛋白(美国Sigma Aldrich)的无菌去离子水中配制成 ，并储存在 。橙皮苷(美国Sigma-Aldrich)储备溶液在吡啶(美国Sigma-Aldrich)中配制成 ，并短期储存在 。5,6-二氯苯并咪唑-1-β-D-呋喃核糖苷(DRB；美国Sigma-Aldrich)在DMSO中配制成浓度为 ，并储存在 直至使用。
Aβ肽的制备
人源 冻干粉末(美国GenScript公司)溶解于 氢氧化铵 (意大利Carlo Erba公司) 。将 储备液用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS，德国Capricorn公司)(pH 7.4)配制，并储存于 。使用前，将 储备液在 孵育 以形成纤维，然后如文献[28, 29]所述，用培养基新鲜稀释至确定浓度。
SH - SY5Y细胞的细胞培养
在本研究中，使用人源SH - SY5Y神经母细胞瘤细胞系(美国Sigma - Aldrich公司)，因其具有分化为神经元样细胞的能力。细胞在补充有10%热灭活胎牛血清(FBS，德国Capricorn公司)和1%(v/v)青霉素/链霉素(德国Capricorn公司)的杜氏改良 Eagle培养基(DMEM)/哈姆F - 12培养基(德国Capricorn公司)中培养。细胞在 和 湿度下孵育。每2天更换一次培养基，当细胞达到80 - 90%汇合度时，胰蛋白酶消化后进行传代培养[30]。
SH - SY5Y细胞的分化
通过诱导RA和BDNF将SH - SY5Y细胞分化为胆碱能神经元。应用了两种不同的分化方案。首先，将6孔板用无菌 I型胶原蛋白(美国Gibco公司)包被约 [31]。SH - SY5Y细胞在补充有 FBS和 青霉素 - 链霉素的培养基中以 个细胞 的密度培养 。然后，用含有 FBS和 RA的第一种分化培养基处理细胞，每2天更换一次培养基，持续4天(RA分化方案)。在第5天，用含有 FBS、10μM RA和 BDNF的第二种分化培养基处理细胞，持续接下来的2天[31, 32]。分化方案在第7天结束时完成(RA和BDNF分化方案)，分化后的SH - SY5Y(d - SH - SY5Y)细胞用于进一步实验(图1)。
为验证这两种分化方案，比较了三组在SH - SY5Y神经母细胞瘤细胞分化为成熟胆碱能神经元过程中神经元和胆碱能标志物(MAP2、NeuN、ChAT和AChE)的形态变化和基因表达水平:对照组(未处理)、RA组(用RA处理5天)和RA + BDNF组(用RA处理5天，随后用BDNF处理2天)。使用配备 物镜的倒置显微镜(德国蔡司Axio倒置显微镜)观察随机选择区域内各组之间的形态差异。使用NeuronJ(ImageJ)程序检查神经突长度和数量，每个视野中六个随机选择细胞的数据按总百分比计算[33 - 35]。使用定量实时PCR(RT - qPCR)方法评估基因表达水平(见第2.7节)。
RA和BDNF分化方案
图1 SH-SY5Y细胞的分化。在两种分化方案中，SH-SY5Y细胞在胶原蛋白包被的培养板上培养最初的 天，培养基中含有10%胎牛血清。在使用视黄酸(RA)的分化方案中，细胞用含有1%胎牛血清和 的RA的培养基处理5天。在使用RA和脑源性神经营养因子(BDNF)的分化方案中，细胞先用第一种分化培养基(1%胎牛血清和10μM RA)处理5天，然后用第二种分化培养基( 胎牛血清、 RA和50 ng/ml BDNF)处理2天
细胞活力评估
使用MTT法(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐；美国西格玛奥德里奇公司)评估毒性模型和药物处理中的细胞活力。在实验期结束时，将细胞与终浓度为0.5 的MTT溶液在 下于 孵育，湿度为 ，温度为 。然后吸出培养基，向每个孔中加入 的二甲基亚砜(DMSO)，接着振荡直至甲臜晶体溶解。在酶标仪(美国伯乐公司Synergy H1)上于 波长和 吸光度下分光光度法测量平板中产生的颜色强度。实验至少进行三次(或四次)重复。通过计算与对照相比的百分比比值来评估结果[36]。
AD的体外建模以及橙皮苷和DRB对d-SH-SY5Y细胞的处理
将SH-SY5Y细胞接种于预先用胶原蛋白包被的96孔板中( 个细胞/孔)。按照2.3节所述应用RA和BDNF的分化方案。首先，为了评估橙皮苷和DRB对d-SH-SY5Y细胞活力的细胞毒性作用，将d-SH-SY5Y细胞用不同浓度的橙皮苷(6.25、12.5、25、50、75、100和 )和DRB(0.25、0.5、1、3.9、7.8,、15.62、31.25、62.5、125和 )处理24小时和 小时，并使用MTT法进行评估。此外，还检测了0.1%吡啶(橙皮苷的溶剂)和0.1% DMSO(DRB的溶剂)对细胞活力的影响。然后，用浓度递增的 的 处理d-SH-SY细胞24小时和 小时，以确定毒性浓度，即 值，使用MTT法。在后续实验中，用 处理24小时的d-SH-SY5Y细胞用于建立体外AD模型。
为评估橙皮苷和DRB的神经保护作用，各治疗组分别用不同浓度的橙皮苷(6.25、12.5、25、50、75、100和 )以及DRB 和 预处理24小时和 。由于125和 浓度的DRB显示出高细胞毒性，因此在较低浓度下进行了进一步研究。随后，去除培养基，并向细胞中加入含有 的培养基培养 。
实时定量聚合酶链反应分析基因表达
通过实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)评估了在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞分化为成熟胆碱能神经元过程中，微管相关蛋白2(MAP2)、神经元核抗原(NeuN)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AChE)(神经元和胆碱能标志物)的基因表达水平，以及评估橙皮苷和DRB在体外阿尔茨海默病模型中的神经保护作用时，解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)、β-分泌酶1(BACE1)和酪蛋白激酶2α(CK2α)的基因表达水平。在对照组(分化的SH-SY5Y细胞)、 组(20 )、橙皮苷组(25和 )以及DRB组(0.25和 )中评估基因表达水平。
使用总RNA纯化分离试剂盒(德国耶拿生物科学公司)从实验组中分离总RNA。使用多模式微孔板读数仪(美国伯腾公司Synergy H1)通过测量吸光度比值A260/A280(1.8 - 2.1)来评估提取RNA的纯度。随后，使用cDNA合成试剂盒(土耳其安卡拉A.B.T.实验室工业公司)从总RNA进行cDNA合成。使用前，RNA样品保存在 ，cDNA保存在 。
在罗氏LightCycler 96仪器上进行RT-qPCR反应，使用RT2 SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒(土耳其安卡拉A.B.T.实验室工业公司)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因用作内参。RT-qPCR的热循环程序如下:在 预孵育 ，随后在 以 进行45个循环的 ，并在 进行 。引物序列见表1。根据 公式使用循环阈值(Ct)方法计算基因表达的相对变化，数据以靶基因mRNA表达的倍数变化表示[37]。
表1 基因表达分析中使用的正向和反向引物序列
| 基因符号 | 正向引物序列 | 反向引物序列 |
| 微管相关蛋白2 | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG |
| 神经元核抗原；RBFOX3 F | TTCTCCTTTTCTATTCCCGTTGT | TGTTAGTTTGAATGGTCACACCT |
| 乙酰胆碱酯酶 | AGCAGTACGTTAGTCTGGACCT | TGCTTGCTGTAGTGGTCGAA |
| 胆碱乙酰转移酶 | CAGCCCTGCCGTGATCTTT | TGTAGCTGAGTACACCAGAGATG |
| 解聚素金属蛋白酶10 | TCATGGTGAAACGCATAAGAATCA | AAGACATAGGCCAAACAGTAGTCAT |
| β-分泌酶1 | TAACTTTGCAGTGGGTGCTG | GTTGGAGCCGTTGATGAAGA |
| 酪蛋白激酶2α1；酪蛋白激酶2 | GGTGGAATGGGGAAATCAAGAT | GCCATCACGCCACAGTTTC |
| 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | GCCATCACGCCACAGTTTC |
酶联免疫吸附测定(ELISA)
使用夹心ELISA试剂盒，按照制造商的说明测量与AD病理相关的 (BT实验室，中国上海)和磷酸化tau(p-tau181)(FineTest，中国湖北)的水平，以及与凋亡机制相关的Bax(BT实验室，中国上海)和Bcl-2(BT实验室，中国上海)的水平。使用多模式微孔板读数仪(Synergy H1，Biotek，美国)在 处测量实验组上清液的吸光度。
统计分析
所有数据均表示为来自三(或四)个独立实验的平均值 标准误。使用GraphPad Prism 9.0软件(GraphPad Software，Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥)计算 、橙皮苷和DRB的 值。其他统计分析使用IBM SPSS软件包(版本21.0)进行。两组之间的统计差异使用单因素方差分析(ANOVA)(参数检验)或曼-惠特尼U检验(非参数检验)进行评估。多组间比较使用ANOVA进行，随后进行事后Tuk-ey’s HSD、Kruskal-Wallis或Dunnett检验。 的p值被认为具有统计学意义 ，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.001)。
结果
SH-SY5Y细胞分化中的形态变化和神经突分析
使用两种不同的分化方案来促进SH-SY5Y细胞的神经元分化:RA分化方案和RA与BDNF联合分化方案(图1)。与未分化的SH-SY5Y细胞(未处理的对照组)相比，RA组(用RA处理5天)增加了神经突长度和分支( ，图2B和D)。RA + BDNF组(用RA处理5天 + 用BDNF处理2天)也显著增加了神经突长度和分支，呈现出神经元外观 。
图2 SH-SY5Y细胞在RA和RA + BDNF两种不同分化方案下的形态结构以及神经元和胆碱能神经元标志物的基因表达水平。A未分化SH-SY5Y细胞(未处理的对照组)。B RA组(用RA处理5天)。C RA + BDNF组(用RA处理5天 + 用BDNF处理2天)。D对照组、RA组和RA + BDNF组中SH-SY5Y细胞的神经突长度
(神经元杂志)。E和(F)作为神经元标志物的MAP2和NeuN的基因表达。G和(H)作为胆碱能神经元标志物的AChE和ChAT的基因表达。结果表示为平均值 标准误(德国蔡司Axio倒置显微镜； 物镜)。与对照组相比的显著差异:* ，** ，*** <0.005和****p<0.001
在第5天和第7天测量神经突长度。此外，RA与RA + BDNF分化方案之间的比较表明，RA + BDNF组的神经突长度更长 。
分化的SH-SY5Y细胞中神经元和胆碱能标志物的基因表达分析
作为神经元标志物的微管相关蛋白2(MAP2)和神经元核抗原(Neun)基因表达水平，以及作为胆碱能神经元标志物的胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AChE)基因表达水平，在分化细胞中进行了评估。视黄酸(RA)组(用RA处理5天)和RA +脑源性神经营养因子(BDNF)组(用RA处理5天，随后用BDNF处理2天)与未分化的SH - SY5Y细胞(未处理的对照组)相比，MAP2、Neun和AChE基因表达水平均显著升高 (图2E、F和G)。与RA组相比，RA + BDNF组在神经元标志物中MAP2基因表达水平也显著更高 。因此，在后续实验中，最能反映胆碱能神经元转化的RA + BDNF处理方案被用于体外阿尔茨海默病(AD)模型。
橙皮苷和5,6 - 二氯 - 1 - β - D - 呋喃核糖基苯并咪唑(DRB)对分化型SH - SY5Y细胞活力的影响
使用MTT法评估了橙皮苷和DRB在一系列浓度下处理24小时和 对分化型SH - SY5Y细胞的细胞毒性作用(图3)。橙皮苷处理24小时和 后，未使分化型SH - SY5Y细胞活力降低至50%以下。在 时观察到细胞活力，即使在橙皮苷最高浓度 时也是如此(图3A)。因此，无法确定橙皮苷的 值。与分化型SH - SY5Y细胞(未用橙皮苷或DRB处理的对照组)相比，DRB在所有组中浓度为 及以上时，处理24小时和 后显著降低细胞活力 。DRB的 值在 时确定为 ，在 时为 。
橙皮苷和DRB处理对分化型SH - SY5Y细胞活力免受 毒性的保护作用
通过MTT法确定了阿尔茨海默病神经毒素 浓度增加 对分化型SH - SY5Y细胞活力处理24小时和 的影响。 暴露导致分化型SH - SY5Y细胞活力显著降低，这是浓度和时间依赖性的(图4A)。基于文献[38, 39]和我们的研究结果(活力为76.38%)，我们选择在神经毒性(体外AD模型)实验中使用浓度为 的 处理 。
测试了橙皮苷和DRB保护d-SH-SY5Y细胞免受 毒性的能力。在预处理24小时和 后，使用MTT法评估细胞活力(图4B)。用橙皮苷预处理 24小时和 ，可显著提高d-SH-SY5Y细胞对 毒性的活力，尤其是在25和 0.005的浓度下。然而，在高于 的浓度下，细胞活力下降(图4C)。
然而，用DRB(0.25 - 62.5μM)预处理24小时和 ，并不能提高细胞对 毒性的活力。尽管没有统计学意义，但与 毒性组相比，在0.25和 的浓度下观察到 的细胞活力略有增加(图4D)。
图3橙皮苷和DRB对d-SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用。A橙皮苷对d-SH-SY5Y细胞活力24小时和 的影响。B DRB对d-SH-SY5Y细胞活力24小时和 的影响。结果以平均值 SEM表示。与对照组相比的显著差异: 和***p<0.005
图4通过MTT试验评估 毒性以及橙皮苷和DRB对d-SHSY5Y细胞活力的浓度和时间依赖性影响。A 对d-SH SY5Y细胞活力的浓度和时间依赖性细胞毒性作用。 用橙皮苷和DRB对d-SHSY5Y细胞进行24小时和48小时预处理的方案。C橙皮苷预处理对d-SHSY5Y细胞中 毒性的保护作用。D DRB预处理对d-SHSY5Y细胞中 毒性的保护作用。结果以平均值 SEM表示。与 毒性组相比的显著差异: 和 。与对照组相比的显著差异:
用橙皮苷和DRB预处理影响体外AD模型中的阿尔茨海默病标志物
将SH-SY5Y细胞分别用橙皮苷(25和 )和DRB(0.25和 )预处理 ，然后用 处理 。为了评估橙皮苷和DRB在由 诱导的体外AD模型中的神经保护作用，我们使用RT-qPCR测量了ADAM10( -分泌酶)和BACE1( -分泌酶)基因的mRNA表达水平，以及使用ELISA测量了 和磷酸化Tau(T181)蛋白水平。
与对照组相比， 组中ADAM10 mRNA表达水平下调，而BACE1 mRNA表达水平显著上调。ADAM10和BACE1基因表达的倍数变化分别为2.9倍和1.9倍 (图5A和B)。然而，浓度为 (2.3倍)和 (两倍)的橙皮苷，以及浓度为 (两倍)和 (2.2倍)的DRB，与 组相比，显著增加了ADAM10 mRNA表达水平 ，而橙皮苷和DRB在这些组中显著降低了BACE1基因表达水平(分别为2.2倍、1.8倍、两倍和2.3倍) (图5A和B)。在体外AD模型中，橙皮苷和DRB对BACE1基因表达的影响比对ADAM10的影响更大。
图5橙皮苷 和50 )以及DRB( 和 )预处理对体外AD模型中阿尔茨海默病标志物的影响。A - B体外AD模型(用 处理 的d - SH - SY5Y细胞)中DRB和橙皮苷预处理对ADAM10和BACE1 mRNA表达(倍数变化)的影响。C - D体外AD模型(用 处理 的d - SH - SY5Y细胞)中DRB和橙皮苷预处理对 和磷酸化Tau(T181)水平的影响。 体外AD模型(用 处理 的d - SH - SY5Y细胞)中橙皮苷和DRB预处理对CK2α mRNA表达的影响。结果以平均值 SEM表示。与 毒性组相比有显著差异:* ，** ，*** 。与对照组相比有显著差异: 和
水平是 的重要标志物，与对照组 相比， 组中其水平显著升高。然而，用橙皮苷(25和 )和DRB(0.25和 )预处理 后，与 组 相比， 水平显著降低(图5C)。同样，与对照组 相比， 组中磷酸化Tau(T181)水平升高，而用橙皮苷(25和 )和DRB(0.25和 )预处理 后，与 组 相比，磷酸化Tau(T181)水平显著降低(图5D)。
橙皮苷和DRB预处理降低体外AD模型中CK2基因表达
为了研究CK2在由 诱导的体外AD模型中的作用，我们使用RT-qPCR测量了 、橙皮苷和DRB组中CK2 mRNA的表达。与对照组 相比， 组中CK2基因表达水平显著上调(1.6倍)(图5E)。用CK2抑制剂之一DRB(0.25和0.5 )预处理，与 组 相比，显著降低了CK2 mRNA表达水平。然而，在体外AD模型 中，与 组相比，橙皮苷预处理(25和50 )并未导致CK2 mRNA表达水平有任何显著降低(图5E)。
橙皮苷和DRB预处理可减少体外AD模型中的细胞凋亡
为了评估橙皮苷和DRB预处理在体外AD模型中的凋亡作用，使用ELISA方法测量促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平。然后通过计算Bax/Bcl-2比值来确定凋亡指数。
组与对照组相比，Bax蛋白水平显著更高，而Bcl-2蛋白水平显著更低 (图6A和B)。与A 组 相比，用25和 橙皮苷预处理可提高Bcl-2水平，而用 橙皮苷预处理可降低Bax水平(图6A和B)。用2.25 M DRB预处理可显著降低Bax水平 ，但DRB预处理后Bcl-2水平没有统计学上的显著升高 (图6A和B)。此外， 组与对照组 之间凋亡指数(即Bax/Bcl-2蛋白比值)大幅增加(图6C)。然而，在体外AD模型中，与 组 和 相比，用 橙皮苷和0.25 DRB预处理分别通过降低Bax/Bcl-2比值减少了细胞凋亡(图6C)。
讨论
目前尚无治疗阿尔茨海默病的有效方法，其分子机制也尚未完全阐明。为了增进我们对该病的了解并推动可行疗法的开发，使用体外和体内AD模型至关重要 。在本研究中，用视黄酸(RA)和脑源性神经营养因子(BDNF)依次处理SH-SY5Y细胞，以生成神经元样分化细胞(d-SH-SY5Y)。通过形态学变化以及神经元标志物(微管相关蛋白2(MAP2)和神经元核抗原(Neun))和胆碱能神经元标志物(胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AChE))的基因表达水平来确认神经元分化。本研究使用MTT法检测细胞活力、RT-qPCR分析模型标志物(酪蛋白激酶2α(CK2α)、解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)和β-分泌酶1(BACE1))的基因表达水平以及ELISA检测β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)、磷酸化tau蛋白(T181)和凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)，评估了DRB(一种CK2抑制剂)和橙皮苷在体外AD模型中的神经保护作用。
图6橙皮苷和DRB预处理对体外AD模型(用 A 处理 的d-SH-SY5Y细胞)中Bax和Bcl-2蛋白水平的影响。A Bax蛋白水平。B Bcl-2蛋白水平。C凋亡Bax/Bcl-2比值。结果以平均值±SEM表示。与对照组相比有显著差异: 和 。与 毒性组相比有显著差异:* 0.05和** p < 0.01
由于SH-SY5Y细胞具有分化为神经元细胞的能力，因此它们是神经退行性疾病相关研究中最常被选用的用于创建体外模型的细胞系之一[31, 41, 42]。先前的研究表明，SH-SY5Y细胞可以通过各种方案进行神经元分化以用于阿尔茨海默病模型，包括用RA处理[43]、用RA和BDNF依次处理[31, 32]或与其他因子如神经生长因子(NGF)、维生素D、二丁酰环磷腺苷(cAMP)、谷氨酰胺(GlutaMAX)和神经基础培养基联合使用[44, 45]。据报道，RA和BDNF处理可诱导SH-SY5Y细胞发生形态变化并增加神经突长度[31, 32]。此外，已证明微管相关蛋白2(MAP2)、神经元核抗原(NeuN)、β-微管蛋白III、乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)基因表达水平的变化可确认胆碱能神经元分化[31, 32, 46]。与先前的研究一致，我们用RA处理SH-SY5Y细胞5天，然后用BDNF处理2天(共7天)以显示胆碱能神经元分化。RA + BDNF分化方案产生了具有神经元样形态、伸长的神经突以及微管相关蛋白2(MAP2)、神经元核抗原(NeuN)和乙酰胆碱酯酶(AChE)基因表达水平显著更高的分化SH-SY5Y(d-SH-SY5Y)细胞。然后我们使用d-SH-SY5Y细胞生成体外AD模型。
浓度范围为10至 ，此前在体外研究中常被用于建立AD模型[28, 47, 48]。本研究表明， 处理d-SH-SY5Y细胞会以浓度和时间依赖性方式降低细胞活力，这为 诱导的细胞毒性提供了直接证据。大量研究表明， 激活淀粉样蛋白生成途径，导致线粒体损伤和DNA断裂，最终引起细胞和基因组功能障碍[49, 50]。我们的结果表明，在由 诱导的毒性组中，BACE1( -分泌酶)基因表达增加，而ADAM10( -分泌酶)基因表达受到抑制。此外，我们观察到 毒性组中 和磷酸化Tau(T181)蛋白水平升高，同时诱导了细胞凋亡。因此，我们的发现与AD中淀粉样蛋白生成途径中通过 -和 -分泌酶参与产生淀粉样斑块一致，也与其他体外AD模型研究报道的结果一致[6, 48, 50, 51]。
柑橘类黄酮，如橙皮苷，因其抗氧化和抗炎特性以及穿越血脑屏障的能力，在神经退行性疾病治疗中日益受到关注。此外，它们副作用极小且对健康细胞细胞毒性低，具有显著的治疗优势[24, 25]。先前研究表明，橙皮苷在SH-SY5Y细胞中即使在高浓度下也表现出低毒性[52, 53]，表明其具有广泛的治疗安全范围。在SH-SY5Y细胞中，已发现它通过提高细胞活力对 -OHDA和布比卡因等神经毒性剂具有保护作用[53 - 55]。在一项关于体外AD模型的研究中，Kusi等人展示了 橙皮苷对 的保护作用[27]。在本研究中，我们在d-SH-SY5Y细胞中使用 构建体外AD模型，并研究了橙皮苷和DRB的保护作用。我们的结果表明，橙皮苷在25和 浓度下显著提高细胞存活率，在体外AD模型中保护d-SH-SY5Y细胞免受 神经毒性。根据Kuşi等人的研究[27]，除了该研究是在不同的SK-N-AS人神经母细胞瘤细胞上进行外， 毒性可能高于 毒性，这解释了为什么我们研究中的橙皮苷浓度高于他们研究中使用的浓度。
另一方面，尽管关于橙皮苷在体外阿尔茨海默病模型中的作用的研究有限，但在众多体内模型中已表明，橙皮苷能有效预防 积累和神经炎症，以及减轻认知和行为障碍[56 - 59]。曼杜尔等人发现，橙皮苷可减少阿尔茨海默病大鼠的记忆丧失，并抑制Aβ - 42、p - Tau和乙酰胆碱酯酶的表达，从而减轻类似阿尔茨海默病的状态[58]。此外，橙皮苷已被证明可通过降低乙酰胆碱酯酶活性和与 生物合成相关的标志物的表达来预防氧化应激、细胞凋亡和认知障碍[56,57]。在一项评估橙皮苷对tau、 -淀粉样蛋白和 -突触核蛋白免疫反应性影响的体外研究中，它在由 产生的体外阿尔茨海默病模型中通过显著降低 -突触核蛋白值显示出神经保护作用[27]。我们还表明，在由 产生的体外阿尔茨海默病模型中，橙皮苷预处理显著增加了ADAM10基因表达，降低了BACE1基因表达，从而降低了 肽和磷酸化Tau(T181)水平。我们的研究结果表明，橙皮苷是一种有前途的治疗阿尔茨海默病的药物，尽管还需要进一步广泛的研究。
CK2在阿尔茨海默病(AD)发病机制中的作用颇具争议。一些临床研究将CK2活性降低与AD联系起来，表明其可能导致Aβ积累 。另一方面，一些研究表明，在人类和AD动物模型的大脑中，尤其是海马体和颞叶皮质，CK2表达水平显著升高，且这种升高与认知障碍有关 。这些发现表明CK2是AD发病机制中的关键靶点，促使研究人员关注该领域的实验模型。据我们所知，此前尚无研究在体外AD模型中研究DRB。在本研究中，体外AD模型中CK2基因表达增加，但DRB(CK2抑制剂)下调了CK2基因表达。尽管针对 毒性，0.25和 浓度的DRB使细胞活力略有增加 ，但这种效果无统计学意义。此外，在之前一项关于帕金森病模型的研究中 ，DRB用于 SH-SY5Y细胞，结果表明DRB降低了α-突触核蛋白p-S129的磷酸化水平[64]。然而，在我们的研究中，我们使用了较低有效剂量的DRB，因为SH-SY5Y细胞较长的培养时间和分化可能使其更敏感。此外，利用体外AD模型，我们研究了AD标志物与淀粉样蛋白生成途径之间与DRB抑制CK2的关系。我们结果表明，CK2抑制在体外AD模型中具有神经保护作用， 和磷酸化Tau(T181)水平降低，ADAM10基因表达增强，BACE1基因表达受到抑制，证明了这一点。此前使用CK2抑制剂的实验研究表明，tau磷酸化、STAT1磷酸化、快速轴突运输(FAT)和GSK3信号传导均与CK2在AD中的作用有关[14, 18, 65, 66]。此外，研究表明，错误折叠的tau和寡聚Aβ分别通过异常激活GSK3β和CK2蛋白激酶抑制AD模型中的突触传递[66, 67]。因此，我们的结果支持这些研究，并表明CK2可能是AD的一个可行治疗靶点。尽管迄今为止已发现多种CK2抑制剂，但由于低靶点特异性和其他相关缺点，其临床潜力仍然有限。鉴定具有CK2抑制活性的天然化合物可能为开发更具选择性的治疗策略提供一条有前景的途径[22]。槲皮素和芹菜素等黄酮类化合物此前已在多项研究中作为CK2抑制剂进行研究[16, 22, 68]。然而，橙皮苷对CK2表达的影响此前尚未在体外AD模型中进行评估。在本研究中，我们还评估了橙皮苷是否具有CK2抑制作用。我们的结果表明，与A 毒性组相比，橙皮苷未改变CK2基因表达。然而，我们的研究表明，橙皮苷在体外AD模型中的神经保护作用——以 和磷酸化Tau(T181)水平降低、ADAM10基因表达增强和BACE1基因表达受到抑制为特征——可能是由CK2抑制以外的机制介导的。如前所述，橙皮苷发挥神经保护作用，可能与淀粉样蛋白生成途径有关。
在诸如阿尔茨海默病(AD)等神经退行性疾病中，细胞凋亡(定义为程序性细胞死亡)是导致突触功能障碍和认知能力丧失的一个因素[69]。在本研究中， 毒性显示出Bax蛋白水平升高、Bcl-2蛋白水平降低以及Bax/Bcl-2比值升高，表明 在体外AD模型中触发细胞凋亡。然而，用橙皮苷和DRB预处理不仅调节了与阿尔茨海默病相关的分子，还降低了Bax水平，增加了Bcl-2蛋白水平，并降低了体外AD模型中凋亡的Bax/Bcl-2比值，表明对 毒性引起的凋亡性细胞死亡具有保护作用。同样，在由 诱导的体外AD模型中，已证明其可抑制caspase-3/-9活性。此外，先前的研究表明，在体内AD模型中，橙皮苷通过降低Bax和caspase-3表达，同时增加Bcl-2表达来抑制细胞凋亡和神经元细胞死亡[57, 71]。由于神经元萎缩是一个重要的病理发现，预防细胞凋亡可能是治疗AD的关键策略之一。已发现阿尔茨海默病患者的大脑显示出活性caspase-3活性增加、促凋亡Bax过表达以及抗凋亡Bcl-2表达降低[72 - 74]。在本研究中，橙皮苷和DRB 的保护作用可能是由于通过神经炎症和淀粉样蛋白生成途径调节细胞死亡信号。基于这些发现，我们假设橙皮苷和DRB 可能通过减少神经元细胞死亡对AD具有治疗作用。
结论
在本研究中，我们通过评估CK2的基因表达为该领域文献做出了贡献，其在AD发病机制中的作用尚未完全阐明。我们的结果表明，CK2抑制剂DRB可以有效调节Aβ1 - 42诱导的体外AD模型中增加的CK2α基因表达。此外，DRB在体外AD模型中对淀粉样蛋白生成途径和细胞凋亡具有保护作用。这些发现表明CK2过表达可能在AD发病机制中起作用。黄酮类化合物橙皮苷通过抑制淀粉样蛋白生成途径、抑制细胞凋亡以及在体外AD模型中激活非淀粉样蛋白生成途径，显示出显著的神经保护作用。我们的结果还表明，橙皮苷不抑制CK2；然而，它可能通过体外AD模型中的其他途径发挥其保护作用。需要进一步研究以更详细地研究CK2在AD中的作用机制，并开发具有较低细胞毒性的CK2抑制剂。
致谢 本文基于Hamiyet ECIROĞLU SARBAN的博士论文(编号778951)。我们还要感谢埃尔西耶斯大学研究院长校对编辑办公室为本手稿提供的校对和编辑服务。
作者贡献 HES和HDA共同设计了项目并撰写了手稿。HES和PAC进行了实验并分析了数据。PKU支持了实验过程并修订了手稿。HDA构思并监督了研究，还修订了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。
资金 由土耳其科学技术研究理事会(TÜBİTAK)提供开放获取资金。这项工作得到了埃尔西耶斯大学科研项目协调单位的资助(编号TDK - 2020 - 10151)。
数据可用性 在当前研究中未生成或分析数据集。
声明
伦理批准 本文不包含任何关于人类参与者或动物的研究。
知情同意 不适用。
发表同意 所有作者都已同意发表本文。
利益冲突 作者声明无利益冲突。
开放获取 本文受Creative Commons Attribution 4.0国际许可协议的许可，只要您适当引用原作者和来源，提供指向Creative Commons许可协议的链接，并表明是否做了更改，您就可以在任何媒介或格式下使用、共享、改编、分发和复制。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的Creative Commons许可协议中，除非在材料的版权声明中另有说明。如果材料不包含在文章的Creative Commons许可协议中，且您的预期用途未经法律法规许可或超出许可范围，您需要直接从版权所有者处获得许可。要查看此许可协议的副本，请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
参考文献
1. Breijyeh Z, Karaman R, Muñoz-Torrero D, Dembinski R (2020) Comprehensive Review on Alzheimer’s Disease: Causes and Treatment. Molecules 25(24):5789. https://doi.org/10.3390/molec ules25245789
2. Long S, Benoist C, Weidner W (2023) World Alzheimer Report 2023: Reducing Dementia Risk: Never Too Early, Never Too Late. London, England. Available online at: https://www.alzint.org/ resource/world-alzheimer-report-2023/. Accessed 2 May 2025
3. Hampel H, Mesulam MM, Cuello AC, Farlow MR, Giacobini E, Grossberg GT et al (2018) The cholinergic system in the pathophysiology and treatment of Alzheimer’s disease. Brain 141(7):1917-1933. https://doi.org/10.1093/brain/awy132
4. Khan S, Barve KH, Kumar MS (2020) Recent Advancements in Pathogenesis, Diagnostics and Treatment of Alzheimer’s Disease. Curr Neuropharmacol 18:1106-1125. https://doi.org/10.2174/ 1570159X18666200528142429
5. Bhole RP, Chikhale RV, Rathi KM (2024) Current biomarkers and treatment strategies in Alzheimer disease: An overview and future perspectives. IBRO Neurosci Rep 16:8-42. https://doi.org/ 10.1016/j.ibneur.2023.11.003
6. Khan MI, Shin JH, Kim MY, Shin TS, Kim JD (2020) Green tea seed isolated theasaponin E1 ameliorates Ad promoting neurotoxic pathogenesis by attenuating peptide levels in sweapp cells. Molecules 25(10). https://doi.org/10.3390/MOLECULES2 5102334.
7. Yiannopoulou KG, Papageorgiou SG (2020) Current and Future Treatments in Alzheimer Disease: An Update. J Cent Nerv Syst Dis 12. https://doi.org/10.1177/1179573520907397
8. Muralidar S, Ambi SV, Sekaran S, Thirumalai D, Palaniappan B (2020) Role of tau protein in Alzheimer’s disease: The prime pathological player. Int J Biol Macromol 163:1599-1617. https:// doi.org/10.1016/J.IJBIOMAC.2020.07.327
9. Pickett EK, Herrmann AG, McQueen J, Abt K, Dando O, Tull-och J et al (2019) Amyloid Beta and Tau Cooperate to Cause Reversible Behavioral and Transcriptional Deficits in a Model of Alzheimer’s Disease. Cell Rep 29(11):3592-3604.e5. https://doi.org/10.1016/J.CELREP.2019.11.044
10. Perkovic MN, Pivac N (2019) Genetic Markers of Alzheimer’s Disease. In Advances in Experimental Medicine and Biology 1192:27-52. https://doi.org/10.1007/978-981-32-9721-0_3
11. Kumar A, Sidhu J, Goyal A, Tsao Jack W (2020) Alzheimer Disease [Updated 2024 Feb 12]. In StatPearls [internet]. StatPearls Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/books/NBK49 9922/. Accessed 04 April 2025
12. Rosenberger AFN, Morrema THJ, Gerritsen WH, van Haastert ES, Snkhchyan H, Hilhorst R et al (2016) Increased occurrence of protein kinase CK2 in astrocytes in Alzheimer’s disease pathology. J Neuroinflammation 13(1):1-14. https://doi.org/10.1186/ S12974-015-0470-X/FiG.S/7
13. Bender M, Schwind L, Grundmann D, Martin M, Klotz M, Götz C et al (2017) Impact of protein kinase CK2 inhibitors on proliferation and differentiation of neural stem cells. Heliyon 3(6). https:// doi.org/10.1016/J.HELIYON.2017.E00318.
14. Perez DI, Gil C, Martinez A (2011) Protein kinases CK1 and CK2 as new targets for neurodegenerative diseases. Med Res Rev 31(6):924-954. https://doi.org/10.1002/MED.20207.DOI:10.1002/MED.20207
15. Castello J, Ragnauth A, Friedman E, Rebholz H (2017) CK2- An Emerging Target for Neurological and Psychiatric Disorders. Pharmaceuticals 10(1):7. https://doi.org/10.3390/PH10010007
16. Baier A, Kokel A, Horton W, Gizińska E, Pandey G, Szyszka R et al (2021) Organofluorine Hydrazone Derivatives as Multifunctional Anti-Alzheimer’s Agents with CK2 Inhibitory and Antioxidant Features. ChemMedChem 16(12):1927-1932. https:// doi.org/10.1002/CMDC.202100047
17. Borgo C, D’Amore C, Sarno S, Salvi M, Ruzzene M (2021) Protein kinase CK2: a potential therapeutic target for diverse human diseases. Signal Transduct Target Ther 6:1. https://doi.org/10.1038/s41392-021-00567-7
18. Zhang Q, Xia Y, Wang Y, Shentu Y, Zeng K, Mahaman YAR et al (2018) CK2 phosphorylating I2PP2A/SET mediates tau pathology and cognitive impairment. Front Mol Neurosci 11:146. https://doi.org/10.3389/FNMOL.2018.00146/BIBTEX
19. Lenzken SC, Stanga S, Lanni C, De Leonardis F, Govoni S, Rac-chi M (2010) Recruitment of Casein Kinase 2 is Involved in AβPP Processing Following Cholinergic Stimulation. J Alzheimers Dis 20(4):1133-1141. https://doi.org/10.3233/JAD-2010-090232
20. Pimenova AA, Thathiah A, De Strooper B, Tesseur I (2014) Regulation of Amyloid Precursor Protein Processing by Serotonin Signaling. PLoS ONE 9(1):e87014. https://doi.org/10.1371/JOURN AL.PONE.0087014
21. Ogata A, Yamada T, Hattori S, Ikenuma H, Abe J, Tada M et al (2023) Development of a novel PET ligand, [11C]GO289 targeting CK2 expressed in the brain. Bioorg Med Chem Lett 90:129327. https://doi.org/10.1016/J.BMCL.2023.129327
22. Chen X, Li C, Wang D, Chen Y, Zhang N (2020) Recent Advances in the Discovery of CK2 Allosteric Inhibitors: From Traditional Screening to Structure-Based Design. Molecules 25(4):870. https://doi.org/10.3390/MOLECULES25040870
SH‑SY5Y,阿尔茨海默病,橙皮苷,CK2抑制剂,神经元
表观信息
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