地塞米松-他莫昔芬联合用药对他莫昔芬耐药乳腺癌细胞具有协同治疗作用
发布时间：
2026-06-27 21:12
地塞米松-他莫昔芬联合用药对他莫昔芬耐药乳腺癌细胞具有协同治疗作用
Aliaa I. Gaballah ，Aliaa A. Elsherbiny ，Marwa Sharaky ，Najat O. Hamed ，Nahed A. Raslan ，Abdullah Almilaibary7，Reda Mohamed Abdrabbou Fayyad ，Mona S. Ousman ，Ahmed M.E. Hamdan 以及 (D Sally A. Fahim
埃及新吉萨大学药学院，新吉萨，开罗-亚历山大沙漠路22公里处，吉萨，邮政信箱12577； 埃及新吉萨大学药学院生物化学系，新吉萨，开罗-亚历山大沙漠路22公里处，吉萨，邮政信箱12577； 埃及开罗大学国家癌症研究所癌症生物学系药理学组，吉萨； 沙特阿拉伯利雅得阿尔马雷法大学药学院制药科学系，邮政信箱71666； 埃及开罗艾资哈尔大学药学院(女子)药理毒理学系，开罗11651； 沙特阿拉伯麦地那阿尔拉扬学院健康科学与护理学院临床药学项目，麦地那42541； 沙特阿拉伯巴哈大学医学院家庭与社区医学系，巴哈； 埃及开罗艾资哈尔大学医学院药理学系， 沙特阿拉伯阿西尔巴特吉医学院普通医学实践项目药理学系，阿西尔61961；10沙特阿拉伯利雅得阿尔马雷法大学应用科学学院紧急医疗服务部，邮政信箱71666； 沙特阿拉伯塔布克大学药学院药学实践系，塔布克71491
通信作者:Sally A. Fahim (sally.atef@ngu.edu.eg)
他莫昔芬(TAM)是雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌(BC)治疗中的关键药物；然而， 的患者由于TAM耐药而出现复发且生存率较低。TAM耐药与SOX-2基因的过表达有关，该基因在Wnt信号通路中受E2F3转录因子调控。有研究表明，地塞米松(DEX)可抑制SOX-2的过表达，DEX是一种常用于BC患者的糖皮质激素。本研究的目的是通过调节E2F3/SOX-2介导的Wnt信号通路，探讨DEX与TAM联合使用对TAM耐药的LCC-2细胞(TAMR-1)的抑制作用。评估了联合治疗对MCF-7和TAMR-1细胞活力的影响。使用CompuSyn和SynergyFinder软件分析药物相互作用。还评估了细胞周期分布、凋亡蛋白表达、SOX-2和E2F3的基因表达水平以及细胞迁移情况。DEX与TAM联合使用可协同抑制TAMR-1细胞增殖和迁移，诱导凋亡，降低SOX-2和E2F3表达，还与S期和G2-M期阻滞有关。因此，DEX与TAM联合使用可能是一种有效的治疗选择，除了其抗炎作用外，还可通过靶向E2F3/SOX-2/Wnt信号通路克服TAM耐药。
引言
乳腺癌(BC)是全球诊断最广泛的癌症，2020年约有230万女性被诊断出患有该病 [1]。它还导致了超过68.5万女性死亡，使其成为全球癌症死亡的第二大原因 [2,3]。此外，预计到2040年将有超过300万新病例和100万死亡病例 [4]。同样，在埃及，BC是2020年诊断最多的癌症，也是癌症死亡的第二大原因 [5]。
雌激素是乳腺癌发展的主要因素，约80%的病例为雌激素受体阳性(ER+)[6]。雌激素的致癌性可归因于三个主要机制:直接导致基因毒性、诱导细胞增殖和促进非整倍体形成[7]。由于ER在乳腺癌中显著参与，内分泌治疗在治疗该疾病中起着关键作用[8]。
收到日期:2024年3月20日
修订日期:2024年6月3日
接收日期:2024年6月11日
在线预接受稿件:2024年6月12日 正式发表版本:2024年7月5日
主要使用三类内分泌治疗:选择性雌激素受体调节剂(SERM)、选择性雌激素受体下调剂和芳香化酶抑制剂[9]。治疗ER+乳腺癌最常用的治疗药物是他莫昔芬(TAM)，一种SERM。在乳腺组织中，TAM通过与雌激素竞争与ER结合发挥拮抗作用，取代雌激素并抑制其促肿瘤功能[10]。据报道，TAM可分别降低乳腺癌的复发率和死亡率约40%和30%。尽管TAM是ER+乳腺癌的首选治疗方法，但20 - 30%的患者表现出TAM耐药性，限制了其治疗效果[9]。TAM耐药导致许多ER+乳腺癌患者复发，并将生存率降低至20%以下[11,12]。确切机制尚不清楚；然而，研究表明保护性自噬、细胞周期调节剂和某些转录因子参与了TAM耐药的发展[13 - 15]。
性别决定区Y(SRY)-盒2(SOX-2)是一种特征明确的转录因子，与TAM耐药的出现有关[16,17]。它属于SOX基因家族，除了在不同癌症类型(如乳腺癌、肺癌和卵巢癌)中促进癌细胞干性和转移外，在细胞发育、增殖和分化中也起着至关重要的作用[18,19]。还发现它通过VEGFA上调促进血管生成[20]。据报道，SOX2通过靶向miR-181a-5p和miR-30e-5p/TUSC3轴促进乳腺癌[18]。
有人认为SOX-2受E2F转录因子3(E2F3)调节，E2F3是E2F转录因子家族的一员，是细胞周期调控的关键参与者[19,21,22]。E2F3与SOX-2的相互作用改变了其在TAM耐药细胞中的表达水平，并且它参与调节多能性、癌症干细胞(CSC)的分化和Wnt信号通路，这表明它可能参与了TAM耐药的出现[23]。因此，E2F3/SOX-2介导的Wnt信号可能是克服TAM耐药的一个有吸引力的治疗靶点。
皮质类固醇具有强大的抗炎特性，常用于治疗几种癌症相关适应症[24]。糖皮质激素是一类皮质类固醇，因其抗炎、抗过敏和抗水肿作用而被广泛用于癌症患者[25]。此外，糖皮质激素对不同类型的癌症包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤显示出各种抗癌作用[25,26]。
地塞米松(DEX)是最常用的糖皮质激素，通过与糖皮质激素受体(GR)结合发挥作用[27]。由于其高效能、长效作用和最小的盐皮质激素特性，它被用于管理癌症相关疼痛[28,29]。DEX的作用因乳腺癌的亚型而异。GR的高表达与ER - 乳腺癌的不良预后相关联，而与ER + 乳腺癌的良好预后相关联[30]。GR调节降低ER + 乳腺癌的增殖并导致化疗耐药[31,32]。而在ER - 乳腺癌患者中，GR的激活与肿瘤存活和化疗耐药相关基因的表达有关。这些基因参与抑制细胞凋亡和促进上皮 - 间质转化的途径[33,34]。
Wang等人的一项研究[35]表明，DEX预处理可降低骨髓抑制并增强某些化疗药物(如吉西他滨和顺铂)的抗肿瘤活性。据报道，DEX通过减少SOX-2驱动的肿瘤发生所需的炎症信号来降低肿瘤发生率。
此前，DEX的抗增殖作用及其机制在耐药性乳腺癌细胞中尚未得到证实。因此，探索最常用的糖皮质激素DEX对三苯氧胺耐药性乳腺癌细胞的作用机制，可能为通过干扰E2F3/SOX-2/ Wnt信号传导对抗耐药细胞产生协同效应提供重要见解。
结果
DEX与TAM联合使用可协同抑制三苯氧胺耐药性LCC-2细胞(TAMR-1)的增殖
通过SRB细胞活力测定评估了DEX和TAM单一疗法对MCF-7和TAMR-1细胞的影响。观察到两种药物均以剂量依赖性方式对两种细胞系具有抑制作用。使用生成的剂量反应曲线，确定了DEX和TAM的IC50值。在MCF-7细胞中，DEX和TAM的IC50值分别为 和 (图1A)。在TAMR-1细胞中，DEX和TAM的IC50值分别为 和 (图1B)。显然，与MCF-7细胞相比，TAMR-1细胞中TAM的IC50值增加了4.8倍。
在Vero正常细胞中，与TAMR-1细胞 相比，DEX显示出明显更低的细胞毒性，其中使用的最大剂量(117.7 )抑制正常细胞活力不到25%，而在TAMR-1细胞中为71%(图1C)。
图1. DEX和TAM对MCF-7和TAMR-1细胞的抗癌活性
将MCF-7细胞接种到96孔板中，并用39.25 - 117.74 µg/ml的DEX和0.93 - 11.15 µg/ml的TAM处理(A)。用39.25 - 117.74 µg/ml的DEX和12.38 - 37.15 µg/ml的TAM处理TAMR-1(B)。然后将细胞孵育 并用SRB染色。通过确定抑制百分比评估每种药物的抑制作用，并确定IC50值。抑制百分比
根据TAMR-1细胞单一疗法中的IC50值选择DEX和TAM联合治疗方案。以3:1的恒定DEX与TAM比例处理TAMR-1细胞，DEX浓度范围为39.25至 ，TAM浓度范围为12.38至 ，持续 。SRB分析显示所有联合处理的细胞中细胞活力均下降。用12.38 μg/ml的TAM处理的细胞在所有使用的DEX浓度下均显示出始终较高的抑制百分比，与 的DEX联合使用时抑制效果为85.7%。将39.25 μg/ml的DEX与12.38 μg/ml 的TAM联合使用，与TAM单一疗法相比，抑制百分比提高了53.38%(图2A)。
图2. DEX和TAM联合对TAMR-1细胞的抑制作用
以恒定的3:1比例用浓度递增的DEX和TAM处理TAMR-1细胞48小时后的抑制百分比(A)。红色阴影代表TAMR-1细胞的抑制量。(B, C) 二维和三维协同作用可视化显示DEX和TAM联合治疗之间存在协同作用。使用SynergyFinder 3.0软件将DEX和TAM联合治疗的抑制百分比可视化为剂量反应矩阵，以及DEX和TAM之间协同作用的二维和三维可视化。协同分数使用HSA参考模型计算。(D) 归一化等效线图表示不同DEX和TAM组合的受影响分数(Fa)和CI值。使用CompuSyn软件通过计算CI来确认DEX和TAM之间存在协同作用。CI < 1表明存在协同效应，CI = 1表明存在相加效应，CI > 1表明存在拮抗效应。
使用SynergyFinder 3.0软件，采用最高单一药物(HSA)参考模型来确定DEX和TAM之间的相互作用类型。二维和三维协同热图表明，DEX和TAM在很宽的浓度范围内表现出协同相互作用，协同分数为20.76，表明超出预期的反应为20.76%(图2B、C)。HSA协同分数大于10、介于10到 -10之间或小于 -10分别表示协同、相加或拮抗作用[36]。此外，使用CompuSyn软件通过使用Chou-Talalay方程[37]计算CI来确认DEX和TAM之间存在协同作用，并使用DRI确定联合治疗对降低TAM剂量的影响。将39.25 µg/ml的DEX和12.38 μg/ml的TAM联合使用时，显示出最低的CI为0.44，TAM的DRI等于4.47(图2D和补充表S1)。与单一疗法相比，这种联合使用使TAMR-1细胞中TAM的IC50从 降至8 。
当与DEX联合使用时，TAMR-1细胞中TAM的IC50从18降至 。基于计算出的协同分数、CI和DRI，为以下研究选择的联合方案包括39.25 μg/ml的DEX和 的TAM。
DEX与TAM联合诱导TAMR-1细胞凋亡
为了研究DEX与TAM联合是否诱导TAMR-1细胞凋亡，使用蛋白质印迹分析(图3A)测量促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白BCL-xL的表达水平。未处理的TAMR-1细胞作为对照。与对照组和TAM处理的细胞相比，DEX与TAM联合导致Bax表达水平升高，而与单一疗法和对照组相比，BCL-xL表达降低(图3B)。此外，与单独使用每种药物和对照组相比，联合使用显著增加了Bax/ Bcl-xL比值 。
DEX和TAM联合治疗诱导S期阻滞
为了确认DEX、TAM或它们的联合的抑制作用是否与细胞周期阻滞有关，在处理 后，使用流式细胞仪分析TAMR-1细胞的细胞周期分布。与对照(2.41%)相比，用DEX和TAM单一疗法处理的细胞在G2-M期的阻滞增加(DEX:3.38%，TAM:4.08%)。此外,与对照(S:46.22%，G2-M:2.41%，图4)相比，联合治疗导致S期(86.52%)以及G2-M期(7.57%)的阻滞增加。
DEX与TAM联合显著抑制TAMR-1细胞迁移
使用伤口愈合试验观察了用DEX、TAM或其组合处理 后的TAMR-1细胞的迁移能力。在0和 时未处理的TAMR-1细胞作为对照(图5A)。虽然DEX单药治疗对细胞迁移没有显著影响(P>0.05)，但与48小时对照相比，TAM单药治疗显著抑制了TAMR-1细胞迁移 。此外，与单药治疗和对照相比，将39.25μg/ml DEX和12.38 TAM联合使用导致TAMR-1细胞迁移的延迟最为显著(P<0.0001)(图5B)。
DEX与TAM联合治疗显著降低TAMR-1细胞中SOX-2和E2F3的表达
为了评估DEX对SOX-2和E2F3表达的影响及其与TAM耐药性的关系，对用 DEX、12.38μg/ml TAM或其组合处理 的MCF-7和TAMR-1细胞进行了RT-qPCR分析。数据以TAMR-1对照为标准进行归一化。结果表明，TAMR-1细胞中SOX-2和E2F3水平显著高于MCF-7细胞(P<0.0001)。与 时的TAMR-1对照相比，DEX、TAM或其组合的单药治疗均显著降低了SOX-2和E2F3的表达。此外，与DEX和TAM单药治疗相比，联合治疗降低了SOX-2和E2F3的表达。有趣的是，联合治疗的TAMR-1细胞与MCF-7细胞之间没有显著差异(图6)。
讨论
乳腺癌是一个全球关注的健康问题[2,3]。尽管TAM是首选治疗方法，但TAM的疗效受到TAM耐药性发展的限制[9]。先前的研究表明，可能的TAM耐药机制之一涉及转录因子SOX-2的过度表达[16,17]。
DEX是一种常用于治疗乳腺癌相关症状的糖皮质激素，先前有人认为它可以降低SOX-2的活性[38,39]。先前还发现DEX可增强某些化疗药物的细胞毒性作用并抑制肿瘤生长和转移[40,41]。基于这些先前的研究，本研究旨在通过靶向E2F3/SOX-2/Wnt信号通路来证明DEX、TAM或其组合对MCF-7和TAMR-1乳腺癌细胞系的细胞毒性作用。
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图3. TAMR-1细胞的蛋白质印迹分析
用 DEX、12.38μg/ml TAM或其组合处理 的TAMR-1细胞的蛋白质印迹分析。(A)TAMR-1细胞中Bax和BCL-xL表达水平的蛋白质印迹图像。(B)比较Bax和BCL-xL表达水平的柱状图。数据以 -肌动蛋白为标准进行归一化，并表示为与对照相比的倍数变化。(C)表示Bax与BCL-xL比值的柱状图。数据表示为平均值 标准差。使用单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey事后检验进行统计分析。**** 在 时具有显著性。
图4. TAMR-1细胞的细胞周期分布
暴露于39.25 DEX、12.38 TAM或其组合48小时的TAMR-1细胞的细胞周期分布。(A)流式细胞术结果显示停滞在每个细胞周期阶段的TAMR-1细胞百分比(G0-G1，紫色；S，绿色；G2-M，红色)。(B)比较对照和处理细胞中细胞周期分布百分比的代表性柱状图。
图5. TAMR-1细胞的伤口愈合试验
用39.25μg/ml地塞米松(DEX)、12.38μg/ml他莫昔芬(TAM)或其组合处理TAMR-1细胞48小时后的伤口愈合试验(A)。使用结晶紫作为染色剂。代表性柱状图显示了TAMR-1细胞迁移的定量分析，结果表示为平均值 标准差(B)。使用单因素方差分析(ANOVA)，随后进行Tukey事后检验进行统计分析。***在 水平上具有显著性，*** ， ，ns 无显著性。
图6. TAMR-1细胞中SOX-2和E2F3 mRNA表达的RT-qPCR分析
用39.25μg/ml地塞米松(DEX)、12.38μg/ml他莫昔芬(TAM)或其组合处理TAMR-1细胞48小时后，对SOX-2和E2F3 mRNA表达进行RT-qPCR分析。定量PCR结果以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为对照进行标准化，并表示为倍数变化。数据来自三个独立实验，并表示为平均值 标准差。使用双向方差分析(ANOVA)，随后进行Tukey事后检验进行统计分析。(a、b、c和d分别代表在 水平上TAMR-1、MCF-7、DEX和TAM的显著性。
据报道，SOX-2在促进不同癌症类型的肿瘤进展中起重要作用。其过表达与增殖增加、抗凋亡、自噬改变和癌症干细胞(CSC)维持有关[21,42]。Zhu等人[43]表明，SOX-2通过 -连环蛋白介导的自噬信号传导驱动化疗耐药性。此外，Loh等人[44]报道，Wnt通路与乳腺癌细胞中的他莫昔芬耐药性有关。在转录水平上，SOX-2由E2F3上调，E2F3是一种细胞周期调节因子，被发现参与乳腺癌的进展[45]。对SOX-2和E2F3基因表达进行分析，以评估地塞米松对TAMR-1细胞抑制作用的潜在机制。我们研究中TAMR-1细胞中SOX-2的较高表达与先前的研究结果一致，即SOX-2在耐药MCF-7细胞中过表达，沉默其表达可增加对他莫昔芬的敏感性[46]。虽然之前未确定TAMR-1细胞中E2F3的表达，但先前的研究报道，E2F3在紫杉醇耐药的MCF-7细胞以及包括卵巢癌和肺癌细胞在内的不同耐药癌症类型中表达升高[47-49]。用他莫昔芬或地塞米松或其组合处理导致SOX-2和E2F表达显著降低至非耐药细胞水平。同样，先前的一项研究报道，联合治疗通过下调SOX-2导致癌细胞的化疗敏感性增加[50]。地塞米松下调SOX-2的潜在机制可能涉及抑制Wnt/ -连环蛋白通路[51]。此外，还发现E2F3通过涉及诱导MEX3A的机制激活Wnt通路，导致促分化转录因子KLF4的抑制[52]。先前的研究结果表明，过量的糖皮质激素通过激活Wnt抑制剂(包括Dickkopf-1(Dkk-1))中断Wnt通路，据报道Dkk-1是乳腺癌中的一种肿瘤抑制因子，因为其抑制会导致乳腺癌细胞迁移和侵袭增加[53]。
我们的研究发现，地塞米松(DEX)处理导致MCF - 7和TAMR - 1细胞系的细胞活力降低，其IC50值大致相等。这与先前的研究相关，先前研究表明DEX对白血病、骨髓瘤和淋巴瘤等多种癌症类型具有促凋亡作用[25,26]。有趣的是，与TAMR - 1细胞相比，DEX对正常Vero细胞的细胞毒性显著更低。先前的一项研究报告称，DEX已显示出减轻细胞毒性化疗对正常组织长期影响的潜力[54]。然而，他莫昔芬(TAM)处理在MCF - 7和TAMR - 1细胞系上显示出不同的IC50值，分别为3.72和18μg/ml。TAM在TAMR - 1细胞上较高的IC50值表明，与MCF - 7细胞相比，TAMR - 1细胞的敏感性降低。先前的研究也支持了这一点，这些研究表明正常MCF - 7细胞和耐药性乳腺癌细胞系中的TAM IC50值存在类似差异[55]，一项研究表明MCF - 7细胞上的TAM IC50值为 ，TAMR - 1细胞上为17.54μg/ml [56]。与TAM单药治疗相比，DEX与TAM联合使用导致对TAMR - 1细胞的抑制作用增强。这与先前的研究一致，先前研究表明DEX预处理通过增强包括乳腺癌在内的各种癌症类型的肿瘤摄取，增强了某些化疗药物如卡铂、吉西他滨和阿霉素的抗肿瘤活性[35,40]。这也与先前的研究结果相关，先前的研究结果表明，TAM与其他抗炎药物联合使用会导致TAM在MCF - 7和TAMR - 1细胞中的抑制作用增强[57,58]。此外，与DEX联合使用时，TAMR - 1细胞中TAM的IC50从18降至 。这与先前的研究结果相关，先前的研究结果表明，DEX与抗癌药物联合使用，如淋巴瘤中的阿霉素、乳腺癌中的吉西他滨和乳腺癌中的紫杉醇，会导致抑制作用增强，紫杉醇的IC50从19.3降至5.22 。
使用SynergyFinder 3.0和CompuSyn软件进行的相互作用分析表明，DEX和TAM在TAMR - 1细胞中存在协同作用，协同得分、CI和DRI值表明了这一点[36]。该模型假设联合治疗产生的预期效果等同于相同剂量下单一药物较高效果的总和，这支持联合治疗产生的效果超出了单药治疗所能达到的效果[61]。
细胞凋亡是与化疗药物细胞毒性相关的重要机制，涉及内在和外在途径[62,63]。BCL - 2蛋白家族，包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白BCL - xL，在内在水平上调节细胞凋亡[64]。先前已将TAM耐药性与包括Bax在内的促凋亡蛋白水平降低诱导的细胞凋亡联系起来[65]。本研究表明，Bax在TAMR - 1对照细胞中不表达。先前发表的数据在癌症和耐药细胞中报告了类似结果[66 - 68]。Romero等人[66]报告称，BCL - 2家族蛋白；tBID可能能够独立于BAX和BAK直接诱导细胞凋亡。DEX与TAM联合使用增加了Bax的表达并降低了BCL - xL的表达。在MCF - 7细胞中，发现BCL - xL在预防细胞凋亡方面比Bcl - 2效率高十倍[69]。先前的研究结果表明，SOX - 2的下调在包括乳腺癌在内的各种癌症类型中显著诱导细胞凋亡[70 - 72]。此外，还发现SOX - 2通过增加卵巢癌细胞中抗凋亡蛋白如Bcl - 2的表达和降低促凋亡蛋白如PUMA/BBC3的表达来诱导耐药性[73]。
评估了TAMR-1细胞的细胞周期分布，以确定地塞米松(DEX)和他莫昔芬(TAM)治疗的抑制作用机制。本研究表明，DEX和TAM单药治疗导致TAMR-1细胞停滞在S期。这些发现与之前的研究相关，之前的研究表明，用TAM处理的TAMR-1细胞在S期积累[74]。此外，在本研究中，发现联合治疗可增加S期和G2-M期停滞。另一方面，Cheng等人[58]报道，将TAM与另一种抗炎药如阿司匹林联合使用会导致TAMR-1细胞停滞在G0-G1期。尽管之前未探讨DEX对TAMR-1细胞周期分布的影响，但发现其单药治疗以及与其他类型耐药癌症(如来那度胺耐药的多发性骨髓瘤)的联合作用可诱导细胞周期停滞在G0-G1期[75]。此外，Liu等人[18]的研究报道，BC细胞中SOX-2的表达增加了细胞周期蛋白如细胞周期蛋白D1以及细胞周期蛋白依赖性激酶4和6的水平，据报道这些蛋白与G1期和S期之间的转换有关[76]。Feng等人[77]的另一项研究报道，E2F3过表达通过干扰细胞周期促进肿瘤进展，因为其敲低导致G0-G1期停滞增加。
本研究表明，DEX和TAM联合使用具有迁移抑制作用。先前的研究发现，TAM治疗可抑制MCF-7细胞的迁移，但对耐药的TAMR-1细胞无效[78]。此外，据报道，与TAM单药治疗相比，联合治疗导致癌细胞迁移的延迟更显著[79,80]。DEX单药治疗以及与其他抗癌药物如阿霉素和多西他赛联合使用对BC细胞迁移具有显著的抑制作用[81-83]。然而，Pang等人[41]报道，虽然低剂量的DEX抑制迁移，但高剂量(高于 )可能促进BC进展。此外，发现SOX-2的表达与TUSC3蛋白的表达呈负相关，据报道TUSC3蛋白可抑制BC细胞的增殖和迁移[18]。此外，发现SOX-2通过Wnt/β-连环蛋白信号通路促进EMT，该通路诱导BC中的细胞迁移[84]。先前的研究还报道，SOX-2和E2F3可能促进癌细胞的迁移[85-87]。这些结果表明，将DEX与TAM联合使用可能通过涉及E2F3和SOX-2下调的机制抑制TAMR-1细胞的增殖和迁移。
DEX是CYP3A4的中度诱导剂，因此与DEX联合使用时，TAM的代谢可能会增加[88]。他莫昔芬的活性代谢物4-羟基他莫昔芬是通过CYP3A4介导的N-去甲基化和CYP2D6介导的羟基化产生的。当帕罗西汀与TAM同时给药时，会导致4-羟基他莫昔芬的血浆浓度降低[89]。此外，利福平通过增强CYP3A4降低了TAM的血浆浓度[90]。另一方面，将TAM与DEX联合使用有利于减轻DEX诱导的骨质疏松症和骨质减少，并使糖皮质激素(GC)耐药的细胞系Jurkat对DEX治疗敏感[91,92]。需要更多的研究来充分揭示DEX对TAM代谢的影响。
结论
SOX-2和E2F3的过表达可能导致对他莫昔芬(TAM)产生耐药性。研究发现，将地塞米松(DEX)与TAM联合使用可协同抑制TAMR-1细胞的生长和迁移，诱导细胞凋亡，并使细胞停滞在细胞周期的S期和G2/M期。此外，该联合用药使TAMR-1细胞中E2F3和SOX-2的表达下调，其水平与MCF-7细胞相当。总体而言，我们的数据表明，DEX与TAM联合使用可能是克服TAM耐药性的有效治疗选择，而E2F3/SOX-2/ Wnt信号通路可能是降低TAM耐药性的一个有前景的靶点。建议进一步研究E2F3/SOX-2/ Wnt信号通路抑制的下游效应，以更全面地了解所观察到的效应背后的分子机制。此外，也建议探索DEX在其他类型耐药癌细胞中的疗效。此外，还建议进行临床研究，以检测该信号通路是否可作为联合治疗的生物标志物，并评估这种联合治疗的安全性、疗效和最佳剂量。
材料与方法
药物和化学试剂
DEX由EVA制药公司(埃及开罗)提供，储存在 的密闭容器中。TAM购自Amriya制药工业公司(埃及亚历山大)，室温保存。使用前，将TAM和DEX溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，然后用RPMI-1640培养基稀释。
细胞系
人乳腺癌MCF-7细胞系、LCC-2 TAM耐药乳腺癌(TAMR-1)细胞系和正常Vero细胞系由美国细胞培养物保藏中心(美国明尼苏达州)提供，保存在含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中，于 、 湿度条件下培养。
细胞培养
在75-cm 培养瓶中，癌细胞在含有10% FBS和抗生素的RPMI-1640培养基中单层培养。当细胞达到70%汇合度时，将其传代至不同培养瓶中。使用前，用 胰蛋白酶将贴壁于细胞培养瓶的培养细胞消化，并在 条件下孵育 。
SRB细胞活力测定
在96孔微量滴定板中，以每孔5000个细胞的浓度接种细胞，在添加药物前让细胞贴壁 。细胞分别用不同浓度的每种药物作为单一疗法进行处理。进行初步筛选以确定所用浓度。根据初步筛选结果，MCF-7和TAMR-1细胞系均用不同浓度的DEX(100 - 300 μM/39.25 - 117.74 μg/ml)处理。此外，MCF-7和TAMR-1细胞分别用 和 的TAM处理。将培养板在 条件下孵育 ，然后使用酶标仪(德国Tecan公司Sunrise型)在570 nm波长下测量每孔的光密度(OD)。通过磺酰罗丹明B(SRB)法[93]测定DEX和TAM的细胞毒性。使用Graphpad Prism 8.2.1软件生成的剂量 - 反应曲线计算IC50值。
根据IC50，TAMR-1细胞用DEX和TAM以3:1的固定比例联合处理。联合用药方案中使用的剂量包括单一疗法的IC50以及高于和低于IC50的剂量。
协同效应分析
使用CompuSyn [94]和SynergyFinder 3.0 [95]进行协同分析。CompuSyn软件用于确定组合指数(CI)和剂量降低指数(DRI)。使用CI来确定DEX和TAM之间药物相互作用的类型，其中CI < 1表示协同效应，CI = 1表示相加效应，CI > 1表示拮抗效应。DRI用于确定与单一疗法相比，联合疗法中TAM的剂量可以降低多少倍，其中DRI < 1表示负剂量降低，DRI = 1表示无剂量降低，DRI > 1表示有利的剂量降低。SynergyFinder 3.0软件用于使用最高单药(HSA)参考模型[96,97]确定协同评分。
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表1 RT-qPCR正向和反向引物序列、登录号及退火温度
| 锗 | 登录号 | 正向引物 | 反向引物 | 扩增子大小(碱基对) | 解链温度 |
| 性别决定区Y框蛋白2 | NM_003106.4 | 5’-GAGCTTTGCAGGAAGTTTGC-3’ | -GCAAGAAGCCTCTCCTTGAA-3’ | 190 | 57.81°C |
| E2F转录因子3 | NM_001243076.3 | 5’-TATCCCTAAACCCGCTTCC-3’ | -TTCACAAACGGTCCTTCTA-3’ | 159 | 53.61°C |
| 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | NM_001357943.2 | -CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’ | 5′-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3’ | 195 | 54.58°C |
蛋白质免疫印迹分析
通过添加 Tris-HCl、 Triton X-100、pH 7.6且不含EDTA的蛋白酶抑制剂，从不同细胞中提取蛋白质。使用Pierce™ BCA蛋白质定量检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司)进行蛋白质定量。使用12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，然后将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(GE10600021 Sigma，西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州)。用 脱脂牛奶封闭膜，然后与细胞信号技术公司提供的抗 -肌动蛋白、抗BCL-xL和抗Bax单克隆兔抗体孵育 (β-肌动蛋白抗体:4970S，BCL-xL抗体:2764T，Bax抗体:2772T，美国加利福尼亚州)。然后用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔二抗(7074P2，细胞信号技术公司，美国马萨诸塞州丹弗斯)孵育膜。使用Chemi-Doc MP成像系统(伯乐公司，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯)进行图像处理，进行蛋白质表达和定量分析。
通过流式细胞术进行细胞周期分析
使用流式细胞术评估TAMR-1细胞在 地塞米松、12.38 + 他莫昔芬或其组合处理后的细胞周期。细胞在生长培养基中生长至70%汇合度，处理 后收集。胰蛋白酶消化后，细胞在 乙醇中于 固定过夜。细胞冲洗两次，然后重悬于碧云天(中国江苏)提供的含50 mg/ml碘化丙啶(PI)和0.1 mg/ml核糖核酸酶A(RNase A)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后在黑暗中于 孵育 。使用BD Biosciences公司(美国新泽西州)提供的LSR II FACS流式细胞仪分析细胞，以确定细胞周期各阶段的细胞分布。
细胞迁移实验
通过伤口愈合实验检测TAMR-1细胞的迁移。将细胞接种到6孔板后，用移液器吸头在孔间造成伤口。通过冲洗孔去除多余细胞。吸出培养基，用39.25μg/ml地塞米松、12.38μg/ml他莫昔芬或其组合处理孔，未处理的孔作为0小时和48小时的对照。使用倒置显微镜(DFC290，徕卡公司，德国韦茨拉尔)进行图像采集，并通过测量伤口间隙大小分析迁移距离。
使用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定SOX-2和E2F3基因表达
使用德国耶拿生物科学公司(慕尼黑)提供的总RNA纯化试剂盒从处理和对照样品中分离总RNA。美国应用生物系统公司(加利福尼亚州福斯特城)提供了用于将RNA转化为cDNA的cDNA存档试剂盒。使用Promega公司(美国威斯康星州麦迪逊)的GoTaq PCR预混液，通过将预混液的 与cDNA的 、每种引物的 和CXR参比染料的 混合进行定量PCR。使用美国应用生物系统公司(加利福尼亚州福斯特城)的7500实时PCR系统进行该实验方案，该方案包括在 下变性 以及退火 的40个循环。使用 技术分析后，将值记录为相对于GAPDH调整后的相对表达水平[98]。引物序列、登录号和熔解温度 列于表1。
数据可用性
支持本研究结果的数据可应相应作者的要求提供。
利益冲突
作者声明与该手稿不存在利益冲突。
资金
作者声明没有资金来源需要致谢。
CRediT作者贡献
Aliaa I. Gaballah:软件、方法学、撰写 - 原始草案。Aliaa A. Elsherbiny:撰写 - 原始草案。Marwa Sharaky:监督、方法学、撰写 - 审阅与编辑。Najat O. Hamed:验证、撰写 - 审阅与编辑。Nahed A. Raslan:验证、方法学、撰写 - 审阅与编辑。Abdullah Almilaibary:形式分析、撰写 - 审阅与编辑。Reda Mohamed Abdrabbou Fayyad:形式分析、方法学、撰写 - 审阅与编辑。Mona S. Ousman:撰写 - 审阅与编辑。Ahmed M.E. Hamdan:概念化、撰写 - 原始草案。Sally A. Fahim:概念化、软件、形式分析、监督、验证、方法学。
致谢
作者谨向沙特阿拉伯利雅得的Almaarefa大学表示诚挚的感谢，感谢其为本研究提供支持。
缩写
BC，乳腺癌；CI，联合指数；CSC，癌症干细胞；DEX，地塞米松；DRI，剂量降低指数；ER，雌激素受体；E2F3，E2F转录因子3；GC，糖皮质激素；GR，糖皮质激素受体；SOX-2，SRY盒2；SRB，磺酰罗丹明-B；SRY，性别决定区Y；TAM，他莫昔芬。
参考文献
1 Bray, F., Laversanne, M., Sung, H., Ferlay, J., Siegel, R.L., Soerjomataram, I. et al. (2024) Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 74, 229-263, https://doi.org/10.3322/caac.21834
2 Bray, F., Ferlay, J., Soerjomataram, I., Siegel, R.L., Torre, L.A. and Jemal, A. (2018) Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 68, 394-424, https://doi.org/10.3322/caac.21492
3 (2022) Breast cancer n.d. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/breast-cancer (accessed on September 6, 2022)
4 Arnold, M., Morgan, E., Rumgay, H., Mafra, A., Singh, D., Laversanne, M. et al. (2022) Current and future burden of breast cancer: Global statistics for 2020 and 2040. Breast 66, 15-23, https://doi.org/10.1016/j.breast.2022.08.010
5 Ibrahim, A.H. and Shash, E. (2022) General oncology care in Egypt. Cancer Arab World 41-61, https://doi.org/10.1007/978-981-16-7945-2’4
6 (2022) Hormone Receptor Status n.d., https://www.breastcancer.org/pathology-report/hormone-receptor-status (accessed on September 24, 2022)
7 Russo, J. and Russo, I.H. (2006) The role of estrogen in the initation of brest cancer. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 102, 89, https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2006.09.004
8 Yao, J., Deng, K., Huang, J., Zeng, R. and Zuo, J. (2020) Progress in the understanding of the mechanism of tamoxifen resistance in breast cancer. Front Pharmacol. 11, 1848, https://doi.org/10.3389/fphar.2020.592912
9 Ali, S., Rasool, M., Chaoudhry, H., Pushparaj, P.N., Jha, P., Hafiz, A. et al. (2016) Molecular mechanisms and mode of tamoxifen resistance in breast cancer. Bioinformation 12, 135, https://doi.org/10.6026/97320630012135
10 Farrar, M.C. and Jacobs, T.F. (2022) Tamoxifen. Encyclopedia of Toxicology, Third Edition, pp. 471-473
11 Sotgia, F., Fiorillo, M., Lisanti, M.P., Sotgia, F., Fiorillo, M. and Lisanti, M.P. (2017) Mitochondrial markers predict recurrence, metastasis and tamoxifen-resistance in breast cancer patients: Early detection of treatment failure with companion diagnostics. Oncotarget 8, 68730-68745, https://doi.org/10.18632/oncotarget.19612
12 Zhu, Y., Liu, Y., Zhang, C., Chu, J., Wu, Y., Li, Y. et al. (2018) Tamoxifen-resistant breast cancer cells are resistant to DNA-damaging chemotherapy because of upregulated BARD1 and BRCA1. Nat. Commun. 9, 1-11, https://doi.org/10.1038/s41467-018-03951-0
13 Gao, A., Sun, T., Ma, G., Cao, J., Hu, Q., Chen, L. et al. (2018) LEM4 confers tamoxifen resistance to breast cancer cells by activating cyclin D-CDK4/6-Rb and ERα pathway. Nat. Commun. 9, 4180-4125, https://doi.org/10.1038/s41467-018-06309-8
14 Jia, Y., Zhou, J., Luo, X., Chen, M., Chen, Y., Wang, J. et al. (2018) KLF4 overcomes tamoxifen resistance by suppressing MAPK signaling pathway and predicts good prognosis in breast cancer. Cell. Signal. 42, 165-175, https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2017.09.025
15 Fahim, S.A., ElZohairy, Y.A. and Moustafa, R.I. (2024) Favipiravir, an antiviral drug, in combination with tamoxifen exerts synergistic effect in tamoxifen-resistant breast cancer cells via hTERT inhibition. Sci. Rep. 14, 1844-1858, https://doi.org/10.1038/s41598-024-51977-w
16 Piva, M., Domenici, G., Iriondo, O., Rábano, M., Simões, B.M., Comaills, V. et al. (2014) Sox2 promotes tamoxifen resistance in breast cancer cells. EMBO Mol. Med. 6, 66, https://doi.org/10.1002/emmm.201303411
17 Jin, M.L., Yang, L. and Jeong, K.W. (2022) SETD1A-S0X2 axis is involved in tamoxifen resistance in estrogen receptor -positive breast cancer cells. Theranostics 12, 5761, https://doi.org/10.7150/thno.72599
18 Liu, K., Xie, F., Gao, A., Zhang, R., Zhang, L., Xiao, Z. et al. (2017) SOX2 regulates multiple malignant processes of breast cancer development through the SOX2/miR-181a-5p, miR-30e-5p/TUSC3 axis. Mol. Cancer 16, 1-14, https://doi.org/10.1186/s12943-017-0632-9
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ER阳性乳腺癌,他莫昔芬,地塞米松
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