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EpCAM启动子区域的rs62139665多态性与埃及人丙型肝炎病毒相关肝细胞癌风险的关系

发布时间：

2026-08-01 09:52

开放获取

编辑:

纳迪娅·M·哈姆迪，

埃及艾因夏姆斯大学

审阅:

施竹清，

北岸大学医疗系统，

美国

奥斯卡恩·巴希迪诺夫·塔西诺夫，

保加利亚瓦尔纳医科大学

*通信作者:

南希·纳比尔·沙欣

nancy.shahin@pharma.cu.edu.eg

专业领域:

本文已提交至《肿瘤学前沿》杂志的胃肠癌:肝胰胆管癌板块

收稿日期:2021年8月5日

录用日期:2021年12月6日

发布时间:2022年1月5日

引用:

Motawi TMK、Sadik NAH、Sabry D、Fahim SA和Shahin NN(2022年)EpCAM启动子区域的rs62139665多态性与埃及人丙型肝炎病毒相关肝细胞癌风险的关系。《肿瘤前沿》11:754104。doi:10.3389/fonc.2021.754104

EpCAM启动子区域的rs62139665多态性与埃及人丙型肝炎病毒相关肝细胞癌风险的关系

塔雷克·穆罕默德·卡迈勒·莫塔维、内尔敏·阿卜杜勒·哈米德·萨迪克、迪娜·萨布里、萨利·阿泰夫·法希姆和南希·纳比尔·沙欣

开罗大学药学院生物化学系，开罗，埃及，开罗巴德尔大学医学院医学生物化学与分子生物学系，巴德尔城，埃及，3开罗大学医学院医学生物化学与分子生物学系，开罗，埃及，4新吉萨大学(NGU)药学院生物化学系，开罗，埃及

肝细胞癌(HCC)是一个全球性的健康问题，在埃及尤为令人担忧。HCC的主要危险因素是丙型肝炎病毒(HCV)感染，这是埃及的一个主要负担。上皮细胞粘附分子(EpCAM)是一种干细胞标志物，参与包括HCC在内的许多恶性肿瘤的发生和发展。我们研究了EpCAM启动子区域的-935 C/G单核苷酸多态性(rs62139665)与埃及人HCC风险、EpCAM表达和总生存期的关系。共有266名患者(128例HCV患者和138例HCC病例)和117名年龄和性别匹配的对照参与了本研究。使用等位基因鉴别进行基因分型并通过测序确认，结果显示EpCAM rs62139665与HCC易感性之间存在显著关联，HCC患者中GG基因型和G等位基因的分布高于非HCC受试者。与对照组相比，在HCV患者中未检测到这种关联。在隐性模型中，通过RT-qPCR在血液中测定的EpCAM基因表达水平及其通过ELISA测定的血清蛋白表达水平，在HCV和HCC患者中，GG基因型携带者相对于GC+CC基因型携带者显著更高。EpCAM蛋白水平的ROC分析显示HCC患者与非HCC受试者之间具有显著的鉴别能力，与单独使用 -甲胎蛋白相比，联合使用 -甲胎蛋白和EpCAM时诊断准确性更高。总之，EpCAM rs62139665多态性与埃及人群中的HCC以及EpCAM基因和蛋白表达水平显著相关。此外，血清EpCAM水平可能有望用于HCC诊断并提高 -甲胎蛋白的诊断准确性。

关键词:上皮细胞粘附分子；单核苷酸多态性；丙型肝炎病毒；肝细胞癌；埃及人

1引言

丙型肝炎病毒(HCV)感染是埃及的一个主要负担，感染了近14.7%的人口。埃及的HCV感染率被认为是全球最高的。慢性HCV是埃及肝脏相关死亡的主要原因(1)。

肝细胞癌(HCC)被认为是全球癌症相关死亡的第三大原因(2)。这种高死亡率可归因于HCC症状的晚期表现，因此其诊断较晚。这种诊断不足在筛查工具有限的资源匮乏地区尤为突出(3)。大约60-80%的HCV患者会发展为慢性肝炎，其中10-20%会在20-30年内发展为肝硬化。约1-5%的肝硬化患者可能会发展为HCC(4)。因此，肝硬化的存在会增加HCC的风险，然而，一些患者在非肝硬化肝脏且无炎症的情况下也会发展为HCC(5)。几项研究报告了一些导致HCC发病的遗传和表观遗传缺陷。

一小部分癌症干细胞(CSCs)负责肿瘤的起始、生长、转移以及治疗后的复发(8, 9)。CSCs主要对放疗和化疗具有高度抗性(10, 11)。上皮细胞粘附分子(EpCAM)是一种位于2号染色体p21的跨膜糖蛋白，在除鳞状细胞癌、尿路上皮癌和肾细胞癌之外的大多数上皮癌中高度表达(12)。EpCAM被认为是肝CSCs的重要标志物(13)，一旦细胞分化为成熟肝细胞，它就会消失(14)。在EpCAM高表达的癌症中观察到预后不良(15)。EpCAM的作用不仅限于细胞间连接，还在肝细胞的迁移、增殖、信号传导、分化、转移和更新中发挥重要作用(16)。EpCAM通过激活Wnt信号并增加高度增殖肿瘤细胞中的c-Myc表达来发挥作用(17, 18)。

单核苷酸多态性(SNPs)被认为是遍布人类基因组的最常见的遗传多样性形式，并且是导致患者之间遗传特征的大多数变异性的原因，如疾病易感性、预后和对治疗的反应(19)。基因的启动子区域单核苷酸多态性调节其表达，因为转录因子与该区域内的某些核苷酸序列结合，从而调节翻译并使个体易患某些疾病，包括癌症(20 - 22)。例如，EpCAM基因中的单核苷酸多态性rs1126497与乳腺癌和宫颈癌的风险增加显著相关，以及与患有门静脉肿瘤血栓的非小细胞肺癌患者和肝癌患者的总生存期(OS)相关(19，23 - 25)。这些发现表明，EpCAM基因中的单核苷酸多态性可能在各种类型癌症的发生和发展中起重要作用。

本研究的目的是调查EpCAM基因启动子区域的-935 C/G SNP(rs62139665)是否与其高表达相关，从而与埃及丙型肝炎患者的肝癌易感性和总生存期相关。

2 主题与方法

2.1 主题

本研究对266例埃及患者进行，这些患者分为128例丙型肝炎病毒(HCV)感染患者和138例HCV相关的肝细胞癌(HCC)患者，于2014年6月至2017年10月从开罗大学医学院地方病医学与胃肠病学系招募。患者随访2年，除非死亡。所有HCV患者均检测到丙型肝炎病毒RNA，而HCC患者的HCV感染通过抗HCV抗体检测呈阳性来确定。HCC患者的病史见表S1。HCC患者除根据血清甲胎蛋白(AFP)水平外，还根据病理学、细胞学、超声和计算机断层扫描(CT)成像进行诊断。还评估了肿瘤数量、病变大小、宏观血管侵犯、TNM分期、门静脉血栓形成、门静脉高压以及脑部、胸部和全身骨骼CT(以排除肝外转移)。还确定了终末期肝病模型(MELD)和Child-Pugh评分。接受放疗或化疗或患有其他类型癌症的HCC患者被排除在研究之外。

117名年龄和性别与患者匹配的明显健康志愿者作为对照组加入了研究(表1)。他们均表现出肝功能指标正常、肝胆超声正常，以及病毒性肝病和自身免疫性疾病的血清学结果为阴性，且既往无肝病病史。研究组的肝脏超声检查结果见表S2。

所有研究参与者均签署了知情同意书。该研究方案已获得开罗大学药学院研究伦理委员会的批准(许可证编号:BC 1813)，并符合1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则。

乙肝病毒(HBV)或人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体、糖尿病、脂肪肝、活动性血吸虫病、血液中存在酒精或重金属被视为研究参与者的排除标准。

2.2方法

2.2.1 样本处理及实验室检测

由训练有素的实验室技术人员从所有入组受试者中采集10毫升静脉血标本。采集的样本按先前描述的方法(22)进行分装和处理。简要地说，一份用于RNA和DNA提取以及随后的基因表达分析、基因分型和测序。第二份分装样本分为血浆，用于检测白蛋白以及凝血酶原时间-国际标准化比值(PT-INR)。第三份分装样本用于血清分离，以评估HCV-RNA和抗体滴度、甲胎蛋白(AFP)和上皮细胞粘附分子(EpCAM)水平、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性，以及总胆红素和直接胆红素。根据依赖白蛋白、胆红素、凝血酶原时间、腹水和脑病的Child评分系统评估HCC中的肝硬化程度。根据Child和Turcotte(26)为患者分配Child-Pugh分级。

缩写:AFP，甲胎蛋白；ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；CIs，置信区间；CSCs，癌症干细胞；CT，计算机断层扫描；EpCAM，上皮细胞粘附分子；HCC，肝细胞癌；HCV，丙型肝炎病毒；HWE，哈迪-温伯格平衡；MELD，终末期肝病模型；OR，比值比；OS，总生存期；PT-INR，凝血酶原时间-国际标准化比值；ROC，受试者工作特征曲线；SNPs，单核苷酸多态性。

表1 | HCV、HCC患者和健康对照的人口统计学特征和实验室数据。

	对照(n = 117)	丙型肝炎病毒(n = 128)	肝细胞癌(n = 138)	P值
年龄(岁)	49.17 ± 18.69	48.29 ± 13.2	52.28 ± 10.29	0.06
性别
男性	62 (52.9%)	76 (59.4%)	83 (60.1%)	0.46
女性	55 (47.1%)	52 (40.6%)	55 (39.9%)
血红蛋白	10.82 ± 1.14	13.89 ± 1.48†		<0.0001
白细胞(x103)		6.49 ± 1.96†		<0.0001
血小板(x103)	186.4 ± 77.48	238.62 ± 110.22†		<0.0001
PC(%)	92.03 ± 5.73	79.72 ± 25.73†		<0.0001
PT - INR	1.09 ± 0.11	1.08 ± 0.11		0.002
直接胆红素(mg/dl)	0.21 ± 0.13			<0.0001
总胆红素(mg/dl)	0.91 ± 0.22			<0.0001
谷丙转氨酶(U/L)	27.55 ± 6.51		59.2 ± 36.13†	<0.0001
谷草转氨酶(U/L)	26.82 ± 6.35		70.21 ± 39.11†‡	<0.0001
碱性磷酸酶(U/L)	78.54 ± 29.51		180.89 ± 58.54**	<0.0001
白蛋白(g/dl)	4.13 ± 0.58	4.22 ± 0.42		<0.0001
肌酐(mg/dl)	0.98 ± 0.63	0.88 ± 0.21		0.038
甲胎蛋白(ng/ml)	3.95 ± 1.89	6.82 ± 15.81		<0.0001

数据表示为平均值，或。

使用卡方(X’2)检验比较性别数据。其余数据使用单向方差分析和Tukey多重比较检验进行分析。

与对照组有显著差异。

与丙型肝炎病毒组有显著差异。

WBCs，白细胞；PC, 凝血酶原浓度；PT-INR，凝血酶原时间-国际标准化比值；DBII，直接胆红素；TBII，总胆红素；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；ALP，碱性磷酸酶；AFP，甲胎蛋白。

2.2.2 设计引物和探针

EpCAM序列从NCBI获取。使用Ensembl基因组浏览器90显示所有变体，以设计不叠加单核苷酸多态性(SNP)的引物。然后，使用Primer3Plus设计等位基因特异性引物和探针，并通过Blast和MFEprimer-2.0检查其特异性。我们在5’非翻译区选择了一个MAF超过20%且预计可调节启动子与各种转录因子结合亲和力从而改变EpCAM基因表达的SNP，rs62139665。

2.2.3 EpCAM mRNA表达分析

RNA提取、逆转录和定量聚合酶链反应(qPCR)按先前描述(22)进行。简要地说，使用总RNA纯化试剂盒(德国慕尼黑耶拿生物科学公司)从血样中提取总RNA，然后将分离的RNA储存在直至分析。使用cDNA存档试剂盒(美国加利福尼亚州福斯特城应用生物系统公司)进行逆转录。使用GoTaq PCR预混液(美国麦迪逊普洛麦格公司)进行定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)；将1微升 cDNA加入到预混液、 CXR参比染料、正向和反向引物中，并将体积补足至。在7500实时PCR系统(美国加利福尼亚州福斯特城应用生物系统公司)上进行一个方案，包括在初始变性10分钟，然后在变性40个循环，每个循环15秒，在退火和延伸1分钟，然后在延伸30秒。所用引物序列如下:5’-AGTGTAATGGCACGATCTCTG-3’(正向)，用于EpCAM的5’-GGATCACCTGAGGTTTGAAGT-3’(反向)，以β-肌动蛋白作为内对照。

2.2.4 EpCAM单核苷酸多态性rs62139665基因分型

DNA提取和基因分型按先前详细描述(22)进行，使用引物:5’-AGTGTAATGGCACGATCTCTG-3’(正向)和5’-GGATCACCTGAGGTTTGAAGT-3’(反向)，以及两个标记探针:VIC-TAGTAGAGACGGGGTTCCTCCATGT和FAM-TAGTAGAGACGGCGTTCCTCCATGT。6-羧基-X-罗丹明(ROX)用作被动参比染料。

2.2.5 Sanger测序

为验证等位基因鉴别结果，如Motawi及其同事先前所述(22)对每种基因型的20个样本进行测序。所用引物序列如下:5’-GGCTCTATGGGAACACCTTT-3’(正向)和5’-GGATCACC TGAGGTTTGAAGT-3’(反向)。扩增子大小为240 bp。

2.2.6 血清EpCAM水平的测定

血清EpCAM蛋白浓度通过美国加利福尼亚州普莱森顿市博斯特生物技术公司提供的ELISA试剂盒(产品目录编号:EK0755)按照其操作指南进行测定。

2.2.7统计分析

数据以均值、数量(百分比)或中位数(四分位间距)表示。两组之间的差异分别通过学生t检验和卡方检验对数值变量和分类变量进行统计分析。三组之间的差异使用单因素方差分析，随后进行Tukey多重比较事后检验进行评估。进行受试者操作特征(ROC)分析以分别或联合计算EpCAM和AFP的敏感性和特异性。通过Spearman相关分析测试EpCAM和AFP水平之间的相关性。使用四种模型(显性、隐性、超显性和乘法模型)评估每种基因型与HCC风险之间的关联。进行逻辑回归以估计EpCAM SNP rs62139665与HCC风险之间关联的比值比(OR)和95%置信区间(CI)。对于双侧检验，P值低于0.05被认为具有统计学意义。采用Kaplan-Meier方法和对数秩生存检验来估计总生存期(OS)。使用GraphPad Prism 6(美国加利福尼亚州GraphPad软件公司)和SPSS软件20.0版(美国伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司)统计软件包进行统计分析。在线测试Hardy-Weinberg平衡(HWE)(http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml)。

3结果

3.1研究参与者的人口统计学、实验室和临床特征

研究参与者的人口统计学特征以及实验室和临床数据见表1、S1和S2。研究组之间年龄和性别均无显著差异。

3.2研究组中EpCAM rs62139665多态性的基因型分布和等位基因频率，以及符合Hardy-Weinberg平衡情况

如表2所示，对照组、HCV组和HCC组的基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡的假设。

表3和图1显示了EpCAM rs62139665多态性的基因型和等位基因频率。与HCV患者和 (分别为P = 0.0001)以及对照组和 (分别为P = 0.001)相比，HCC组中GG基因型和G等位基因频率显著更高，而HCV组和对照组之间未发现显著差异。根据遗传模型选择策略(27)，选择隐性模型，因为它最适合分析rs62139665与HCC风险之间的关联。表4显示了rs62139665与HCV和HCC的关联。在HCC病例中，相对于对照组(OR = 2.86，P = 0.003)和HCV组(OR = 2.66， )，rs62139665 GG基因型携带者的分布明显高于GC + CC基因型携带者。此外，HCC病例中G等位基因频率明显高于对照组(OR = 1.76， )和HCV组(OR )。

本文报道的结果突出了EpCAM rs62139665 SNP与埃及人HCC易感性之间的显著关联。然而，在测试样本中，EpCAM rs62139665与HCV风险无显著关联。

3.3 EpCAM rs62139665多态性与HCC患者临床病理特征的关联

至于临床病理变量，与GC + CC基因型相比，GG基因型与更高的碱性磷酸酶(ALP)活性显著相关( ，表5)。此外，Kaplan-Meier和对数秩生存检验显示，HCC组中EpCAM rs62139665 GG基因型携带者的总生存期和生存时间与GC + CC基因型携带者相比无显著降低。此外，与GG基因型携带者相比，GC + CC基因型携带者的终末期肝病模型(MELD)评分无显著降低(表5和图2)。

表2 | EpCAM -935 C/G(rs62139665)的Hardy Weinberg平衡

组	观察频率			预期频率			P值
基因型	CC	GC	GG	CC	GC	GG	P值
对照	45	60	12	48.08	53.85	15.08	0.22
丙型肝炎病毒	58	56	14	57.78	56.44	13.78	0.93
肝细胞癌	35	69	34	35	69	34	0.99

采用卡方检验来确定是否偏离哈迪-温伯格平衡(HWE)。

表3 | 患者组和对照组中EpCAM rs62139665基因型和等位基因的频率分布。

	对照	丙型肝炎病毒	肝细胞癌
胆管癌	45 (0.39)	58 (0.45)	35 (0.25)
胃癌	60 (0.51)	56 (0.44)	69 (0.5)
未提及具体含义，保留原文	12 (0.1)	14 (0.11)	34 (0.25)
P值	0.04†			0.00061
C	150 (0.64)	172 (0.67)	139 (0.51)
G	84 (0.36)	84 (0.33)	137 (0.49)
P值	0.001†			0.0001

数据表示为。

检验肝癌与对照组频率的差异。

检验丙型肝炎病毒与对照组频率的差异。

检验肝癌与丙型肝炎病毒频率的差异。

检验研究人群中频率的差异。

图1 | EpCAM rs62139665 G/C等位基因的等位基因鉴别图，显示Y轴附近的C/C基因型(由左上角的点表示)、X轴附近的G/G基因型(由右下角的点表示)以及两轴之间中间位置的G/C基因型。

3.4研究组中EpCAM基因和蛋白表达水平

如表6所示，与对照组相比，EpCAM在基因和蛋白水平的表达在丙型肝炎病毒和，分别)以及肝癌患者中显著更高。此外，肝癌患者中EpCAM蛋白表达水平明显高于丙型肝炎病毒患者，而两组之间基因表达水平无显著差异。比较rs62139665基因型之间EpCAM的表达，我们观察到EpCAM rs62139665多态性与其表达之间存在显著关联。在三个研究组和中，GG携带者在基因和蛋白表达方面，分别)在对照组中表现出比GC + CC携带者显著更高的EpCAM基因和蛋白表达水平；在丙型肝炎病毒组和肝癌组中，基因和蛋白表达均如此)。

3.5血清甲胎蛋白水平、与EpCAM水平的相关性以及甲胎蛋白和EpCAM单独及联合的鉴别性能的ROC分析

比较三个研究组中的血清甲胎蛋白水平，发现肝癌组中的水平明显高于对照组和丙型肝炎病毒组。如图S1所示，观察到甲胎蛋白与EpCAM蛋白水平之间存在强正相关(r 。

EpCAM蛋白表达水平的ROC曲线显示肝癌患者与非肝癌受试者之间具有显著的鉴别能力(AUC = 0.92，CI = 0.87 - 0.97， )，如图S2所示，表明其诊断准确性与甲胎蛋白相当(AUC = 0.961，CI = 0.92 - 0.99， 0.0001)。将甲胎蛋白和EpCAM联合使用导致诊断准确性比单独使用甲胎蛋白或EpCAM有所提高(AUC = 0.99，CI = 0.95 - 1，P < 0.0001)。

表4 | 不同研究组中EpCAM -935 C/G多态性的基因型和等位基因频率及其通过逻辑回归分析与丙型肝炎病毒和肝癌风险的关联。

	基因型/等位基因	对照(117)N(%)	丙型肝炎病毒(128)N(%)	肝细胞癌(138)N(%)	优势比(95%置信区间)	P值†	优势比*(95%置信区间)	P值*	比值比(95%置信区间)	P值
共显性	CC	45 (38.5%)	58 (45.3%)	35 (25.4%)	参考		参考		参考
	GC	60 (51.3%)	56 (43.8%)	69 (50%)	1.47 (0.84 - 2.59)	0.2	0.72 (0.42 - 1.23)	0.28	2.04 (1.18 - 3.53)	0.01
	GG	12 (10.2%)	14 (10.9%)	34 (24.6%)	3.64 (1.64 - 8.04)	0.001	0.9 (0.38 - 2.15)	0.83	4.02 (1.89-8.52)	0.0002
显性	GC + GG	72 (61.5)	70 (54.7%)	103 (74.6%)	1.84 (1.07 - 3.14)	0.03	0.75 (0.45 - 1.25)	0.3	2.43 (1.45-4.09)	0.0008
隐性	GC + CC	105 (89.7%)	114 (89.1%)	104 (75.4%)	2.86 (1.4 - 5.83)	0.003	1.07 (0.47-2.43)	1	2.66 (1.35-5.23)	0.004
超显性	CC + GG	57 (48.7%)	72 (56.2%)	69 (50%)	1.05 (0.64 - 1.72)	0.9	1.35 (0.81 - 2.24)	0.25	0.78 (0.47 - 1.26)	0.32
等位基因	C	150 (64.1%)	172 (67.2%)	139 (50.4%)	参考		参考		参考
等位基因	G	84 (35.9%)	84 (32.8%)	137 (49.6%)	1.76 (1.23 - 2.51)	0.002	0.87 (0.6 - 1.26)	0.5	2.02 (1.41 - 2.86)	0.0001

通过逻辑回归估计95%的优势比(OR)和置信区间(CI)用于关联分析。

肝癌与对照。

丙肝病毒与对照。

肝癌与丙肝病毒。

HCC，肝细胞癌；HCV，丙型肝炎病毒；OR，优势比。

表5 | 肝癌患者生化参数与EpCAM -935 C/G多态性的关联。

基因型/参数	GC + CC(n = 104)	GG(n = 34)	P值
血红蛋白	12.57 ± 1.58	12.67 ± 1.93	0.75
白细胞(x103)	5.82 ± 1.99		0.39
血小板(x103)	142 ± 61.18	128.3 ± 65.54	0.27
PC(%)	77.42 ± 13.61	75.16 ± 11.23	0.38
PT - INR	1.23 ± 0.21	1.26 ± 0.14	0.37
直接胆红素(mg/dl)	0.5 ± 0.37	0.54 ± 0.27	0.58
总胆红素(mg/dl)	1.21 ± 0.6	1.27 ± 0.58	0.6
谷丙转氨酶(U/L)	56.42 ± 34.97	67.82 ± 38.81	0.11
谷草转氨酶(U/L)	67.45 ± 38.25	67.73 ± 33.78	0.59
碱性磷酸酶(U/L)	173.7 ± 56.29	205 ± 60.56	0.01*
白蛋白(g/dl)	3.33 ± 0.56	3.46 ± 0.39	0.23
肌酐(mg/dl)	0.86 ± 0.23	0.86 ± 0.19	0.99
生存期(月)	15.31 ± 9.15	13.03 ± 8.87	0.22
终末期肝病模型评分	9 (6-11)	10 (6-15)	0.2
Child - Pugh评分	A(n = 68)；B(n = 30)；C(n = 6)		0.32
甲胎蛋白(ng/ml)	238.4 ± 430	1947 ± 2445	<0.0001*

数据以均值标准差或中位数(四分位间距)表示，具有显著性。使用学生检验进行参数检验，曼-惠特尼检验进行非参数检验，卡方检验进行分类变量比较。

WBCs，白细胞；PC，凝血酶原浓度；PT-INR，凝血酶原时间-国际标准化比值；D BII，直接胆红素；T BII，总胆红素；ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸氨基转移酶；ALP，碱性磷酸酶；MELD，终末期肝病模型；A、B和C，根据Child和Turcotte(26)指出的标准划分的Child-Pugh A级(5至6分)、B级(7至9分)和C级(10至15分)；AFP，甲胎蛋白。

3.6 通过桑格测序法对EpCAM rs62139665基因分型结果的验证

将通过等位基因鉴别获得的EpCAM rs62139665基因分型结果与桑格测序结果进行比较，测试样本中所有基因型的两种结果完全匹配(图3)。

图2 | 隐性模型下肝癌患者与EpCAM rs62139665基因型相关的Kaplan-Meier和对数秩生存曲线。

4 讨论

在全球范围内，埃及的丙型肝炎病毒(HCV)感染发病率最高，HCV被认为是肝癌进展的主要诱发因素。本研究旨在探讨EpCAM启动子区域-935 C/G(rs62139665)单核苷酸多态性(SNP)与埃及人群中HCV相关肝癌风险、EpCAM表达水平及总生存期(OS)的关联。

本研究首次证明了EpCAM rs62139665与肝癌风险的关联。rs62139665位于启动子区域上游935处，据报道EpCAM基因上游1.1kb的转录活性与EpCAM水平密切相关[28]。Lynch综合征患者中通过3’非翻译区(UTR)缺失或先天性簇状肠病导致EpCAM蛋白水平降低的患者中报道了EpCAM基因的突变[29]。

在本研究中，我们采用等位基因鉴别方法检测EpCAM启动子区域的-935 C/G基因多态性(rs62139665)，随后通过直接DNA测序验证结果。三个研究组的基因型分布符合哈迪-温伯格平衡(HWE)。

值得注意的是，如NCBI地图数据库中针对不同种族人群所报道的，EpCAM rs62139665 SNP的发生率存在种族差异，显示非洲加勒比人中和等位基因频率分别为和，汉族人群中为和，意大利托斯卡纳人群中为和。本研究对照组中披露的EpCAM rs’62139665 C和G等位基因频率分别为0.64和0.36，与意大利托斯卡纳人群中报道的相当，其中C等位基因为主要等位基因。

SNP rs62139665在基因型和等位基因水平上，肝癌患者与非肝癌受试者之间的分布存在显著差异。EpCAM GG基因型和G等位基因在肝癌患者中比在HCV患者和对照组中显著更常见，表明C等位基因的存在可能具有保护作用。通过逻辑回归分析，我们发现在隐性模型中，与GC + CC相比，肝癌风险与rs62139665 G等位基因和GG基因型之间存在显著关联。本研究中观察到的GG基因型对EpCAM基因和蛋白表达水平的显著上调作用可以解释并证明这种与肝癌风险的关联。许多研究表明启动子区域的SNP与基因表达增加相关。

表6 | rs62139665不同基因型中EpCAM的基因和蛋白表达水平。

组	基因型	基因表达水平		蛋白质表达水平
对照	GG		3.28 ± 0.75	362.8 ± 17.59	281.2 ± 75.3
	GC + CC			247.2 ± 62.54°
丙型肝炎病毒	GG	1.01 ± 0.21		819.7 ± 84.05
	GC + CC			356.7 ± 183.4°*
肝细胞癌	GG	0.95 ± 0.35		1046 ± 115.1
	GC + CC			637.6 ± 148.4°*

EpCAM基因表达以ACt均值标准差表示，其中ACt = EpCAM的Ct值 - -肌动蛋白的Ct值；ACt值越小，基因表达水平越高。EpCAM蛋白表达以均值标准差表示。

使用学生t检验分析两组数据，使用单因素方差分析及随后的Tukey多重比较检验分析三组研究数据。与对照组有显著差异。

与HCV组有显著差异。

与同组内的GG有显著差异。

*在水平显著。

**在水平显著。

尽管HCV组和对照组在rs62139665基因型和等位基因频率上无显著差异，但HCV组的EpCAM基因和蛋白表达显著高于对照组。与对照组相比，HCV组中观察到的EpCAM高表达可能与报道的HCV诱导的纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)升高有关。HCV感染后PAI-1表达增加，通过激活细胞增殖的主要介质蛋白激酶B，与CSC标志物EpCAM表达增加协同作用，促进了HCV感染的肝细胞中的癌干细胞(CSC)状态(参考文献31)。

多项研究报道了EPCAM基因在HCC发病机制中的作用，作为预后标志物以及在HCC复发中的作用(参考文献32 - 35)。然而，参考TCGA和GEO数据库(由GEO2R比较的数据)，发现与正常对照相比(GSE49515)，以及在有和无静脉转移的HCC患者中(GSE5093)，EPCAM基因在HCC样本中的表达无显著增加。

先前的研究报道HCC中EpCAM表达与高肿瘤分级和AFP水平显著相关(参考文献36, 37)。在我们目前的研究中，HCC组中AFP和EpCAM的表达水平相对于HCV组和对照组显著更高。此外，发现AFP和EpCAM蛋白水平之间存在正相关。这些结果与其他已发表的数据一致，这些数据也报道了与正常组织相比，EpCAM在肝硬化和肝肿瘤组织中过表达(参考文献38)。此外，AFP水平可以预测HCC中肝祖细胞标志物如EpCAM的表达(参考文献39)，并且与肿瘤转移相关(参考文献40)。在本研究中进行了ROC分析以比较AFP和EpCAM的诊断性能。结果表明，在所有敏感性水平下，AFP和EPCAM的联合模型比单独使用它们中的任何一个具有更高的特异性。先前， EpCAM HCC与AFP /EpCAM HCC相比，预后较差(参考文献35)。

图3 | 显示EpCAM -935 C/G变体的Sanger测序色谱图(由ABI遗传分析仪创建)。

通过检查SNP rs62139665对疾病结果的影响，将SNP rs62139665基因型与肝功能测试等几个参数相关联，仅在GG基因型频率(因此EpCAM高表达)与ALP活性之间检测到显著相关性。这种关联可能归因于ALP是一种在细胞重编程过程中观察到的胚胎干细胞标志物(参考文献41)。此外，EpCAM表达的抑制导致ALP活性降低(参考文献42)。

与GC + CC基因型携带者相比，HCC患者中rs62139665 GG基因型携带者的总生存期(OS)和生存期均较短，但未达到统计学意义。鉴于与GC + CC基因型携带者相比在GG基因型携带者中观察到EpCAM过表达，我们发现GG基因型携带者与GC + CC基因型携带者相比OS明显较短，这与Noh及其同事的建议一致，即EpCAM免疫组化表达阳性的患者与HCC手术切除后EpCAM阴性的患者相比，OS降低(参考文献43)。此外，EpCAM阳性循环肿瘤细胞的检测与HCC患者的临床结果和OS密切相关(参考文献39)。

在当前研究中，MELD评分在GC + CC和GG基因型携带者之间没有显著差异。我们的观察结果似乎与Sancho - Bru及其同事关于酒精性肝炎患者中EpCAM基因表达与MELD评分缺乏相关性的报告一致(44)。另一方面，输注EpCAM阳性干细胞的肝硬化患者MELD评分显著降低，临床症状明显改善。

总之，本研究强调了EpCAM rs62139665单核苷酸多态性，特别是G等位基因频率，与肝癌风险的关联。然而，在测试的埃及样本中未发现与丙型肝炎病毒感染有此类关联。此外，本研究结果突出了rs62139665 GG基因型在基因和蛋白质水平上与EpCAM表达增加的关联。有必要对更大的数据集、其他种族和其他癌症类型进行进一步研究，以全面阐明EpCAM -935 C/G多态性与癌症风险的关联。

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