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胞嘧啶环中5-碳上的甲基若具备共有原子价的条件，就能引发DNA的甲基化，产生5-甲基胞嘧啶（5-mC）。在生物进化，发展，生长和变异方面，对于基因的表达的调节与DNA甲基化有着潜在的联系。异常的甲基化变化通常伴随这疾病的发生，如：癌症，自身免疫的失常和精神分裂症。因此，基因/特定基因区域或全基因组的DNA甲基化分析，对于疾病诊断和治疗目标基因区域的开发DNA甲基化标志物有重要的研究价值。羟甲基胞嘧啶(5-hmC)作为DNA的第六碱基的转录调节功能方面在人和小鼠大脑与胚胎干细胞(ES)中大量存在。在哺乳动物中，通过氧化5mC可以发生,也可通过第10-11转运酶(TET)家族5mC-羟化酶的介导得到。
更为重要的是，与5mC通常作为基因抑制标志相比,5hmC通常是作为DNA去甲基化的中间形式并且在基因激活方面伴有基因表达中具有重要作用。像5mC,5hmC在亚硫酸盐C到U转化中保持不变,这样就很难区分5hmC与5mC。正如测序结果中所显示,在实验中采用MS-PCR或亚硫酸盐-测序中,所有的5hmC全部误读为5mC。
在亚硫酸氢盐处理过程中，DNA同时被亚硫酸氢盐修饰并分割成适当的长度。在亚硫酸氢盐处理过程中，未修饰的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶。并将在测序中被读作T。5-甲基胞嘧啶（5mC）保持不变，而5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC)形成5-亚甲基磺酸胞嘧啶(CMS)。亚硫酸氢盐修饰的DNA被进一步用特定的 APOBEC脱氨酶处理，它将5mC转化为胸腺嘧啶，但不影响CMS。在PCR和测序过程中。 在PCR和测序过程中，CMS仍将被读作C，因此5hmC不仅可以从C、5mC中区分出来，而且还可以从其他修饰过的胞嘧啶中区分出来，如5fC和5caC区别开来（见表1）。双硫酸盐酶转化后的DNA可以用于qPCR来检测5mC和5hmC的特异性位点。
内容 C 5mC 5hmC 5fC 5caC 参考碱基 C C C C C 亚硫酸氢盐转化 T C C T T APOBEC处理 T T C T T 表1：采用亚硫酸氢盐和APOBEC处理后的碱基变化原理。
目前,几种方法如:TET辅助的亚硫酸盐测序法(TAB-Sec)和亚硫酸盐氧化测序(oxBS-seq)通过使用单碱基分辨率绘制5hmC的全基因组图谱。然而，他们都是昂贵且耗时。介于针对5mC&5hmC 特定位点或特定基因的检测方法较少的背景下,IVDSHOW针对这些问题特别的推出一款:双位点5mC&5hmC定量检测试剂盒（qPCR版）。
5mC&5hmC双位点定量检测试剂盒（qPCR版）具有如下优势和特点：
- 同时读取。同时制备5hmC和5mC的DNA处理，这样就可以通过qPCR同时以位点或基因特异的方式进行平行鉴定。
- 创新方法。结合亚硫酸氢盐和随后的胞嘧啶脱氨酶（APOBEC）处理，可以对5mC进行战术转换，以鉴定5hmC。
- 高特异性：5hmC可以从C和5mC以及其他修饰过的胞嘧啶5fC和5caC中区分出来。
- 灵活性。同时进行24次5hmC和24次5mC分析反应，或只进行24次5mC分析反应。
- 快速和精简的程序。从DNA亚硫酸氢盐处理到PCR产物的过程可在5小时内完成。
- 完全转化。将C完全转化为尿嘧啶（>99%），将5mC完全转化为胸腺嘧啶（>95%）。
- 广泛的样品适用性。起始材料可以是从各种组织/细胞样品中分离出的基因组DNA，如新鲜和冷冻组织、从烧瓶或微孔板中培养的细胞、显微切割样品、石蜡包埋组织、活检、胚胎细胞、血浆/血清样品和体液样品等。从各种富集反应中富集的DNA，如ChIP、MeDIP/hMeDIP或外显子捕获，也可作为起始材料。
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产品组分
组分内容
型号：A-P-1067-48(48次)
型号：A-P-1067-96(96次) 储存温度
CNBF
Cnoversion Buffer
10 ml
20 ml
室温
CVRP
Conversion Reagent
3 Vials
6 Vials
室温 DNBB
DNA Binding Buffer
15 ml
30 ml
室温 NAOH
Denatuation Solution
100 ul
200 ul
室温 DNAE
Modified DNA Elution
2 ml
4 ml
室温 Clum
F-离心管
50
100
室温 Tube
F-收集管
50
100
室温 APOE
APOBEC Enzyme
24 ul
48 ul
-20°C
APOB
10x APOBEC Reaction Buffer
100 ul
200 ul
-20°C
MMIX
Master Mix
1 ml
2 ml
-20°C
MCST
Methylated DNA
5 ul 10 ul -20°C
HMCS
Hydroxymethylated DNA
5 ul 10 ul -20°C
MPRF
M-Control Primer-F*
10 ul 20 ul -20°C
MPRR
M-Control Primer-R*
10 ul 20 ul -20°C
UNPF
U-Control Primer-F*
10 ul 20 ul -20°C
UNPR
U-Control Primer-R*
10 ul
20 ul
-20°C
AHDB
AH Dilution Buffer*
4 ml
8 ml
室温
*注意：在使用各溶液之前，将溶液离心至管底。
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营销中心
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注意事项
保存建议 推荐蓝冰或冰袋运输。当您收到产品后，按照说明书建议保存各组分。 警告 本品仅供科研使用，请勿用于临床与诊断。 -
FAQ
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Zhang M et. al. (August 2021). Ten-eleven translocation 1 mediated-DNA hydroxymethylation is required for myelination and remyelination in the mouse brain. Nat Commun. 12(1):5091.
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