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在真核细胞中,mRNA群体约占总RNA的1%,转录本的数量从几千个到几万个不等。通常情况下,只有5-10个基因的高丰度转录本(每个细胞几千个mRNA拷贝)占细胞mRNA的20%。500-2000个基因的中等丰度转录本(每个细胞几百个拷贝)约占细胞mRNA的40-60%。其余20-40%的mRNA是由罕见的转录本(每个细胞有1到几十个mRNA拷贝)代表[Alberts等人,1994]。如此巨大的丰度差异使大规模的转录组分析变得复杂,这导致了对更丰富的cDNA的反复测序。
cDNA正常化减少了高丰度转录物的流行,并使cDNA样本中的转录物浓度相等,从而极大地提高了测序和稀有基因发现的效率。
cDNA标准化试剂盒被设计用来对使用IVDSHOW 的cDNA合成试剂盒制备的扩增全长富集的cDNA进行规范化处理。由此产生的cDNA包含不同转录物的均衡丰度,可用于构建cDNA文库和直接测序,包括下一代测序平台(Roche/454、ABI/SOLiD或Illumina/Solexa)上的高通量测序。该试剂盒还包括特殊的适配接头,允许使用基于Clontech SMART的试剂盒来构建用于Trimmer-2正常化的cDNA。

(A)非正常化(1)和正常化(2)的人类cDNA样本的琼脂糖/EtBr凝胶电泳;
B)通过虚拟Northern印迹显示这些样本中丰富的转录物的浓度。GPDH--甘油-3-磷酸脱氢酶;UBC--泛素C;M,1kb的DNA大小标记(SibEnzyme)。
(C) 归一化大大增加了cDNA文库的基因发现率。来自Aplysia神经元的标准和归一化cDNA文库中的转录物分布:黄色-所有序列,蓝色-独特序列;绿色-非独特序列。cDNA标准化试剂盒具有如下优势和特性:
- 从cDNA文库中去除重复转录物,快速而可靠的方法
- 在文库克隆前对全长富集的cDNA进行均衡处理
- 程序简单,没有物理分离步骤
- 与Illumina / Solexa、ABI / SOLiD和Roche / 454测序流程完全兼容
关键词:- cDNA标准化试剂盒
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