核纤层蛋白A/C缺乏介导的活性氧升高促成诱导多能干细胞模型中扩张型心肌病的致病表型
发布时间：
2026-04-01 20:54
核纤层蛋白A/C缺乏介导的活性氧升高促成诱导多能干细胞模型中扩张型心肌病的致病表型
邱杭远 ，孙亚勋 ，王小晨 ，龚婷玉 ，苏君 ，申佳熙G ，周景军 ，夏家峰 ，王浩 ，孟祥福 ，付国盛 ，张东辉 ，蒋晨阳 & 梁平 ©
核膜(NE)蛋白核纤层蛋白A/C(由LMNA编码)的突变会导致一种严重的扩张型心肌病(DCM)，伴有早发性危及生命的心律失常。然而，LMNA相关扩张型心肌病(LMNA-DCM)中致心律失常增加的分子机制在很大程度上仍不清楚。在这里，我们表明LMNA中的移码突变会导致异常的 处理、心律失常以及LMNA-DCM患者特异性诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CMs)中核膜变形。从机制上讲，核纤层蛋白A与沉默调节蛋白1(SIRT1)相互作用，其中突变的核纤层蛋白A/C会加速SIRT1的降解，导致线粒体功能障碍和氧化应激。升高的活性氧(ROS)随后激活 /钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)-雷诺丁受体2(RYR2)途径，并加剧SUN1在突变iPSC-CMs中的积累，分别导致心律失常和核膜变形。综上所述，核纤层蛋白A/C缺乏介导的ROS紊乱被揭示为LMNA-DCM发展的核心。操纵受损的SIRT1活性和过度的氧化应激是未来治疗LMNA-DCM的潜在策略。
收到日期:2023年3月14日
接受日期:2024年8月5日
在线发表日期:2024年8月14日
B. 检查更新
扩张型心肌病(DCM)的特征是左心室或双心室扩张以及心脏收缩受损，是心力衰竭的第二大常见原因，在普通人群中的估计患病率为 。数十年的研究揭示了DCM的多种病因，包括基因突变、感染、炎症、自身免疫性疾病、接触毒素以及内分泌或神经肌肉原因 。多种基因突变与DCM的发生有关，最显著的是在编码细胞骨架、肌节、桥粒或核膜(NE)蛋白的基因中 。尽管如此，对DCM潜在病理生理学的理解仍仅为部分，DCM广泛的潜在病因使得预防不可逆损伤，即使在早期阶段，也极具挑战性。总体而言，死亡率仍然很高(1年死亡率为25 - 30%，5年生存率为50%)，在这些死亡中，心力衰竭(70%)和猝死(25 - 30%)仍然是最常见的情况 。
中国杭州浙江大学医学院附属邵逸夫医院心内科 。中国杭州浙江省心血管介入与再生医学重点实验室 。中国浙江杭州杭州医学院附属人民医院(浙江省人民医院)心血管内科心脏中心 。中国杭州浙江大学医学院附属第一医院卫生部多器官联合移植重点实验室 。中国杭州浙江大学转化医学研究院 。中国杭州浙江大学医学院附属第一医院感染性疾病诊治国家重点实验室 。中国杭州杭州市妇产科医院产前诊断中心 。电子邮箱:cyjiang@zju.edu.cn；pingliang@zju.edu.cn
随着已知与扩张型心肌病(DCM)相关的突变数量稳步增加，占DCM病例4-8%的核纤层蛋白A/C基因相关扩张型心肌病(LMNA-DCM)受到了广泛关注 。LMNA基因编码A型核纤层蛋白，它作为核纤层的主要成分位于内核膜上。它们在细胞核和细胞骨架组织、机械稳定性、染色质组织、信号传导、基因调控、基因组稳定性和细胞分化中发挥重要作用 。LMNA突变与十多种先前定义的临床疾病相关，统称为核纤层蛋白病，如哈钦森-吉尔福德早衰综合征(HGPS)、常染色体显性遗传的埃默里-德赖富斯肌营养不良症、肢带型肌营养不良症和DCM。与其他类型的DCM相比，LMNA-DCM相对不典型且更严重 。患者主要表现为早期出现的危及生命的心脏电异常，如房室传导阻滞、室性心动过速和颤动。心脏性猝死(SCD)的高风险以及植入式心脏复律除颤器(ICD)植入的必要性是影响患者生活质量和生存的主要临床特征 。
尽管近年来将LMNA缺陷与心肌病和猝死联系起来的分子机制已得到广泛研究，但许多方面仍不清楚。已假设有三种独立机制支撑LMNA相关心肌病的发病机制，即异染色质组织失调、核机械抗性受损以及核纤层蛋白A/C相关细胞内信号通路改变 。关于第一种机制，在确认由异常异染色质组织导致的血小板衍生生长因子途径激活可在LMNA-DCM中诱导心律失常表型后，LMNA单倍体不足诱导的染色质失调最近已成为一个相当重要的焦点 。
在这里，我们证明了LMNA-DCM患者特异性诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CMs)表现出舒张期 升高、 处理异常、心律失常负担增加以及核膜(NE)变形。通过将突变iPSC-CMs中的这些异常联系起来，我们发现层粘连蛋白A结合蛋白沉默调节蛋白1(SIRT1)的降解加速。这反过来又导致线粒体功能障碍和氧化应激。然后，我们测试了活性氧(ROS)升高促成LMNA-DCM发展的假设。一方面，升高的ROS激活了 钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)。这随后通过RYR2-Ser2814磷酸化促进了兰尼碱受体2(RYR2)介导的肌浆网(SR) 泄漏，随后导致LMNA-DCM iPSC-CMs舒张期 升高、 处理异常和心律失常。另一方面，过量的ROS产生加速了SUN1的积累，这导致了LMNA-DCM iPSC-CMs中的NE变形。这些结果为层粘连蛋白A/C不足、ROS、心律失常和异常核结构之间的联系提供了见解，这可能为LMNA-DCM带来有前景的治疗途径。
结果
临床特征
2016年，我们招募了一个家系，先证者(II-1)及其妹妹(II-2)，分别为一名57岁男性和一名50岁女性。两名患者最初被诊断为心房颤动(AF)，表现出特征性心电图(ECG)(补充图1a、b)，左心房扩大，超声心动图显示左心室功能保留(补充图1c)。两年后，两名患者均出现房室传导阻滞并植入了起搏器。先证者的心电图出现室性早搏和非持续性室性心动过速。为了做出准确诊断，从先证者及其亲属采集外周血样本进行基因检测，结果显示两名患者及其一名兄弟姐妹的LMNA基因存在杂合移码突变(c.1163dupC；p.A388fs)(图1a)。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南，该变异的致病性被分类为“可能致病”。结合他们的临床特征，两名患者被诊断为以传导系统缺陷为主的LMNA-DCM。随访期间，先证者的妹妹不幸死于心源性猝死(SCD)，先证者的儿子最终也患上了AF。
患者特异性和基因编辑的诱导多能干细胞来源的心肌细胞的生成与表征
为了在单细胞水平上研究LMNA - DCM的分子和细胞特性，我们从两名患者(II - 1、II - 2)和三名健康供体(Con - 1、Con - 2、Con - 3)身上采集了皮肤活检样本。使用非整合型仙台病毒方法生成了多个对照和患者特异性的诱导多能干细胞系(iPSC系)(补充表1)。由于iPSC系之间的变异性会深刻影响表型分析，我们通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，利用患者iPSC(II - 1)生成了两个LMNA序列校正的基因校正(GC)同基因系(图1b和补充图2a)。我们还通过靶向LMNA基因座的外显子4，利用对照iPSC(Con - 3)生成了一个敲除(KO)系(图1b和补充图2a)。CRISPR/Cas9对细胞基因组的影响主要通过确定单导向RNA(sgRNA)的潜在脱靶位点是否发生改变来评估。我们对LMNA - sgRNA的3个预测脱靶位点进行了DNA测序，在GC II - 1 - corr iPSC中未观察到脱靶情况(补充图2b、c和补充表2)。新生成的iPSC系呈现出人类胚胎干细胞样形态，表达多能性标志物，具有正常核型，并且能够分化为三个胚层(补充图3和4)。随后，这些iPSC使用基于小分子的单层分化方案分化为心肌细胞(补充图5a)。荧光激活细胞分选(FACS)分析表明，分化效率超过95%(补充图5b)。单细胞膜片钳记录显示，生成的iPSC - CM大多数是心室样心肌细胞(补充图5c)。
核纤层蛋白A/C单倍体不足导致A388fs iPSC - CM出现心律失常和异常的 处理
根据碱基序列的变化，LMNA基因中的A388fs突变(LMNA - A388fs)可导致提前终止密码子(PTC)，这可能导致携带者出现核纤层蛋白A/C单倍体不足(图1c)。因此，我们试图评估A388fs突变是否与LMNA及其编码蛋白核纤层蛋白A/C的表达有关。与Con - 3和II - 1 - corr iPSC - CM相比，突变体(II - 1、II - 2)和Con - 3 - KO iPSC - CM中LMNA的mRNA表达显著降低(补充图6a和补充表3)。同样，蛋白质印迹分析显示，突变体(II - 1、II - 2)iPSC - CM中核纤层蛋白A/C的蛋白质表达水平显著低于对照(Con - 1、Con - 2、Con - 3)和II - 1 - corr iPSC - CM(补充图6b、c)。此外，在Con - 3 - KO iPSC - CM中未检测到全长或截短的核纤层蛋白A/C(补充图2)。这些结果表明，A388fs突变导致患者特异性iPSC - CM中核纤层蛋白A/C单倍体不足。
鉴于两名患者的临床特征均主要表现为具有 高风险的心律失常，接下来我们通过单细胞膜片钳研究了携带LMNA - A388fs的患者特异性诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC - CM)的电生理特性。我们在对照(Con - 1、Con - 2和Con - 3)iPSC - CM中观察到均匀且有节律的动作电位波形(补充图7a)。相比之下，与对照(22.9%， )相比，在大部分A388fs(II - 1、II - 2)iPSC - CM中检测到心律失常波形(67.1%， )，表现为延迟后去极化(DADs)(图1d和补充图7a、b)。值得注意的是，我们观察到II - 1 - corr iPSC - CM的心律失常发生率显著降低(25.9%， )，降至与对照记录的动作电位相似的水平(图1d和补充图7a、b)。我们还观察到Con - 3 - KO iPSC - CM中出现DAD心律失常的比例(79.2%， )高于对照，重现了A388fs iPSC - CM中的心律失常表型(图1d和补充图7a、b)。
图1 | 核纤层蛋白A/C单倍体不足导致心律失常、异常的钙 处理、线粒体功能障碍和活性氧升高。a携带LMNA基因新杂合突变的家族谱系。已故个体用叉号标记。先证者用红色箭头指示。b本研究中使用的诱导多能干细胞系的示意图。c. LMNA A388fs突变对两种剪接产物核纤层蛋白A和C的预测影响。d柱状图比较对照(Con-1、Con-2、Con-3)诱导多能干细胞来源的心肌细胞、A388fs突变体(II-1、II-2)诱导多能干细胞来源的心肌细胞、基因校正(GC)(II-1-corr)诱导多能干细胞来源的心肌细胞和LMNA基因敲除(Con-3-KO)诱导多能干细胞来源的心肌细胞中心律失常的发生率。e、f小提琴图比较Con-1、II-1-corr和II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的钙 瞬变幅度和舒张期 。 (Con-1)、71(II- 1)、94(II-1-corr)个细胞。g、h小提琴图比较Con-1、II-1-corr和II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中由兰尼碱受体2介导的肌浆网钙 泄漏和肌浆网钙 负荷。 (II-1)、46(Con-1)、60(II-1-corr)个细胞。i基因本体分析确定线粒体组织有显著变化。j通过透射电子显微镜观察II-1-corr和II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中线粒体的代表性图像。比例尺， 。k分析Con-1、II-1-corr和II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的耗氧量。n = 3个独立的生物学重复。I柱状图比较Con-1、II-1-corr和II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中氧消耗率的关键参数，包括基础氧消耗率、质子泄漏氧消耗率、最大容量(最大容量)、ATP偶联氧消耗率和储备容量(储备容量)。 个独立的生物学重复。m、n通过对用CellROX或MitoSOX染色的细胞进行流式细胞术测量Con-1、II-1-corr和II- 1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的细胞和线粒体活性氧水平。 个独立的生物学重复。数据以平均值 标准误表示， 中的值在e-h、I-n中通过Dunnett多重比较检验计算，在i中通过双侧不成对 检验计算。图1 b由BioRender.com创建，并根据知识共享署名-非商业性使用-禁止演绎4.0国际许可协议发布。源数据作为源数据文件提供。
由于DADs与心肌细胞内 处理不当有关 ，接下来我们通过Fura-2比率 成像评估了iPSC-CMs中的 瞬变(补充图7c)。与同基因对照(II-1-corr iPSC-CMs)相比，II-1 iPSC-CMs中的 瞬变幅度降低了16.6%(图1e)。此外，与Con-1和II-1-corr iPSC-CMs相比，我们观察到II-1 iPSC-CMs中的舒张期细胞内 显著增加(图1f)。II-1 iPSC-CMs中的最大上升和恢复速度均显著降低(补充图7d、e)。通过RYR2的肌浆网(SR) 泄漏是舒张期 浓度 的关键决定因素。为了阐明舒张期 升高的原因，我们在iPSC-CMs中使用标准丁卡因方案评估了总的RYR2介导的SR 泄漏和SR 负荷(补充图7f)。值得注意的是，我们观察到，与Con-1和II-1-corr iPSC-CMs相比，II-1 iPSC-CMs中总的RYR2介导的SR 泄漏(通过丁卡因诱导的 变化定量)显著增加(图1g)。与Con-1和II-1-corr iPSC-CMs相比，II-1 iPSC-CMs中由咖啡因诱发的 瞬变幅度所指示的SR 负荷显著降低(图1h)。与Con-3 iPSC-CMs相比，在II-2和Con-3-KO iPSC-CMs中也观察到了类似的 处理异常，表现为 瞬变幅度降低、舒张期 增加、RYR2介导的SR 泄漏增加以及SR Ca 负荷降低(补充图8)。总体而言，这些结果表明，核纤层蛋白A/C单倍体不足会导致A388fs iPSC-CMs中的心律失常和异常 处理。
A388fs iPSC-CMs表现出线粒体功能障碍和ROS升高的致病特征
为了探究核纤层蛋白A/C(一种核包膜蛋白)缺乏导致心律失常和 处理异常的潜在机制，我们进行了基于串联质谱标签的蛋白质组学分析，以检测II-1-corr和II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)之间的蛋白质表达变化。在我们的研究中检测到446种差异表达蛋白(补充图9a、b)。使用京都基因与基因组百科全书(KEGG)进行的分析表明存在扩张型心肌病(DCM)表型(补充图9c)，基因本体(GO)分析显示线粒体组织发生了显著变化(图1i和补充图9d)。这些结果表明，A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞中可能存在线粒体功能障碍。透射电子显微镜显示，与II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞相比，II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的线粒体肿胀(图1j和补充图9e)。突变型(II-1、II-2)诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的线粒体DNA(mtDNA)拷贝数显著低于对照1和II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞(补充图9f)。为了进一步评估线粒体呼吸功能，我们使用海马生物科学XF-96细胞外通量分析仪测量了诱导多能干细胞来源的心肌细胞的氧消耗率(OCR)。与对照1和II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞相比，II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞的最大容量和储备容量水平显著降低(图1k、l)，表明线粒体生物能量学受损。
鉴于线粒体功能障碍通常与活性氧(ROS)生成增加相关，且线粒体是ROS生成的主要来源之一 ，接下来我们使用荧光CellROX探针通过流式细胞术评估细胞ROS生成情况。II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)中的ROS水平显著高于对照1(Con-1)和II-1校正的iPSC-CMs(图1m)。使用线粒体超氧化物探针(MitoSOX)，我们发现与Con-1和II-1校正的iPSC-CMs相比，II-1 iPSC-CMs中的线粒体ROS水平大幅升高(图1n)。综上所述，这些结果证明了A388fs iPSC-CMs中线粒体功能障碍和ROS升高的致病特征。
A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞中SIRT1加速降解导致线粒体功能障碍和活性氧水平升高
沉默调节蛋白1(SIRT1)是一种III类组蛋白脱乙酰酶，它作为氧化还原变化的传感器，塑造宿主 的线粒体代谢和炎症反应。先前的一项研究报道，核纤层蛋白A与沉默调节蛋白1相互作用 。接下来，我们试图研究在A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞中观察到的线粒体功能障碍和活性氧升高的表型是否与沉默调节蛋白1有关。我们的免疫荧光分析表明，在对照(Con-1)和A388fs(II-1、II-2)诱导多能干细胞来源的心肌细胞中，核纤层蛋白A和沉默调节蛋白1始终共定位(图2a)。与对照相比，A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞中沉默调节蛋白1的荧光强度显著降低(图2b)。此外，免疫共沉淀(co-IP)结果还显示，在Con-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中，核纤层蛋白A和沉默调节蛋白1之间存在相互作用(图2c)。蛋白质印迹分析表明，与对照(Con-1、Con-2、Con-3)和II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞相比，A388fs(II-1、II-2)和Con-3-KO诱导多能干细胞来源的心肌细胞中沉默调节蛋白1的蛋白质表达显著降低(图2d、e和补充图10)，而与同基因对照相比，II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中沉默调节蛋白1的mRNA表达水平略有上调(图2f和补充表3)。
考虑到核纤层蛋白A与SIRT1之间的相互作用，并且鉴于在A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)中已注意到的核纤层蛋白A/C单倍体不足，我们推测核纤层蛋白A可能在SIRT1的周转中起重要作用，从而保护SIRT1蛋白不被降解。为了验证这一点，我们通过环己酰亚胺(CHX)处理比较了Con-3、Con-3-KO、II-1-corr和II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中SIRT1的降解速率。在此过程中，与Con-3和II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞相比，II-1和Con-3-KO诱导多能干细胞来源的心肌细胞表现出SIRT1降解速率大大加快(图2g，h)。II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中SIRT1的核表达明显低于其同基因对照，表明SIRT1活性受损(补充图11a，b)。氯喹(CQ)而非MG-132处理显著挽救了Con-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中CHX诱导的SIRT1蛋白降解，表明SIRT1在诱导多能干细胞来源的心肌细胞中通过溶酶体途径降解(补充图11c，d)。II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中SIRT1活性明显低于其同基因对照，用选择性SIRT1激活剂SRT1720(SRT，1μM，24小时)处理可大大恢复该活性(补充图11e)。此外，SIRT1的下游基因TFAM、SIRT3和SOD2的mRNA表达水平在II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中明显低于Con-3和II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞(图2i和补充表3)。
为了研究SIRT1的表达变化是否会产生功能后果，在II-1-corr和II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中应用SRT来激活SIRT1。海马实验表明，用SRT处理后，II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中受损的线粒体生物能量学得到挽救，最大容量和储备容量的改善证明了这一点(图2j，k)。此外，在II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中用SRT处理显著降低了线粒体活性氧(图2l)。用SRT或线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO(MT，5µM，3天)处理也显著降低了II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的细胞活性氧水平(图2m)。综上所述，这些结果表明核纤层蛋白A/C单倍体不足导致SIRT1降解加速，这导致了A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的线粒体功能障碍和活性氧水平过高。
激活的ROS-CAMKII-RYR2途径将下调的SIRT1与A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的心律失常表型联系起来
据报道，ROS-CAMKII-RYR2通路是调控细胞内 稳态 的重要参与者。ROS升高诱导的CaMKII激活可调节多种 处理蛋白的活性，最终导致 处理异常 。我们之前的数据表明，A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)中肌浆网(SR)钙 释放异常。我们假设，线粒体ROS升高会激活A388fs iPSC-CMs中的CaMKII-RYR2通路，导致 处理异常和心律失常表型。为了验证这一假设，我们使用检测磷酸化CaMKII(磷酸化苏氨酸286；p-CaMKII)、氧化型CaMKII(M281-M282氧化；ox-CaMKII)或总CaMKII的抗体，评估了对照和A388fs iPSC-CMs中的CaMKII活性。我们发现，A388fs iPSC-CMs中CaMKII的氧化和磷酸化水平均显著高于对照组(图3a-d)。有趣的是，与Con-1和II-1-corr iPSC-CMs相比，II-1 iPSC-CMs中RYR2丝氨酸2814位点的CaMKII依赖性磷酸化(p-RYR2)显著增强，而RYR2的总表达保持不变(图3a、b)。在Con-3-KO iPSC-CMs中也观察到了类似的结果，与Con-3 iPSC-CMs相比，其ox-CaMKII、p-CaMKII、p-RYR2和细胞ROS水平显著更高(补充图12)。
图2 | SIRT1加速降解导致A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)线粒体功能障碍和活性氧水平升高。a. 对照1(Con-1)和突变体(II-1、II-2)iPSC-CMs中SIRT1(红色)和核纤层蛋白A/C(绿色)染色的代表性图像。DAPI表示细胞核染色(蓝色)。比例尺， 。b. 条形图，比较a中不同组之间的SIRT1强度。 (Con-1)、38(II-1)、41(II-2)个细胞。c. 蛋白质免疫印迹分析显示，在抗SIRT1免疫沉淀中检测到核纤层蛋白A，在抗核纤层蛋白A/C免疫沉淀中检测到SIRT1。 独立生物学重复。d、e. 对照(Con-1、Con-2、Con-3)、II-1-corr和突变体(II-1、II-2)iPSC-CMs中SIRT1蛋白表达的蛋白质免疫印迹分析。 独立生物学重复。 条形图，比较II-1-corr和II-1 iPSC-CMs之间SIRT1的mRNA表达。 独立生物学重复。g. CHX处理后，对照3(Con-3)、对照3敲除(Con-3-KO)、II-1-corr和II-1 iPSC-CMs中SIRT1表达的蛋白质免疫印迹分析。h. 折线图，比较g中不同组之间SIRT1表达的降解率。 (Con-3、II-1-corr、II-1)、4(Con-3-KO)独立生物学重复。i. 条形图，比较II-1-corr和II-1 iPSC-CMs之间线粒体转录因子A(TFAM)、SIRT3和超氧化物歧化酶2(SOD2)的mRNA表达。 (TFAM-Con-3)、4(其他)和8(TFAM-II-1)独立生物学重复。j. 有或无SRT1720(SRT)处理的II-1-corr和II-1 iPSC-CMs中的耗氧量分析。 独立生物学重复。k. 条形图，比较j中不同组之间氧消耗率(OCR)的关键参数。 独立生物学重复。I. 用二甲基亚砜(DMSO)处理的对照1、II-1-corr和II-1 iPSC-CMs以及用SRT处理的II-！iPSC-CMs中的线粒体活性氧水平。 独立生物学重复。m. 用DMSO处理的对照1、II-1-corr和II-1 iPSC-CMs以及用线粒体靶向抗氧化剂(MT)或SRT处理的II-1 iPSC-CMs中的细胞活性氧水平。 独立生物学重复。数据在b、e、f、h-m中表示为平均值 标准误。 值在b、i、l、m中通过Dunnett多重比较检验计算，在e中通过嵌套 -检验计算，在 中通过双侧不成对t检验计算。原始数据作为原始数据文件提供。
图3 | 激活的ROS-CAMKII-RYR2信号通路与A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞中SIRT1下调及心律失常表型相关。a、b对Con-1、II-1-corr和II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中总CaMKII、磷酸化CaMKII(CaMKII-T286)、总RYR2和磷酸化RYR2(RYR2-2814S)表达进行蛋白质免疫印迹分析。n = 4个独立生物学重复。c、d对Con-1、II-1-corr和II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中总CaMKII和氧化型CaMKII(M281-M282氧化；ox-CaMKII)的蛋白质表达进行蛋白质免疫印迹分析。 个独立生物学重复。e、f分别用二甲基亚砜(DMSO)、SRT或线粒体靶向抗氧化剂(MT)处理II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞后，对总CaMKII、磷酸化CaMKII、总RYR2和磷酸化RYR2表达进行蛋白质免疫印迹分析。 个独立生物学重复。g、h用DMSO、SRT或线粒体靶向抗氧化剂(mitoTEMPO，MT)处理II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞后，对总CaMKII和氧化型CaMKII的蛋白质表达进行蛋白质免疫印迹分析。 个独立生物学重复。i分别用DMSO、SRT、MT或KN93处理II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞后记录的代表性 瞬时电流轨迹。j、k小提琴图，比较i中不同组之间的 瞬时电流幅度和舒张期 。 (II-1 + KN93)、74(II-1 + SRT)、76(II-1 + MT)、80(II-1 + DMSO)个细胞。l在正常Tyrode’s(NT)溶液中用DMSO、SRT、MT或KN93处理II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞，并暴露于含有丁卡因(Tet)和咖啡因(Caff)的 溶液中后，胞质 荧光的代表性轨迹。m - n小提琴图，比较l中不同组之间RYR2介导的肌浆网(SR)钙 泄漏和SR钙 负载。 (II-1 + DMSO)、54(II-1 + KN93)、55(II-1 + SRT)和58(II-1 + MT)个细胞。o分别用DMSO、白藜芦醇(resver)、SRT、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、MT或KN93处理II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞后，对自发动作电位进行代表性电生理测量。p柱状图，比较o中不同组之间心律失常的发生率。数据以平均值 标准误表示， 中的 值通过Dunnett多重比较检验计算得出。源数据以源数据文件形式提供。
与我们的假设一致，用SRT或MT处理显著降低了II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)中氧化型钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(ox-CaMKII)、磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(p-CaMKII)和磷酸化兰尼碱受体2(p-RYR2)的水平(图3e-h)。同时，与用无活性类似物KN92(1μM，24小时)处理的II-1 iPSC-CMs相比，用KN93(1μM，24小时)抑制钙调蛋白依赖性蛋白激酶II后，II-1 iPSC-CMs中的p-RYR2水平降低(补充图13a，b)。这些数据表明，线粒体活性氧升高导致A388fs iPSC-CMs中钙调蛋白依赖性蛋白激酶II活化以及随后兰尼碱受体2的过度活化。此外，用SIRT1激活剂(SRT)、活性氧清除剂(MT)或钙调蛋白依赖性蛋白激酶II抑制剂(KN93)处理，在很大程度上减轻了在II-1 iPSC-CMs中观察到的 处理异常，这通过兰尼碱受体2介导的肌浆网(SR)钙 泄漏减少和SR 泄漏负荷增加得到证明(图3i-n和补充图13c-h)。
接下来，我们通过膜片钳研究了多种具有不同靶点的药物的抗心律失常作用。用SIRT激活剂SRT或白藜芦醇 处理II-1 iPSC-CMs可有效挽救心律失常表型(图3o，p)。此外，MT或N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC，5 mM, 4小时)，一种公认的抗氧化剂，在II-1 iPSC-CMs中发挥了抗心律失常作用(图3o，p)。用KN93抑制钙调蛋白依赖性蛋白激酶II也大大逆转了在II-1 iPSC-CMs中发现的心律失常表型(图3o，p和补充图13i，j)。总之，这些结果表明，SIRT1的下调激活了活性氧-钙调蛋白依赖性蛋白激酶II-兰尼碱受体2途径，导致A388fs iPSC-CMs中 处理异常和心律失常。
活性氧介导的SUN1蛋白积累导致A388fs iPSC-CMs中核被膜结构异常
哺乳动物A型核纤层蛋白对于细胞核的机械刚度至关重要，是细胞核维持 的先决条件。因此，我们研究了LMNA-A388fs是否与核被膜结构的变化有关。诱导多能干细胞来源的心肌细胞分别用肌钙蛋白T2(TNNT2)和核纤层蛋白A/C进行共染色，分别指示心肌细胞和核被膜。与对照(Con-1、Con-2、Con-3)(19.4%，n = 24)和II-1-corr(17.9%， )诱导多能干细胞来源的心肌细胞相比，观察到A388fs(II-1、II-2)诱导多能干细胞来源的心肌细胞中有很大一部分(77.4%，n = 16)呈现核被膜结构起皱(图4a和补充图14)。先前有报道称，核内膜蛋白SUN1的积累在早衰和营养不良性核纤层蛋白病 中具有致病性。有趣的是，蛋白质印迹分析显示，A388fs(II-1、II-2)诱导多能干细胞来源的心肌细胞中SUN1的蛋白质表达水平显著高于Con-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞(图4b，c)。用过氧化氢 处理后，Con-1和II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中SUN1的表达均显著增加，表明活性氧升高导致诱导多能干细胞来源的心肌细胞中SUN1表达增强(图4d，e)。此外，用SRT或MT处理显著降低了II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中SUN1的表达，免疫荧光和蛋白质印迹分析证明了这一点(图4f-h和补充图15a，b)。重要的是，用SRT或MT处理可部分挽救II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的核被膜变形(图4i和补充图15c，d)。
我们还通过小干扰RNA(siRNA)研究了II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)中SUN1基因敲低(KD)后的挽救作用(补充图16a、b)。我们观察到，在经乱序siRNA和SUN1 siRNA处理的II-1 iPSC-CMs之间，CaMKII(总蛋白、氧化型、磷酸化型)和RYR2(总蛋白、磷酸化型)的表达水平没有显著变化(补充图16a、b)。此外，SUN1基因敲低对II-1 iPSC-CMs没有抗心律失常作用(补充图16c、d)。值得注意的是，SUN1基因敲低显著减轻了II-1 iPSC-CMs中NE的结构异常(补充图16e、f)。总的来说，这些结果表明，ROS升高会导致A388fs iPSC-CMs中SUN1蛋白积累和NE结构异常。
图4 | ROS介导的SUN1蛋白积累导致A388fs iPSC-CMs中NE结构异常。a. 对照(Con-1、Con-2和Con-3)、II-1-校正和突变体(II-1、II-2)iPSC-CMs中层粘连蛋白A/C(绿色)和心脏特异性标志物TNNT2(红色)染色的代表性图像。DAPI表示细胞核染色(蓝色)。比例尺， 。该实验重复了4次，结果相似。b、c对照(Con-1)、II-1-校正和突变体(II-1、II-2)iPSC-CMs中SUN1表达的蛋白质免疫印迹分析。 个独立的生物学重复。d、e对照(Con-1)和II-1 iPSC-CMs在有或没有 处理情况下SUN1表达的蛋白质免疫印迹分析。 个独立的生物学重复。 II-1 iPSC-CMs用二甲基亚砜(DMSO)、SRT或MT处理后SUN1表达的蛋白质免疫印迹分析。 个独立的生物学重复。h用DMSO或MT处理的II-1 iPSC-CMs中SUN1(绿色)和心脏特异性标志物TNNT2(红色)染色的代表性图像。DAPI表示细胞核染色(蓝色)。比例尺， 。该实验重复了3次，结果相似。i用DMSO或MT处理的II-1 iPSC-CMs中层粘连蛋白A/C(绿色)和心脏特异性标志物TNNT2(红色)染色的代表性图像。DAPI表示细胞核染色(蓝色)。比例尺， 。该实验重复了3次，结果相似。数据在c、e、g中表示为平均值 标准误。 值在 中通过嵌套 检验计算，在e中通过双侧不成对 检验计算，在g中通过邓尼特多重比较检验计算。源数据作为源数据文件提供。
同基因对照iPSC-CMs中SIRT1的基因抑制激活ROS-CAMKII-RYR2通路并重现A388fs iPSC-CMs的致病表型
A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)中SIRT1的加速降解导致活性氧(ROS)过量，这可能是心律失常表型和异常核周肌小节(NE)结构的原因。因此，为了进一步证实SIRT1与致病表型之间的关系，我们在II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞中通过小干扰RNA(siRNA)对SIRT1的表达进行遗传抑制。通过蛋白质免疫印迹分析验证了敲低(KD)效率。随着SIRT1表达的下调，II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞中SIRT1的敲低引发了氧化型钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶II(ox-CaMKII)、磷酸化钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶II(p-CaMKII)、磷酸化兰尼碱受体2(p-RYR2)和SUN1水平的显著升高(图5a、b)。此外，与乱序siRNA处理的II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞相比，SIRT1 siRNA处理的II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞表现出显著升高的ROS水平(图5c)、异常的 处理(图5d-i)、增加的心律失常负担(图5j、k)和异常的NE结构(图5I、m)。同时，SRT处理显著挽救了SIRT1敲低诱导的II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的蛋白质表达变化和致病表型(图5a-m)。这些结果表明，在同基因对照诱导多能干细胞来源的心肌细胞中对SIRT1进行遗传抑制会激活ROS-CAMKII-RYR2通路，并重现A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞的致病表型。
SIRT1的过表达通过抑制ROS-CAMKII-RYR2通路挽救A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的致病表型
我们之前的数据表明，SIRT1的药理学激活可以挽救A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的致病表型。为了提供SIRT1与ROS-CAMKII-RYR2通路之间的直接联系，我们在突变型II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中过表达人野生型SIRT1质粒。
SIRT1的过表达(OE)导致SIRT1的表达显著增加，同时氧化型钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶II(ox-CaMKII)、磷酸化钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶II(p-CaMKII)磷酸化兰尼碱受体2(p-RYR2)和SUN1的水平显著降低(图6a、b)。在过表达SIRT1的II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中，细胞ROS水平显著降低(图6c)。此外，SIRT1过表达显著减轻了在II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中观察到的 处理异常， 瞬变幅度增加(图6d、e)、舒张期 降低(图6d、e)、兰尼碱受体2(RYR2)介导的肌浆网(SR)钙 泄漏减少(图6f、g)和SR 负荷增加(图6f、g)证明了这一点。重要的是，SIRT1过表达极大地挽救了II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的心律失常表型，显示出与对照诱导多能干细胞来源的心肌细胞相似的正常动作电位轮廓(图6h、i)。同时，SIRT1过表达部分挽救了II-1诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的NE变形表型(图6j、k)。综上所述，这些结果表明，SIRT1过表达通过抑制ROS-CAMKII-RYR2通路挽救A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的异常 处理和心律失常。
操纵SIRT1或钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶II(CaMKII)的活性可改善患者特异性工程心脏组织的功能
为了在组织水平上进一步评估通过操纵SIRT1或钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶II(CaMKII)的活性产生的挽救作用，我们构建了基于人的
图5 | 同基因对照诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)中SIRT1的基因抑制激活了ROS-CAMKII-RYR2通路，并重现了A388fs诱导多能干细胞来源的心肌细胞的致病表型。a、b分别用乱序siRNA(NC)、SIRT1 siRNA(KD)或SIRT1 siRNA与SRT(KD + SRT)处理II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞后，对SIRT1、总CaMKII、氧化型CaMKII、磷酸化CaMKII、总RYR2、磷酸化RYR2和SUN1表达进行蛋白质免疫印迹分析。 独立生物学重复。c分别用乱序siRNA、SIRT1 siRNA或SIRT1 siRNA与SRT处理II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞后的细胞ROS水平。 独立生物学重复。d分别用乱序siRNA、SIRT1 siRNA或SIRT1 siRNA与SRT处理II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞后记录的代表性 瞬态轨迹。e、f柱状图，比较 中不同组的 瞬态幅度和舒张期 在 (KD)、21(NC、KD + SRT)细胞中的差异。g分别用乱序siRNA、SIRT1 siRNA或SIRT1 siRNA与SRT处理II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞后，在NT溶液中并暴露于含有Tet和Caff的 溶液中的胞质 荧光的代表性轨迹。h、i柱状图用于比较g中不同组之间RYR2介导的肌浆网Ca 泄漏和肌浆网Ca 负载。 (KD)、26(KD + SRT)、30(NC)细胞。j分别用乱序siRNA、SIRT1 siRNA或SIRT1 siRNA与SRT处理II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞后，对自发动作电位的代表性电生理测量。k柱状图，比较j中不同组之间心律失常的发生率。I分别用乱序siRNA、SIRT1 siRNA或SIRT1 siRNA与SRT处理II-1-corr诱导多能干细胞来源的心肌细胞后，层粘连蛋白A/C(绿色)和心脏特异性标志物TNNT2(红色)染色的代表性图像。DAPI表示细胞核染色(蓝色)。比例尺， 柱状图，比较I中不同组之间异常NE结构的发生率。 来自3个独立实验的视野。数据以 SEM表示， 中的值通过Dunnett多重比较检验计算。源数据作为源数据文件提供。工程心脏组织(EHT)模型。Con-1和II-1 EHT均用自磷酸化钙调蛋白2相关抑制肽(AIP)(CaMKII抑制剂， )或SRT(1 μM)处理3天。我们观察到，在II-1 EHT中用AIP或SRT处理会产生更紧密的结构，类似于在Con-1 EHT中观察到的形态(补充图17a)。此外，我们使用定制的收缩力测量系统，分析在逐步增加拉伸长度(拉伸比率0 - 12%)时EHT的收缩情况。同时，我们在逐步增加起搏频率(0.5 - 3.5 Hz)时检测收缩状态。我们发现，在我们的研究中，EHT束的最佳反应频率是 (补充图17b)，并且大多数束在该频率下可以有效地起搏。随着频率增加，在12%拉伸比率下，无论有无异丙肾上腺素刺激，II-1 EHT中的起搏效率都会迅速下降，而用AIP或SRT处理可以有效挽救这种情况(补充图17b)。还记录了EHT在0%和12%拉伸比率(有无异丙肾上腺素刺激)下的收缩状态。我们发现，与用二甲基亚砜处理的II-1 EHT相比，用AIP或SRT处理的II-1 EHT在12%拉伸比率下的收缩力显著增加(补充图17c)。这些结果表明，操纵SIRT1或CaMKII活性可以在基于人体的组织水平上改善电 - 收缩偶联能力。纠正LMNA - DCM心肌细胞中异常的SIRT1/CaMKII活性可能是恢复电和收缩功能障碍的一种有前景的策略。
讨论
与LMNA - DCM相关的SCD高风险凸显了理解层粘连蛋白A/C 缺乏如何引发心律失常的重要性。我们的研究建立了一个具有显著促心律失常活性和NE结构破坏的患者来源的LMNA - DCM细胞模型。然后我们证明，缺乏层粘连蛋白A/C的患者特异性iPSC - CM表现出线粒体功能障碍和ROS升高的致病特征，这是由于SIRT1加速降解所致。已知过量的氧化应激对心肌细胞结构和功能 均有害，进而导致心律失常倾向和NE紊乱加剧。这些证据表明，层粘连蛋白A/C - SIRT1 - ROS分子途径在维持正常心律和NE结构中起重要作用(图7)。
线粒体提供心脏构建 所需的大部分能量，线粒体代谢受损会增加对应激的敏感性。正如在各种心血管疾病中观察到的那样，衰竭的心脏表现出线粒体生物发生和功能的严重受损，导致过量的氧化应激。在我们的研究中，在LMNA - DCM iPSC - CM中鉴定出线粒体功能障碍和ROS升高的致病特征。虽然最近一项研究在 的小鼠胚胎成纤维细胞中证明了类似的表型，但层粘连蛋白 与线粒体功能障碍之间的关系仍未确定。在本研究中，通过阐明潜在机制并证明线粒体功能的挽救，我们最终揭示了LMNA - DCM一个有前景的治疗靶点。
作为核周网络的主要成分，层粘连蛋白A/C已知与越来越多涉及众多基本细胞机制的蛋白质结合，包括核和细胞骨架组织、机械稳定性、染色质组织、信号传导、基因调控、基因组稳定性和细胞分化 。LMNA中的突变可能潜在地导致这些相互作用中的任何一种改变或破坏，并产生有害影响。SIRT1是线粒体功能的关键调节因子，据报道它与层粘连蛋白 相互作用。在我们的iPSC - CM模型系统中证实了SIRT1与层粘连蛋白A之间的相互作用，其中层粘连蛋白A似乎对SIRT1有保护作用。在A388fs和LMNA - KO iPSC - CM中，与对照相比，SIRT1的降解速率显著加快。层粘连蛋白A/C单倍体不足可能导致SIRT1与层粘连蛋白A之间的相互作用受损以及SIRT1降解速率加快，从而导致SIRT1缺乏。用SIRT1激活剂治疗后，A388fs iPSC - CM中的线粒体功能障碍和氧化应激均显著减轻，表明层粘连蛋白A/C缺乏相关的SIRT1下调导致LMNA - DCM中线粒体功能受损和ROS升高。
氧化应激是各种心脏疾病的标志。过载的氧化应激是细胞细胞骨架变化、心脏功能障碍和心律失常 的重要驱动力。在多项研究中已充分证实ROS - CaMKII - RYR2途径会加剧心脏功能障碍并导致心律失常倾向 。在过量氧化应激下，CaMKII的磷酸化和氧化水平显著升高。作为关键介质，活化的CaMKII使 处理蛋白RYR2磷酸化，然后介导肌浆网 泄漏。通过RYR2增加的肌浆网 泄漏会扰乱细胞质舒张期 浓度，最终导致心律失常活动。在我们的研究中，SIRT1激活剂或ROS清除剂的治疗效果令人印象深刻。SRT或MT治疗可逆转A388fs iPSC - CM中的 处理异常和心律失常。有趣的是，我们还发现线粒体功能障碍导致的ROS升高加速了SUN1的积累。
SUN1是核变形 的重要致病因素。SUN1功能的破坏可保护心肌细胞免受收缩诱导的应激并维持核结构。在SIRT1激活剂或ROS清除剂治疗下，随着氧化应激降低，A388fs iPSC - CM中SUN1的表达显著降低，NE缺陷得到部分纠正。
我们研究中的一个局限性是缺乏体内数据。未来将在基因小鼠模型中进行进一步研究以证实我们的发现。此外，尽管已经证实了
核纤层蛋白A与沉默调节蛋白1之间的相互作用，但仍需要进一步研究来确定这种相互作用的确切结合位点。
总之，我们的研究确定沉默调节蛋白1缺乏介导的氧化应激是LMNA - DCM中电生理和核结构致病进展的一个原因。我们的结果还通过操纵受损的沉默调节蛋白1活性和过度的氧化应激，为LMNA - DCM提供了有前景的治疗策略。
方法
伦理批准
本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。我们的研究遵守了所有相关的伦理规定。在获得书面知情同意后，从LMNA - DCM患者和健康供体处采集3毫米皮肤打孔活检组织。诱导多能干细胞系的生成得到了浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会的批准(编号:2020 - 813)。作者确认人类研究参与者或其父母/法定监护人已提供书面知情同意，以发表本文中包含的潜在可识别医疗数据。
图6 | 沉默调节蛋白1的过表达通过抑制ROS - CAMKII - RYR2途径挽救A388fs诱导多能干细胞 - 心肌细胞中的致病表型。a、b 仅过表达载体的II - 1诱导多能干细胞 - 心肌细胞(阴性对照，NC)或过表达沉默调节蛋白1的II - 1诱导多能干细胞 - 心肌细胞(沉默调节蛋白1过表达，SIRT1 OE)中沉默调节蛋白1、总CaMKII、氧化型CaMKII、CaMKII - T286、总RYR2、磷酸化 - RYR2和SUN1表达的蛋白质免疫印迹分析。 (总CaMKII，氧化型CaMKII)，6(沉默调节蛋白1、CaMKII - T286、总RYR2、磷酸化 - RYR2、SUN1)个独立生物学重复。c NC和沉默调节蛋白1过表达组中的细胞ROS水平。 个独立生物学重复。d 从NC和沉默调节蛋白1过表达组记录的代表性 瞬时轨迹。e 条形图，比较d中两组之间的 瞬时振幅和舒张期 。 (II - 1 - OE)，22(II - 1 - NC)个细胞。f 在NT溶液中以及暴露于含有四环素和咖啡因 溶液的NC和沉默调节蛋白1过表达组中胞质 荧光的代表性轨迹。g 条形图，比较f中两组之间RYR2介导的肌浆网Ca 泄漏和肌浆网Ca 负载。 (II - 1 - OE)，28(II - 1 - NC)个细胞。h NC和沉默调节蛋白1过表达组中自发动作电位的代表性电生理测量。i 条形图，比较 中两组之间心律失常的发生率。 NC和沉默调节蛋白1过表达组中层粘连蛋白A/C(绿色)和心脏特异性标志物TNNT2(红色)染色的代表性图像。DAPI表示核染色(蓝色)。比例尺， 。 条形图，比较3个独立实验 视野中两组之间异常核被膜结构的发生率。数据在b、c、e、g、k中表示为平均值 标准误。在 中通过双侧不成对 检验计算p值。源数据作为源数据文件提供。
图7 | 提出的工作模型。LMNA基因中的新型突变A388fs导致核纤层蛋白A/C单倍体不足。这会导致突变的诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)中钙 处理异常、心律失常和核膜(NE)畸形。A388fs iPSC-CMs中核纤层蛋白A/C的表达降低导致核纤层蛋白A结合蛋白沉默调节蛋白1(SIRT1)加速降解，从而导致线粒体功能障碍和氧化应激。一方面，升高的活性氧(ROS)激活钙 /钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)。这进而促进兰尼碱受体2(RYR2)介导的肌浆网(SR) 泄漏，随后导致A388fs iPSC-CMs的舒张期 升高、 处理异常和心律失常。通过应用CaMKII抑制剂KN93可以挽救这些表型。另一方面，过量的ROS产生加速了核蛋白SUN1的积累，这进而导致A388fs iPSC-CMs中的NE变形。在这种情况下，通过应用SIRT1激活剂(SRT1720或白藜芦醇)或ROS清除剂(NAC或线粒体靶向抗氧化剂mitoTEMPO)可以挽救心律失常和核缺陷。由BioRender.com创建的图7根据知识共享署名-非商业性使用-禁止演绎4.0国际许可协议发布。
基因检测
从LMNA-DCM患者采集外周血样本，并送往PrecissionMD Inc(中国北京)进行基因组DNA分离和商业基因检测。对基因组DNA进行靶向测序以筛选7469个基因。将DNA片段化以生成双端文库。使用xGen Lock-down Probes(Precision MD，北京，中国)捕获目标。按照制造商的说明(Illumina，美国圣地亚哥)，使用Illumina hiseq2500分析仪对捕获的文库进行测序。使用SOAPsnp(北京基因组研究所内部软件)和Samtools调用单核苷酸变异和插入缺失。通过多个数据库对所有单核苷酸变异和插入缺失进行过滤。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)发布的方案评估致病变异。通过Sanger测序在先证者及其家庭成员中验证该突变。
皮肤成纤维细胞的培养与维持
将新分离的皮肤活检组织用杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(Gibco，C14190500BT)冲洗，然后转移到一个
1.5毫升管中。将组织在胶原酶I(在杜氏改良 Eagle培养基(DMEM)中为1mg/mL，Gibco，C11995500BT)中切碎，并在 于 消化。将解离的皮肤成纤维细胞接种并用含有10%胎牛血清(FBS)(Gibco，10091148)和青霉素-链霉素(Gibco，15140122)的DMEM在 空气和 的湿度培养箱中培养。所有皮肤成纤维细胞在5代内用于重编程。
iPSC系的生成
使用体细胞重编程，按照制造商的说明(Invitrogen，A16517) ，使用CytoTune-iPS 2.0仙台重编程试剂盒从皮肤成纤维细胞生成iPSC系。
iPSC的培养与维持
将iPSC在无饲养层的mTeSR1(STEMCELL Technologies，85850)培养基中培养在基质胶(Corning，354277)包被的培养板上，在 ，添加 (体积/体积) 。每天更换培养基，使用Accutase(STEMCELL Technologies，07920)每3 - 4天对iPSC进行传代，重悬并接种到含有 Y27632 ROCK抑制剂(Selleck，S1049) 的mTeSR1中。
核型分析
杭州妇女医院产前诊断中心对第20代的诱导多能干细胞进行了G显带染色体分析。在300 - 400条带水平分析了至少20个中期细胞。
碱性磷酸酶染色
按照制造商的说明，使用VECTOR Blue碱性磷酸酶底物试剂盒(Vector Laboratories，SK - 5300)进行碱性磷酸酶(ALP)染色。
利用CRISPR/Cas9对LMNA基因中的A388fs突变进行基因校正
选择LMNA的外显子9进行引导RNA(gRNA)设计，gRNA根据CRISPR在线设计工具:http://crispor.tefor.net进行设计。一对靶向位点的寡核苷酸序列如下:正向，5’-CACCGCCCTACCGACCTGGTGT GGA-3’；反向，5’-AAAC TCCACACCAGGTCGGTAGGGC-3’。寡核苷酸退火并连接到线性化的慢病毒CRISPRv2载体中，以生成表达gRNA的质粒。通过同源重组对II-1诱导多能干细胞中的突变(c.1163dupC；p.A388fs)进行校正。 将II-1诱导多能干细胞接种到12孔板中，达到80%汇合度。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen，L3000-015)将重组质粒和单链寡脱氧核苷酸(ssODN)作为修复模板转染到II -1诱导多能干细胞中。将细胞置于添加了浓度为 的嘌呤霉素(Gibco，A1113803)的mTeSR1中。2 - 3天后，选择抗嘌呤霉素的克隆，然后通过基因组PCR和DNA测序(上海生工生物工程股份有限公司)进行验证。
利用CRISPR/Cas9生成LMNA基因敲除的诱导多能干细胞系
选择LMNA的外显子4构建引导RNA(gRNA)。然后根据CRISPR在线设计工具:http://crispor.tefor.net设计gRNA。一对靶向位点的寡核苷酸序列如下:正向，5’-CACCGAA-CAGGCTGCAGACCATGA-3’；反向，5’-AAACTCATGGTCTGCAGCCT GTTC-3’。寡核苷酸退火并连接到线性化的慢病毒CRISPRv2载体中，以生成表达gRNA的质粒。 然后将Con-3诱导多能干细胞接种到12孔板中，达到80%汇合度。使用Lipofectamine 3000将重组质粒转染到Con-3诱导多能干细胞中。然后将细胞置于添加了浓度为 的嘌呤霉素的mTeSR1中。 天后，挑选抗嘌呤霉素的克隆，并通过基因组PCR和DNA测序(上海生工生物工程股份有限公司)进行验证。
心脏分化
诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)采用二维单层分化方案生成。简而言之， 未分化的诱导多能干细胞解离后重新接种到基质胶包被的6孔板中。诱导多能干细胞进行培养，扩增至85%汇合度，然后在含有B27添加剂但不含胰岛素的RPMI 1640培养基(Gibco，C11875500BT)中用6 μM CHIR99021(Axon Medchem，1386)处理2天以激活Wnt信号通路。第2天，细胞置于去除CHIR99021的含有B27添加剂但不含胰岛素的RPMI 1640培养基中。第3 - 4天，细胞用 IWR-1(Millipore，681669)处理以抑制Wnt信号通路。第5 - 6天，停止IWR-1处理，将细胞置于含有B27添加剂但不含胰岛素的RPMI 1640培养基中。从第7天起，细胞在含有胰岛素的RPMI 1640培养基和B27添加剂(Gibco, 17504044)(RPMI + B27 +胰岛素)中培养，直至观察到细胞跳动。然后用含有B27添加剂但不含胰岛素的RPMI 1640培养基对细胞进行3天的葡萄糖饥饿处理以进行纯化。心脏分化后第30 - 40天的心肌细胞用于下游功能分析。
免疫荧光染色
细胞用4%多聚甲醛固定 ，用0.1% Triton X - 100(生工生物工程(上海)股份有限公司，A110694)通透5分钟，并用3%牛血清白蛋白(Sigma - Aldrich，A1933)封闭1小时。然后用适当的一抗和AlexaFluor偶联二抗对细胞进行染色。一抗包括OCT4(Cell Signaling Technology，2750 S，1:200)、NANOG(Santa Cruz Biotechnology，sc - 33759，1:200)、SSEA - 4(Abcam，ab16287，1:200)、SOX2(Abcam，ab171380，1:200)、TNNT2(Abcam，ab8295，1:500)、α - 肌动蛋白(Cell Signaling Technology，6487 P，1:100)、核纤层蛋白A/C(Abcam，ab108595，1:500)、SIRT1(Santa Cruz Biotechnology，sc - 74465，1:200)和SUN1(Abcam，ab103021，1:500)。二抗包括AlexaFluor® 647(Abcam，ab150079，1:200)、AlexaFluor® 594(Abcam，ab150080，1:500；Abcam，ab150108，1:500)和AlexaFluor® 488(Abcam，ab150113，1:500；Invitrogen，A11008，1:500)。细胞核用DAPI(罗氏诊断，1023276001，1 μg/ml)染色。使用尼康A1共聚焦显微镜，通过 物镜，利用NIS - Elements AR软件(尼康)拍摄图片。
透射电子显微镜
将诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Gibco，25200072)消化，刮入1.5毫升微量离心管中，离心，然后用0.1M磷酸盐缓冲液配制的2.5%戊二醛(Sigma-Aldrich，G5882)在 下固定过夜。标本用磷酸盐缓冲液配制的1% 进行后固定，并通过一系列梯度乙醇脱水，每步15 - 20分钟，然后转移到无水丙酮中 。接下来，将标本置于无水丙酮和最终包埋树脂混合物的1:1混合物中在室温下放置 ，转移到无水丙酮和最终包埋树脂混合物的1:3混合物中放置 ，然后转移到最终包埋树脂混合物中过夜。然后将标本置于装有包埋树脂的1.5毫升管中，在 下加热超过 ，并使用徕卡EM UC7超薄切片机切片。切片然后用醋酸铀和碱性柠檬酸铅染色5 - 10分钟。使用透射电子显微镜(日立，型号H - 7650)观察图片。
细胞活性氧的测量
为了检测细胞活性氧，将诱导多能干细胞来源的心肌细胞与 细胞活性氧绿色荧光探针(赛默飞世尔科技，C10444)在 下孵育 ，然后洗涤3次，再使用CytoFLEX LX流式细胞仪进行分析。使用FlowJo通过测量每个样品的平均荧光强度来分析数据。
线粒体活性氧的检测
为了检测线粒体活性氧,使用线粒体分离试剂盒(碧云天，C3601)分离得到的线粒体用 线粒体超氧化物荧光探针(赛默飞世尔科技，M36008)在 下处理15分钟，然后洗涤3次并使用CytoFLEX LX流式细胞仪进行分析。使用FlowJo通过测量每个样品的平均荧光强度来分析数据。
线粒体应激分析
使用XFe96细胞外通量分析仪(安捷伦科技)测量实时耗氧率(OCR)。将细胞以每孔 个细胞接种到XFe96细胞培养微孔板(安捷伦科技)中并孵育5至7天。在安捷伦检测培养基(10 mM葡萄糖，10 mM丙酮酸，pH7.4)中测量OCR。通过依次添加不同的化合物来研究不同的线粒体呼吸状态，这些化合物以不同方式调节或抑制线粒体呼吸。首先，测量“基础OCR”以指示正常生理条件下的细胞呼吸。其次，加入寡霉素(1.5μM)以获得有关线粒体“质子泄漏”和“ATP相关OCR”的信息。接着，加入解偶联剂羰基氰化物-对-三氟甲氧基苯腙(FCCP；3μM)以获得最大呼吸速率。最大容量与基础OCR之间的差异表示电子传递链的“储备容量”。最后，加入鱼藤酮( )和抗霉素A(抗A； )的组合分别抑制复合物III和I的活性，以获得非线粒体OCR(“NM OCR”)(以便校正OCR的非线粒体来源)。具体而言，OCR参数计算如下:基础OCR = 添加药物前的OCR - NM OCR；质子泄漏 = 添加寡霉素后的OCR - NM OCR；最大容量 = 添加FCCP后的OCR - NM OCR；ATP相关OCR = 添加药物前的OCR - 添加寡霉素后的OCR；储备容量 = 添加FCCP后的OCR - 添加药物前的OCR。
线粒体拷贝数定量
使用天根基因组DNA试剂盒(天根)按照制造商的说明提取线粒体DNA和基因组DNA。使用TB Green Premix EX Taq (宝生物)在ABI Prism 7500系统上对线粒体DNA(mtDNA)和核DNA(nDNA)的拷贝数进行定量。分别使用针对ND1、ND5、SLCO2B1和SERPINA1的引物来定量mtDNA和nDNA(宝生物，72,46)。以同样的方式使用ND1/SLCO2B1对和ND5/SERPINA1对的 值之差，将两个值的平均值作为mtDNA拷贝数。
定量实时PCR
使用TRIzol®试剂(赛默飞世尔科技，T9424)进行总RNA提取。在 (Nanodrop 2000，赛默飞世尔科技)使用紫外分光光度法测量RNA浓度。使用4×EZscript逆转录混合液II(EZB，RT2G)获得cDNA。使用SYBR Green PCR预混液(宝生物)进行定量实时PCR。本研究中使用的引物序列列于补充表3。每个反应一式四份，使用Applied Biosystems Viia7 Dx(赛默飞世尔科技)运行。基因表达值以管家基因GAPDH进行标准化。
蛋白质免疫印迹法
使用TrypLE分离诱导多能干细胞来源的心肌细胞，然后在 以 在 条件下离心成沉淀。用PBS洗涤后，将沉淀重悬于 裂解缓冲液中。裂解物在冰上放置 ，然后在 以15分钟离心后收集上清液。使用BCA试剂盒(Pierce，23227)测量蛋白质浓度。使用标准方案和以下抗体进行蛋白质免疫印迹法:核纤层蛋白A/C(Abcam，ab108595，1:1000；Santa Cruz Biotechnology，sc - 7292，1:200)、SIRT1(Santa Cruz Biotechnology，sc - 74465，1:200)、总CaMKII(Abcam，ab181052，1:1000)、磷酸化CaMKII - T286(Abcam，ab32678，1:1000)、总RYR2(Abcam，ab2827，1:500)、磷酸化RYR2(Badrilla，Aolo - 3/AP，1:500)、SUN1(Abcam，ab103021，1:500)和GAPDH(Abmart，M20006M，1:5000)。使用Quantity One软件(伯乐)将每个条带的强度值确定为固定区域内的积分密度(像素值总和)。
细胞质和细胞核提取物的分离
使用NE-PER™核质提取试剂(赛默飞世尔科技，78833)分离细胞质和细胞核提取物。前两种试剂可破坏细胞膜并释放细胞质内容物。通过离心将完整的细胞核与细胞质提取物分离。用第三种试剂提取核蛋白。然后将蛋白质裂解物按照上述方法用抗体进行免疫印迹分析。
SIRT1活性检测
按照制造商的说明，使用表观遗传通用SIRT活性/抑制检测试剂盒(Epigentek，P-4037-48)检测SIRT1活性。如上述方法制备核提取物。活性SIRTs与乙酰化组蛋白SIRT底物结合，并从底物上去除乙酰基。SIRT-乙酰化产物可用特异性抗体识别。通过在荧光酶标仪中读取荧光来测量去乙酰化产物的比例。SIRT酶的活性与测得的相对荧光单位成正比。
免疫共沉淀
使用Pierce经典磁性免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒(赛默飞世尔科技，88804)进行免疫沉淀和免疫共沉淀实验。细胞裂解物在室温下与特异性一抗孵育 。免疫复合物与A/G磁珠孵育 。然后用免疫沉淀缓冲液将磁珠洗涤两次，再用纯水洗涤抗原/抗体复合物一次。向管中加入洗脱缓冲液并混合孵育 以分离磁珠和靶抗原。然后将蛋白质裂解物按照上述方法用抗体进行免疫印迹分析。
诱导多能干细胞来源的心肌细胞的膜片钳记录
将诱导多能干细胞来源的心肌细胞进行机械和酶解以获得单细胞。将这些细胞接种在基质胶包被的玻璃盖玻片(华纳仪器)上。选择具有自发搏动的细胞，使用EPC-10膜片钳放大器(HEKA)记录动作电位。使用快速溶液交换器(Bio-logic科学仪器，RSC-200)实现连续的细胞外溶液灌注。所有信号均使用PatchMaster软件(HEKA)采集，并在 进行滤波，在 进行数字化。使用Igor Pro(Wavemetrics)和GraphPad Prism(GraphPad软件)进行数据分析。使用TC-344C双通道加热系统(华纳仪器)将温度维持在35.5 - 。使用含有 葡萄糖、 、1.0 mM丙酮酸钠和10 mM HEPES(用NaOH调至pH 7.4)的台氏液作为细胞外溶液。细胞内溶液含有140 mM KCl, 5.0 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM Mg-ATP和5 mM EGTA(用KOH调至pH 7.2)。根据动作电位形态和动作电位参数区分心室样诱导多能干细胞来源的心肌细胞，这些参数表现出明显的平台期、更大的动作电位幅度和 值，以及更负的最大舒张电位值，伴有 和 。
成像
将生长在盖玻片上的诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)用不含酚红的RPMI 1640培养基(Gibco，11835030)加载，并补充5 μM 氟罗-2 AM(Invitrogen，F14185)，在室温黑暗条件下孵育30分钟。在用预热的DPBS和RPMI 1640洗涤两次后，iPSC-CMs在成像实验前在成像缓冲液中浸泡 。为了成像，将iPSC-CMs置于配备有温度控制器的小室中，在 成像缓冲液的持续灌注下。通过使用安装在倒置显微镜(Eclipse Ti，尼康)上的CCD相机(Zyla，Andor)的超高速波长切换器(Lambda DG-4，Sutter Instruments)记录细胞的荧光来进行 信号传导。在 和 激发时获得荧光信号。 瞬变的幅度定义为 的比率。
RYR2介导的舒张期 泄漏和肌浆网 负荷的评估
使用Fluo-4荧光测定RYR2介导的舒张期 泄漏和肌浆网 负荷。将iPSC-CMs在室温下于不含酚红的RPMI 1640(Gibco，11835030)中孵育15分钟，该培养基含有 的胞质 染料Fluo-4 AM(Invitrogen，F23917)，以将指示剂加载到细胞质中。孵育后，去除含指示剂的培养基。iPSC-CMs用不含酚红的RPMI 1640洗涤三次，并在室温下在成像缓冲液中再浸泡30 - 45分钟，以使指示剂去酯化。使用落射荧光显微镜进行记录。在含有 的正常台氏液中以 对iPSC-CMs进行场刺激，直到达到稳定状态的细胞内 含量。然后关闭刺激，将浴液迅速更换为 台氏液(140 mM LiCl，5.4 mM KCl，1 mM MgCl，5 mM HEPES， 葡萄糖， 乙二醇双乙醚二胺四乙酸，用LiOH调至pH 7.4)以消除跨肌膜 通量。加入一剂丁卡因( )以抑制RYR2。然后观察到的转移( 从细胞质到肌浆网)与肌浆网钙 泄漏成比例。然后将溶液迅速切换为咖啡因 以耗尽肌浆网钙 储存。最后，将浴液从 台氏液切换回正常台氏液。使用NIS-Elements软件(尼康仪器公司)采集数据，并使用Igor Pro(Wavemetrics)和GraphPad Prism(GraphPad软件)进行分析。
通过IonOptix系统记录细胞内 瞬变
在实验前，将诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)接种在共聚焦培养皿中3 - 5天。在室温黑暗条件下，用Fura-2 AM对iPSC-CMs进行负载30分钟。用预热的DPBS和RPMI 1640洗涤两次后，在进行荧光强度记录前，将iPSC-CMs浸入成像缓冲液中30分钟。使用荧光光电倍增管(IonOptix，米尔顿，马萨诸塞州)检测荧光发射。在 (F340)和 (F380)激发下获得荧光信号。 瞬变的幅度定义为F340/F380的比值。
多重串联质量标签质谱法定量蛋白质组学
取20 mg诱导多能干细胞来源的心肌细胞(II - 1 - corr和II - 1， 个生物学重复样本)，用裂解缓冲液( 尿素， 三乙胺碳酸氢盐(TEAB)，pH 8.5)裂解，然后在 条件下离心 以收集上清液。提取的蛋白质裂解物用 二硫苏糖醇(DTT)在 条件下处理 ，并在室温下用碘乙酰胺烷基化 。用Bradford蛋白质定量试剂盒进行定量和鉴定后，蛋白质样品用胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质比例为1:20)消化，并用Strata X C18 SPE柱脱盐柱(Phenomenex，托伦斯，加利福尼亚州，美国)脱盐并真空干燥。制备的肽段用0.1 M TEAB缓冲液复溶，随后根据制造商的方案用串联质量标签(TMT)标记试剂进行标记。TMT标记的肽段在Rigol L3000 HPLC系统上进行分级分离并合并为10个级分，然后真空干燥。使用EASY - nLC 1200 UHPLC系统(赛默飞世尔，德国)与Q ExactiveTM HF - X(赛默飞世尔，德国)联用进行超高效液相色谱 - 串联质谱(UHPLC - MS/MS)分析。所得光谱在UniProt数据库(homo_sapiens_uniprot_UP000005640(82493个序列))中使用Proteome Discoverer(PD，赛默飞世尔，HFX，和480)进行分析。搜索参数设置如下:前体离子的质量容差为10 ppm，产物离子的质量容差为0.02 Da。为了提高分析结果的质量，使用PD软件进一步过滤检索结果，将可信度超过99%的肽段谱匹配(PSMs)视为PSMs。鉴定出的蛋白质至少包含1个独特肽段。保留鉴定出的PSMs和蛋白质，其错误发现率(FDR)不超过1.0%。通过t检验对蛋白质定量结果进行统计分析。根据标准 和倍数变化(FC) 或FC 筛选差异表达蛋白(DEP)。定量的总蛋白中DEP为11.5%。使用interproscan程序针对非冗余蛋白质数据库(包括Pfam、PRINTS、ProDom、SMART、ProSite、PANTHER)进行基因本体(GO)和InterPro(IPR)功能分析，并使用直系同源簇(COG)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库分析蛋白质家族和通路。DEP用于火山图分析、聚类热图分析以及GO、IPR和KEGG的富集分析。
SIRT1在诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的过表达
将人源SIRT1 cDNA分别导入pCDH - CMV - MCS - EF1 - copGFP - T2 - Puro和pCDH - CMV - MCS - EF1 - T2 - Puro载体。按照制造商说明，使用Lipofectamine 3000转染试剂将构建好的质粒导入诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC - CMs)。在 后更换培养基，在 后可在 细胞中检测到绿色荧光蛋白(GFP)。
诱导多能干细胞来源的心肌细胞中SIRT1或SUN1的敲低
SIRT1或SUN1的小干扰RNA(siRNA)购自GenePharma。按照制造商说明，使用RNAiMAX(Invitrogen，13778075)系统将siRNA导入诱导多能干细胞来源的心肌细胞。在 后更换培养基。培养3天后可观察到SIRT1或SUN1表达显著降低。
工程化心脏组织束(EHTs)的构建与培养
为生成 个人类心脏组织束，设计并微制造了聚二甲基硅氧烷(道康宁，SYLGARD 184)模具 。将水凝胶溶液(24 μL 10 mg/mL纤维蛋白原(Sigma，F3879)，12 μL基质胶(康宁，354277)，24 μL 培养基)与 诱导多能干细胞来源的心肌细胞在 培养基中混合。加入2.4 μL 50 U/mL凝血酶(Sigma，T7201)后，将细胞/凝胶混合物加入模具中，置于 孵育 以聚合。从模具中取出心脏组织束，在12孔板的摇摆平台上培养7天，然后用于药物测试。每2天更换一次培养基。
工程化心脏组织束的收缩力评估
用二甲基亚砜(DMSO)或指定浓度的药物处理心脏组织束3天。使用定制的力测量装置 评估药物处理后心脏组织束的电刺激和机械拉伸刺激的收缩力。为评估力 - 长度关系，在含有 的台氏液中，使用一对铂电极以电脉冲(10 V，2 Hz)刺激心脏组织束，并依次将其拉伸至其培养长度的 至 (有或无异丙肾上腺素刺激)。为评估力 - 频率关系和电收缩偶联能力，在0%和12%的拉伸率下，以逐步增加的频率(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 Hz)刺激心脏组织束(有或无异丙肾上腺素刺激)。数据用MATLAB软件(版本R2020b(9.9.0.1467703))分析。
化合物与溶液
电生理实验中使用的所有化学试剂均购自Sigma-Aldrich。Fluo-4 AM和Fura-2 AM购自Invitrogen，储备液均用溶解于二甲基亚砜(Sigma-Aldrich，D2650)中的1 mM 20% Pluronic F-127(生工生物工程，A600750)配制。白藜芦醇购自MedChemExpress，储备液用 溶解于二甲基亚砜中配制。SRT购自MedChemExpress(HY-15145)，储备液用 溶解于二甲基亚砜中配制。KN93购自Abcam(Ab120980)，储备液用 溶解于二甲基亚砜中配制。丁卡因(Sigma-Aldrich，T7508)和咖啡因(Sigma-Aldrich，C0750)溶液在需要时新鲜配制。MT购自Sigma-Aldrich，储备液用 溶解于二甲基亚砜中配制。NAC购自Sigma-Aldrich，储备液用 溶解于二甲基亚砜中配制。AIP购自Sigma-Aldrich(SCP0001)，储备液用 溶解于 中配制。
统计与可重复性
在每次定量分析中，单个绘图点表示一个细胞、视野或独立的生物学重复(单个培养孔)。定量数据取自至少 个生物学重复。每个图注中均注明了 的值及其代表的含义。在图1j、k、m、n、2a、c、d、f、g、j、i、l、m、3a、c、e、g、i、l、4b、d、f、h、i、5a、c、d、g、l和6a、c、d、f、j中，实验独立重复三次；在图3o、4a、5j和6h中，实验独立重复四次，结果相似。使用未配对双尾学生 检验比较两组，使用单向方差分析比较多组，以确定统计学意义。 值为 时被认为具有统计学意义。数据以平均值 标准误表示，并使用GraphPad Prism(GraphPad软件)进行分析。在所有实验的数据收集和分析过程中，研究人员对分组情况不知情。
报告总结
有关研究设计的更多信息，请参阅与本文相关的《自然》系列报告总结。
数据可用性
本研究中生成的蛋白质组数据已通过iProX存储库存入蛋白质组交换联盟，数据集标识符为PXD039452 [https://www.iprox.cn/page/subproject.html?id=IPX0005778001]。原始临床数据受到保护，由于数据隐私法，无法提供。通过给通讯作者(梁平博士:pingliang@zju.edu.cn；蒋晨阳博士:cyjiang@zju.edu.cn)发送电子邮件，可在两周内共享完全匿名的临床数据。源数据文件中提供了未裁剪和未处理的印迹扫描图。评估本文结论所需的所有数据均包含在本文和/或补充信息中。本文提供了源数据。
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