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组蛋白去乙酰化酶5是间歇性低氧诱导交感神经激活和血压升高的早期表观遗传调节因子

发布时间：

2026-04-01 21:55

开放获取

编辑:

罗德里戈·伊图里亚加，智利天主教大学，智利

审阅:

*通信作者:

贾亚斯里·南杜里

jnanduri@uchicago.edu

专业领域:

本文已提交至《生理学前沿》杂志的综合生理学板块

接收日期:2021年3月30日

录用日期:2021年4月26日

发表日期:2021年5月17日

组蛋白去乙酰化酶5是间歇性低氧诱导交感神经激活和血压升高的早期表观遗传调节因子

王宁，彭英杰，苏晓宇，南杜里·R·普拉巴卡尔和贾亚斯里·南杜里*

美国芝加哥大学综合生理学研究所，传感系统生物学中心

间歇性低氧(IH)是阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)的标志性表现。长期间歇性低氧(LT-IH)触发了氧化还原状态的表观遗传重编程，涉及颈动脉体化学反射途径中的DNA高甲基化，导致持续性交感神经激活和高血压。本研究探讨了IH是否还会激活除DNA甲基化以外的表观遗传机制。赖氨酸乙酰化介导的组蛋白修饰是另一种与基因调控相关的主要表观遗传机制。组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的活性平衡决定了赖氨酸乙酰化的水平。在此，我们报告，体外将大鼠嗜铬细胞瘤(PC)-12细胞暴露于IH后，由于HDAC3和HDAC5蛋白的蛋白酶体降解，HDAC酶活性降低。机制研究表明，IH引起的HDAC活性降低增加了缺氧诱导因子(HIF)-1α的亚基以及组蛋白(H3)蛋白的赖氨酸乙酰化，导致HIF-1转录活性增加。HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA)模拟了IH的作用。对接受10天IH或TSA治疗的大鼠的研究表明，肾上腺髓质(AM)中的HDAC活性、HDAC5蛋白降低，HIF-1依赖性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)-4转录增加，导致血浆儿茶酚胺和血压升高。同样，由于自发呼吸暂停发生率高(呼吸暂停指数72 ± 1.2次呼吸暂停/小时)而表现出IH的血红素加氧酶(HO)-2基因敲除小鼠，其AM中的HDAC活性和HDAC5蛋白也降低，同时循环去甲肾上腺素水平升高。这些发现表明，组蛋白和非组蛋白蛋白的赖氨酸乙酰化是IH啮齿动物模型中与交感神经激活和高血压相关的早期表观遗传机制。

关键词:间歇性低氧，阻塞性睡眠呼吸暂停，赖氨酸脱乙酰酶，HDAC5，组蛋白3，HIF-1，高血压

罗薇博，美国德克萨斯大学西南医学中心；安杰拉·戈麦斯 - 尼尼奥，西班牙巴利亚多利德大学

引用文献:

王 N，彭 Y - J，苏 X，普拉巴卡尔 NR 和南杜里 J(2021 年)组蛋白去乙酰化酶 5 是间歇性缺氧诱导交感神经激活和血压的早期表观遗传调节因子。《生理学前沿》12:688322。doi:10.3389/fphys.2021.688322

引言

阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)是一种广泛存在的呼吸障碍，影响 10 - 15%的成年人口(佩珀德等人，2013 年)。OSA 被定义为睡眠期间由于上呼吸道完全(呼吸暂停)或部分塌陷(呼吸浅慢)导致的气流周期性中断。基于人群的研究表明原发性高血压患病率高，且与 OSA 严重程度密切相关(莫雷尔等人，2000 年；涅托等人，2000 年)。

间歇性缺氧(IH)是 OSA 的一个标志性表现，是高血压的一个主要促成因素(普拉巴卡尔等人，2020 年综述)。长期接受 IH(30 天；LT - IH)治疗的大鼠表现出高血压和交感神经活动增强，即使在恢复正常空气环境 30 天后仍持续存在(南杜里等人，2017 年)。LT - IH 引起的长期血压升高让人联想到一部分 OSA 患者中报道的难治性高血压。LT - IH 引起的长期高血压是由于 DNA 甲基化对抗氧化酶基因的表观遗传抑制导致 ROS 持续升高所致(南杜里等人，2017 年)。

组蛋白(H2A、H2B、H3 和 H4)的赖氨酸乙酰化是另一种重要的表观遗传机制，它通过改变染色质结构来调节基因转录。高乙酰化激活转录，而低乙酰化抑制转录激活(格伦斯坦，1997 年；奥迪亚和坎贝尔，2016 年)。赖氨酸乙酰化是一个动态过程，涉及组蛋白/赖氨酸乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的相反活性(杨和濑户，2007 年)。最近的一项研究报道，慢性应激会降低 HDAC 活性，导致组蛋白乙酰化增加和靶基因转录激活(伦萨尔等人，2007 年)。鉴于 IH 是一种慢性应激形式，HDAC 活性降低导致的赖氨酸乙酰化是否参与 IH 引起的基因激活尚未得到研究。

除了组蛋白外，转录因子等非组蛋白蛋白质的赖氨酸乙酰化也控制基因转录(朴等人，2015 年)。缺氧诱导因子(HIF - 1)是缺氧期间基因转录的主要调节因子(塞门扎等人，1998 年)。对肿瘤细胞系的研究表明，HDAC1 和 HDAC3 正向调节 HIF - 1α稳定性，而 HDAC4 和 HDAC5 增加 HIF - 1 依赖性转录激活(金等人，2007 年；徐等人，2009 年；耿等人，2011 年)。我们早期的研究表明，HIF - 1 复合物的调节亚基部分缺陷的小鼠，表现出显著缺乏 IH 引起的 ROS 升高、交感神经激活和高血压(彭等人，2006 年)。此外，HIF - 1 是包括 NADPH 氧化酶(NOX)在内的促氧化酶基因的有效激活剂(袁等人，2011 年；王等人，2020 年)。鉴于 HDAC 调节 HIF - 1 的稳定性以及 HIF - 1 活性(钱等人，2006 年；金等人，2007 年；徐等人‘2009 年)，我们假设 IH 通过赖氨酸乙酰化降低 HDAC 活性并稳定 HIF - 1α，导致涉及组蛋白蛋白质赖氨酸乙酰化的 HIF - 1 依赖性转录激活。这些可能性首先在大鼠嗜铬细胞瘤(PC)- 12 细胞中进行了测试，然后在两种 OSA 啮齿动物模型中进一步验证，即接受 IH 治疗的大鼠和表现出 OSA 的血红素加氧酶(HO)- 2 基因敲除小鼠(彭等人，2018 年)。

材料与方法

实验方案经芝加哥大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准，并在成年Sprague Dawley大鼠(SD；2 - 4个月龄，批准方案#71811)、年龄和性别匹配的野生型(WT；C57BL6)和HO - 2基因敲除小鼠(6 - 8个月龄，批准方案#71810)上进行。

大鼠间歇性低氧暴露(IH)

将大鼠暴露于间歇性低氧(IH)的实验方案与之前描述的基本相同(Peng等人，2006年)。简而言之，将清醒的大鼠置于一个特殊的舱室中，使其暴露于缺氧( ，最低点)与室内空气( ，天)交替循环的环境中，持续10天。在相同的舱室中，对暴露于室内空气交替循环(对照)的大鼠进行平行实验。气流持续时间由定时器控制的电磁阀调节。持续监测舱室内的环境和水平，并将水平维持在。

将大鼠嗜铬细胞瘤 (PC)-12 细胞暴露于间歇性低氧环境

PC12细胞(最初克隆自美国纽约哥伦比亚大学的劳埃德·A·格林博士)(格林和 Tischler，1976年)在补充有5%胎牛血清(FBS)、10%马血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中，于和条件下，在的环境中培养(袁等人，2005年)。实验在DMEM培养基中血清饥饿过夜的细胞上进行。细胞按照所述方法(袁等人，2004年)暴露于体外间歇性缺氧( 交替循环，随后在下持续5分钟)。间歇性缺氧舱内的环境水平由分析仪(Alpha Omega Instruments，休斯顿，德克萨斯州)监测。在涉及药物处理的实验中，细胞在间歇性缺氧暴露之前和期间用药物或溶剂预孵育30分钟。

血压(BP)和血浆去甲肾上腺素的测量

采用无创血压系统(美国加利福尼亚州IITC生命科学公司)通过尾套法于上午09:00至11:00在清醒大鼠中测量血压。从用氨基甲酸乙酯(1.2 g/kg，腹腔注射)麻醉的大鼠/小鼠中收集血液样本于肝素化小瓶(30 IU/ml)中。通过离心分离血浆并储存在。血浆去甲肾上腺素(NE)水平通过高压液相色谱(HPLC)结合电化学检测来测定，使用氢溴酸二羟基苄胺(DHBA；Sigma-Aldrich)作为内标。NE水平针对回收率损失进行校正，并表示为根据NE标准曲线计算的每毫升血浆中的纳克数(Peng等人，2006年)。

呼吸测量

如前所述(Peng等人，2018年)，在环境温度为的清醒小鼠中，通过全身体积描记法监测呼吸。由两名对基因型不知情的人员对呼吸暂停进行评分。分析每小时的呼吸暂停次数(定义为呼吸停止超过三次呼吸的持续时间)，并将其作为呼吸暂停指数呈现。分析中排除了叹息、嗅探和运动引起的呼吸变化。

组蛋白去乙酰化酶、沉默调节蛋白和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性的测量

分别使用比色法表观遗传酶HDAC活性和SIRT活性试剂盒(美国纽约法明顿的Epigentek公司)在核裂解物中测量HDAC和沉默调节蛋白(SIRT)的活性。简而言之，将的核提取物(来自两只大鼠肾上腺髓质(AM)和4只小鼠AM)加入到涂有乙酰化组蛋白HDAC或SIRT底物的平板中。活性HDAC或SIRT结合并使H3去乙酰化，H3可被特异性抗体识别，并通过读取处的吸光度进行测量。该活性与所测OD强度成正比，并以ng/分钟/毫克蛋白质表示。通过超氧化物歧化酶抑制的细胞色素c还原速率，并读取处的吸光度，测量富含膜蛋白组分(50 :两只大鼠AM和4只小鼠AM)中的NADPH氧化酶活性。NADPH氧化酶活性基于每厘米的消光系数[21 mmol/(L)]计算，并以nmol/分钟/毫克蛋白质表示(Khan等人，2011年)。

##免疫印迹和免疫沉淀分析

使用核提取试剂盒(Active Motif，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)制备PC12细胞的核提取物。简要地说，将中的细胞在试剂盒提供的低渗缓冲液中匀浆，并在下以离心。将沉淀重悬于低渗缓冲液中，并在显微镜下检查一小份样品，以验证细胞是否有效裂解且细胞核是否释放。将悬浮液在14,000 下离心。将核沉淀重悬于提供的完全裂解缓冲液中，并通过聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳进行分级分离。免疫印迹用HIF-1α(1/1000稀释；#NB100-479，Novus Biologicals，美国科罗拉多州森特尼尔)、HDAC1-5(1/2000；分别为#5356、#5113、#3949、#7628和#20458)和H3(1/4000；#4499)(Cell signaling，美国马萨诸塞州丹弗斯)、TBP(1/1000；Tata结合蛋白；#ab51841，Abcam)或微管蛋白(1/10000；#T6199，Sigma，美国密苏里州圣路易斯)抗体进行检测，随后用Clarity Western ECL底物试剂盒(Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯)检测相应的HRP偶联二抗。使用Odyssey Fc成像系统(LI-COR，美国内布拉斯加州林肯)对免疫印迹进行扫描和定量。为了分析HIF-1α乙酰化，用FLAG标记的HIF-1α质粒转染的PC12细胞暴露于间歇性缺氧(IH)。细胞裂解物用抗FLAG抗体(#1804，Sigma，美国密苏里州圣路易斯)进行免疫沉淀，免疫沉淀物如上所述用乙酰化赖氨酸(1/500，#SC-32268，Santa Cruz，美国得克萨斯州达拉斯)抗体进行分析。大鼠/小鼠肾上腺髓质细胞提取物在RIPA缓冲液(pH 7.4的磷酸盐缓冲液，含有、1% Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS、5 mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物)中制备，并使用基于大小的自动毛细管电泳分离进行分析，随后根据制造商的说明使用Protein Simple的WES系统进行免疫测定。数据用Compass软件(Protein Simple)进行分析。用于免疫印迹分析的针对以下蛋白质的一抗以1/50的稀释度使用:HIF-1α(#NB100-123，Novus Biologicals，美国科罗拉多州森特尼尔)。HDAC5(#ab20458，Cell Signaling，美国马萨诸塞州丹弗斯)。样品上样变异性通过微管蛋白(#T6199，Sigma，美国密苏里州圣路易斯)抗体进行标准化。通过聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳分析AM细胞裂解物中的乙酰化H3和NOX4蛋白表达，免疫印迹用乙酰化赖氨酸抗体(1/500，#SC-32268，Santa Cruz，美国得克萨斯州达拉斯)或NOX4抗体(1/1000；NB110-58851，Novus Biologicals，美国科罗拉多州森特尼尔)进行检测。

定量逆转录PCR(qRT-PCR)

使用TRIZOL(Invitrogen)分离总RNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)合成cDNA。使用SsoFast EvaGreen(Bio-RAD)作为荧光结合染料进行qRT-PCR。看家基因18S RNA和 -肌动蛋白作为定量对照。根据之前描述的方法计算靶mRNA表达的变化(Nanduri等人，2009年)。用于实时PCR扩增的引物序列如下:大鼠NOX4；(NM_053524.1):正向；CGGGTGGCTTGTTGAAGTAT；反向；TGGAACTTGGGTTCTTCCAG，小鼠NOX4；(NM_015760.5):正向:TGTTGGGCCTAGGATTGTGTT；反向:AGGGACCTTCTGTGATCCTCG，18S(NR_003278):正向；CGCCGCTAGAGGTGAAATTC；反向；CGAACCTCCGACTTTCGTTCT。β-肌动蛋白(NM_031144.3):正向；AGG CCC AGA GCA AGA GAG G；反向；TAC ATG GCT GGG GTG TTG AA。

瞬时转染和HRE报告基因检测

使用TransIT-2020(Mirus)转染试剂将过表达质粒pHDAC5和pHDAC3(addgene)或对照载体质粒pcDNA瞬时转染到PC12细胞中。简要地说，将细胞以个细胞/孔的密度接种在含血清的生长培养基中的组织培养板中。后，以1:3的比例加入DNA-TransIT试剂。后，血清饥饿的细胞暴露于间歇性缺氧(IH)。为了分析缺氧诱导因子-1(HIF-1)的转录活性，将细胞与两种报告质粒共转染:p2.1，其在基础SV40启动子下游包含萤火虫荧光素酶编码序列和来自人促红细胞生成素1(EPO1)基因的68 bp缺氧反应元件(HRE)(Semenza等人，1996年)和海肾荧光素酶对照报告载体(pRL)。使用Bright-Glo™荧光素酶检测系统(Promega，美国威斯康星州麦迪逊)测量细胞核细胞裂解物中的荧光素酶活性，并将其标准化为通过Bio-Rad蛋白质检测试剂盒(Bio-Rad，美国加利福尼亚州里士满)测量的蛋白质含量。

数据分析

数据表示为来自小鼠(每组8 - 12只动物)和3 - 5个独立细胞培养实验的平均值标准误。通过方差分析(单因素方差分析和事后Turkey HSD检验)和Mann-Whitney检验进行统计分析。被认为具有显著性。

结果

间歇性缺氧降低HDAC酶活性

选择嗜铬细胞瘤(PC)12细胞培养物是因为实验需要用于报告基因检测的瞬时转染方案，并且蛋白质的异位表达在细胞培养物中比在大鼠组织中能更好地进行(Prabhakar等人，2012年)。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)由四类蛋白质组成(Haberland等人，2009年)，包括I类(HDACs 1、2、3和8)、II类(HDACs 4、5、6、7、9和10)、III类(NAD -依赖性沉默调节蛋白)和IV类(HDAC11)。在接受60个间歇性缺氧循环或作为对照的常氧(N)交替循环处理的细胞中测定HDAC和沉默调节蛋白(SIRT)的酶活性。用处理的细胞显示HDAC活性降低，而SIRT活性未改变(图1A、B)。用曲古抑菌素A(TSA)处理细胞，TSA是HDACs而非SIRTs的抑制剂(Finnin等人，1999年；Bertrand，2010年)，与用载体处理的对照相比，通过显著降低HDAC活性模拟了间歇性缺氧的作用(图1C)。

间歇性低氧降低HDAC5和HDAC3蛋白水平

接下来，我们确定HDAC蛋白表达降低是否是间歇性低氧导致HDAC活性降低的原因。为此，通过免疫印迹分析测定间歇性低氧处理细胞的核提取物中HDAC1 - 5蛋白丰度。间歇性低氧处理的细胞显示HDAC3和HDAC5蛋白水平降低，而HDAC1、HDAC2和HDAC4蛋白水平未改变(图2A、B)。

间歇性低氧对HDAC3或HDAC5 mRNA表达没有影响(图2C)，这表明间歇性低氧导致HDAC3和HDAC5蛋白减少并非由于转录减少。HDAC可经历翻译后修饰，导致泛素介导的蛋白酶体降解(Adenuga等人，2009年)。为了确定间歇性低氧的影响是否是由于蛋白酶体降解增加，细胞用蛋白酶体抑制剂MG - 132(5 )处理。如图2D所示，与载体处理的细胞相比，用MG - 132处理的细胞显示间歇性低氧诱导的HDAC3和HDAC5蛋白减少不存在。这些数据表明，HDAC3和HDAC5的蛋白酶体降解导致暴露于的PC12细胞中HDAC活性降低。

降低的HDAC通过赖氨酸乙酰化促进间歇性低氧诱导的HIF - 1α稳定性

间歇性低氧可稳定PC12细胞中的HIF - 1α蛋白并激活HIF - 1依赖性转录(Yuan等人，2005年，2011年)。鉴于HDAC可影响HIF - 1α稳定性(Qian等人，2006年；Kim等人，2007年；Seo等人，2009年)，我们假设间歇性低氧导致的HDAC活性降低通过赖氨酸乙酰化促进HIF - 1α稳定。首先通过监测用或50 nM曲古抑菌素A(阳性对照)处理的PC12细胞核提取物中的HIF - 1α蛋白来测试这种可能性。在间歇性低氧以及曲古抑菌素A处理的细胞中，HDAC3和HDAC5蛋白表达降低与HIF - 1α蛋白升高相关(图3A)。

接下来，我们确定间歇性低氧或曲古抑菌素A诱导的HIF - 蛋白积累是否与HIF - 1α赖氨酸乙酰化增加相关。评估PC12细胞中内源性HIF - 1α赖氨酸乙酰化在技术上具有挑战性。为了规避这一限制，将PC12细胞用FLAG标签的HIF - 1α表达质粒转染，然后用或曲古抑菌素A(50 nM用于 )处理。在核提取物中用FLAG抗体免疫沉淀HIF - 1α，并用抗乙酰化赖氨酸抗体测定赖氨酸乙酰化。与常氧(N)或载体处理的对照相比，用以及曲古抑菌素A处理的细胞显示赖氨酸乙酰化HIF - 1α蛋白丰度增加(图3B、C)。

图1 | 60个周期间歇性低氧(IH60)或HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA)处理对PC12细胞中HDAC和SIRT活性的影响。(A、B)常氧(N)和间歇性低氧暴露(IH )的PC12细胞核裂解物中的HDAC和SIRT活性。(C)在常氧(N)中用TSA(HDAC抑制剂；50 nM)处理7小时的PC12细胞核裂解物中的HDAC活性(平均值标准误； )。；ns 无显著性差异通过Mann - Whitney检验确定。

图2 | 间歇性低氧对组蛋白去乙酰化酶(HDAC)蛋白及mRNA表达的影响。(A) 免疫印迹的代表性示例，显示了在常氧(N)和间歇性低氧处理的PC12细胞核裂解物中HDAC1 - 5蛋白表达以及作为上样对照的Tata结合蛋白(TBP)。(B) 通过ImageJ对印迹进行定量分析。(C) 通过qRT - PCR检测HDAC3和HDAC5 mRNA表达。(D) 上图:用溶剂或MG132(蛋白酶抑制剂； )处理并暴露于间歇性低氧的细胞中HDAC3和HDAC5蛋白表达。下图:通过Odyssey Fc成像系统的Image Studio对印迹进行定量分析(平均值标准误； )。** ；ns = 无显著性差异，通过单因素方差分析及事后Turkey HSD检验确定。

HDAC通过组蛋白赖氨酸乙酰化调节间歇性低氧诱导的HIF - 1转录

然后，我们询问赖氨酸乙酰化导致的HIF - 1α稳定是否伴随着间歇性低氧诱导的HIF - 1转录激活。为此，用含有荧光素酶编码序列上游缺氧反应元件(HRE)的质粒转染细胞。监测荧光素酶活性增加作为HIF转录活性指标。用以及曲古抑菌素A(TSA)处理的细胞显示出强大的HIF - 1依赖性转录激活，荧光素酶活性显著增加证明了这一点(图4A)。

组蛋白的赖氨酸乙酰化通过改变染色质结构促进转录因子与靶基因启动子区域的结合来调节转录(Yang和Seto，2003；Seto和Yoshida，2014)。我们评估HDAC活性降低是否通过增加组蛋白赖氨酸乙酰化导致间歇性低氧诱导的HIF - 1转录激活。首先通过确定在间歇性低氧或TSA处理的PC12细胞中哪些组蛋白被乙酰化来测试这种可能性。用泛乙酰化赖氨酸抗体进行免疫印迹分析在间歇性低氧和TSA处理的细胞裂解物中检测到约处的条带。该分子量对应于组蛋白3(H3)而非组蛋白4(约11 kD)(图4B)。为了证实间歇性低氧增加H3赖氨酸乙酰化，用抗H3抗体从核提取物中免疫沉淀H3，并用乙酰化赖氨酸抗体检测免疫沉淀物中的赖氨酸乙酰化。在间歇性低氧以及TSA处理的细胞中，赖氨酸乙酰化H3蛋白丰度增加，而总H3蛋白表达无变化(图4B、C)。这些观察结果表明HDAC活性降低增加了H3蛋白的赖氨酸乙酰化，这伴随着间歇性低氧诱导的HIF - 1转录激活。

HDAC5而非HDAC3调节间歇性低氧诱导的HIF - 1激活

HDAC作为具有同型和/或异型二聚体结构的多聚体蛋白复合物发挥作用(Yang和Seto，2003)。鉴于间歇性低氧降低了HDAC3和HDAC5蛋白水平，我们研究了HDAC3和HDAC5对间歇性低氧诱发的HIF - 1转录激活的相对贡献。为此，用编码HDAC3或HDAC5的过表达质粒转染细胞，然后暴露于或常氧(对照)。HDAC5过表达阻断了间歇性低氧特征性的HDAC5表达降低以及HIF - 1α蛋白积累，对HDAC3蛋白无显著影响(图5A)。另一方面，HDAC3过表达阻断了间歇性低氧诱导的HDAC3表达降低，但对间歇性低氧诱导的HIF - 1α或HDAC 5蛋白表达均无影响(图5A)。此外，在异位表达HDAC5而非HDAC3的细胞中不存在间歇性低氧诱发的HRE转录活性(图5B)。在细胞恢复到常氧后内，间歇性低氧对HDAC5和HIF - 1α蛋白的影响被逆转(图5C、D)。这些发现表明，HDAC5而非HDAC3的减少导致间歇性低氧诱导的HIF - 1α稳定性和HIF - 1转录激活，并且间歇性低氧对HDAC5蛋白的影响是可逆的。

图3 | I 和曲古抑菌素A(TSA)对PC12细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白及HIF-1α乙酰化的影响。(A)以微管蛋白作为上样对照，检测常氧(N)、间歇性缺氧(IH)处理及TSA(50 nM，处理7小时)处理的PC12细胞核裂解物中组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)、HDAC5和HIF-1蛋白表达；(B)用FLAG标签的HIF-1过表达质粒瞬时转染PC12细胞，分别用IH 或TSA处理，从细胞核提取物中用抗FLAG抗体免疫沉淀HIF-1α。用抗乙酰化赖氨酸抗体通过免疫印迹法分析免疫沉淀中HIF-1(α)的乙酰化情况。用抗Flag抗体分析HIF-1蛋白。(C)印迹的定量分析，以乙酰化HIF-1 蛋白的比值表示(平均值标准误； )。通过单因素方差分析及事后Turkey HSD检验确定。

图4 | 间歇性低氧(IH) 和曲古抑菌素A(TSA)对PC12细胞中缺氧诱导因子-1(HIF-1)转录活性和组蛋白(H3)乙酰化的影响。(A)用含有SV40启动子上游缺氧反应元件(HRE)和荧光素酶编码序列的质粒p2.1与海肾荧光素酶对照载体共转染的细胞，在核裂解物中的HRE转录活性，细胞分别暴露于常氧(N)、低氧(H)及低氧加TSA处理。(B)用抗乙酰赖氨酸抗体通过免疫印迹分析组蛋白3(H3)的乙酰化。用抗H3抗体进行免疫沉淀，并用抗H3抗体和抗乙酰赖氨酸抗体对免疫沉淀产物进行检测，从而确认H3的乙酰化。(C)印迹的定量分析，以乙酰化H3与总H3蛋白的比值表示(平均值标准误； )。通过单因素方差分析和事后Turkey HSD检验确定。

图5 | HDAC5而非HDAC3促进间歇性缺氧增强的HIF-1转录活性。(A)免疫印迹的代表性示例，显示在转染了编码HDAC3、HDAC5或对照载体pcDNA的过表达质粒的常氧(N)和间歇性缺氧处理的PC12细胞核裂解物中，以Tata结合蛋白(TBP)作为上样对照的HDAC5、HDAC3和HIF-1α蛋白表达(平均值标准误；n =3)。(B)在过表达HDAC3或HDAC5蛋白的对照(N)和间歇性缺氧处理的PC12细胞核裂解物中的HRE转录活性(平均值标准误； )。；经曼-惠特尼检验确定，ns 无显著性差异。(C)免疫印迹显示在常氧(N)、间歇性缺氧处理(IH )以及间歇性缺氧处理后恢复常氧16小时(IH60+恢复)的细胞裂解物中以微管蛋白作为上样对照的HDAC5、HIF-1α蛋白和乙酰化-H3蛋白表达。(D)印迹的定量分析。经单因素方差分析和事后Turkey HSD检验确定。

阻塞性睡眠呼吸暂停啮齿动物模型中HIF-1活性的HDAC调节

为了验证细胞培养研究中的观察结果，对啮齿动物进行了以下实验。研究了两种间歇性低氧(IH)的啮齿动物模型:(1)按照阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)期间血液谱进行10天间歇性低氧处理的大鼠；(2)血红素加氧酶(HO)-2缺陷的小鼠，由于自发性呼吸暂停发生率高而经历间歇性低氧(Peng等人，2017年)。

接受间歇性低氧处理的大鼠

成年大鼠接受间歇性低氧(IH)或TSA(10 mg/kg；腹腔注射)处理10天，TSA作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，作为HDAC的阳性对照。接受常氧交替循环处理的大鼠作为对照。测定麻醉大鼠肾上腺髓质(AM)中的HDAC活性、HDAC5、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白以及组蛋白H3乙酰化水平。选择AM组织有两个原因:(1)上述细胞培养研究中使用的PC12细胞源自肾上腺髓质嗜铬细胞(Greene和Tischler，1976)；(2)AM在IH诱导的高血压中起关键作用(Bao等人，1997；Prabhakar等人，2012)。技术限制使得在这些实验中无法测量HIF-1α蛋白的赖氨酸乙酰化水平。IH和TSA处理的大鼠AM中，HDAC活性和HDAC5蛋白表达降低(图6A、B)。这些效应与H3赖氨酸乙酰化增加、HIF-1α蛋白增加以及HIF-1靶基因NOX4 mRNA升高有关(图6B-C)。与常氧处理的对照相比，NOX4 mRNA升高伴随着NOX酶活性增加(图6D)。

血红素加氧酶-2基因敲除小鼠的研究

缺乏血红素加氧酶-2(HO-2)的小鼠表现出睡眠呼吸暂停(Peng等人，2017)。通过体积描记法记录未麻醉的野生型(WT)和HO-2基因敲除小鼠的呼吸情况，分析呼吸暂停指数(AI = 呼吸暂停次数/小时)。WT和HO-2基因敲除小鼠的呼吸示例见图7A。WT小鼠呼吸稳定，呼吸暂停指数(AI)为次/小时。HO-2基因敲除小鼠呼吸不规则，呼吸暂停发生率高，AI为次/小时(图7A、B)。与WT小鼠的AM相比，HO-2基因敲除小鼠的AM中HDAC活性和HDAC5蛋白降低(图7C、D)。此外，与WT小鼠的AM相比，HO-2基因敲除小鼠的AM中HIF-1α蛋白丰度更高，H3乙酰化增加，同时NOX4 mRNA(HIF-1α的靶基因)、NOX4蛋白和NOX活性增加(图7D-F)。

图6 | IH或TSA处理对SD大鼠AM中HDAC活性、HDAC5、HIF-1α和H3蛋白、NOX 4 mRNA和NOX活性的影响。成年大鼠要么暴露于IH(IH )，要么用TSA(10 mg/Kg；腹腔注射)处理10天。对暴露于常氧的大鼠进行对照实验(N)。用AM制备细胞裂解物，分析(A)HDAC活性，(B)HDAC5、乙酰化-H3、HIF-1α蛋白表达，以微管蛋白作为上样对照进行免疫印迹分析，(C)通过qRT-PCR分析NOX4 mRNA表达，(D)NOX活性，如方法中所述在膜蛋白组分(每组8只大鼠凌晨2点的样本合并)中进行分析。数据为每组8只大鼠的平均值标准误。通过单因素方差分析和事后Turkey HSD检验确定。

HDAC表达降低会升高血压和血浆去甲肾上腺素水平

IH处理的啮齿动物表现出交感神经活性升高和高血压，这些反应与HIF-1依赖的NOX转录激活有关(Prabhakar等人，2015)。鉴于IH导致的HDAC活性降低会导致HIF-1依赖的NOX激活，我们推测这些反应会伴随着交感神经系统激活和血压升高。为了评估全身效应是否与HDAC活性降低有关，监测了用IH或TSA(10 mg/kg/天；10天；腹腔注射)处理的大鼠的血压和血浆去甲肾上腺素水平(交感神经激活的标志物)。TSA处理的大鼠与IH处理的大鼠一样，血压和血浆去甲肾上腺素水平升高(图8A、B)。同样，与WT小鼠相比，HO-2基因敲除小鼠表现出更高的AI和降低的HDAC活性，其血压和血浆去甲肾上腺素水平也升高(图8C、D)。

讨论

本研究考察了组蛋白去乙酰化酶(HDACs)在间歇性低氧(IH)诱导的缺氧诱导因子-1(HIF-1)转录激活中的作用。细胞培养研究表明:(1)IH降低HDAC活性，这是由于HDAC5和HDAC3蛋白表达减少；(2)HDAC活性降低通过HIF-1蛋白的赖氨酸乙酰化使HIF-1α稳定；(3)通过组蛋白(H)-3赖氨酸乙酰化激活HIF-1介导的转录活性。与PC12细胞类似，接受IH处理的大鼠以及HO-2基因敲除小鼠(其自发性呼吸暂停发生率较高)的主动脉弓(AM)组织也显示HDAC5蛋白和酶活性降低，同时血浆去甲肾上腺素(NE)水平和血压升高。在常氧条件下用泛HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA)处理对照大鼠，可模拟IH的作用。这些发现揭示了HDACs在IH激活HIF-1过程中迄今未被描述的作用，该作用导致阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)啮齿动物模型出现自主神经病变。

图7 | OSA啮齿动物模型中HDAC对HIF-1的调节。(A)通过体积描记法测量的年龄匹配(6个月)的C57BL6小鼠(野生型，WT)和HO-2基因敲除小鼠(HO-2 )的代表性呼吸描记图。(B)每小时测量的呼吸暂停次数(呼吸停止超过三次)，以呼吸暂停指数表示。(C)核提取物中的HDAC活性(凌晨4点采集样本进行单次测量)。(D)上图:通过蛋白质简单公司的WES系统测定的HDAC5、HIF-1α和微管蛋白(上样对照)蛋白表达的代表性免疫印迹；通过SDS-PAGE凝胶电泳测定Nov4、乙酰化H3和微管蛋白(上样对照)蛋白。下图:使用Compass软件(蛋白质简单公司)对HDAC5和HIF-1蛋白进行定量分析。NOX4和乙酰化H3数据通过ImageJ分析。通过单因素方差分析和事后Turkey HSD检验确定。(E)通过qRT-PCR检测Nox4 mRNA表达，以及(F)C57BL6小鼠(WT)和HO-2 小鼠的AM膜裂解物(凌晨4点采集样本进行单次测量)中的NOX活性。数据为每组12只小鼠的平均值标准误。通过Mann-Whitney检验确定。

虽然HDACs和沉默调节蛋白(SIRTs)均作为组蛋白去乙酰化酶发挥作用(Lim等人，2010年；Geng等人，2011年)，但IH降低了HDAC活性，而未降低SIRT酶活性。此外，TSA是HDACs而非SIRTs的选择性抑制剂，它在细胞培养和OSA啮齿动物模型中均模拟了IH的作用。SIRT在IH诱发的HIF-1活性中的作用(如果有的话)仍有待研究。

组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性降低会导致高乙酰化，已知这会激活基因转录(Grunstein，1997年)。与这种可能性一致，间歇性缺氧(IH)导致的HDAC活性降低与缺氧诱导因子-1(HIF-1)依赖性基因激活增加有关，这是IH引起自主神经病变的主要分子机制(Prabhakar等人，2020年)。HIF-1介导的靶基因转录激活需要两个步骤:(1)稳定HIF-1α，即调节亚基；(2)靶基因的反式激活。脯氨酰羟化酶(PHD)的抑制通常被认为是在持续缺氧时稳定HIF-1α(Semenza，2001年)。然而，PHD在IH诱导的HIF- 稳定中似乎起的作用较小(Yuan等人，2008年)。新出现的证据表明，包括HIF-1α蛋白乙酰化-去乙酰化在内的其他机制也有助于HIF-1α的稳定性(Jeong等人，2002年；Lim等人，2010年)。对IH或曲古抑菌素A(TSA)处理的PC12细胞核提取物进行的共免疫沉淀研究表明，HIF-1α蛋白的赖氨酸乙酰化增加，这与HDAC可以调节非组蛋白乙酰化的观点一致(Park等人，2015年)。已在HIF-1 蛋白中鉴定出多个乙酰化位点，这可能有助于HIF-1 蛋白的稳定(Jeong等人，2002年；Lim等人，2010年；Geng等人，2011年；Seo等人，2015年)。赖氨酸乙酰化被证明可抑制泛素化依赖性蛋白酶体介导的降解(Caron等人，2005年)。因此，在常氧条件下，HDAC可能使HIF-1α保持去乙酰化状态，使其易于被蛋白酶体降解。在IH期间，HDAC活性降低导致HIF-1α的赖氨酸乙酰化增加，从而增强了蛋白质稳定性(图9)。

图8 | TSA处理的大鼠和HO-2基因敲除小鼠的血浆去甲肾上腺素和血压 (A)终止IH或TSA处理15小时后测得的平均血压(MBP)。(B)接受IH或TSA处理的大鼠的血浆去甲肾上腺素(NE)水平。数据为每组8只大鼠的平均值标准误。通过单因素方差分析确定。(C)年龄匹配(6个月)的C57BL6(野生型，WT)和HO-2 小鼠的平均血压和(D)血浆NE水平。数据为每组8只小鼠的平均值标准误。通过曼-惠特尼检验确定。

IH在细胞培养物以及啮齿动物组织中激活了HIF-1转录。HIF-1转录增加伴随着H3赖氨酸乙酰化增加(图4B)。鉴于组蛋白的赖氨酸乙酰化会打开染色质，从而促进转录因子的结合(Seto和Yoshida，2014年)，可以想象H3乙酰化通过促进HIF-1与靶基因(如NOX4)启动子区域的结合来促进HIF-1的转录激活，但这一可能性需要进一步研究，且超出了本研究的范围。

IH导致的HDAC活性降低伴随着HDAC5(II类)和HDAC3(I类)蛋白丰度的降低。由于HDAC作为多聚体蛋白复合物发挥作用(Seto和Yoshida，2014年)，我们预计HDAC5和HDAC3的协同降低对于IH激活HIF-1是必要的。与我们的预期相反，单独过表达HDAC5就足以阻断IH诱导的HIF-1α蛋白积累以及转录激活。另一方面，过表达HDAC3对改变IH诱导的HIF-1激活无效。这些发现表明，在IH的背景下，单个HDAC具有不同的功能。然而，需要进一步研究来阐明HDAC3在IH诱导的生理变化中的作用(如果有的话)。

间歇性低氧(IH)导致HDAC3和HDAC5蛋白表达降低并非由于转录减少，而是由于蛋白酶体降解增加(图2A、B)。HDACs可通过磷酸化进行翻译后修饰，导致泛素化和蛋白酶体降解(Adenuga等人，2009年)。已知HDAC5会响应刺激以钙和磷酸化依赖的方式在细胞核和细胞质之间穿梭(Chawla等人，2003年；Renthal等人，2007年)。涉及磷酸化的翻译后修饰可能在IH导致HDAC5蛋白减少中起作用。我们之前已经表明，IH会增加几种组织中的活性氧(ROS)水平(Peng和Prabhakar，2003年)，而ROS已知可调节蛋白激酶和磷酸酶(Yuan等人，2008年；Corcoran和Cotter，2013年)。IH导致的HDAC3和HDAC5蛋白减少是否涉及ROS依赖的翻译后磷酸化修饰仍有待研究。

图9 | HDAC5在IH诱导的交感神经激活中的作用示意图。IH降低的HDAC活性导致HIF - 1和H3的乙酰化增加，从而增强促氧化酶NADPH氧化酶的HIF转录活性。这种效应与ROS水平升高相关，导致血浆儿茶酚胺增加，这是交感神经激活增强和高血压的一个标志物。

本研究为啮齿动物阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)模型中HDAC改变、交感神经激活和血压升高之间的联系提供了重要见解。HDACs增强的HIF - 1转录活性如何导致IH引起的交感神经激活增强和血压升高？HIF - 1依赖的促氧化酶基因(如NOX)的转录激活以及随后的ROS信号传导已被确定为IH诱导的交感神经激活和血压升高的重要分子机制(Prabhakar等人，2020年)。如先前报道(Kumar等人，2006年；Kuri等人，2007年；Peng等人，2014年)，HIF - 1依赖的NOX激活增强了IH处理大鼠肾上腺髓质(AM)中儿茶酚胺(CA)的释放并升高了血压。除了NOX之外，HDAC依赖的HIF - 1激活是否还通过肾上腺髓质嗜铬细胞胞吐机制的一个或多个成分影响AM中CA的分泌仍有待研究。尽管存在这些局限性，我们的研究结果建立了一种致病机制，将HDACs、HIF - 1、ROS生成与IH/OSA相关的心血管病理联系起来(图9)。

本研究表明，IH激活H3和HIF - 1α的赖氨酸乙酰化，这是一种表观遗传机制，可改变染色质，从而影响转录因子对DNA的可及性，而DNA本身的编码序列不变。我们之前报道过，IH会触发涉及DNA高甲基化的氧化还原状态的表观遗传重编程(Nanduri等人，2017年)。然而，IH激活的两种表观遗传机制，即DNA甲基化和HDAC介导的赖氨酸乙酰化之间存在重要差异。这些差异包括:(1)DNA甲基化由长期IH激活，而HDAC减少导致的赖氨酸乙酰化即使在短期IH处理后也会启动；(2)DNA甲基化主要与抗氧化酶基因相关，而赖氨酸乙酰化与NOX激活相关，NOX是一个促氧化基因；(3)DNA甲基化与血压和血浆去甲肾上腺素(NE)反应的长期升高相关，即使在恢复到正常空气环境30天后仍未逆转，而如本研究(图5C、D)及先前报道(Nanduri等人，2017年)所示，与赖氨酸乙酰化和HDAC5减少相关的全身反应在恢复到正常空气环境几小时后就会逆转。涉及组蛋白翻译后修饰和DNA甲基化的表观遗传机制是相互关联的机制。因此，由于HDAC活性降低导致的组蛋白和非组蛋白蛋白赖氨酸乙酰化的早期表观遗传变化可能会触发长期间歇性低氧(LT - IH)时出现的DNA甲基化，这一点仍有待确定。

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)在健康和疾病状态下发挥转录抑制因子或激活因子的作用(哈伯兰德等人，2009年)。例如，某些类型的癌症与HDACs表达增加有关。因此，HDAC抑制剂目前被认为是缓解癌症的新型潜在治疗干预措施。另一方面，已知HDACs在炎症性肺病患者(阿德科克等人，2005年)以及心脏损伤(张等人，2004年)中具有保护作用。目前的结果表明，HDACs在导致与阻塞性睡眠呼吸暂停(一种广泛存在的呼吸障碍)相关的自主神经病变方面还有一个未被探索的作用。