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Apelin/APJ通过SIRT3-KLF15改善肾小球内皮细胞功能障碍来减轻糖尿病肾病

发布时间：

2026-04-02 22:03

Apelin/APJ通过SIRT3-KLF15改善肾小球内皮细胞功能障碍来减轻糖尿病肾病

黄明聪，常静，刘瑜，尹继明，曾祥军

首都医科大学生理与病理生理学系，北京100069，中华人民共和国；首都医科大学附属北京佑安医院生理教研室，北京100069，中华人民共和国；首都医科大学附属北京佑安医院北京肝病研究所，北京100069，中华人民共和国

DOI: 10.3892/mmr.2025.13487

摘要。肾小球基底膜(GBM)增厚是糖尿病肾病(DN)最早出现的形态学变化，与肾小球内皮细胞(GECs)功能障碍有关，后者会增加细胞外基质(ECM)的合成。Apelin是apelin/apelin受体(APJ)的内源性配体，据报道可减轻DN中的内皮细胞功能障碍。因此，推测apelin/APJ通过减少GECs中ECM的合成来减轻GBM增厚。结果显示，apelin通过降低糖尿病小鼠中层粘连蛋白和IV型胶原的表达来减轻肾小球纤维化和GBM增厚，而在GECs中敲除APJ后这些作用被消除。此外，apelin/APJ通过增加SIRT3的表达和活性来抑制GECs中层粘连蛋白和IV型胶原的合成，这促进了KLF15的去乙酰化并使其易位至细胞核。总之，apelin/APJ通过GECs中SIRT3-KLF15途径阻止层粘连蛋白和IV型胶原的合成，从而减轻糖尿病中的GBM增厚。

引言

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)最常见且严重的并发症之一，是糖尿病相关医疗负担的主要原因(1,2)。在DN的发展过程中，肾小球基底膜(GBM)增厚是最早出现的形态学变化(2)，这与肾小球内皮细胞(GECs)中细胞外基质(ECM)合成与降解失衡有关(3-5)，并导致肾功能障碍。因此，阐明GECs功能障碍的机制将有助于理解DN中GBM增厚的情况。

据报道，GECs合成的层粘连蛋白和IV型胶原是高血糖和胰岛素抵抗导致GBM增厚的主要成分(3,11)。然而，高血糖和胰岛素抵抗并不能解释DM期间所有的GECs功能障碍，因为严格控制这些情况并不一定能预防或减缓疾病进展(12)。因此，DM相关肥胖导致的脂肪因子增加引起了关注，因为它们可能直接影响DM期间的内皮细胞功能(13,14)。Apelin是一种脂肪因子，据报道可改善DM期间的内皮细胞功能障碍(15,16)，但其是否能减轻GBM增厚尚不清楚。apelin可能通过减轻DM期间的GECs功能障碍来减少ECM合成。

GECs中ECM的合成和降解均导致GBM增厚，然而与降解相比，由转录和翻译控制的合成在糖尿病GBM增厚过程中起更关键的作用(4,17)。因此，推测apelin可能在DM期间减少GECs中ECM的合成。其细胞内机制可能是什么呢？

在追踪apelin的细胞内信号通路时，发现apelin/apelin受体(APJ)下游的沉默调节蛋白3(SIRT3)(18,19)，在MPC-5细胞中以NAD⁺依赖的方式使Krüppel样因子15(KLF15，一种抗纤维化转录因子)去乙酰化(20)。此外，据报道KLF15可抑制足细胞和系膜细胞中IV型胶原和纤连蛋白的表达(21,22)。然而，SIRT3是否在糖尿病肾病中调节KLF15，以及KLF15是否控制肾小球内皮细胞(GECs)中层粘连蛋白和IV型胶原的转录，尚未见报道。因此，推测apelin可能通过SIRT3诱导的KLF15去乙酰化和易位进入细胞核，从而阻止GECs中层粘连蛋白和IV型胶原的合成，进而在糖尿病肾病早期减少肾小球基底膜(GBM)增厚。使用Cre-loxP系统培育内皮细胞特异性APJ基因敲除小鼠，以确认apelin是否通过直接结合内皮APJ改善GBM增厚。

通信作者:曾祥军教授，首都医科大学生理与病理生理学系，北京市右安门外西头条10号，邮编100069，中华人民共和国。电子邮箱:megan_zeng@163.com

尹继明博士，首都医科大学附属北京佑安医院北京肝病研究所，北京市右安门外西头条8号，邮编100069

电子邮箱:yinjm7411@163.com

关键词:糖尿病肾病；肾小球基底膜；内皮细胞；细胞外基质；apelin

材料与方法

动物模型。所有动物实验均经首都医科大学伦理委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院制定的指南。使用6 - 8周龄的APJf1/IC57BL/6小鼠(购自基因敲除小鼠项目；杰克逊实验室)和TEK-CRE C57BL/6小鼠(赛业生物科技有限公司)。内皮细胞特异性APJ基因敲除(APJ )小鼠由首都医科大学动物实验实验室(中国北京)将小鼠与TEK-CRE小鼠杂交培育而成。所有动物饲养在特定病原体-free动物房，光照/黑暗周期为，温度为，相对湿度为。所有动物实验均经首都医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号:AEEI - 2020 - 045)，并按照《实验动物饲养与使用指南》(美国国立卫生研究院，https://olaw.nih.gov/policies-laws/guide-care-use-lab-animals)进行。

总共24只雄性APJ 小鼠和雄性小鼠(体重: )均随机分为假手术组，连续5天腹腔注射生理盐水；apelin治疗组，连续5天腹腔注射生理盐水，随后腹腔内输注(使用微渗透泵法尔泽特；型号1004；DURECT公司)apelin - 13(30 /天)，持续4周(n = 6)；链脲佐菌素(STZ)治疗组连续5天腹腔注射STZ(40 mg/kg/天) ；STZ + apelin治疗组连续5天腹腔注射STZ(40 mg/kg/天)，随后腹腔内输注apelin - 13 ，持续4周(n = 6)。

每天监测动物的健康状况和行为。每5天测量一次随机血糖。如果随机血糖升高至>16.0 mmol/l，则确诊为成功的糖尿病。在实验期间，没有动物在5周内达到体重减轻的人道终点。经过周的治疗后，通过吸入法处死了总共48只小鼠以进行组织收集，并通过观察呼吸、心跳和神经反射等指标来确认动物死亡。

免疫组织化学(IHC)染色。处死后，取出小鼠的肾脏用于组织学检查。肾脏组织在室温下用福尔马林固定，经过酒精-二甲苯处理后嵌入石蜡，然后在冠状平面切片。的组织切片在抗原修复后于室温下用处理，然后与一抗(4°C过夜)和辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(室温下 )孵育，随后使用DAB试剂盒[产品编号:GK600705；基因技术(上海)有限公司]在室温下进行比色检测30秒。用苏木精在室温下对细胞核染色30秒。使用数字载玻片扫描仪(全景扫描，3DHISTECH)获取图像。总共从每个切片的肾皮质中随机选择20个肾小球进行评估。

一抗包括兔抗apelin(产品编号:11497-1-AP；Proteintech Group，Inc.；1:200)、兔抗APJ(产品编号:ab214369；Abcam；1:200)、兔抗CD31(产品编号:77699S；Cell Signaling Technology，Inc.；1:200)、兔抗层粘连蛋白(产品编号:ARG59198；Arigobio；1:200)、兔抗胶原蛋白IV(产品编号:ab236640；Abcam；1:200)。

Masson染色。切片脱蜡后在预热至的Bouin氏液中重新固定。用流水冲洗去除黄色后，将这些切片在比布里希猩红-酸性品红(产品编号:HT151；MilliporeSigma)中染色5分钟，在磷钨酸/磷钼酸溶液中染色5分钟，在苯胺蓝溶液中染色，然后用酒精系列脱水。染色后的切片用树脂封固，然后用数字载玻片扫描仪扫描，蓝色区域代表纤维化区域。总共从每个切片的肾皮质中随机选择20个肾小球进行评估。

天狼星红苦味酸(PSR)染色。切片在室温下用天狼星红苦味酸染色溶液(产品编号:DC0041；Leagene；北京瑞格生物技术有限公司)染色60分钟，并用自来水冲洗。用苏木精在室温下对细胞核染色30秒。染色后的切片用数字载玻片扫描仪扫描。总共从每个切片的肾皮质中随机选择20个肾小球进行评估。

过碘酸-希夫(PAS)染色。切片首先在室温下用PAS氧化剂(产品编号:G1281；北京索莱宝科技有限公司)染色5分钟，并用自来水冲洗，然后在暗处用希夫溶液染色15分钟。苏木精在室温下对细胞核染色。染色后的切片用数字载玻片扫描仪扫描。总共从每个切片的肾皮质中随机选择20个肾小球进行评估。

肾小球内皮细胞培养。从和小鼠的肾脏中分离出原代肾小球内皮细胞(GECs)。简要地说，通过使用直径为100、76和的筛网依次过滤肾皮质来制备肾小球。收集留在孔径为的筛网上的组织，并用IV型胶原酶(产品编号V900893；MilliporeSigma)消化，然后转移到培养板中，在含有20%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的内皮细胞生长培养基(产品编号1001；ScienCell Research Laboratories, Inc.)中，添加内皮细胞生长因子培养5天，通过CD31进行鉴定。当GECs充分分化(约3 - 5代)时，用无血清内皮细胞培养基饥饿，然后用甘露醇(25 mmol/l甘露醇)、高糖(25 mmol/l d - 葡萄糖)和/或apelin(1.0 nmol/l)处理。莫能菌素(1.0 ，产品编号1001；CSN11465；CSN Pharma)可阻止蛋白质从高尔基体分泌，在检测分泌蛋白表达时提前添加。

KLF15小干扰(si)RNA转染。KLF15 siRNA(si - KLF15)或阴性对照siRNA(si - NC)由汉恒生物技术(上海)有限公司合成。使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(产品编号1001；13778075；Invitrogen；Thermo Fisher Scientific, Inc.)，按照制造商说明，在37°C对汇合度为的培养GECs转染si - KLF15或si - NC。转染后，进行后续实验。si - KLF15及其对照的最终浓度为。siRNA序列如下:si - KLF15 - 1正义链序列:5’-CCUGUGAAGGAGGAA CAUUTT-3’；si - KLF15 - 1反义链序列:5’-AAUGUU CCUCCUUCACAGGTT-3’；si - KLF15 - 3正义链序列:5’-CUACCCUGGAGGAGAUUGAAGTT-3’；si - KLF15 - 3反义链序列:5’-CUUCAAUCUCCUCCAGGGUAGTT-3’；si - NC正义链序列:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；si - NC反义链序列:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

RNA的制备及逆转录定量(RT-q)PCR。按照制造商的说明，使用TRIzol®试剂(货号15596026；赛默飞世尔科技公司)从培养的肾小球内皮细胞(GECs)中提取总RNA。使用微孔板读数仪(Eon；Omega Bio-Tek公司)通过检测光密度来测量RNA的浓度，并使用OD 260与OD 280的比值来确定纯度。使用带有gDNA eraser的PrimeScript TM RT试剂试剂盒(RR047A；宝生物工程(大连)有限公司)将总RNA 逆转录为第一链DNA(cDNA)。使用7500实时PCR系统(Applied Biosystems；赛默飞世尔科技公司)和SYBR green qPCR混合试剂(CoWin Biosciences)检测RT-PCR信号。预变性设置为持续。变性、退火和延伸分别在 (15秒)和 (45秒)下进行45个循环。所有反应均一式三份进行，并使用方法(23)将其标准化为参考基因GAPDH。用于扩增cDNA的基因特异性引物如下:APJ正向:5’-TCGTGGTGCTTG TAGTGACC-3’；APJ反向:5’-ATGCAGGTGCAGTAC GGAAA-3’；层粘连蛋白- 正向:5’-AGAGAGCCAGTT CTTGTGCC-3’；层粘连蛋白- 反向:5’-AAACACTTG GATCGCCTTGC-3’；层粘连蛋白-β2正向:5’-GGAGTG ACTGCTAGGTCCGA-3’；层粘连蛋白-β2反向:5’-CTCCAT CCCGACCGTGTG-3’；胶原蛋白IV- 正向:5’-AAC AACGTCTGCAACTTCGC-3’；胶原蛋白IV-α1反向:5’-CTTCACAAACCGCACACCTG-3’；KLF15正向:5’-TCAGTGTGACTTTGCTGTCA-3’；KLF15反向:5’-GGTGGTGGATTCTACACGCA-3’；SIRT3正向:5’-GTCCGGGAGTGTTTACAGGTG-3’；SIRT3反向:5’-ACCATGACCACCACCCTACT-3’；GAPDH正向:5’-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3’；GAPDH反向:5’-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3’。

蛋白质免疫印迹法。用补充有蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF；货号P0100；北京索莱宝科技有限公司)的RIPA裂解缓冲液(货号R0010；北京索莱宝科技有限公司)裂解培养的GECs，并在13,500 x g和4°C下离心15分钟。使用BCA测定法(货号23227；赛默飞世尔科技公司)测定蛋白质浓度。将来自GECs的蛋白质(每组总蛋白质)在10% SDS-PAGE上进行电泳分离，然后转移到PVDF膜(货号IPVH00010；MilliporeSigma)上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭后，将PVDF膜与一抗在下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育。为了验证上样量相等，使用了抗GAPDH和微管蛋白的抗体。该实验重复三次。使用ImageJ软件(ImageJ 1.48v；美国国立卫生研究院)对结果进行定量分析。

一抗包括兔抗APJ(货号20341-1-AP；Proteintech集团；1:1000)、兔抗层粘连蛋白(货号ab233389；Abcam；1:1000)、兔抗IV型胶原(货号E1A0175C；EnoGene；1:1000)、小鼠抗KLF15(货号sc-271675；Santa Cruz生物技术公司；1:1000)、兔抗SIRT3(货号5490S；Cell Signaling Technology公司；1:1000)、兔抗GAPDH(货号5174S；Cell Signaling Technology公司；1:2000)、兔抗微管蛋白(货号2148S；Cell Signaling Technology；1:2000)、兔抗组蛋白H3(货号ab1791；Abcam；1:2000)。二抗包括驴抗小鼠IgG(货号SA00001-8；Proteintech集团；1:2000)、驴抗兔IgG-HRP(货号7074S；Cell Signaling Technology公司；1:2000)。

肾小球内皮细胞(GECs)线粒体提取。收集培养的GECs，按照线粒体提取试剂盒(货号BA62；EnoGene)的说明书，在条件下以转速离心。将离心获得的上清液沿管壁加入含有溶液A的管中，在条件下以转速离心。然后，将沉淀物(线粒体)用保存液冲洗并重悬以进行保存。

SIRT3活性检测。根据表观遗传酶通用SIRT活性/抑制检测试剂盒(货号P-4036；EpiGentek)的制造商说明书，制备工作缓冲液，将从处理后的GECs中提取的溶液和线粒体加入相应孔中，包括空白孔、无NAD对照(NNC)孔、标准孔和样品孔。将平板在条件下孵育90分钟，进行抗体结合和信号增强。然后，向每个孔中加入显影液，在室温下避光孵育。阳性对照孔中的颜色变为中蓝色后，向每个孔中加入终止液以终止酶反应，并在2至10分钟内在条件下用酶标仪(Eon；Omega Bio-Tek公司)读取吸光度，可选参考波长为。计算SIRT3活性的公式为:

细胞核与细胞质组分的分离。分离过程按照Minute细胞质和细胞核提取试剂盒(产品编号:SC - 003；Invent生物技术公司)的说明书进行，并使用蛋白质免疫印迹法进行分析。使用终浓度为的3 - TYP(产品编号:S8628；Selleck化学公司)抑制肾小球内皮细胞(GECs)中的SIRT3活性。简要地说，将培养的GECs收集在细胞质提取缓冲液中。通过在下以离心获得细胞质蛋白。沉淀物用细胞核提取缓冲液重悬，然后在下以离心30秒以分离细胞核蛋白。统计分析。使用适用于个人计算机的SPSS 25.0版(IBM公司)对数据进行分析。根据Shapiro - Wilk检验，所有数据均呈正态分布，并表示为平均值标准误。使用两组的非配对t检验或两组以上的单因素方差分析评估差异的显著性，随后进行Tukey事后检验。使用Levene检验评估方差齐性。所有报告的P值均为双侧。P < 0.05被认为表示具有统计学显著差异。

图1. 糖尿病增加肾小球中apelin的表达并降低APJ的表达。(A)APJ 小鼠肾小球中apelin和APJ免疫组织化学染色的代表性图像。目标蛋白显示为棕色。标尺，20 。(B)肾小球中apelin的定量数据(n = 6)。(C)肾小球中APJ的定量数据(n = 6)。数据表示为平均值标准误。*P < 0.01。APJ，apelin/apelin受体；STZ，链脲佐菌素。

结果

糖尿病增加肾小球中apelin的表达并降低APJ的表达。免疫组织化学结果显示，糖尿病小鼠肾小球中apelin的表达从增加到 (n = 6；P < 0.01；图1A和B)。然而，糖尿病小鼠肾小球中APJ的表达从降低到 (n = 6；P < 0.01，图1A和C)。

阿佩林可降低糖尿病小鼠的随机血糖水平。与对照小鼠相比，糖尿病小鼠的随机血糖从显著升高至，而通过输注阿佩林可逆转至；表SI)。在内皮细胞中敲除APJ后，这些现象部分被放大，其肾小球内皮细胞中的APJ表达从在小鼠中降至在小鼠中，图S1)，这表明糖尿病小鼠的随机血糖从升高至，并通过输注阿佩林逆转至 (n = 6；P < 0.05；表SI)。

阿佩林可改善糖尿病小鼠的肾功能。糖尿病小鼠的尿量(从增加到 )和尿蛋白含量(从增加到 )均增加，而阿佩林治疗后则降低(尿量: ，尿蛋白:5.97±0.84 mg/24 h，n = 6；P<0.05；表SI)。同时，与对照小鼠相比，糖尿病APJf 小鼠的血清肌酐(SCR)也显著增加(从增加到 )，阿佩林将其降低至。

然而，apelin对糖尿病APJ 小鼠的尿量、尿蛋白和血清肌酐没有显示出类似的影响。糖尿病APJ 小鼠的尿量从增加到，在输注apelin后变为；糖尿病小鼠的尿量从增加到，在输注apelin后变为 (n = 6；P>0.05；表SI)。糖尿病APJ 小鼠的血清肌酐从增加到，在输注apelin后变为 (n = 6；P>0.05；表SI)。

Apelin可减轻依赖内皮APJ的糖尿病小鼠的肾小球基底膜增厚和肾小球纤维化。PAS染色显示，与对照小鼠相比，糖尿病小鼠( 小鼠从到以及小鼠从到 )的基质沉积增加，apelin可将糖尿病小鼠的基质沉积逆转至，但在apelin处理的糖尿病APJ 小鼠中则不然。

Masson染色显示，与对照小鼠相比，糖尿病AP 小鼠(从至， )和糖尿病APJ 小鼠(从至 )肾小球的纤维化面积均显著增加，阿朴脂蛋白可使糖尿病小鼠(n = 6； )的纤维化面积逆转至，但在阿朴脂蛋白处理的糖尿病APJ 小鼠中未出现逆转；P>0.05，图2A和C。

PSR染色显示，与对照小鼠相比，糖尿病小鼠(从2.24±0.11%增至5.17±0.21%，n = 6；P<0.001)和糖尿病APJ 小鼠(从至， )的胶原纤维量也增加，阿朴脂蛋白可使糖尿病小鼠的胶原纤维量逆转至，但在阿朴脂蛋白处理的糖尿病APJ 小鼠中未出现逆转，图2A和D。

图2. 阿朴脂蛋白依赖内皮APJ减轻糖尿病小鼠的肾小球基底膜增厚和肾小球纤维化。(A) 每组肾小球的PAS、Masson和PSR染色的代表性图像。标尺，20 。(B) PAS染色的定量数据(n = 6)。(C) PSR染色的定量数据(n = 6)。(D) Masson染色的定量数据(n = 6)。数据表示为平均值标准误。实心点代表AP 小鼠，空心点代表AP 小鼠。。GBM，肾小球基底膜；APJ，阿朴脂蛋白/阿朴脂蛋白受体；PAS，过碘酸希夫；PSR，苦味酸天狼星红；STZ，链脲佐菌素。

阿佩林可降低肾小球中纤连蛋白和IV型胶原蛋白的表达，且该作用依赖于内皮细胞APJ。为证实阿佩林对肾小球基底膜(GBM)成分表达的影响，我们进行了纤连蛋白和IV型胶原蛋白的免疫组化实验。结果显示，糖尿病小鼠肾小球中纤连蛋白的阳性面积显著增加(从小鼠的增加至糖尿病小鼠的，n = 6；P < 0.001)，但阿佩林可将其逆转至 (n = 6；P < 0.001，图3A和B)。值得注意的是，小鼠中纤连蛋白的表达也从增加至糖尿病小鼠的，而在糖尿病APJ 小鼠中，阿佩林可将其降至 (n = 6；P > 0.05；图3A和B)。

图3. 阿佩林可降低肾小球中纤连蛋白和IV型胶原蛋白的表达，且该作用依赖于内皮细胞APJ。(A)每组肾小球中纤连蛋白和IV型胶原蛋白免疫组化染色的代表性图像。目标蛋白呈棕色。标尺，。(B)肾小球中纤连蛋白的定量数据(n = 六)。(C)肾小球中IV型胶原蛋白的定量数据(n = 六)。数据表示为平均值标准误。实心点代表APJ 小鼠，空心点代表APJ 小鼠。P < 0.05， P < 0.01， P < 0.001。APJ，阿佩林/阿佩林受体；STZ，链脲佐菌素。

IV型胶原蛋白免疫染色也得到了类似结果。肾小球中的阳性面积从小鼠的增加至糖尿病小鼠的，而阿佩林可将糖尿病小鼠的该面积逆转至 (n = 6；P < 0.001，图3A和C)。然而，IV型胶原蛋白的阳性面积从APJ 的增加至糖尿病APJ 小鼠的 (n = 6；P < 0.01)，而在阿佩林处理的糖尿病APJ 小鼠中，该面积变为 (n = 6；P > 0.05，图3A和C)。

Apelin抑制肾小球内皮细胞(GECs)中纤连蛋白和IV型胶原蛋白的合成，该过程依赖于APJ。为了全面了解apelin对GECs的影响，提取了来自小鼠和小鼠的原代肾小球内皮细胞(GECs)。结果显示，APJ基因敲除后，GECs中APJ的mRNA和蛋白水平均下降(mRNA为0.61±0.05倍，蛋白为倍，，图S2)。

据报道，胶质母细胞瘤中内皮细胞提供的异构体是层粘连蛋白 (层粘连蛋白521)和胶原蛋白IVα1α2α1(3,7,8)，因此检测了层粘连蛋白-α5、层粘连蛋白-β2和胶原蛋白IV-α1的表达。结果显示，在甘露醇培养的肾小球内皮细胞(GECs)中，apelin降低了层粘连蛋白、层粘连蛋白-β2( 倍；n = 3；P < 0.01)和胶原蛋白IV-α1(0.35±0.12倍；n = 3；P < 0.01)的mRNA水平(图4A)，但在APJ基因敲除后未出现这种情况(层粘连蛋白的mRNA为1.28±0.13倍，层粘连蛋白-β2的mRNA为倍，胶原蛋白IV-α1的mRNA为1.06±0.13倍，n = 3；P > 0.05；图4B)。同样，在高糖培养的GECs中，apelin也降低了层粘连蛋白 (从倍降至倍)、层粘连蛋白-β2(从倍降至倍)和胶原蛋白IV (从倍降至倍)的mRNA水平(n = 3；P < 0.01，图4A)，但在来自APJ 小鼠的GECs中未出现这种情况(层粘连蛋白从1.22±0.13倍降至0.98±0.08倍，层粘连蛋白-β2的mRNA从倍降至倍，胶原蛋白IV-α1的mRNA从0.89±0.08倍降至0.98±0.15倍，n = 3；P > 0.05，图4B)。

为了证实apelin/APJ对肾小球内皮细胞(GECs)中细胞外基质(ECM)合成的影响，在用莫能菌素破坏高尔基体以抑制蛋白质分泌后，检测了层粘连蛋白和IV型胶原蛋白的蛋白表达。结果显示，在高糖条件下，apelin降低了层粘连蛋白(从1.21±0.03倍降至0.96±0.02倍，n = 3；P<0.05；图4C和D)和IV型胶原蛋白(从倍降至倍，；图4C和E)，而在APJ基因敲除后这种作用被消除(层粘连蛋白从倍升至倍，IV型胶原蛋白从倍升至倍，n = 3；P>0.05，图4F - H)。

KLF15介导apelin/APJ在肾小球内皮细胞(GECs)中的作用。蛋白质印迹法结果显示，在高糖条件下，apelin增加了KLF15的表达(从倍升至倍，；图5A和B)。结果还显示，沉默KLF15(使用si - KLF15 - 3使KLF15 mRNA从0.86±0.02倍降至倍，KLF15蛋白从0.95±0.04倍降至倍，n = 3；P<0.01；图5C和S3)上调了apelin对高糖条件下肾小球内皮细胞中层粘连蛋白和IV型胶原蛋白mRNA(层粘连蛋白 - 从倍降至倍，层粘连蛋白 - β2 mRNA从倍降至倍，IV型胶原蛋白 - mRNA从0.28±0.03倍升至0.77±0.02倍，n = 3；P<0.05；图5D - F)和蛋白(层粘连蛋白从倍降至倍，IV型胶原蛋白从倍降至倍，n = 3；P<0.05，图5G - I)降低作用。

图4. 阿片肽通过APJ抑制肾小球内皮细胞(GECs)中层粘连蛋白和IV型胶原蛋白的合成。(A)对APJ 基因敲除小鼠GECs中层粘连蛋白、层粘连蛋白和IV型胶原蛋白α1的逆转录定量PCR结果进行定量分析(n = 3)。(B)对APJ 基因敲除小鼠GECs中层粘连蛋白、层粘连蛋白和IV型胶原蛋白的逆转录定量PCR结果进行定量分析(n = 3)。(C)阿片肽/APJ基因敲除小鼠GECs中层粘连蛋白和IV型胶原蛋白的蛋白质免疫印迹代表性图像。(D)层粘连蛋白蛋白质免疫印迹定量分析(n = 3)。(E)IV型胶原蛋白蛋白质免疫印迹定量分析(n = 3)。(F)阿片肽基因敲除小鼠GECs中层粘连蛋白和IV型胶原蛋白的蛋白质免疫印迹代表性图像。(G)层粘连蛋白蛋白质免疫印迹定量分析(n = 3)。(H)IV型胶原蛋白蛋白质免疫印迹定量分析(n = 3)。数据以平均值标准误表示。实心点代表基因敲除小鼠，空心点代表APJ 基因敲除小鼠。*P<0.05，**P<0.01。GECs，肾小球内皮细胞；APJ，阿片肽/阿片肽受体；HG，高糖d-葡萄糖。

图5. KLF15介导apelin/APJ在肾小球内皮细胞(GECs)中的作用。(A)APJ 小鼠肾小球内皮细胞中KLF15的蛋白质免疫印迹代表性图像。(B)KLF15蛋白质免疫印迹的定量分析(n = 3)。小鼠中(C)KLF15、(D)层粘连蛋白- 、(E)层粘连蛋白- 和(F)IV型胶原α1的逆转录定量PCR(RT-qPCR)结果的定量分析(n = 3)。(G) 小鼠肾小球内皮细胞中层粘连蛋白和IV型胶原的蛋白质免疫印迹代表性图像。(H)层粘连蛋白蛋白质免疫印迹的定量分析(n = 3)。(I)IV型胶原蛋白质免疫印迹的定量分析(n = 3)。数据表示为平均值标准误。*P<0.05， P<0.01，***P<0.001。KLF15，Krüppel样因子15；APJ，apelin/apelin受体；GECs，肾小球内皮细胞；RT-qPCR，逆转录定量PCR； d-葡萄糖。

图6. Apelin/APJ增加了SIRT3的表达和活性。(A) AP 小鼠肾小球内皮细胞(GECs)中SIRT3的RT-qPCR结果定量分析(n=3)。(B) APJ 小鼠GECs中SIRT3的RT-qPCR结果定量分析(n=3)。(C) APJ 小鼠GECs中SIRT3的蛋白质印迹代表性图像及定量分析(n=3)。(D) APJ 小鼠GECs中SIRT3的蛋白质印迹代表性图像及定量分析(n=3)。(E) AP 小鼠GECs中SIRT3活性的定量分析。数据表示为平均值标准误。实心点代表APJ 小鼠，空心点代表APJ^EC小鼠。’P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。APJ，apelin/apelin受体；SIRT3，沉默调节蛋白3；RT-qPCR，逆转录定量PCR；GECs，肾小球内皮细胞；HG，25 mM d-葡萄糖。

图7. Apelin/APJ通过SIRT3促进KLF15的去乙酰化和易位。(A) APJ 小鼠GECs中KLF15核质分离的蛋白质印迹代表性图像。(B) 细胞核中KLF15的蛋白质印迹定量分析(n=4)。(C) 细胞质中KLF15的蛋白质印迹定量分析(n=4)。数据表示为平均值标准误。*P<0.05。APJ，apelin/apelin受体；KLF15，Krüppel样因子15；SIRT3，沉默调节蛋白3；GECs，肾小球内皮细胞；HG，25 mM d-葡萄糖。

SIRT3介导apelin/APJ对GECs中KLF15的作用。KLF15的转录活性受SIRT3调节(20)。因此，检测了apelin对GECs中SIRT3表达和活性的影响。结果显示，在高糖条件下，apelin使SIRT3 mRNA表达从倍增加到倍，在APJ基因敲除后恢复到倍( 图6A和B)。蛋白质印迹结果显示，在高糖条件下，apelin使SIRT3蛋白表达从倍增加到倍，在GECs中APJ基因敲除后被消除(从倍到倍；；图6D)。同时，在高糖条件下，apelin也显著增加了GECs中SIRT3的活性(从到，在APJ基因敲除后被消除(从到 OD/min/mg；n=3；P>0.05；图6E)。

为了验证apelin是否通过SIRT3促进KLF15的去乙酰化和向细胞核的转位，用3-TYP抑制SIRT3活性。结果表明，在高糖条件下，3-TYP显著逆转了apelin对KLF15向细胞核转位的增强作用(从倍增加到倍；；图7A和B)。

讨论

据作者所知，本研究首次揭示apelin可能通过内皮细胞APJ激活的SIRT3-KLF15途径减轻糖尿病中的肾小球基底膜(GBM)增厚。Apelin通过促进KLF15向细胞核转位，降低层粘连蛋白和IV型胶原的表达，从而减少肾小球纤维化和GBM增厚，这在高糖条件下的肾小球内皮细胞(GECs)中依赖于APJ激活的SIRT3。

GBM增厚是糖尿病肾病(DN)最早的形态学变化，随后是肾小球硬化并伴有进行性肾功能障碍(2,3,8,24)。重要的是，据报道GBM增厚与GECs功能障碍有关(6-8)。基于apelin/APJ改善糖尿病中内皮功能障碍的报道(15,16)，在糖尿病小鼠中评估了apelin对肾小球形态缺陷的影响。与先前报道一致(25,26)，糖尿病条件下apelin增加(图1)减轻了肾小球纤维化和GBM增厚(图2)。Apelin的这些作用是否依赖于其内皮受体APJ？

然后生成内皮特异性APJ基因敲除小鼠，以研究APJ是否介导了apelin在DN期间对内皮细胞的作用。APJ基因敲除部分抵消了apelin对DN肾损伤的保护作用(图2和表SI)，这表明apelin可能通过与APJ结合来调节内皮功能。接下来的问题是:在糖尿病条件下GBM增厚期间apelin与APJ结合后会发生什么？

GBM增厚的原因之一是GECs中细胞外基质(ECM)合成增加，导致GBM中蛋白质积累(4,27)。据报道，GBM的主要成分包括层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(3)。巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖不仅表达量极少，而且对GBM功能影响很小。因此，在小鼠中人为改变apelin/APJ后，检测了GBM中最丰富的两种成分层粘连蛋白和IV型胶原的表达(3,10,28,29)。Apelin治疗逆转了糖尿病小鼠肾小球中层粘连蛋白和IV型胶原的含量(图3)。这些发现表明apelin可能通过减少肾小球中层粘连蛋白和IV型胶原的沉积来减轻GBM增厚。此外，GECs中APJ基因敲除部分抵消了apelin对肾小球中层粘连蛋白和IV型胶原的影响(图3)。总之，这些结果表明apelin通过与内皮APJ结合，降低GECs中层粘连蛋白和IV型胶原的表达，从而减轻GBM增厚。因此有人问:apelin/APJ调节ECM合成和沉积的细胞内机制是什么？

转录和翻译可能都参与了GECs中的ECM合成(4,17)，因此在培养的GECs中检测了层粘连蛋白521和IV型胶原α1α2α1的mRNA和蛋白质水平。Apelin降低了GECs中层粘连蛋白和IV型胶原的mRNA和蛋白质水平(图4)。由于这两种蛋白质是GBM中由GECs表达的特定异构体，这些结果表明apelin可能通过在糖尿病期间抑制GECs中GBM蛋白的转录和翻译来减轻GBM增厚。值得注意的是，本研究还指出甘露醇几乎完全模拟了高血糖对GECs中GBM蛋白mRNA水平的影响(图S4)，这表明渗透压可能是高血糖增加GECs中ECM表达的关键因素。由于据报道APJ介导细胞中的机械刺激(30)，apelin是否有可能通过抵消高血糖或高渗诱导的GECs功能障碍来减少GECs中GBM蛋白的合成？

据报道，KLF15是一种转录因子，可抑制细胞外基质(ECM)合成和纤维化(21,22)，在高血糖条件下，apelin可使肾小球内皮细胞(GECs)中的KLF15增加(图5A和B)。此外，沉默KLF15后，apelin对层粘连蛋白和IV型胶原的作用消失(图5D - I)。因此，推测KLF15是apelin调节GECs中ECM合成的关键细胞内信号分子。

KLF15的活性受SIRT3诱导的去乙酰化调节(20)，而这也是apelin的下游通路(18,19)。在本研究中，apelin增加了GECs中SIRT3的表达和活性，而这些作用在APJ基因敲除后消失(图6)。这些结果表明，apelin以APJ依赖的方式激活SIRT3通路。本研究还表明，抑制SIRT3活性后，apelin促进KLF15易位至细胞核的作用减弱(图7)。这些发现证实，apelin通过增加SIRT3的表达和活性促进KLF15去乙酰化并易位至细胞核。此外，据作者所知，这也是首次证明SIRT3 - KLF15通路调节GECs中ECM的转录，这可能对糖尿病肾病(DN)具有保护作用。

然而，必须注意的是，输注apelin也降低了高血糖，而高血糖是糖尿病(DM)期间GECs功能障碍的最重要危险因素(31 - 33)。在本研究中，无论有无APJ基因敲除，apelin均降低了糖尿病小鼠的随机血糖水平(表SI)，这表明apelin可能通过独立于内皮APJ的方式降低血糖来减轻DN。值得注意的是，在糖尿病小鼠中，APJ的降糖作用比apelin更强，这可能与高渗或机械刺激(30)激活的 - arrestin信号通路(34)有关。然而，在本研究中，高糖并未改变GECs中APJ的表达(图S5)，尽管糖尿病小鼠肾小球中的APJ减少(图1)。这些结果表明，是APJ而非apelin降低了糖尿病小鼠的血糖。因此可以得出结论，apelin通过内皮APJ和相关下游分子发挥抗糖尿病肾病作用，而非通过控制血糖。然而，本研究的局限性在于无法阐明apelin如何通过影响其他肾细胞来降低血糖。

总之，据作者所知，本研究首次证明apelin通过阻止GECs合成层粘连蛋白和IV型胶原，从而减少肾小球基底膜(GBM)增厚，这一过程依赖于内皮APJ激活的SIRT3 - KLF15通路。尽管apelin/APJ在糖尿病肾病中有多种作用，但本研究结果表明了apelin/APJ的保护作用，这可能为DN提供一个潜在的治疗靶点。