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SL010110，一种先导化合物，通过SIRT2 - p300介导的PEPCK1降解抑制糖异生，并改善糖尿病小鼠的葡萄糖稳态

发布时间：

2026-04-04 16:05

SL010110，一种先导化合物，通过SIRT2 - p300介导的PEPCK1降解抑制糖异生，并改善糖尿病小鼠的葡萄糖稳态

任宇然，叶阳亮，冯颖，徐腾飞，申宇，刘佳，黄苏玲，沈建华和冷颖

抑制肝脏过度的糖异生是控制2型糖尿病(T2D)高血糖的有效策略。在本研究中，我们筛选了化合物库以发现能够抑制原代小鼠肝细胞糖异生的活性分子。我们发现SL010110(5 - ((4 - 烯丙基 - 2 - 甲氧基苯氧基)甲基)呋喃 - 2 - 羧酸)能有效抑制糖异生，和分别导致糖异生减少45.5%和67.5%。此外，SL010110抑制糖异生是通过下调磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PEPCK1)的蛋白水平，而非影响PEPCK、葡萄糖 - 6 - 磷酸酶和果糖 - 1,6 - 二磷酸酶的基因表达。此外，SL010110增加了PEPCK1的乙酰化，并促进了PEPCK1的泛素化和降解。SL010110激活了原代小鼠肝细胞中的p300乙酰转移酶活性。组蛋白乙酰转移酶p300抑制剂C646阻断了SL010110引起的PEPCK1乙酰化增强和糖异生抑制，表明SL010110通过激活p300抑制糖异生。SL010110降低了NAD /NADH比值，抑制了SIRT2活性，并进一步促进了p300乙酰转移酶的激活和PEPCK1的乙酰化。NAD 前体NMN阻断了这些效应，表明SL010110通过抑制SIRT2、激活p300并随后促进PEPCK1乙酰化来抑制糖异生。在2型糖尿病ob/ob小鼠中，单次口服剂量的SL010110(100 mg/kg)抑制了糖异生，同时伴随着肝脏SIRT2活性的抑制、p300活性的增加、PEPCK1乙酰化和降解的增强。长期口服SL010110(15或50 mg/kg)显著降低了ob/ob和db/db小鼠的血糖水平。本研究表明SL010110是一种先导化合物，具有通过SIRT2 - p300介导的PEPCK1降解抑制糖异生的独特机制以及有效的抗高血糖活性，可用于治疗T2D。

关键词:SL010110；糖异生；原代小鼠肝细胞；PEPCK；乙酰化；降解

《中国药理学报》(2021)42:1834 - 1846；https://doi.org/10.1038/s41401 - 020 - 00609 - w

引言

高血糖是2型糖尿病(T2D)最显著的病理特征之一[1]。肝脏在整个进食 - 禁食周期中通过调节糖原合成、糖原分解和糖异生来维持葡萄糖稳态方面起着关键作用[2]。肝脏过度的糖异生被认为是导致T2D高血糖发生的最重要因素之一[3,4]。二甲双胍是一种广泛用于治疗糖尿病的药物，主要通过抑制肝脏糖异生来改善葡萄糖代谢[5]。因此，靶向抑制肝脏糖异生被视为发现治疗T2D活性先导化合物的有效策略。

肝糖异生主要受关键限速酶的控制，特别是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6pase)和果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)[6, 7]。肝脏中表达两种PEPCK同工酶:一种胞质形式(PEPCK1)和一种线粒体同工型(PEPCK2)。PEPCK1负责肝脏中95%的PEPCK活性，因此被认为是参与糖异生的主要同工型[8, 9]。siRNA介导的PEPCK1敲低导致葡萄糖生成减少[10]。通过调节其转录因子或共激活因子，如PPARy共激活因子1a(PGC-1a)和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)，直接或间接靶向关键糖异生酶，被证明是调节肝糖异生和控制高血糖的有效策略[11-13]。最近，几项研究表明，PEPCK的翻译后修饰可以促进其降解，并在体外和体内影响肝糖异生[14-18]。赵及其同事发现，PEPCK1的一些赖氨酸残基可以根据细胞外燃料的可用性进行乙酰化，这种乙酰化使PEPCK1与泛素蛋白连接酶E3组分n-识别素5(UBR5)相互作用，然后在蛋白酶体中降解[15]。随后的研究表明，PEPCK1的SUMO化或磷酸化也会导致蛋白质不稳定并导致其降解[19, 20]。近年来，许多化合物，如二甲双胍、表没食子儿茶素没食子酸酯、林丹和番荔枝宁A，已被报道通过抑制PEPCK和G6pase的基因表达来抑制糖异生[5, 21-23]。然而，迄今为止，很少有分子被报道通过调节PEPCK1蛋白稳定性来抑制糖异生。

中国科学院上海药物研究所药物研究国家重点实验室，上海201203；中国科学院大学，北京100049，以及中国科学院上海药物研究所，上海201203

通讯作者:黄苏玲(slhuang@simm.ac.cn)或沈建华(jhshen@simm.ac.cn)或冷莹(yleng@simm.ac.cn)

收稿日期:2020年11月1日接受日期:2020年12月29日

在线发表日期:2021年2月11日

p300，作为一种通过与pck1启动子结合来调节糖异生的转录因子，也可以作为一种乙酰转移酶，催化PEPCK1的乙酰化并影响其蛋白质稳定性[15, 24]。在HEK293T细胞中，将PEPCK1与p300共转染，但不与其催化失活的突变体共转染，刺激了PEPCK1的乙酰化，表明p300的乙酰转移酶活性是必需的[15]。一致地，p300敲低显著降低了PEPCK1的乙酰化并增加了稳态PEPCK1水平[15]。PEPCK1蛋白稳定性也可以由SIRT2调节，SIRT2是一种依赖性脱乙酰酶。通过将原核表达的SIRT2蛋白与含有PEPCK(Lys70和Lys71)两个乙酰化位点的肽一起孵育，乙酰化PEPCK1的总体水平降低[17]。Sirtinol，一种SIRT2抑制剂，消除了SIRT2对PEPCK1肽脱乙酰化的作用[17]。由于SIRT2可以使p300脱乙酰化并调节其活性[25]，研究SIRT2对PEPCK1的调节是否可以由p300介导将是很有趣的。

鉴于肝脏糖异生对于全身葡萄糖稳态的重要性，我们对化合物库进行了筛选，以鉴定能够抑制原代小鼠肝细胞中糖异生的活性分子。SL010110(5 - ((4 - 烯丙基 - 2 - 甲氧基苯氧基)甲基)呋喃 - 2 - 羧酸)，一种从未被报道具有任何生物学效应的化合物，显示出对糖异生的强效抑制作用。此外，SL010110对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖 - 6 - 磷酸酶(G6pase)的基因表达没有影响，但显著下调了PEPCK1的蛋白质表达，这表明SL010110在抑制肝脏糖异生方面具有独特的机制。在本研究中，我们阐明了SL010110通过沉默信息调节因子2相关酶2(SIRT2) - p300介导的PEPCK1乙酰化和降解来抑制糖异生的潜在分子机制。此外，在ob/ob和db/db小鼠中评估了SL010110的急性和慢性作用，以研究SL010110的抗高血糖功效以及促进PEPCK1降解作为糖尿病治疗中血糖控制有效方法的价值。

材料与方法

化学试剂和材料

SL010110(5 - ((4 - 烯丙基 - 2 - 甲氧基苯氧基)甲基)呋喃 - 2 - 羧酸， )由中国科学院上海药物研究所(SIMM，CAS)的沈建华课题组合成。二甲双胍、福斯可林和β - 烟酰胺单核苷酸(NMN)购自Sigma - Aldrich(德国黑森州)。MG132、酮康唑、C646和西曲瑞克购自Med Chem Express(美国新泽西州)。抗甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶(GAPDH，#2118)、抗p300(#86377)、抗BAT3(#8523)、抗泛素(#3933)、抗乙酰化赖氨酸(#9441)和抗乙酰化p300(K1499，#4771)抗体购自Cell Signaling Technology(美国马萨诸塞州)。抗PEPCK1(16754 - 1 - AP)抗体购自Proteintech(美国伊利诺伊州)。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔Ig(H + L)抗体(SH - 0032)购自北京鼎国昌盛生物技术公司。

实验动物

雄性C57BL/6 J小鼠由上海灵畅生物技术有限公司提供，并给予标准饮食。B6.V - Le 小鼠和B6.Cg - mLepr 小鼠(美国缅因州杰克逊实验室)在SIMM，CAS繁殖并给予高脂饮食(产品编号P1400F，上海普路通)。所有小鼠饲养在特定的

YR Ren等人的无病原体等级实验室中，并维持在标准的12小时光照/12小时黑暗周期。所有动物实验均按照SIMM，CAS的实验动物护理和使用委员会的指导方针进行。

原代小鼠肝细胞培养

原代肝细胞通过对Seglen两步法进行一些修改后从C57BL/6 J小鼠中分离得到[26]。过夜禁食的小鼠通过腹腔注射5%(w/v)水合氯醛(上海SCR)进行麻醉，然后用乙二醇四乙酸缓冲液和胶原酶消化缓冲液灌注其肝脏。通过过滤和离心分离小鼠肝细胞。然后，将肝细胞接种在涂有明胶的培养板中，培养基为添加了胎牛血清(FBS)、10 nM胰岛素和10 nM地塞米松(Sigma - Aldrich，德国黑森州)的最低必需培养基，并在于中培养。

糖异生

实验前，将原代小鼠肝细胞接种于48孔板中。然后，将肝细胞在补充有0.1%二甲基亚砜(DMSO)或不同剂量的SL010110或二甲双胍的无葡萄糖杜氏改良 Eagle 培养基中的0.1%牛血清白蛋白中孵育。然后，在有或没有糖异生底物(2 mM丙酮酸钠和20 mM乳酸钠)(Sigma-Aldrich，黑森州，德国)存在或不存在福司可林的情况下，将肝细胞孵育。对于使用抑制剂的实验，将肝细胞用不同的抑制剂预处理，然后按照上述步骤进行操作。孵育结束时收集培养基。用比色法葡萄糖测定试剂盒(RSbio，上海，中国)测定葡萄糖含量，并将其标准化为细胞蛋白浓度。糖异生是根据在有和没有糖异生底物培养的组之间的差异计算得出的。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、葡萄糖-6-磷酸酶和果糖-1,6-二磷酸酶活性测定

分别使用来自索莱宝生物科技(北京，中国)的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性测定试剂盒(BC3310)、葡萄糖-6-磷酸酶活性测定试剂盒(BC3320)或果糖-1,6-二磷酸酶活性测定试剂盒(BC0920)，按照制造商的说明，测定原代小鼠肝细胞和ob/ob小鼠肝脏中的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、葡萄糖-6-磷酸酶或果糖-1,6-二磷酸酶活性。

p300乙酰转移酶活性测定

p300活性通过HAT(p300)测定试剂盒(AS-72172，AnaSpec，加利福尼亚，美国)并做了一些修改来确定[27]。用化合物处理后用抗p300抗体从原代小鼠肝细胞中免疫沉淀p300蛋白，然后在下与乙酰辅酶A和底物肽孵育。用终止液终止反应，然后在室温下与显色剂溶液进一步孵育。通过测量Ex/Em 处的荧光强度来确定p300乙酰转移酶活性。

沉默调节蛋白活性测定

根据制造商的说明，使用提取试剂(78835，赛默飞世尔科技，马萨诸塞州，美国)从原代小鼠肝细胞和ob/ob小鼠肝脏中分离细胞质和细胞核。使用沉默调节蛋白活性测定试剂盒(P-4036-48，Epigentek Group，纽约，美国)检测细胞核(主要是SIRT1)和细胞质(主要是SIRT2)中的沉默调节蛋白活性[28]。简要地说，在将测定缓冲液、沉默调节蛋白底物、、曲古抑菌素A和提取的样品加入到条孔中后，用粘性膜覆盖测试板并在下孵育

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90分钟。然后，去除反应溶液，加入捕获抗体并孵育60分钟。洗涤后，加入检测抗体并孵育30分钟，然后再洗涤一次。随后，用显色剂溶液进行显色反应，然后用终止液终止。通过检测450和处的吸光度来评估沉默调节蛋白活性。

测量

使用商业检测试剂盒(S1075，碧云天生物技术有限公司，中国上海)，按照制造商的说明，测量ob/ob小鼠肝细胞和肝组织中的、NADH含量。含量基于和含量之间的差异。然后，根据NAD 含量与NADH含量的比率计算比率。

实时定量PCR

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(15596018，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州)从ob/ob小鼠的原代肝细胞或肝脏中提取总RNA，并使用PrimeScript RT试剂试剂盒(附带gDNA eraser)(RR037，宝生物工程(大连)有限公司，日本京都)将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq(RR420，宝生物工程(大连)有限公司，日本京都)进行PCR。基因表达水平以 -肌动蛋白表达水平为对照进行标准化，并使用方法确定与实验对照相比的相对表达。引物序列见表1。

免疫沉淀和免疫印迹

对于免疫沉淀，将原代肝细胞或ob/ob小鼠肝脏裂解，并与指定的一抗在下混合过夜。然后，将这些溶液与蛋白A/G琼脂糖珠(sc-2003，圣克鲁斯生物技术公司，美国加利福尼亚州)混合3小时。免疫沉淀物用裂解缓冲液洗涤五次，然后进行免疫印迹或活性测定。

对于免疫印迹，将裂解的肝细胞、匀浆的肝脏或免疫沉淀物中的蛋白质变性，通过SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用7.5%(w/v)脱脂牛奶(生工生物工程(上海)股份有限公司)封闭后，膜用指定的一抗和二抗染色。通过ECL显影和检测，使用Quantity One软件(伯乐生命医学产品(上海)有限公司，美国加利福尼亚州)对指定蛋白质的特异性条带进行定量。

用SL010110对ob/ob小鼠进行急性处理

雄性ob/ob小鼠(7 - 8周龄)禁食，并根据体重分为两组。以的体积向这些小鼠经口灌胃给予单剂量的SL010110(100 mg/kg)或溶剂对照(0.25%羧甲基纤维素钠，CMC-Na)(生工生物工程(上海)股份有限公司)。1.5小时后，通过腹腔注射水合氯醛使小鼠麻醉，然后解剖肝脏进行比率测定、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和沉默调节蛋白(Sirt)活性测定、PCR和免疫印迹分析。

ob/ob小鼠的丙酮酸耐量试验

在小鼠中进行丙酮酸耐量试验(PTT)以评估体内糖异生作用[29]。禁食后，根据血糖和体重将雄性ob/ob小鼠(8 - 9周龄)分为三组。在腹腔注射丙酮酸钠(1.5 g/kg)前30分钟，通过灌胃给小鼠分别施用一定体积的载体对照(0.25% CMC - Na)、SL010110(100mg/kg)或二甲双胍(100 mg/kg)。通过剪尾取血，并使用ACCU - CHEK Performa血糖仪(罗氏公司，瑞士巴塞尔)在注射后0、15、30、60和分钟测量血糖水平。

表1. 实时PCR引物序列。

基因	正向	反向 ( )
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1	CATATGCTGATCCTGGGCATAAC	CAAACTTCATCCAGGCAATGTC
葡萄糖-6-磷酸酶	ACACCGACTACAGCAACAG	CCTCGAAAGATAGCAAGAGTAG
果糖-1,6-二磷酸酶	GTGTCAACTGCTTCATGCTG	GAGATACTCATTGATGGCAGGG
-肌动蛋白	TGACAGGATGCAGAAGGAGA	GCTGGAAGGTGGACAGTGAG

SL010110在ob/ob小鼠中的药代动力学研究

将雌性和雄性ob/ob小鼠(11 - 12周龄)隔夜禁食，给药后喂食，并自由饮水。SL010110溶解于0.25% CMC - Na中，以15mg/kg的剂量分别给予雌性和雄性小鼠。在给药后0.25、0.5、1、2、4、8和小时从雌性ob/ob小鼠采集血样，在给药后0.5、2、4、8和小时采集肝脏样本。在给药后0.083、0.25、0.75、2、4、8和小时从雄性ob/ob小鼠采集血样，在给药后0.25、2、4、8和小时采集肝脏样本。通过LC - MS/MS测定血清和肝脏中SL010110的浓度。

SL010110对ob/ob小鼠的长期治疗

在雄性ob/ob小鼠(7 - 8周龄)中评估SL010110对葡萄糖代谢异常的长期影响。简要地说，根据体重、血糖、HbAc1和血清胰岛素水平将小鼠分为三组。通过灌胃每天两次给小鼠施用载体对照(0.25% CMC - Na，10 mL/kg)和SL010110(15或 )，持续25天。在第0、4、8、12、16、20和25天，使用通过剪尾采集的样本，用ACCU - CHEK Performa血糖仪测量随机和空腹血糖水平。在整个治疗过程中每天测量一次体重和食物摄入量。在长期治疗的最后一天，将小鼠禁食，并通过腹腔注射水合氯醛麻醉。采集血样，并用商业检测试剂盒(罗氏诊断，瑞士巴塞尔)测定HbA1c。解剖肝脏并储存在用于进一步分析。

SL010110对小鼠的长期治疗

在db/db小鼠(7 - 8周龄，雌雄各半)中也评估了SL010110对葡萄糖代谢异常的长期影响。根据体重、血糖、HbAc1和血清胰岛素水平将小鼠分为四组，并通过灌胃每天一次用载体对照(0.25% CMC - Na，10 mL/kg)、SL010110(15或50 mg/kg，10 mL/kg)或二甲双胍进行治疗，持续32天。在第0、8、12、16、20、24和32天，使用通过剪尾采集的样本，用ACCU - CHEK Performa血糖仪测定随机和空腹血糖水平。在整个治疗过程中每天测量一次体重和食物摄入量。在长期治疗的最后一天，将小鼠禁食，麻醉后采集血样用于HbA1c测量。

统计分析

所有统计数据均以平均值 SEM表示，并使用GraphPad Prism软件(GraphPad，美国加利福尼亚)进行分析。在确认数据呈正态分布后，分析采用学生检验。被认为具有统计学意义。

结果

SL010110抑制原代小鼠肝细胞中的糖异生并降低PEPCK1蛋白水平

SL010110的结构如图1a所示。在基础条件下，SL010110以剂量依赖的方式抑制原代小鼠肝细胞中的糖异生作用(图1b)，3和的SL010110分别导致45.5%和67.5%的降低。在用腺苷酸环化酶

SL010110抑制糖异生并改善血糖控制

激活剂福斯高林刺激下，SL010110也强烈抑制糖异生，3和的SL010110分别导致62.8%和82.5%的降低(图1b)。在此用作阳性对照的二甲双胍(500μM)，在基础和福斯高林刺激条件下分别导致55.2%和64.9%的降低。在基础或福斯高林处理状态下，糖异生基因pck1、g6pc和fbp的mRNA表达水平不受SL010110处理的影响，而二甲双胍显著抑制这些基因的表达(图1c、d、e)。测定了原代小鼠肝细胞中PEPCK、G6pase和FBPase的活性。SL010110在基础和福斯高林刺激条件下均以剂量依赖的方式降低PEPCK活性，但不影响G6pase活性或FBPase活性；然而，二甲双胍降低了所有三种酶的活性(图1f、g、h)。我们进一步评估了PEPCK1的蛋白质水平，它是PEPCK的主要功能形式。如图1i所示，SL010110在基础和福斯高林刺激条件下均以剂量依赖的方式降低PEPCK1蛋白质水平。

图1 SL010110抑制原代小鼠肝细胞中的糖异生并降低PEPCK1蛋白质水平。a SL101101的化学结构。在基础和福斯高林(20μM)处理条件下，用所示浓度的SL010110或二甲双胍(Met)处理原代小鼠肝细胞，测定糖异生(b)、pck1(c)、g6pc(d)、fbp(e)的mRNA表达以及PEPCK活性(f)。在基础条件下也测试了原代肝细胞中的G6pase活性(g)和FBPase活性(h)。i通过蛋白质印迹分析在基础和福斯高林处理条件下用SL010110或二甲双胍处理的原代小鼠肝细胞中的PFPCK1蛋白质水平。数据表示为来自三个或五个独立实验的平均值 SEM；和与相应对照相比；与福斯高林处理的对照相比。

图2 SL010110通过促进PEPCK1泛素化和降解来抑制糖异生。用 SL010110或二甲双胍处理后，通过免疫印迹检测原代小鼠肝细胞中的PEPCK1泛素化。原代小鼠肝细胞先用MG132(10μM)和酮康唑(5μM)预处理30分钟，然后用SL010110或二甲双胍处理4小时。然后，测定PEPCK1蛋白质水平(b)、PEPCK活性(c)和糖异生(d)。数值表示为来自三个或五个独立实验的平均值 SEM；*P<0.05和**P<0.01与DMSO处理的对照相比；*P<0.05，*#P<0.01与MG132和酮康唑处理的对照相比；，与SL010110在DMSO条件下引起的降低相比(以对照的百分比表示)。

SL010110通过促进PEPCK1泛素化和降解来抑制糖异生

在原代小鼠肝细胞中，用 SL010110或500 μM二甲双胍孵育后，测量PEPCK1的泛素化水平。如图2a所示，SL010110明显增加了PEPCK1的泛素化，而二甲双胍处理则没有变化。因此，我们推测SL010110诱导的PEPCK1蛋白水平下降可能是由泛素 - 蛋白酶体系统(UPS)介导的蛋白质降解所致。为了验证这一假设，使用了蛋白酶体抑制剂MG132。如报道所述，MG132在原代肝细胞中容易被代谢酶细胞色素P450 3A4(CYP3A4)代谢[30]。同时添加CYP3A4抑制剂酮康唑以增强MG132的稳定性。用MG132和酮康唑预处理后，SL010110诱导的PEPCK1蛋白水平降低受到抑制，而二甲双胍仍然对PEPCK1蛋白含量发挥其抑制作用(图2b)。同样，SL010110介导的PEPCK活性抑制也被消除(图2c)。用抑制剂处理后，1或3 μM SL010110对糖异生的抑制作用完全被消除， SL010110对糖异生的抑制作用显著减弱(分别为74.5%和39.7%，无或有MG132和酮康唑，，图2d)；然而，二甲双胍介导的糖异生抑制作用不受影响(图2d)。这些数据表明，SL010110主要通过促进PEPCK1的泛素化和降解来抑制肝糖异生。

SL010110促进PEPCK1乙酰化并间接增加p300乙酰转移酶活性

用3 μM SL010110处理可明显增加原代小鼠肝细胞中PEPCK1的乙酰化，而二甲双胍则无此作用(图3a)。通过用PEPCK1抗体进行免疫沉淀，我们发现用3 μM SL010110处理后，与PEPCK1结合的p300及其伴侣蛋白HLA - B相关转录本3(BAT3)的量增加(图3b)；这些结果表明p300可能参与了PEPCK1的乙酰化。然后，进一步检测了SL010110对p300乙酰转移酶活性的影响。当直接与p300蛋白孵育时，SL010110不影响p300的乙酰转移酶活性(图3c)，但在原代小鼠肝细胞中显著增加了p300的乙酰转移酶活性(图3d)，表明SL010110可能间接激活p300。通过用p300抗体进行免疫沉淀，我们发现与对照处理相比，3 μM SL010110在原代小鼠肝细胞中诱导p300乙酰化显著增加了3倍(图3e)。在SL010110处理后，还观察到与p300共沉淀的PEPCK1有类似的增加(图3e)。用SL010110处理也刺激了p300的HAT口袋中1499位赖氨酸(K1499)的乙酰化(图3f)。这些结果表明，SL010110可能通过间接激活p300的乙酰转移酶活性来增加PEPCK1的乙酰化。SL010110通过激活p300乙酰转移酶和PEPCK1的乙酰化来抑制糖异生

图3 SL010110促进磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PEPCK1)乙酰化并间接增加p300乙酰转移酶活性。a通过免疫沉淀检测用 SL010110或二甲双胍预处理的原代小鼠肝细胞中的PEPCK1乙酰化。b对用3μM SL010110预处理的肝细胞中与PEPCK1共免疫沉淀的p300和BAT3进行定量。c SL010110未直接增加p300乙酰转移酶活性。用3μM SL010110处理原代小鼠肝细胞，并检测p300乙酰转移酶活性(d)、p300乙酰化水平、PEPCK1与p300的蛋白相互作用(e)以及K1499处的p300乙酰化(f)。数据表示为来自三个或五个独立实验的平均值标准误；** 与对照组相比。

C646是组蛋白乙酰转移酶p300的选择性竞争性抑制剂。用C646预处理消除了SL010110刺激的p300活性(图4a)。C646阻断了SL010110诱导的p300与PEPCK1的结合，从而消除了PEPCK1乙酰化的增强(图4b)。C646阻断了SL010110诱导的PEPCK1蛋白水平降低和PEPCK1活性抑制，而二甲双胍的作用未改变(图4c，d)。此外，用C646处理完全消除了1或3μM SL010110对糖异生的抑制，10μM SL010110对糖异生的抑制作用显著减弱(分别为75.1%和37.0%，无或有C646，，图4e)，而二甲双胍对糖异生的抑制作用未受影响(图4e)。

SL010110抑制细胞质中的Sirt活性，以促进p300乙酰转移酶的激活并抑制糖异生。由于p300活性受去乙酰化酶Sirts调控[25]，我们检测了SL010110对原代小鼠肝细胞中Sirt活性的影响。哺乳动物的Sirts表现出不同的亚细胞定位，SIRT1主要定位于细胞核，而SIRT2主要定位于细胞质[28]。如图5a所示，阳性对照，即SIRT2抑制剂sirtinol和泛Sirt抑制剂NAM，显著抑制了细胞质中的Sirt活性(主要是SIRT2活性)。浓度为1、3和的SL010110也显著降低了细胞质中的Sirt活性，分别降低了19.8%、32.1%和38.2%(图5a)。SL010110和sirtinol未改变原代肝细胞中的细胞核Sirt活性(主要是SIRT1活性)，而NAM则具有抑制作用(图5b)。SL010110以剂量依赖性方式降低了原代小鼠肝细胞中的比值(图5c)。NMN是一种合成前体，据报道可上调细胞中的比值[31 - 33]。与NMN共同处理后，SL010110介导的SIRT2活性抑制被完全消除(图5d)。此外，NMN完全阻断了SL010110刺激的p300乙酰转移酶活性和PEPCK1乙酰化(图5e，f)。此外，NMN完全消除了1或3 μM SL010110对糖异生的抑制作用，并且 SL010110导致的糖异生减少也显著降低(无或有NMN时分别为69.9%对28.8%，，图5g)；然而，二甲双胍对糖异生的抑制作用不受影响(图5g)。这些结果表明，SL010110通过抑制原代小鼠肝细胞中的SIRT2并随后激活p300来抑制糖异生。Sirtinol通过激活p300乙酰转移酶抑制糖异生并增加PEPCK1乙酰化

图4 SL010110通过激活p300乙酰转移酶和PEPCK1的乙酰化来抑制糖异生。原代小鼠肝细胞先用组蛋白乙酰转移酶p300抑制剂C646(10 μM)预处理，然后与SL010110共同处理。然后，分析p300乙酰转移酶活性(a)、p300与PEPCK1的相互作用、PEPCK1乙酰化(b)、PEPCK1蛋白水平(c)、PEPCK活性(d)和糖异生(e)。结果表示为来自三个或五个独立实验的平均值 SEM；与DMSO处理的对照相比，**P < 0.01；与C646处理的对照相比，**P 0.01；与DMSO条件下SL010110引起的降低相比(以对照的百分比表示)， P 0.01。

为进一步证实p300参与SIRT2诱导的PEPCK1乙酰化，我们在原代小鼠肝细胞中使用SIRT2抑制剂sirtinol进行了额外的研究。如图6a所示，在基础条件下，25 μM和 μM的sirtinol处理分别显著抑制糖异生25.1%和49.6%；在福斯高林刺激条件下，分别抑制49.8%和73.4%。浓度为 μM的sirtinol显著促进原代肝细胞中p300乙酰转移酶活性并增加p300乙酰化(图6b、c)。此外，sirtinol显著刺激PEPCK1乙酰化，而在存在p300抑制剂C646的情况下，这种作用被消除(图6d)。此外，C646也可阻断sirtinol对糖异生的抑制作用(图6e)。这些结果表明，SIRT2抑制剂通过激活p300乙酰转移酶活性并随后增加PEPCK1乙酰化来抑制糖异生。

SL010110急性处理抑制ob/ob小鼠肝脏SIRT2活性，增加p300和PEPCK1乙酰化并抑制糖异生

在患有2型糖尿病的ob/ob小鼠中，研究了单次口服剂量的SL010110(100 mg/kg)对肝脏NAD /NADH比值、SIRT2活性、p300乙酰化、PEPCK1乙酰化和降解的影响，并进行了丙酮酸耐量试验以评估SL010110对体内糖异生的作用。如图7a和b所示，单次给予SL010110后，小鼠肝脏中的比值降低了37.2%，肝脏SIRT2活性降低了25.7%。相应地，SL010110处理使肝脏中p300乙酰化增加了1.8倍，PEPCK1乙酰化增加了2.5倍(图7c、d)。SL010110降低了ob/ob小鼠肝脏中的PEPCK1蛋白水平和PEPCK活性，但PEPCK和G6Pase的mRNA水平未改变(图7e - g)。此外，SL010110处理显著降低了腹腔注射丙酮酸钠后15、三十和60分钟时的血糖水平，表明其在体内抑制全身糖异生(图7h)。

图5 SL010110抑制细胞质Sirt活性以促进p300乙酰转移酶激活并抑制糖异生。在用所示化合物处理的原代小鼠肝细胞中测量细胞质Sirts(主要是SIRT2)(a)和细胞核Sirts(主要是SIRT1)(b)的活性。c在所示浓度的SL010110处理的肝细胞中测量NAD /NADH比值。原代小鼠肝细胞用NAD 合成前体NMN(500 μM)预处理，并与3 μM SL010110共同处理，然后检测细胞质Sirt活性(d)、p300乙酰转移酶活性(e)、PEPCK1乙酰化(f)和糖异生(g)。数值表示为三到五个独立实验的平均值 SEM；烟酰胺(NAM)作为Sirt活性的阳性对照，*P 且**P < 0.01，与DMSO处理的对照相比；**P < 0.01，与NMN处理的对照相比； P < 0.01，与DMSO条件下SL010110引起的降低相比(以对照的百分比表示)。

SL010110在ob/ob小鼠血清和肝脏中的药代动力学特性

在雌性和雄性ob/ob小鼠中进行了SL010110的药代动力学研究，剂量为15mg/kg。雌性小鼠中SL010110的血清和肝脏浓度-时间曲线如图8a、b所示，雄性小鼠中SL010110的曲线如图8c、d所示。计算了SL010110的药代动力学参数(表2)。在雌性ob/ob小鼠中，给药后SL010110的血清浓度为58642±4313ng/mL ，为。在雄性ob/ob小鼠中，给药后SL010110的血清浓度为，为 h*ng/mL。在雌性ob/ob小鼠中，给药后SL010110的肝脏浓度为。在雄性ob/ob小鼠中，给药15分钟后SL010110的肝脏浓度为125733±3579 ng/g。结果表明，SL010110口服给药后吸收迅速，两性的值相当相似；然而，在SL010110的血清或肝脏浓度中可以观察到一些差异，这是由于不同的测试时间点所致。

SL010110的长期给药改善糖尿病ob/ob和db/db小鼠的葡萄糖稳态

在ob/ob小鼠中评估了SL010110(15或，口服，每日两次)的长期降血糖潜力。两种剂量的SL010110从第8天开始均显著降低随机血糖水平，在第25天时分别降低了33.3%和34.8%(图9a)。SL010110治疗也显著降低了空腹血糖水平，在治疗结束时分别降低了37.2%和41.9%(图9b)。 SL010110治疗明显降低了慢性血糖指数HbA1c(图9c)。两种剂量的SL010110均未影响体重和食物摄入量(图9d、e)。长期给予SL010110未改变ob/ob小鼠肝脏中的pck1或g6p基因转录(图9f)。然而，50mg/kg SL010110长期治疗使PEPCK活性显著降低了41.8%，15或 SL010110长期给药分别使PEPCK1蛋白水平明显降低了52.3%和49.1%(图9g、h)。还在db/db小鼠中评估了SL010110(15或50mg/kg，口服，每日一次)对葡萄糖代谢异常的长期影响，并使用二甲双胍(250mg/kg，口服，每日一次)作为阳性对照。在治疗过程中，15和50mg/kg SL010110显著降低了随机血糖水平，在治疗结束时分别降低了31.6%和46.1%(图9i)。SL010110治疗也降低了空腹血糖水平，在治疗结束时分别降低了17.5%和38.9%(图9j)。二甲双胍治疗小鼠的随机和空腹血糖水平也分别显著降低了41.8%和53.6%(图9i、j)。 SL010110治疗后db/db小鼠的HbA1c水平也呈下降趋势(图9k)。两种剂量的SL010110均未影响体重和食物摄入量(图9l、m)。

图6 西曲瑞克通过激活p300乙酰转移酶抑制糖异生并增加PEPCK1乙酰化。a 西曲瑞克在基础和福斯高林诱导条件下抑制原代小鼠肝细胞中的糖异生。在50 西曲瑞克处理的原代小鼠肝细胞中测量p300乙酰转移酶活性(b)和乙酰化(c)。原代小鼠肝细胞用C646(10μM)预处理并与50μM西曲瑞克共同处理，检测PEPCK1乙酰化(d)和糖异生(e)。结果表示为三到五个独立实验的平均值 SEM；*P 和**P 与相应对照相比；##P 与福斯高林处理的对照相比。

讨论

鉴于肝脏是葡萄糖稳态的关键器官，肝脏糖异生失调会导致2型糖尿病患者的葡萄糖代谢异常[34]。因此，开发抑制糖异生的活性分子是治疗糖尿病患者血糖控制的一种有吸引力的方法[35]。在发现具有降血糖作用的新化合物时，发现许多分子，包括广泛使用的药物二甲双胍，通过下调PEPCK和G6pase的基因表达来抑制糖异生。然而，很少有报道靶向PEPCK蛋白质稳定性来调节糖异生的化合物。在本研究中，我们发现先导化合物SL010110可以通过促进PEPCK1乙酰化和降解来有效抑制肝脏糖异生。更重要的是，我们证明SL010110抑制SIRT2活性并减少p300去乙酰化，从而促进p300乙酰转移酶活性和PEPCK1乙酰化。此外，SL010110在ob/ob和 2型糖尿病小鼠中显示出有效的降血糖作用。

PEPCK1是糖异生中限速酶PEPCK的主要功能异构体[9]，它可以通过调节其基因表达或蛋白质稳定性来进行调控。SL010110明显降低了PEPCK1蛋白水平，而PEPCK1基因表达水平没有改变。泛素-蛋白酶体系统(UPS)是维持细胞内稳态中蛋白质降解的主要途径之一[36]。由于据报道PEPCK1通过UPS降解[15,19,20]，我们评估了SL010110对PEPCK1泛素化的影响。正如预期的那样，SL010110处理显著增加了PEPCK1的泛素化。蛋白酶体抑制剂MG132消除了SL010110对糖异生的抑制作用。因此，SL010110在原代小鼠肝细胞中对糖异生的抑制作用取决于PEPCK1蛋白酶体降解的增加。

PEPCK1的泛素化和蛋白酶体降解可以受到多种因素的调节，包括p300的乙酰化[15]、泛素结合酶9(Ubc9)的SUMO化[19]以及糖原合成激酶3β(GSK3β)的磷酸化[20]。在这里，SL010110显著增加了PEPCK1的乙酰化以及PEPCK1与

图7 SL010110急性处理抑制ob/ob小鼠肝脏SIRT2活性，增加p300和PEPCK1乙酰化并抑制糖异生。单次口服剂量的SL010110(100mg/kg)后，检测并定量ob/ob小鼠肝脏中的NAD /NADH比值(a)、细胞质Sirt活性(b)、p300乙酰化(c)、PEPCK1乙酰化(d)、PEPCK1蛋白水平(e)、PEPCK活性(f)和糖异生基因表达(g)。h 在进行丙酮酸耐量试验的ob/ob小鼠中测量血糖水平。数据表示为只小鼠的平均值 SEM；* 和** 与载体对照小鼠相比。

图8 通过灌胃给予ob/ob小鼠后，SL010110在血清和肝脏中的药代动力学变化。通过灌胃给予ob/ob小鼠后，SL010110在血清和肝脏中的药代动力学变化。雌性ob/ob小鼠灌胃 SL010110后，SL010110的血清浓度-时间曲线(a)和肝脏浓度-时间曲线(b)，以及雄性ob/ob小鼠灌胃 SL010110后，SL010110的血清浓度-时间曲线(c)和肝脏浓度-时间曲线(d)。数据表示为三只小鼠的平均值标准误。

1844 p300。作为p300的增强子，BAT3总是与p300结合，形成复合物以增强p300的活性[37, 38]。在此，SL010110处理增加了BAT3与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PEPCK1)的相互作用，进一步表明p300参与了SL010110诱导的PEPCK1乙酰化。p300既可以作为转录共激活因子来调节下游基因表达，也可以作为乙酰转移酶来使某些底物乙酰化。在此，SL010110刺激了p300的活性，但不影响原代小鼠肝细胞中糖异生基因的表达。我们推测p300作为乙酰转移酶来调节SL010110介导的PEPCK1乙酰化诱导。正如预期的那样，竞争性p300抑制剂C646消除了SL010110诱导的PEPCK1乙酰化和降解，并减弱了SL010110对原代小鼠肝细胞中糖异生的抑制作用，表明p300是SL010110使PEPCK1乙酰化并抑制糖异生所必需的。

表2. 给雌性和雄性ob/ob小鼠口服SL010110(15 mg/kg)后的药代动力学性质(平均值标准误， )。

口服 (15毫克/千克)	(小时)	(h)	(纳克/毫升)	(小时·纳克/毫升)
雌性	2.9 ± 0.1	0.3±0.06	58642±4313	63529 ± 8728
雄性	4.77 ± 0.22	0.083±0.011	82353±5173	73335±11080

据报道，组蛋白脱乙酰酶SIRT2可使某些蛋白质底物(包括磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PEPCK1)和p300)脱乙酰化，从而调节其活性或稳定性[15, 25]。在此，SL010110降低了原代小鼠肝细胞中的比率，并抑制了细胞质中的Sirt活性(主要是SIRT2活性)。比率会受到多种因素的影响，如衰老和营养可利用性。也有文献记载，NADH水平与线粒体呼吸密切相关，尤其是线粒体复合物1的活性[39]。然而，线粒体复合物1是否参与SL010110诱导的比率下降仍需进一步探究。烟酰胺单核苷酸(NMN)是合成的前体，可显著增强细胞质中的Sirt活性。补充NMN后，SL010110无法抑制SIRT2活性，且SL010110诱导的PEPCK1乙酰化被消除，这表明抑制SIRT2活性对于调节PEPCK1乙酰化水平至关重要。由于p300在SL010110诱导的PEPCK1乙酰化和糖异生抑制中也起着重要作用，我们评估了p300是否可能是SIRT2 - PEPCK1轴中的关键介质。正如预期的那样，补充NMN完全消除了SL010110刺激的p300乙酰转移酶活性，这表明SL010110抑制SIRT2是为了激活p300使PEPCK1乙酰化以便降解。据报道，SIRT2抑制剂sirtinol可促进PEPCK1乙酰化和降解，从而降低细胞糖异生[17]。然而，p300是否参与sirtinol诱导的PEPCK1乙酰化尚不清楚。在本研究中，sirtinol增加了p300的乙酰化和乙酰转移酶活性，并且p300抑制剂C646完全阻断了sirtinol诱导的PEPCK1乙酰化和糖异生抑制。这些数据表明，sirtinol诱导的PEPCK1乙酰化也依赖于p300乙酰转移酶活性。这些发现揭示了一种新机制，即p300可能在SIRT2介导的PEPCK1降解和糖异生调节中起关键作用。

图9长期给予SL010110可改善糖尿病ob/ob和db/db小鼠的葡萄糖稳态。给ob/ob小鼠分别口服剂量为15和50mg/kg的SL01110或赋形剂，每日两次，共25天。测定随机血糖水平(a)、空腹血糖水平(b)、糖化血红蛋白(HbA1c)水平(c)、体重(d)和平均每日食物摄入量(e)。还检测了肝脏中pck1和g6pc mRNA表达(f)、PEPCK活性(g)和PEPCK1蛋白表达(h)。给db/db小鼠分别口服SL010110(15和 )、二甲双胍(250mg/kg)或赋形剂，每日一次，共32天。测量随机血糖水平(i)、空腹血糖水平(j)、HbA1c水平(k)、体重(I)和平均每日食物摄入量(m)。结果表示为只小鼠的平均值标准误；与赋形剂对照小鼠相比，*P < 0.05，**P < 0.01。

为了研究SL010110是否影响2型糖尿病小鼠肝脏中的SIRT2-p300-PEPCK1轴，我们进行了进一步的体内研究。与原代小鼠肝细胞中的结果一致，单次口服剂量的SL010110降低了SIRT2的活性，增加了乙酰化p300和PEPCK1的水平，降低了PEPCK1的蛋白质水平和活性，但对ob/ob小鼠肝脏中的糖异生基因表达没有影响。异常增强的糖异生是2型糖尿病空腹高血糖的主要原因，糖尿病ob/ob小鼠的糖异生显著增加[40, 41]。在此，通过灌胃给予单次剂量的SL010110也显著降低了糖尿病ob/ob小鼠丙酮酸刺激后的血糖水平，表明在体内抑制了全身糖异生。这些发现支持了SL010110可以通过SIRT2-p300介导的PEPCK1降解抑制ob/ob小鼠糖异生的结论。

治疗2型糖尿病的最重要目标是降低高血糖。长期给予SL010110(15或，口服，每日两次)可明显降低ob/ob小鼠的随机血糖、空腹血糖水平和HbAc1水平。给予SL010110还降低了肝脏PEPCK1的活性和蛋白质水平，但不影响糖异生基因的表达，这表明促进PEPCK1蛋白质降解可以实现降低血糖水平这一目标。我们进一步评估了SL010110在另一种2型糖尿病小鼠模型即db/db小鼠中的抗高血糖作用，并且SL010110在随机和空腹状态下均具有显著的降血糖作用。综上所述，我们证明了SL010110可以通过促进PEPCK1降解来缓解2型糖尿病小鼠的葡萄糖代谢紊乱。

结论

总之，我们的研究确定SL010110是一种有价值的化合物，其通过促进PEPCK1降解来抑制肝脏糖异生的机制独特。SL010110抑制SIRT2以激活p300乙酰转移酶活性，进一步使PEPCK1乙酰化，并促进PEPCK1降解。长期给予SL010110可显著降低ob/ob和db/db小鼠的血糖水平。这些发现揭示了一种新机制，即p300可能在SIRT2介导的PEPCK1降解中起重要作用，并突出了SL010110作为具有有效抗高血糖活性的先导化合物用于治疗2型糖尿病的潜在价值。

致谢

本研究得到上海市科学技术委员会(19431900900)的资助。

作者贡献

YL、JHS和SLH设计了本研究。YRR、YLY、YF、TFX、YS和JL进行了研究。YRR、SLH和YL分析并解释了数据。YRR、SLH和YL撰写了本文。

附加信息

利益冲突:作者声明无利益冲突。

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SL010110,糖异生,2型糖尿病

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